KR101978102B1 - 면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리 - Google Patents

면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리 Download PDF

Info

Publication number
KR101978102B1
KR101978102B1 KR1020187004098A KR20187004098A KR101978102B1 KR 101978102 B1 KR101978102 B1 KR 101978102B1 KR 1020187004098 A KR1020187004098 A KR 1020187004098A KR 20187004098 A KR20187004098 A KR 20187004098A KR 101978102 B1 KR101978102 B1 KR 101978102B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
virus
capsid polypeptide
detecting
compound
Prior art date
Application number
KR1020187004098A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180030629A (ko
Inventor
엘케 파츠
페터 뮌흐
미르코 리터
글로리아 타바레스
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20180030629A publication Critical patent/KR20180030629A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101978102B1 publication Critical patent/KR101978102B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human Parvovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법으로서, (a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플에서의 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 바이러스의 검출을 위해 대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법으로서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 방법에 관련된 키트, 용도 및 장치에 관한 것이다.

Description

면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리 {ALKALINE PRETREATMENT OF PARVOVIRUSES FOR IMMUNOASSAYS}
본 발명은 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법으로서, (a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플에서의 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 바이러스의 검출을 위해 대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법으로서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 방법에 관련된 키트, 용도 및 장치에 관한 것이다.
외피-비보유 바이러스는, 대부분의 외피보유 바이러스와 반대로, 열, 산, 세제 등을 비롯한 환경적 영향에 대해 그의 강건성 및 그의 상대적 무감응성으로 알려져 있다. 그 결과로서, 외피-비보유 바이러스의 존재를 검출하기 위해 바이러스의 구성 성분 분자를 얻기 위하여 외피-비보유 바이러스를 분해하기가 어렵다는 것이 발견되었다.
외피-비보유 바이러스의 예시적 군, 파보바이러스는, 캡시드 내로 패키징된 선형, 비-분절, 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는 작은, 외피-비보유 바이러스이다. 파보바이러스의 캡시드는 각각 VP1 ~ VP2 또는 VP1 ~ VP4 로 지칭되는 2 내지 4 개의 캡시드 단백질로 본질적으로 이루어진다. 캡시드 단백질은, 적어도 일부가 모든 VP 단백질에 대해 동일하여 VP 단백질이 아미노산 서열에 있어서 부분적으로 동일한 바이러스의 게놈에서 개방 판독 프레임으로부터 발현된다. 파보바이러스는 다양한 범위의 pH 값, 용매 및 온도에 대해 무감응성인 그의 캡시드의 우수한 안정성으로 알려져 있다 (예를 들어 Yuan and Parrish (2001), Virology 279: 546).
인간을 감염시키는 에리트로파보바이러스 (erythroparvovirus) 속 일원인 영장류 에리트로파보바이러스 1 (파보바이러스 B19) 은, "제 5 질환" 으로도 알려져 있는 전염성 홍반의 원인 인자이다. 질환의 증상은 열, 두통, 구역 및 설사와 같은 바이러스 감염의 고전적 증상을 포함한다. 이들에는 통상, 팔자주름, 이마 및 입을 전형적으로 포함하지 않는, 특히 뺨에서의 붉은 반점; 및 몸통 및/또는 손발에서의 붉은 반점이 뒤이어진다. 임신한 여성에서의 파보바이러스 B19 감염은 특히 중요한데, 태아에서의 빈혈 및 태아수종의 발생을 초래할 수 있기 때문이다.
파보바이러스 B19 감염의 면역학적 진단은 통상 혈액 샘플에서, 바이러스 캡시드 단백질을 검출하여 수행된다. 사용한 방법은, 검정의 감수성을 증가시키기 위해 바이러스 입자를 분해시키는 것을 목적으로 한, 샘플의 산성 전처리를 포함한다 (WO 2008/072216). 동일한 목적을 위해 카오트로픽 (Chaotropic) 염이 또한 사용된다 (JP 2007-278902). 그러나, 산 처리는 바이러스 입자가 적어도 부분적으로 재조립되게 하는 가역적 변성을 일으킨다. 더욱이, 혈액 샘플로부터의 잠재적 교란 면역글로불린은 또한 복원될 수 있으며, 따라서 효과적으로 제거되지 않는다. 카오트로픽 염은 검출 반응을 방해할 수 있고, 제거되는 경우, 캡시드 및 교란요인이 복원되게 할 수 있다. 또한 이들의 사용은, 부식을 일으킬 수 있으므로 스테인레스 스틸 모듈을 포함하는 장치에서 중요할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 파보바이러스를 검출하기 위한 개선된 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
이러한 문제점은 독립 청구항의 특질을 갖는 본 발명의 수단 및 방법에 의해 해결된다. 분리된 방식으로 또는 어떠한 임의의 조합으로 실현될 수 있는 바람직한 구현예가 종속 청구항에 열거된다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스 (non-enveloped virus) 의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 상기 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
하기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "갖는다", "포함한다" 또는 "비롯하다" 또는 이의 어떠한 임의적인 문법적 변이는 비-배타적 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어에 의해 도입된 특질 외에 이러한 맥락에서 기재된 개체에 추가 특질이 존재하지 않는 상황, 및 하나 이상의 추가 특질이 존재하는 상황 모두를 나타낼 수 있다. 예로서, 표현 "A 는 B 를 갖는다", "A 는 B 를 포함한다" 및 "A 는 B 를 비롯하다" 는 B 외의 다른 요소가 A 에 존재하지 않는 상황 (즉, 오로지 및 배타적으로 B 로 이루어지는 상황), 및 요소 C, 요소 C 및 D 또는 심지어 추가 요소와 같은 B 외의 하나 이상의 추가 요소가 개체 A 에 존재하는 상황 모두를 나타낼 수 있다.
또한, 하기에서 사용하는 바와 같이, 용어 "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로" 또는 유사한 용어는, 추가 가능성의 제한 없이, 선택적 특질과 함께 사용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입된 특질은 선택적 특질이며 어떠한 방식으로도 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은, 숙련자가 인지할 바와 같이, 대안적 특질을 사용하여 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 구현예에서" 또는 유사한 표현에 의해 도입된 특질은 본 발명의 추가 구현예에 관한 어떠한 제한도 없이, 본 발명의 범주에 관한 어떠한 제한도 없이, 그리고 이러한 방식으로 도입된 특질과 본 발명의 다른 선택적 또는 비-선택적 특질을 조합하는 가능성에 관한 어떠한 제한도 없이, 선택적 특질인 것으로 의도된다. 더욱이, 다르게 나타내지 않는 경우, 용어 "약" 은 나타낸 값 ±20% 에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법은 생체외 (in vitro) 방법이다. 또한, 이는 상기 명백하게 언급된 것들에 추가로 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예컨대 단계 a) 에 대한 샘플을 수득하는 것, 또는 단계 b) 에서의 측정값 또는 수정된 측정값을 계산하는 것에 관한 것일 수 있다. 더욱이, 상기 단계 중 하나 이상은 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 샘플과 염기를 접촉시켜, 그로써 샘플이 상기 염기와 상호작용하게 하는 반응 혼합물을 생성시키는 단계,
(b) 임의로는 상기 반응 혼합물을 중화시키는 단계,
(c) 상기 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 2 개 이상의 결합 화합물을 첨가하는 단계 (상기 2 개 이상의 결합 화합물 중 1 개는 포획 화합물 (capture compound) 이고, 상기 2 개 이상의 결합 화합물 중 1 개는 검출 화합물 (detector compound) 임),
(d) 상기 반응 혼합물과 상기 결합 화합물을 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
(e) 상기 샘플에 존재하는 상기 캡시드 폴리펩티드를 2 개 이상의 결합 화합물과 면역반응시키기에 충분한 시간 동안 상기 면역반응 혼화물을 유지시켜, 면역반응 생성물을 형성시키는 단계, 및
(f) 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 대상의 샘플에서 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은 통상 바이러스의 존재를 나타낼 것이다. 따라서, 한 구현예에서 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법은, 하기 단계를 포함하는, 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 검출 방법이다:
(a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계,
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계, 그로써,
(c) 상기 바이러스를 검출하는 단계.
한 구현예에서, 상술한 방법에서 캡시드 폴리펩티드는 비-크기 차별 검출 방법, 즉 한 구현예에서, 검출된 분석물의 분자 질량 검출 없이 상기 캡시드 폴리펩티드의 특질 (feature) 을 검출하는 방법에 의해 검출된다. 따라서 한 구현예에서, 상술한 방법은 샌드위치 면역검정, 특히 이중 항체 샌드위치 면역검정, 예를 들어 샌드위치 ELISA 또는 샌드위치 ECLIA 를 포함한다.
용어 "바이러스" 는 당업자에 의해 이해된다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "외피-비보유 바이러스" 는 가장 바깥쪽 외피로서 캡시드를 갖는 바이러스에 관한 것이고; 따라서 한 구현예에서, 외피-비보유 바이러스는 지질 멤브레인에 의해 둘러싸이지 않은 바이러스이다. 한 구현예에서, 외피-비보유 바이러스는 레오바이러스 (Reovirus), 칼시바이러스 (Calcivirus), 피코르나바이러스 (Picornavirus), 파보바이러스 (Parvovirus), 써코바이러스 (Circovirus), 폴리오마바이러스 (Polyomavirus), 파필로마바이러스 (Papillomavirus) 또는 아데노바이러스 (Adenovirus) 이다. 한 구현예에서, 외피-비보유 바이러스는 인간 병원성 바이러스이다. 따라서 추가 구현예에서, 외피-비보유 바이러스는 인간 병원성 레오바이러스, 인간 병원성 칼시바이러스, 인간 병원성 피코르나바이러스, 인간 병원성 파보바이러스, 인간 병원성 써코바이러스, 인간 병원성 폴리오마바이러스, 인간 병원성 파필로마바이러스 또는 인간 병원성 아데노바이러스이다.
한 구현예에서, 외피-비보유 바이러스는 파보비리데 과의 바이러스이다. 일반적으로 "파보바이러스" 로도 지칭되는 용어 "파보비리데 과 (family Parvoviridae)" 는 당업자에게 알려져 있다. 파보비리데 과 바이러스는 2 개의 아과, 암비덴소바이러스 (Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스 (Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스 (Hepandensovirus), 이테라덴소바이러스 (Iteradensovirus) 및 펜스틸덴소바이러스 (Penstyldensovirus) 속을 포함하는 덴소비리네 (Densovirinae); 및 암도파보바이러스 (Amdoparvovirus), 아베파보바이러스 (Aveparvovirus), 보카파보바이러스 (Bocaparvovirus), 코피파보바이러스 (Copiparvovirus), 데펜도파보바이러스 (Dependoparvovirus), 에리트로파보바이러스 (Erythroparvovirus), 프로토파보바이러스 (Protoparvovirus), 테트라파보바이러스 (Tetraparvovirus) 속을 포함하는 파보비리네 (Parvovirinae) 를 갖는다. 따라서, 용어 "파보비리데 과의 바이러스" 는 상기 바이러스 과의 일원으로서 게놈 유사성을 기반으로 분류되거나 분류될 수 있는 바이러스에 관한 것이다. 한 구현예에서, 바이러스는 파보비리네 아과의 바이러스이다. 추가 구현예에서, 바이러스는 에리트로파보바이러스 속의 바이러스이다. 추가 구현예에서, 바이러스는 영장류 에리트로파보바이러스 1 (파보바이러스 B19) 이다.
본 발명의 방법의 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "접촉시키는" 은, 숙련자에 의해 이해된다. 한 구현예에서, 용어는 본 발명의 화합물, 특히 염기를 물리적으로 샘플 또는 추가 화합물과 접촉시키고, 그로써 화합물 및 추가 화합물을 상호작용시키는 것에 관한 것이다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "반응 혼합물" 은 제 1 화합물과 제 2 화합물, 예를 들어 염기와 샘플을 접촉시켜, 상기 제 1 및 제 2 화합물이 반응하게 되는 임의의 혼합물에 관한 것이다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "염기" 는, 수용액에서 pH 증가를 유도하는 화합물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 염기는 브뢴스테드-로우리 (Brønsted-Lowry) 염기이다. 추가 구현예에서, 염기는 수용액에서 수산화물 이온을 포함하거나 생성시키는 화합물이다. 추가 구현예에서, 염기는 알칼리 금속 수산화물 예를 들어 LiOH, NaOH, KOH 또는 RbOH; 또는 알칼리 토금속 수산화물, 예를 들어 Be(OH)2, Mg(OH)2 또는 Ca(OH)2 이다. 또 다른 구현예에서, 염기는 최대 4, 한 구현예에서 최대 3, 추가 구현예에서 최대 2 의 pKB 값을 갖는다. 추가 구현예에서, 염기는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이다.
한 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 상기 샘플을 pH 10.5 이상에서, 추가 구현예에서 pH 11 이상에서, 추가 구현예에서 pH 11.5 이상에서, 추가 구현예에서 pH 11.7 이상에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 강한 알칼리 pH 에서의 연장된 인큐베이션은 캡시드 폴리펩티드를 비롯하는 폴리펩티드의 가수분해를 초래할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 샘플은 최대 pH 14, 추가 구현예에서 최대 pH 13 에서 인큐베이션된다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 pH 12±1.5 에서, 한 구현예에서 pH 11.5±1 에서, 추가 구현예에서 pH 11.5±0.5 에서 인큐베이션된다. 한 구현예에서, 수용액의 pH 는 DIN EN ISO 10523 (2012 년 4 월) 에 따라 측정된다. 따라서 한 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 샘플과 상기 나타낸 바와 같은 pH 의 완충제를, 한 구현예에서 상기 나타낸 바와 같은 pH 에서 하나 이상의 pKB 를 갖는 완충제 화합물을 포함하는 완충제를 접촉시키는 것이다.
한 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 2 분 이상, 한 구현예에서 5 분 이상, 추가 구현예에서 9 분 이상 동안 염기의 존재 하에 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 강한 알칼리 pH 에서의 연장된 인큐베이션은 캡시드 폴리펩티드를 비롯하는 폴리펩티드의 가수분해를 초래할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 샘플은 2 시간 미만, 한 구현예에서 1 시간 미만, 추가 구현예에서 30 분 미만 동안 염기의 존재 하에 인큐베이션된다. 따라서 한 구현예에서, 샘플은 2 분 내지 60 분, 한 구현예에서 5 분 내지 20 분, 추가 구현예에서 9 분 내지 15 분 동안 염기의 존재 하에 인큐베이션된다.
따라서 한 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 pH 12±1.5 에서 2 분 내지 60 분 동안, 한 구현예에서 5 분 내지 20 분 동안, 추가 구현예에서 9 분 내지 15 분 동안 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 pH 11.5±1 에서 2 분 내지 60 분 동안, 한 구현예에서 5 분 내지 20 분 동안, 추가 구현예에서 7 분 내지 15 분 동안 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 추가 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 pH 11±0.5 에서 2 분 내지 60 분 동안, 한 구현예에서 5 분 내지 20 분, 추가 구현예에서 9 분 내지 15 분 동안 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 샘플과 염기를 접촉시키는 것은 10℃ 내지 50℃ 의 온도에서, 한 구현예에서 20℃ 내지 45℃ 의 온도에서, 추가 구현예에서 30℃ 내지 40℃ 의 온도에서, 추가 구현예에서 37±3℃ 의 온도에서 상기 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다.
이해될 바와 같이, 특히 사용한 결합 화합물(들) 의 성질에 따라, 염기-처리 샘플과 결합 화합물을 접촉시키기 전에 염기를 중화시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 방법은 단계 b) 에서 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 전에 염기를 중화시키는 추가 단계를 포함한다. 그러나 중화는 또한, 예를 들어 염기-처리 샘플이 염기 처리 후 강하게 희석되는 경우 및/또는 사용한 결합 화합물(들) 이 알칼리 조건에 무감응성인 경우 불필요할 수 있다. 한 구현예에서, 샘플은 pH 8±2 로, 한 구현예에서 pH 7±2 로, 추가 구현예에서 pH 7±1 로 중화된다. 숙련자는 수용액 중에서 염기를 중화시키는 적절한 방법을 알고 있다. 한 구현예에서, 중화는 적절한 pH 에서 완충된 완충제 화합물을 첨가하여 이루어진다. 한 구현예에서, 중화는 샘플이 본 발명의 결합 화합물에 접촉하기 전에 수행된다. 추가 구현예에서, 본 발명의 결합 화합물(들) 은 중화에 사용한 중화 용액에 포함되는데, 즉 중화는 상기 바이러스와 결합 폴리펩티드를 접촉시키면서 수행된다.
한 구현예에서, 변성된 폴리펩티드는 알칼리 처리 후, 특히 염기 중화 후 샘플로부터 제거되지 않는다. 추가 구현예에서, 변성된 폴리펩티드는 카오트로픽제, 특히 카오트로픽 세제, 예를 들어 나트륨 도데실 술페이트 첨가에 의해 가용화되지 않는다. 그러나, 알칼리 처리 후에 약한, 한 구현예에서 비-이온성, 세제를 첨가하여 예를 들어 고체 표면의 습윤이 보장된다는 것이 본 발명에 의해 예상된다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "검출하는" 은 정량적으로 또는 정성적으로, 샘플에서 검출할 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 하나 이상의 특질, 한 구현예에서 면역학적 특질을 검출하는 것을 나타낸다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 특질은 예를 들어 상기 특질에 특이적으로 결합하는 결합 화합물에 의해 샘플 중 캡시드 폴리펩티드 검출을 촉진시키는 캡시드 폴리펩티드의 구조적 특질이다. 한 구현예에서, 상기 특질은 면역학적 수단에 의한 캡시드 폴리펩티드의 식별 (identification), 추가 구현예에서 정량화를 촉진시킨다. 전형적인 사용가능 특질은 샘플에 존재하는 다른 화학적 화합물로부터의 상기 캡시드 폴리펩티드의 구별을 촉진시키는 특질이다. 한 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은 캡시드 폴리펩티드가 방법의 검출 한계 초과의 역가에서 샘플 중 존재하거나 부재하는지 여부를 확립하는 것이다. 주어진 방법에 대한 검출 한계를 확립하는 방법은 숙련자에게 알려져 있으며 예를 들어 희석 적정 실험을 포함한다. 추가 구현예에서, 검출하는 것은 샘플 중 캡시드 폴리펩티드 또는 바이러스의 양 또는 역가를 반-정량적으로 또는 정량적으로 검출하는 것이다. 정량적 검출을 위해, 캡시드 폴리펩티드 또는 바이러스의 절대량 또는 정확량이 검출되거나 캡시드 폴리펩티드 또는 바이러스의 상대량이 검출될 것이다. 상대량은, 정확량이 검출될 수 없거나 검출되어서는 안되는 경우에 검출될 수 있다. 상기 경우, 캡시드 폴리펩티드 또는 바이러스가 존재하는 양이, 제 2 의 양, 한 구현예에서 사전결정량으로 상기 캡시드 폴리펩티드 또는 바이러스를 포함하는 제 2 샘플에 대하여 증가하거나 감소하는지 여부가 검출될 수 있다.
숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 캡시드 폴리펩티드의 검출은 선택된 검정 포맷에 따라 좌우될 것이다. 한 구현예에서, 검정은 분석물, 예를 들어 바이러스, 이의 캡소머 (capsomer), 또는 이의 캡시드 폴리펩티드가, 고체 표면에 결합한 포획 화합물에 결합하고, 포획된 분석물의 양이 상기 포획된 분석물에 대한 하기 본원에서 명시된 바와 같은 검출 화합물의 결합에 의해 검출되는, 샌드위치 검정이다. 한 구현예에서, 포획 및/또는 검출 화합물은 항체이고 샌드위치 검정은 샌드위치 면역검정이다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 한 구현예에서, 분석물의 검출가능한 특질 (feature) 은 한 번 초과로 분석물에 존재할 수 있으며; 이러한 경우, 포획 화합물 및 검출 화합물은 둘 모두 상기 특질을 인지할 수 있거나; 포획 화합물은 제 1 특질을 인지하고 검출 화합물은 제 2, 즉 구조적으로 상이한, 특질을 인지한다. 그러나, 분석물의 특정 검출가능한 특질은 분석물에 단 한번 존재할 수 있으며; 이러한 경우, 한 구현예에서, 포획 화합물은 제 1 특질을 인지하고 검출 화합물은 제 2, 즉 구조적으로 상이한 특질을 인지한다.
한 구현예에서, 검출된 바이러스 및/또는 캡시드 폴리펩티드의 특질은 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드에 포함된 에피토프이다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "캡시드 폴리펩티드" 는, 검출가능한 양으로 본 발명의 바이러스의 캡시드에 포함되는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가 구현예에서, 용어 캡시드 폴리펩티드는 바이러스 캡시드의 구조적 성분인 폴리펩티드에 관한 것이며, 이때 한 구현예에서, 캡시드의 구조적 성분은 구조적으로 정상인 캡시드 형성 및/또는 전염성 바이러스 입자 형성에 필요한 성분이다. 추가 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드는 캡시드 당 5 카피 이상, 한 구현예에서 캡시드 당 10 카피 이상으로 바이러스 캡시드에 존재하는 폴리펩티드이다. 한 구현예에서, 바이러스는 파보바이러스이고 캡시드 폴리펩티드는 바이러스 VP1, VP2, VP3 및 VP4 캡시드 폴리펩티드 중 하나 이상이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 파보비리데 과의 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법은 바이러스 VP1, VP2, VP3 및 VP4 캡시드 폴리펩티드 중 하나 이상을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 외피-비보유 바이러스, 한 구현예에서, 상기 명시한 바와 같은 파보비리데 과의 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하고; 따라서 상기 방법에서 검출할 "분석물" 은, 한 구현예에서 상기 캡시드 폴리펩티드이다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 방법은 추가 분석물, 예를 들어 하나 이상의 추가 캡시드 폴리펩티드(들) 를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 한 구현예에서 분석물로서 바이러스 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은, 상기 캡시드 폴리펩티드의 올리고머를 검출하는 것을 포함하고/하거나 미손상 캡시드를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은 샘플을 결합 화합물에 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "결합 화합물" 은 본 발명의 분석물, 한 구현예에서 캡시드 폴리펩티드에 결합하는 화학적 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 결합 화합물은 유기 분자 또는 이의 복합체이고, 추가 구현예에서 생물학적 거대분자, 특히 폴리펩티드 또는 이의 복합체이다. 한 구현예에서, 결합 화합물은 항체, 특히 단일클론 항체이다. 따라서, 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "면역반응 생성물" 은 특정 구현예에서, 하나 이상의 항체와 본 발명의 캡시드 폴리펩티드 사이의 복합체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 결합 화합물은, 분석물 및 결합 화합물을 포함하는 복합체의 검출을 허용하기에 충분한 친화성으로 본 발명의 분석물에 간접적 또는 직접적으로 결합한다. 한 구현예에서, 분석물/결합 화합물 복합체의 해리 상수 (Kd) 는 최대 10-7 mol/L, 추가 구현예에서 최대 10-8 mol/L, 추가 구현예에서 최대 10-9 mol/L 이다. 한 구현예에서, 결합 화합물은 캡시드 폴리펩티드 및 결합 화합물을 포함하는 복합체의 검출을 허용하기에 충분한 친화성으로 본 발명의 캡시드 폴리펩티드에 간접적 또는 직접적으로 결합한다. 한 구현예에서, 결합 화합물은 분석물, 특히 본 발명의 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물이다. 한 구현예에서, 결합 화합물은 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며; 따라서 한 구현예에서, 결합 화합물은 본원의 다른 곳에서 명시한 바와 같이 알칼리 처리에 의해 변성되지 않은 캡시드 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 추가 구현예에서, 결합 화합물은 연속적인 (선형) 에피토프, 즉 분석물, 예를 들어 캡시드 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산에 의해 형성된 에피토프에 결합한다. 따라서 한 구현예에서, 결합 화합물은 분석물의 구조적 (conformational) 에피토프에 결합하지 않는 결합 화합물이다. 한 구현예에서, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물은, 하기 본원에서 기재한 방법에 의해 식별된 결합 화합물이다.
숙련자가 이해할 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는", 또는 이의 문법적 변이는, 샘플에 존재하는 다른 화합물, 전형적으로 생체분자가 리간드, 특히 본 발명의 결합 화합물에 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타내는데 사용되며; 한 구현예에서, 이는 화학적 화합물, 예를 들어 간섭 화합물의, 분석물과의 상호작용에 관련되지 않은 결합 화합물의 부위에 대한 결합을 배제하지 않는다. 한 구현예에서, 분석물 외의 화합물에 대한 결합 화합물의 결합 수준은 분석물에 대한 친화성의 각각 최대 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하인 결합 친화성을 초래한다.
한 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은 포획 화합물에 의해 고체 표면에 캡시드 폴리펩티드를 포획하는 것을 포함한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "포획 화합물" 은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같이 고체 표면에 부착되거나 부착되도록 조정된 결합 화합물에 관한 것이다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 포획 화합물을 고체 표면에 부착시키고 상기 고체 표면 결합된 포획 화합물과 샘플을 접촉시키는 것은, 존재시, 상기 포획 화합물에 의해 결합된 분석물이 상기 샘플에 포함된 다른 화합물로부터 특이적으로 분리되게 한다. 결합 화합물, 예를 들어 생물학적 분자, 전형적으로 폴리펩티드를 고체 표면에 부착시키는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 소수성 상호작용에 의한 결합, 비오틴화 및 고정화된 스트렙타비딘을 통한 결합, 공유 결합, 항체-항원 상호작용 등, 또는 이들 상호작용의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 포획 화합물은 또한 포획 복합체일 수 있다. 한 구현예에서, 포획 화합물은 항체이다. 추가 구현예에서, 포획 화합물은 단일클론 항체이다. 또 다른 구현예에서, 포획 화합물은 항체, 즉 포획 항체, 특히 단일클론 항체이다. 한 구현예에서, 포획 항체는 비오틴에 공유적으로 연결된다.
한 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것은 상기 캡시드 폴리펩티드와 검출 화합물을 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "검출 화합물" 은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 표시제 (indicator) 에 결합한 결합 화합물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 검출 화합물은 고체 표면에 결합하지 않으며 고체 표면에 결합하도록 조정되지 않는다. 한 구현예에서, 검출 화합물은 본 발명의 분석물, 한 구현예에서 캡시드 폴리펩티드에 직접 결합하는 화합물이다. 한 구현예에서, 검출 화합물은 또한 검출 복합체 (detector complex) 일 수 있다. 숙련자는 선택된 표시제에 따라 결합 화합물 또는 결합 복합체를 표시제에 어떻게 결합시키는지를 알고 있다. 한 구현예에서, 검출 화합물에서 표시제와 결합제 사이의 결합은 공유 결합이다. 한 구현예에서, 검출 화합물은 항체, 즉 검출 항체이다. 추가 구현예에서, 검출 화합물은 단일클론 항체이다. 또 다른 구현예에서, 검출 화합물은 루테늄 이온을 포함하는 복합체, 예를 들어 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체에 공유적으로 연결된 항체, 특히 단일클론 항체이다.
한 구현예에서, 검출 화합물의 결합 화합물 및 포획 화합물로 구성된 결합제는 동일하지 않다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "표시제" 는 상기 표시제를 포함하는 복합체 또는 분자의 존재를 검출할 수 있도록 조정된 화합물에 관한 것이다. 통상, 표시제는 검출가능한 특성, 전형적으로 광학 및/또는 효소적 특성을 갖는다. 그러나, 또한 상기 검출가능한 특성이 방사능을 배출하는 특성임이 예상된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "광학 특성" 은 광학 기기에 의해 검출될 수 있는 임의의 특성에 관한 것이다. 특히, 광학적으로 검출가능한 특성은: 반사 특성, 전파 특성, 방사 특성, 산란 특성, 형광 특성, 인광 특성, 회절 특성 및 분극 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 특성일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 예상된 추가 광학적 특성은 색, 형광, 발광 또는 굴절이다. 한 구현예에서, 본원에서 나타낸 바와 같은 광학적으로 측정가능한 특성은 광 흡수, 광 방사, 광 완화 (light remission) 또는 이와 연관된 특성과 같은 임의로 검출될 수 있는 화학적 화합물의 특성을 나타낸다. 본원에서 사용하는 바와 같은 광학적으로 검출가능한 특성을 검출하는 것이, 이전에 검출가능하지 않았던 특성 존재의 검출, 이전에 검출되었던 특성 부재의 검출 및 특성의 정량적 변화 검출, 즉 하나 이상의 광학 특성 변화 정도와 상호연관되는 신호 강도 변화의 검출을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 한 구현예에서, 용어 "광학적으로 검출가능한 특성" 은 또한 전기발생된 화학발광으로도 알려져 있는 전자화학발광에 관한 것임이 이해된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "효소적 특성" 은 생물학적 촉매작용에 의해 기질로부터 검출가능 생성물을 생성시키는 표시제의 특성에 관한 것이다. 따라서, 효소적 특성은 통상, 상기 표시제에서의 상기 효소적 특성을 갖는 폴리펩티드의 존재에 의해 부여된다. 전형적으로, 효소적 특성은: 포스파타아제 활성 (예를 들어 알칼리 포스파타아제에서의), 퍼옥시다아제 활성 (예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제에서의) 및 글리코시다아제 활성 (예를 들어 베타-갈락토시다아제에서의) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소적 활성이다. 효소적 활성에 대한 통상적인 기질은 당업계에 널리 알려져 있다. 통상, 상기 효소적 활성은 상기 본원에서 명시된 바와 같은 측정가능한 광학 특성을 갖는 생성물을 생성시키고/시키거나, 상기 효소적 활성은 전기 기기에 의해 측정가능한 생성물을 생성시킨다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "고체 표면" 은, 본 발명의 포획 화합물에 결합하도록 조정되고 예를 들어 물리적 수단에 의해 샘플로부터 분리되도록 조정된 임의의 적합한 고체 표면에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 고체 표면은 비드, 한 구현예에서 마이크로비드, 예를 들어 자성 또는 상자성 (paramagnetic) 마이크로비드의 표면이다. 한 구현예에서, 상기 표면은 예를 들어 포획 화합물의 하부구조에 결합하는 분자를 공유 또는 비공유적으로 부착시켜, 포획 화합물의 결합이 개선되도록 조정된다. 포획 화합물의 하부구조에 결합하는 통상적인 분자는 예를 들어 항체, 스트렙타비딘, 착물화 니켈 이온 등이다. 추가 구현예에서, 고체 표면은 공유 및/또는 비공유 결합, 예를 들어 소수성 상호작용에 의해 상기 포획 화합물에 결합한다. 따라서 한 구현예에서, 상기 고체 표면은 멀티-클러스터 플레이트의 표면이다. 한 구현예에서, 멀티-클러스터 플레이트의 표면은 포획 화합물의 결합을 위한 친화성 및/또는 능력을 증가시키기 위해 전처리된다. 적합한 전처리는 당업계에 알려져 있다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "샘플" 은 본 발명의 바이러스 또는 이의 구성요소 부분을 포함하는 것으로 추측되는 샘플에 관한 것이다. 한 구현예에서, 샘플은 본 발명의 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 포함하는 것으로 추측되는 샘플이다. 한 구현예에서, 샘플은 체액의 샘플, 조직 또는 기관으로부터의 샘플, 또는 외부 또는 내부 체표면으로부터 수득한 면봉채취 (swab) 또는 도말 (smear) 또는 세척/헹굼액의 샘플이거나 이를 포함한다. 한 구현예에서, 대변, 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장 또는 누액의 샘플이 본 발명의 방법에 의한 샘플로서 포함된다. 샘플은 브러시, (면봉)채취, 스파츌라, 헹굼/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 란셋으로의 공동 천자의 사용, 또는 수술 도구에 의해 수득될 수 있다. 그러나, 한 구현예에서 비뇨 생식로, 항문주위 부분, 항문관, 구강, 상부 호흡소화관 및 상피로부터의 스크레이프, 면봉채취 또는 생검을 포함하는 널리 알려져 있는 기법에 의해 수득한 샘플이 또한 본 발명의 샘플로서 포함된다. 세포-불포함액은 균질화와 같은 용해 기법 및/또는 여과 또는 원심분리와 같은 분리 기법에 의해 체액 또는 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 샘플은 본 발명의 바이러스 및/또는 바이러스 캡시드 폴리펩티드를 포함하는 것으로 알려져 있는 체액, 즉, 한 구현예에서 혈액, 혈장, 혈청, 타액 등으로부터 수득된다. 본 발명의 방법을 실행하기 위해 샘플이 추가로 가공될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 특히, 세포는 당업계에 알려져 있는 방법 및 수단에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 한 구현예에서, 샘플은 면역글로불린을 포함하는 샘플, 한 구현예에서 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "대상" 은 동물, 한 구현예에서 포유동물, 추가 구현예에서 영장류, 추가 구현예에서 인간에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 대상은 파보바이러스로 감염된 것으로 추측되는 대상이고; 따라서 한 구현예에서, 대상은 숙련자에게 알려져 있고 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 파보바이러스 감염의 하나 이상, 추가 구현예에서 둘 이상의 증상을 나타내는 대상이다. 그러나, 대상이 파보바이러스로 감염된 것으로 진단된 어린이의 친척, 가구원, 놀이 상대 및/또는 관리인인 것이 또한 예상된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "항체" 는 단일클론 항체, 둘 이상의 미손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 원하는 결합 활성을 나타내는 한) 을 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 한 구현예에서, 항체는 전장 (full-length) 항체 또는 항체 단편이다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린) 는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5 가지 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (동형) 로 더 나뉠 수 있다 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 면역글로불린의 상이한 부류의 아단위 구조 및 3 차원적 구성은 널리 알려져 있으며 일반적으로 예를 들어 Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co. (2000) 에 기재되어 있다. 항체는, 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "미손상 항체" 및 "전체 항체" 는 본원에서, 하기 정의한 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 미손상 형태인 항체를 나타내는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 특히, Fc 부위를 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다. "항체 단편" 은 한 구현예에서 그의 항원-결합 부위를 포함하는, 미손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자, 나노바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 2 개의 동일한 항원-결합 단편, 소위 "Fab" 단편 (각각 단일한 항원-결합 위치를 가짐) 및 잔여 "Fc" 단편 (이 명칭은 용이하게 결정화시키는 그의 능력을 반영하는 것임) 을 생성시킨다. 펩신 처리는 2 개의 항원-결합 위치를 갖고 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 산출해낸다. "Fv" 는 완전한 항원-결합 위치를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 한 구현예에서, 2-사슬 Fv 종류는 단단한, 비공유 결합으로의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종류에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 유연한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv 종류에서와 유사한 "이량체성" 구조로 결합될 수 있다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3 개 과가변부 (HVR) 가 상호작용하여 항원-결합 위치를 규정한다. 종합적으로, 6 개의 HVR 은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일한 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단 3 개의 HVR 을 포함하는 Fv 의 절반) 은, 전체 결합 위치보다 더 낮은 친화성에서도 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "디아바디" 는, 단편이 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 에서 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 를 포함하는, 2 개의 항원-결합 위치를 갖는 항체 단편을 나타낸다. 동일한 사슬에서 2 개의 도메인 사이의 페어링 (pairing) 을 허용하기에 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 강제적으로 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링되며 2 개의 항원-결합 위치를 생성시킨다. 디아바디는 2 가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Hollinger et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448 에서 보다 충분히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 에 기재되어 있다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 동종 항체 집단 (즉, 그 집단에 포함된 개별 항체가, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이 (예를 들어 자연 발생적 돌연변이) 를 제외하고는 동일함) 으로부터 수득된 항체를 나타낸다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 별개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 단일클론 항체는 통상 분석물에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 이때 분석물-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일한 분석물 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 방법은 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool) 과 같은 복수의 클론으로부터의 고유 클론 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열이 예를 들어, 표적에 대한 친화성 개선, 표적-결합 서열 인간화, 세포 배양물에서의 그의 생성 개선, 생체내 (in vivo) 면역원성 감소, 다중특이적 항체 생성 등을 위해 추가 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단일클론 항체라는 것이 이해되어야 한다. 상이한 결정자 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제조물과 반대로, 단일클론-항체 제조물의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일한 결정자에 대해 유도된다. 그의 특이성에 추가로, 단일클론-항체 제조물은 통상 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에 있어서 유리하다.
유리하게는, 본 발명의 근원적 작업에서, 알칼리 처리가 외피-비보유 바이러스 캡시드, 예를 들어 파보바이러스 캡시드가 분해되게 하여, 이들 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법에서의 신호 세기 증가를 초래한다는 것이 발견되었다. 더욱이, 대부분의 다른 폴리펩티드와 반대로, 캡시드 폴리펩티드는 강한 알칼리 처리 후에도 가용성으로 남아 있다. 따라서, 알칼리 전처리가 캡시드 폴리펩티드의 특정 신호를 증가시킨 것이 발견된 한편, 간섭 화합물의 신호는 감소되었다.
상기 제공된 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 하기에 적용된다. 하기 추가로 제공된 부가적 정의 및 설명 또한 필요한 부분만 약간 수정하여 이 명세서에 기재된 모든 구현예에 적용된다.
본 발명은 또한 샘플과 염기를 접촉시키는 것을 포함하는, 바이러스 검출을 위해 대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법에 관한 것이다.
대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법은 또한, 명백히 언급된 것들에 추가로 단계를 포함할 수 있다. 더욱이, 한 구현예에서 방법은 생체외 방법이다. 한 구현예에서, 검출할 바이러스는 상기 본원에 명시된 바와 같은, 외피-비보유 바이러스, 추가 구현예에서 파보비리데 과의 바이러스이다.
본 발명은 또한 염기, 및 1 개 이상, 한 구현예에서 2 개 이상의, 바이러스에 특이적으로 결합하는 화합물(들) 을 포함하는, 샘플에서의 바이러스를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "키트" 는 함께 패키징될 수 있거나 패키징되지 않을 수 있는 본 발명의 상술한 화합물, 수단 또는 시약의 모음을 나타낸다. 키트의 성분은 별개의 바이알 (즉, 별개 부분의 키트로서) 로 구성될 수 있거나, 특히 결합제는 단일 바이알로 제공된다. 더욱이, 본 발명의 키트가 상기 본원에 나타낸 방법을 실행하는데 사용될 것이 이해된다. 한 구현예에서, 모든 성분이 상기 나타낸 방법을 실행하기 위해 즉시 사용 가능 (ready-to-use) 방식으로 제공된다는 것이 예상된다. 또한 한 구현예에서, 키트는 상기 방법을 실행하기 위한 지시사항을 포함한다. 지시사항은 종이 또는 전자 형태로 사용자 매뉴얼에 의해 제공될 수 있다. 또한, 매뉴얼은 본 발명의 키트를 사용하여 상술한 방법을 실행하는 경우 수득한 결과를 해석하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 키트는 2 개 이상의 결합 화합물을 포함하는데, 이때 1 개 이상의 결합 화합물은 포획 화합물이고, 1 개 이상의 결합 화합물은 검출 화합물이다. 한 구현예에서, 키트에 포함된 1 개 이상의 포획 화합물은 비오틴 표지를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트에 포함된 1 개 이상의 검출 화합물은 루테늄 표지를 포함한다. 또한 한 구현예에서, 키트는 중화 수단, 예를 들어 완충제를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 검출할 바이러스는 상기 본원에서 명시된 바와 같은, 외피-비보유 바이러스, 추가 구현예에서 파보비리데 과의 바이러스이다.
또한, 본 발명은 외피-비보유 바이러스를 검출하기 위한 면역검정에서 사용하기 위해 대상의 샘플을 전처리하기 위한 염기의 용도에 관한 것이며; 본 발명은 면역검정에 의해 대상의 샘플에서 외피-비보유 바이러스를 검출하기 위한 염기의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 방법에 관한 것이다:
a1) 상기 결합 화합물을 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
a2) 단계 a1) 의 상기 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
b1) 상기 결합 화합물을 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 및 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
b2) 단계 b1) 의 상기 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
c) 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합을 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합과 비교하는 단계, 및
d) 단계 c) 의 비교를 기반으로 하여, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, (i) 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 방법에 관한 것이다:
a1) 상기 결합 화합물을 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
a2) 단계 a1) 의 상기 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
b1) 상기 결합 화합물을 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 및 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
b2) 단계 b1) 의 상기 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
c) 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합을 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합과 비교하는 단계, 및
d) 단계 c) 의 비교를 기반으로 하여, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 단계.
한 구현예에서, 본 발명의 결합 화합물을 식별하는 방법은 생체외 방법이다. 더욱이, 이들은 상기 명백히 언급된 것들에 추가로 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예컨대 캡시드 폴리펩티드에 결합하는 결합 화합물을 초기에 식별하거나; 캡시드 폴리펩티드 및 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드를 제공하는 것에 관한 것일 수 있다. 또한, 상기 단계 중 하나 이상은 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 캡시드 폴리펩티드는 상기 본원에서 명시된 바와 같은, 외피-비보유 바이러스, 추가 구현예에서 파보비리데 과 바이러스의 캡시드 폴리펩티드이다. 따라서 한 구현예에서, 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 및/또는 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 것은 본질적으로 상기 본원의 상세한 설명 및 실시예에 따라 수행된다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 본 발명의 결합 화합물을 식별하는 방법은 본질적으로, 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드가 결합 화합물에 대한 결합에 있어서 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드와 경쟁하는 경쟁 검정이다. 따라서, 알칼리 처리 및 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드는 한 구현예에서, 알칼리 처리를 제외하고는 동일하다.
따라서, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하기 위한 상기 방법에서, 결합 화합물은, 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합이 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합과 크게 상이하지 않다면, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 식별된다. 그러나 결합 화합물은, 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합이 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합보다 크게 더 높다면, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 식별된다. 추가 구현예에서 상기 결합 화합물의 결합은, 잠재적 결합 화합물/캡시드 폴리펩티드 복합체와, 화합물 부류를 일반적으로 인지하는 화합물을 접촉시킴으로써 검출되고, 상기 결합 화합물은 예를 들어 항-마우스 항체로부터의 것이다.
상응하게, (i) 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 상기 방법에서, 결합 화합물은, 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합이 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합과 크게 상이하지 않다면, 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 식별된다. 그러나 결합 화합물은, 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합이 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합보다 크게 더 높다면, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 식별된다. 추가 구현예에서 상기 결합 화합물의 결합은, 잠재적 결합 화합물/캡시드 폴리펩티드 복합체와, 화합물 부류를 일반적으로 인지하는 화합물을 접촉시킴으로써 검출되고, 상기 결합 화합물은 예를 들어 항-마우스 항체로부터의 것이다.
상기로부터 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 결합 화합물을 식별하는 두 방법 모두는 알칼리-처리 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 모두에 결합하는 결합 화합물을 식별하는데 적합하다. 숙련자에 의해 또한 이해될 바와 같이, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 결합하는 결합 화합물이 식별될 경우, 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드가 또한 결합하는지 여부에 대한 지식은 필요하지 않으며, 단계 b1) ~ c) 는 상기 명시된 바와 같은 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 방법으로부터 생략될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 결합하는, 한 구현예에서 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 방법에 관한 것이다:
a1) 상기 결합 화합물을 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
a2) 단계 a1) 의 상기 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계, 및
b) 단계 a2) 에서의 결합 검출을 기반으로 하여, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 결합하는 결합 화합물을 식별하는 단계.
더욱이, 본 발명은 또한, 샘플 처리 유닛을 갖는 분석 유닛을 포함하는, 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치에 관한 것으로서, 상기 분석 유닛은 하기 단계 수행이 초래되도록 조정된다:
(a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용한 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
한 구현예에서, 분석 유닛의 샘플 처리 유닛은 컨트롤러 유닛에 연결되고, 상기 컨트롤러 유닛은 상기 명시한 바와 같은 단계 수행이 유도되도록 조정된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "장치" 는 검출 결과가 수득되도록 서로 작동가능하게 연결된 적어도 상술한 수단을 포함하는 수단의 시스템에 관한 것이다. 샘플과 염기를 접촉시키고 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 바람직한 수단이 본 발명의 방법과 관련되어 상기에 개시된다. 작동 방식에 있어서 수단을 어떻게 연결시키는지는 장치에 포함된 수단의 유형에 따라 좌우될 것이다. 한 구현예에서, 수단은 단일한 장치로 구성된다.
한 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 샘플용 용기 (receptacle) 를 포함한다. 용기는 샘플과 직접 접촉할 수 있거나, 샘플을 받는 추가 수단에 대한 용기일 수 있는데, 이때 추가 수단은 예를 들어 샘플 또는 다수의 샘플을 적용할 수 있는 멀티-웰 플레이트일 수 있다. 또한, 한 구현예에서 샘플 처리 유닛은 예를 들어 건조 형태로, 또는 투여 수단에 연결된 저장소, 예를 들어 펌프에 연결된 튜빙 (tubing) 내에 염기를 포함한다. 임의로는, 샘플 처리 유닛은 샘플을 상기 염기에 접촉시킨 후 샘플 중 pH 를 감소시키는 중화 수단을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 예를 들어 건조 형태로, 또는 투여 수단에 연결된 저장소, 예를 들어 펌프에 연결된 튜빙 내에 하나 이상의 검출 화합물을 포함한다. 추가 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 혼합 수단 및 반응 혼합물의 온도 조정 수단을 포함한다.
한 구현예에서, 검출 결과는 사용자에 의한 육안 검사에 의해 또는 적절한 장치에서의 검출 측정 수행에 의해 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 장치의 분석 유닛은 본 발명의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한, 한 구현예에서 본 발명의 캡시드 폴리펩티드의 양을 검출하기 위한 검출 유닛을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 검출 유닛으로서 적합한 수단은 숙련자에게 알려져 있으며 예를 들어 광도계 장치를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 장치는 검출 유닛에 연결된 데이터 출력 유닛을 추가로 포함한다. 한 구현예에서 데이터 출력 유닛은 검출 유닛에 의해 수득된 출력 데이터에 대해 조정된다. 적합한 데이터 출력 유닛은 숙련자에게 알려져 있으며 단순 출력 유닛 예컨대 표시 램프 (indicator lamp) 또는 캡시드 폴리펩티드가 검출 역치를 넘어 검출되었음을 표시하는 디스플레이를 포함한다. 그러나 출력 유닛은 또한 평가 장치에 대한 인터페이스일 수 있으며, 이때 상기 인터페이스는 예를 들어 케이블 연결 예컨대 USB, 와이어리스 연결 예컨대 와이어리스 LAN, 블루투스 등, 또는 간접 연결 예컨대 인스턴트 메세징 (instant messaging), 이메일 등에 의한 데이터 전송을 포함하는, 임의 종류의 데이터 전송 수단일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 장치는 분석 시스템의 일부이며, 상기 분석 시스템은 평가 장치를 추가로 포함한다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 평가 장치는 본 발명의 장치, 예를 들어 평가 유닛과 동일한 하우징에 포함될 수 있거나, 별개의 장치일 수 있다. 한 구현예에서, 평가 장치는 본 발명의 장치의 출력 유닛으로부터 출력 데이터를 받고 상기 출력 데이터의 평가를 제공하는 논리 연산을 수행하도록 프로그래밍된 마이크로프로세서를 포함한다. 출력 데이터의 평가는, 예를 들어, 하나 이상의 제어 검출 반응, 통계적 계산, 예를 들어 둘 이상의 병렬 검출 반응의 계산 수단에서 측정한 값에 대해 데이터를 교정하고, 희석 인자에 대해 데이터를 교정하고, 출력 데이터를 참조 값과 비교하고, 목록에서 데이터를 컴파일링하는 것 등을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 평가 장치는 데이터 저장 유닛을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 데이터 저장 유닛은 예를 들어 참조 값 데이터베이스에서의 참조 값을 포함한다. 더욱이, 한 구현예에서 데이터 저장 유닛은 상기 명시한 바와 같은 본 발명의 장치로부터 받은 출력 데이터를 저장하도록 조정된다.
한 구현예에서, 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 자동적으로 검출하기 위한 수단이 적용되는 경우, 상기 자동적으로 작동하는 수단에 의해 수득한 데이터는 진단 (즉, 외피-비보유 바이러스로 감염된 대상을 식별함) 을 확립하기 위해 예를 들어 컴퓨터 프로그램에 의해 프로세싱될 수 있다. 검출을 위한 통상적 수단은 상기 본 발명의 방법에 관한 구현예와 관련하여 개시된다. 이러한 경우, 시스템 사용자가 지시사항 및 매뉴얼에 제공된 설명에 기인하여 양 및 그의 진단값 측정 결과를 종합한다는 점에 있어서, 수단은 작동적으로 연결된다. 당업자는 추가의 발명적 기술 없이 수단을 어떻게 연결시킬지를 알아차릴 것이다. 통상적인 장치는 전문 임상의의 특별한 지식 없이 적용될 수 있는 것들, 예를 들어, 단지 샘플 로딩을 필요로 하는 전자 장치 또는 시험 스트립이다. 결과는, 바람직하게는 절대량 또는 상대량으로서 매개변수적 진단 미가공 데이터의 출력으로서 제공될 수 있다. 이들 데이터는 임상의에 의한 설명을 필요로 할 것임이 이해된다. 그러나, 출력이 프로세싱된 진단 미가공 데이터를 포함하며 그의 설명이 전문 임상의를 필요로 하지 않는 전문가 시스템 장치가 또한 예상된다. 장치의 추가 구현예는 본 발명의 방법에 따라 상기 나타낸 분석 유닛/장치 (예를 들어, 바이오센서, 어레이, 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 리간드에 연결된 고체 지지체, 플라스몬 표면 공명 장치, NMR 분광계, 질량-분광계 등) 또는 평가 유닛/장치를 포함한다.
본 발명은, 프로그램이 분석 장치, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행될 때 본원에 포함된 하나 이상의 구현예에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 지시사항을 포함하는 컴퓨터 프로그램을 추가로 개시 및 제시한다. 특히, 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터-판독가능 데이터 운반체에 저장될 수 있다. 따라서, 특히 상기 나타낸 바와 같은 방법 단계 중 하나, 하나 초과 또는 모두는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여, 바람직하게는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은, 프로그램이 분석 장치, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행될 때 본원에 포함된 하나 이상의 구현예에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한, 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 개시 및 제시한다. 특히, 프로그램 코드 수단은 컴퓨터-판독가능 데이터 운반체에 저장될 수 있다.
또한, 본 발명은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크, 예컨대 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 워킹 메모리 또는 메인 메모리에 로딩한 후, 본원에 개시된 하나 이상의 구현예에 따라 방법을 실행할 수 있는, 저장된 데이터 구조를 갖는 데이터 운반체를 개시 및 제시한다.
본 발명은, 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행될 때 본원에 개시된 하나 이상의 구현예에 따라 방법을 수행하기 위한, 기기-판독가능 운반체에 저장된 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 제시 및 개시한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 컴퓨터 프로그램 제품은 거래가능 제품으로서의 프로그램을 나타낸다. 제품은 일반적으로 임의적 포맷, 예컨대 종이 포맷으로, 또는 컴퓨터-판독가능 데이터 운반체에 존재할 수 있다. 특히, 컴퓨터 프로그램 제품은 데이터 네트워크에 분포될 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 구현예에 따라 방법을 수행하기 위한, 컴퓨터 시스템 또는 컴퓨터 네트워크에 의해 판독가능한 지시사항을 포함하는 조절된 데이터 신호를 제시 및 개시한다.
바람직하게는, 본 발명의 컴퓨터-실행 측면을 참조하여, 본원에 개시된 하나 이상의 구현예에 따른 방법의 하나 이상의 방법 단계 또는 모든 방법 단계는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서 일반적으로, 데이터의 제공 및/또는 조작을 포함하는 임의의 방법 단계는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법 단계는 샘플 제공 및/또는 실제 측정 수행의 특정 측면과 같은 통상 손으로 하는 작업을 필요로 하는 방법 단계를 제외하고, 임의의 방법 단계를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명은 하기를 추가로 개시한다:
- 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하도록 조정되는 하나 이상의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크,
- 데이터 구조를 컴퓨터에서 실행하면서, 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하도록 조정된, 컴퓨터 로딩가능 데이터 구조,
- 프로그램을 컴퓨터에서 실행하면서, 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하도록 조정된, 컴퓨터 프로그램,
- 컴퓨터 프로그램을 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행하면서, 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하기 위한 프로그램 수단을 포함하는, 컴퓨터 프로그램 ,
- 프로그램 수단이 컴퓨터에 판독가능한 저장 매체에 저장되는, 선행 구현예에 따른 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램,
- 데이터 구조가 저장 매체에 저장되고 데이터 구조가 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 메인 및/또는 작업 저장소에 로딩된 후 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하도록 조정된, 저장 매체, 및
- 프로그램 코드 수단이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크에서 실행되는 경우, 본 설명에서 기재된 구현예 중 하나에 따라 방법을 수행하기 위한, 프로그램 코드 수단이 저장 매체에 저장될 수 있거나 저장되는, 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품.
또한, 본 발명은 외피-비보유 바이러스를 갖는 대상의 감염을 진단하기 위한 장치, 키트 또는 조성물의 제조를 위한 염기의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 발견을 요약하자면, 하기 구현예가 바람직하다:
1. 하기 단계를 포함하는, 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법:
(a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
2. 구현예 1 에 있어서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것이 포획 화합물에 의해, 한 구현예에서 포획 항체에 의해 고체 표면에 하나 이상의 캡시드 폴리펩티드를 포획하는 것을 포함하는, 검출 방법.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 상기 캡시드 폴리펩티드와 검출 화합물, 한 구현예에서 검출 항체와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 검출 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 항체 및/또는 상기 검출 항체가 단일클론 항체인, 검출 방법.
5. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 화합물 및/또는 검출 화합물이 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물인, 검출 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스를 검출하는 것이 샌드위치 면역검정에서 상기 바이러스를 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 대변 샘플 또는 체액 샘플, 한 구현예에서 대변, 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인, 검출 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 면역글로불린을 포함하는 샘플, 한 구현예에서 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인, 검출 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기가 브뢴스테드-로우리 염기, 한 구현예에서 수용액 중 수산화물 이온을 포함하거나 생성시키는 화합물, 추가 구현예에서 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물인, 검출 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기가 최대 4, 한 구현예에서 최대 3, 추가 구현예에서 최대 2 의 pKB 값을 갖는, 검출 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기가 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인, 검출 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것이 pH 10.5 이상, 한 구현예에서 pH 11 이상, 추가 구현예에서 pH 11.5 이상, 추가 구현예에서 pH 11.7 이상에서 상기 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것이 2 분 이상, 한 구현예에서 5 분 이상, 추가 구현예에서 9 분 이상 동안 상기 염기의 존재 하에 상기 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것이 10℃ 내지 50℃, 한 구현예에서 20℃ 내지 45℃, 추가 구현예에서 30℃ 내지 40℃, 추가 구현예에서 37±3℃ 의 온도에서 상기 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 단계 b) 에서 상기 바이러스를 검출하기 전에 상기 염기를 중화시키는 추가 단계를 포함하는, 검출 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것이 상기 바이러스의 캡시드에 존재하는 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하고, 한 구현예에서 바이러스 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 폴리펩티드 중 하나 이상을 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 상기 바이러스와 결합 폴리펩티드를 접촉시키기 전 또는 접촉시키면서 상기 염기를 중화시키는 추가 단계를 포함하는, 검출 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 변성된 폴리펩티드가, 상기 염기를 중화시키는 상기 추가 단계 후 샘플로부터 제거되지 않는, 검출 방법.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스를 검출하는 것이 비-크기 차별 검출 방법으로 수행되는, 검출 방법.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 외피-비보유 바이러스가 파보비리데 과의 바이러스, 추가 구현예에서 파보비리네 아과의 바이러스인, 검출 방법.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 외피-비보유 바이러스가 에리트로파보바이러스 속의 바이러스인, 검출 방법.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 외피-비보유 바이러스가 영장류 에리트로파보바이러스 1 (파보바이러스 B19) 인, 검출 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상이 포유동물, 한 구현예에서 영장류, 추가 구현예에서 인간인, 검출 방법.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상이 외피-비보유 바이러스, 추가 구현예에서 파보비리데 과의 바이러스로 감염된 것으로 추측되는 대상인, 검출 방법.
25. 샘플과 염기를 접촉시키는 것을 포함하는, 외피-비보유 바이러스 검출을 위해 대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법.
26. 염기 및 하나 이상, 한 구현예에서 둘 이상의, 상기 바이러스에 특이적으로 결합하는 결합 화합물(들) 을 포함하는, 샘플에서의 외피-비보유 바이러스 검출을 위한 키트.
27. 구현예 26 에 있어서, 상기 결합 화합물 중 둘 이상을 포함하고, 하나 이상의 결합 화합물이 포획 화합물이며, 하나 이상의 결합 화합물이 검출 화합물인, 키트.
28. 구현예 27 에 있어서, 상기 하나 이상의 포획 화합물이 비오틴 표지를 포함하는, 키트.
29. 구현예 27 또는 28 에 있어서, 상기 하나 이상의 검출 화합물이 루테늄 표지를 포함하는, 키트.
30. 구현예 26 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 결합 화합물이 항체, 한 구현예에서 단일클론 항체인, 키트.
31. 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 화합물 중 하나 이상 및 상기 검출 화합물 중 하나 이상이 항체, 한 구현예에서 단일클론 항체인, 키트.
32. 외피-비보유 바이러스를 검출하기 위한 면역검정에서 사용하기 위해 대상의 샘플을 전처리하기 위한 염기의 용도.
33. 면역검정에 의해 대상의 샘플에서 외피-비보유 바이러스를 검출하기 위한 염기의 용도.
34. 하기 단계를 포함하는, (i) 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물의 식별 방법:
a1) 상기 결합 화합물을 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
a2) 단계 a1) 의 상기 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
b1) 상기 결합 화합물을 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드 및 알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 접촉시키는 단계,
b2) 단계 b1) 의 상기 비-알칼리 처리 캡시드 폴리펩티드에 대한 상기 결합 화합물의 결합을 검출하는 단계,
c) 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합을 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합과 비교하는 단계, 및
d) 단계 c) 의 비교를 기반으로 하여, (i) 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 식별하는 단계.
35. 구현예 34 에 있어서, 단계 a2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합이 단계 b2) 에서의 상기 결합 화합물의 결합보다 크게 더 높다면, (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물이 식별되는, 식별 방법.
36. 샘플 처리 유닛을 갖는 분석 유닛을 포함하는, 샘플에서 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치로서, 상기 분석 유닛이 하기 단계 수행이 초래되도록 조정되는, 분석 장치:
(a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용한 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
37. 샘플 처리 유닛을 갖는 분석 유닛을 포함하는, 샘플에서 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치로서, 상기 분석 유닛이 컨트롤러 유닛에 연결되고, 상기 컨트롤러 유닛이 하기 단계 수행이 유도되도록 조정되는, 분석 장치:
(a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용한 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
38. 구현예 36 또는 37 의 분석 장치, 및 평가 장치를 포함하는 분석 시스템.
본 발명의 추가 선택적 특질 및 구현예를, 바람직하게는 독립 청구항과 함께 바람직한 구현예의 후속 설명에서 보다 상세히 개시할 것이다. 여기서, 각각의 선택적 특질은 숙련자가 인지할 바와 같이, 어떠한 임의적 실현가능한 조합에서 뿐 아니라 분리된 방식에서 실현될 수 있다. 본 발명의 범주는 바람직한 구현예에 의해 제한되지 않는다. 구현예의 측면은 도면에서 모식적으로 묘사된다.
도면에서:
도 1 은 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 비오티닐화 바이러스 유사 입자를 인지하는 항체를 스크리닝하는 원리를 보여준다. A) 사전-스크리닝; B) 사전-스크리닝 후, 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드를 인지하는 항체의 결합; C) 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드만을 인지하는 항체의 결합. (1): 비오티닐화 바이러스-유사 입자, (3): 루테닐화 항-마우스 검출 항체, (2): 후보 항체 (결합 화합물), (4) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드.
실시예
실시예 1
단일클론 항-파보바이러스 B19 캡시드 항체의 생성
a) 마우스의 면역화
NMRI 마우스를, CFA (완전 프로인트 아쥬반트 (Complete Freund's Adjuvant)) 로 제형화한 100 μg 재조합 B19 바이러스-유사 입자 (VLP) (Diarect, Freiburg, Germany) 로 복강내 초기 면역화시켰다. 면역화에 사용한 재조합 B19 VLP 는 B19 캡시드 단백질 VLP1 및 VLP2 로 구성되었다. 2 개의 추가 복강내 면역화 단계가, IFA (불완전 프로인트 아쥬반트 (Incomplete Freund's Adjuvant)) 와 혼합된 마우스 당 100 μg B19 VLP 를 적용하여, 6 주 및 10 주 후 이어졌다. 이후, 동물을 희생시키기 3 및 2 일 전에 50 μg B19 VLP 를 i.v. 투여하여 마우스를 부스트하고, 비장 세포를 단리하고 융합에 사용하였다.
b) 융합 및 클로닝
골수종 세포와의 비장 세포의 융합을 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 표준 절차에 의해 수행하였다. 간략하게, 대략 1 x 108 개 비장세포를 대략 2 x 107 개 골수종 세포 (P3x63-Ag8.653) 와 RPMI-1640 에서 혼합하고, 원심분리하였다 (10 분, 250 x g). 세포를 RPMI-1640 으로 1 회 세척하고 다시 원심분리하였다. 이후, 1 ㎖ 의 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 를 세포 펠렛에 첨가하고 피펫팅에 의해 혼합하였다. 37℃ 에서 수조에서 1 분 후, 5 ㎖ 의 RPMI-1640 을 적가하고, 현탁액을 혼합하고, RPMI-1640 으로 30 ㎖ 로 채우고 원심분리하였다 (10 분, 180 x g). 세포를 선택 배지 (10% FCS, 100 U/㎖ IL-6, 2 mM L-글루타민, 100 μM NEAA, 1 mM 나트륨 피루베이트, 24 μM 2-머캅토에탄올, 1x 아자세린 / 히폭산틴 (Sigma-Aldrich) 이 보충된 RPMI-1640) 에 재현탁하였다. 37℃ 에서 배양 24 시간 후, 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 대략 10 일 후, 1 차 배양물을 특정 항체 (하기 기재한 바와 같음) 의 생성에 대해 검정하였다. 선택된 1 차 배양물을 유세포 분석기 (FACSAria, BD Biosciences) 를 사용하여 단일 세포 분류에 의해 클로닝하였다. 세포 클론을 10% FCS, 50 U/㎖ IL-6, 2 mM L-글루타민, 100 μM NEAA, 1 mM 나트륨 피루베이트 및 24 μM 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 에서 성장시켰다. 확립된 단일클론 하이브리도마 세포주를 하기 기재한 바와 같이 특이성에 대해 재시험하였다.
c) B19 VLP 에 결합하는 항체에 대한 스크리닝 (ELISA)
하이브리도마 세포의 배양 상청액에서의 항체 특이성 측정을 위해, 재조합 스트렙타비딘으로 사전-코팅된 96-웰 플레이트 (MicroCoat, Bernried, Germany) 를 1 시간 동안 실온 (RT) 에서 300 ng/㎖ 의 비오티닐화 B19 VLP 로 코팅하였다. 이후, 플레이트를 0.9% NaCl / 0.05% Tween-20® 으로 세척하였다. 세척 후 검정할 100 ㎕/웰의 항체 용액 (배양 상청액) 을 첨가하고 1 시간 동안 RT 에서 인큐베이션하였다. 0.9% NaCl / 0.05% Tween-20® 으로 세척한 후, 결합한 샘플 항체 검출을 위해 다클론 양 항-마우스 (sheep anti-mouse) Fcγ 항체 (100 ng/㎖) 의 서양고추냉이 퍼옥시다아제-표지 F(ab')2 단편 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 1 시간 동안 RT 에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 상기 기재한 바와 같이 세척하였다. 마지막으로, 100 ㎕/웰의 ABTS® (Roche) 를 첨가하였다. RT 에서 30 분 인큐베이션한 후, 405 nm 및 492 nm 에서 소멸을 측정하였다.
이러한 스크리닝은, ELISA 에서 B19 VLP 에 결합하는 항체의 선택을 이끌어내었다. 이러한 항체 선택을 하기 기재한 검정에서 추가로 특징지었다.
d) B19 VLP 에 결합하는 항체에 대한 스크리닝 ( Elecsys )
알칼리 조건 하 샘플의 인큐베이션은 바이러스 캡시드의 해리 및 캡시드 단백질의 적어도 부분적인 언폴딩 (unfolding) 을 초래한다. 따라서 검정에 적합한 항체는 바람직하게는 항원의 선형 및 비구조적 에피토프에 대하여 유도된다 (도 1A 참조). 첫 번째 실행에서, 비오티닐화 바이러스 유사 입자 (1) 및 루테닐화 항-마우스 검출 항체 (3) 를 포함하는 항체 스크리닝 검정을 사용하여 후보 항체 (2) 를 스크리닝하였다.
두 번째 실행에서 적합한 후보를, 알칼리 조건 하에 사전-인큐베이션한 바이러스 유사 입자 (4) 를 검출하는 능력에 대해 시험하였다 (도 1B 및 C). 이들 실험에서, 자유 NaOH- 또는 HCl-전처리 바이러스 유사 입자는 고체상에 결합하는 비오티닐화 비처리 바이러스 유사 입자와 경쟁한다. 검정 설계에 적합한 항체는 두 항원 모두에 결합해야 하는 한편 (신호 감소 초래) (도 1B), 형태-특이적 항체는 영향받지 않아야 한다 (도 1C).
표 1: 적합한 단일클론 항-파보바이러스 B19 캡시드 항체의 선택
Figure 112018014587895-pct00001
표 1 에서와 같이, 자연적 VLP 가 조사할 항체에 대한 결합을 위해 고체상-결합 VLP 와 효과적으로 경쟁한다면, 신호 감소에 대한 결과는 100% "신호 감소" 로 설정된다. 항체 2.053 을 고려하여, 자연적 VLP 가 고체상 결합 VLP 를 완전히 대체한다는 것을 볼 수 있다 (100% 신호 감소). 한편, 변성된 VLP (1.4 M NaOH 로 처리) 가 항체 2.053 에 대한 결합을 위해 자연적 고체상 결합 VLP 와 경쟁하는 경우, 신호는 단지 57% 로 감소한다. 이것은, 이 항체에 대해, 변성된 VLP 가 자연적 VLP 와 완전히 경쟁하지 않는다는 것을 의미한다. 즉, 항체 2.053 은 변성된 VLP 를 효과적으로 인지하지 않거나 변성된 VLP 를 작은 정도로만 인지하며, 따라서 NaOH 로의 전처리 후 바이러스 항원 검출 검정에서 결합 성분으로서 덜 적합하다. 반대로, 예를 들어 항체 2.061 은, NaOH-변성된 VLP 가 항체 2.061 에 대한 결합을 위해 자연적 VLP 와 완전히 (100%) 경쟁할 수 있기 때문에, 효과적 방식으로 VLP 의 변이체 모두에 결합한다.
이들 결과로부터, 항체 2.061, 2.068, 2.081 및 2.106 (및 더 낮은 정도로 2.111 및 2.127) 이 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 결합하는 항체로서 식별되었다.
e) 선택된 항-B19 단일클론 항체의 중간 규모 생산
상응하는 하이브리도마를 CellLine 생물반응기 (Integra) 에 시딩하여, 선택된 mAb 를 생산시켰다. 생물반응기의 제조사의 지시사항에 따라 생산을 수행하였다.
실시예 2
단일클론 항체에 대한 비오틴 및 루테늄 모이어티의 연결 (coupling)
선택된 클론으로부터의 세포-배양물 상청액을 하기 3 단계 크로마토그래피 절차: 먼저, 단백질 A 에 대한 친화성 크로마토그래피, 그런 다음 이온-교환 크로마토그래피 및 마지막으로 미량의 소 IgG 를 제거하기 위한 음-친화성 크로마토그래피에 따라 정제하였고, 대안적으로, 크기-배제 크로마토그래피를 적용함으로써 폴리싱 (polishing) 단계를 수행하였다.
융합 폴리펩티드의 리신 ε-아미노 기를, 5-30 mg/㎖ 의 단백질 농도에서 각각 N-히드록시-숙신이미드 활성화 비오틴 및 루테늄 표지 분자로 개질하였다. 표지/단백질 비는 각각의 항체에 따라 2:1 내지 10:1 (mol:mol) 로 가변적이었다. 반응 완충제는 50 mM 인산칼륨 pH 8.4, 150 mM KCl 이었다. 반응을 실온에서 15 분 동안 실행하고, 완충 L-리신을 최종 농도 10 mM 로 첨가하여 중단시켰다. 표지의 가수분해적 불활성화를 방지하기 위해, 각각의 저장 용액을 건조 DMSO (Sigma-Aldrich, Germany) 중에서 제조하였다. 반응 완충액 중 5% 까지의 DMSO 농도는 연구한 모든 융합 단백질에 의해 용인되었다. 연결 반응 후, 겔 여과 컬럼 (예를 들어: Superdex 200 HiLoad) 에 걸쳐 미정제 단백질 컨쥬게이트를 통과시켜, 미반응 자유 표지를 제거하였다.
실시예 3
알칼리 전처리를 통한 파보바이러스 B19 검출 검정의 감수성 증가
파보바이러스 B19 검정의 감수성을 자동화 Elecsys® 2010 및 cobas e 411 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 평가하였다. Elecsys® 는 Roche 그룹의 등록 상표이다. 샘플 사전인큐베이션을 갖는 이중 항체 샌드위치 포맷에서 측정을 실행하였다.
Elecsys® 2010 및 cobas e 411 에서의 신호 검출은 전자화학발광을 기반으로 한다. 비오틴-컨쥬게이트 (즉, 포획-항체) 는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드의 표면에 고정되는 한편, 검출-항체는 신호전달 모이어티로서 착물화 루테늄 양이온 (산화환원 상태 2+ 및 3+ 사이의 스위칭) 을 갖는다. 특정 분석물의 존재 하에, 발색성 루테늄 복합체는 고체상에 브릿지연결되고, 백금 전극에서 여기 후 620 nm 에서 발광한다. 신호 출력은 상대적 광 단위이다.
가변적 pH 로의 샘플 사전인큐베이션의 효과를 2 가지 성분 전처리에 의해 평가하였다. 성분 1 (PT1) 은 상이한 농도로 HCl 또는 NaOH, 또는 대조군으로서 등장성 NaCl 을 함유하고, 성분 2 (PT2) 는 세제 및 환원제를 함유한다. 성분 2 는 가변적이지 않다. 9 분 사전인큐베이션 후 시약 완충제 (200 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.01% 메틸이소티아졸리논, 0.20% Tween20, 0.30% 소 혈청 알부민, pH 6.8) 및 비오티닐화 및 루테닐화 항체를 첨가한다. 알칼리 조건 하 사전인큐베이션 (시약 3 ~ 5) 은, 각각의 샘플 (#2-7) 에서의 산성 전처리와 비슷하거나 우수한 대조군 실험 (시약 1) 과 비교하여 신호 증가를 초래하였다. 또한, 불특정 교차-간섭 샘플 (#8) 신호는 시약 3 ~ 5 에서 백그라운드 (샘플 #1) 로 감소하는 한편, 산성 사전인큐베이션은 불특정 상호작용으로부터의 신호를 줄이지 않는다. 알칼리 사전인큐베이션의 긍정적 효과가 pH > 10.5 (시약 3-5) 에 대해 가시적인 한편, 더 낮은 사전인큐베이션 pH (시약 6) 는 신호 증가 및 불특정 신호의 억제를 초래하지 않는다.
표 2: 알칼리 전처리를 통한 파보바이러스 B19 검출 검정의 감수성 증가
Figure 112018014587895-pct00002
* 음성 샘플은 신호 대 백그라운드 계산을 위한 백그라운드로서 정의됨.
표 2 (계속)
Figure 112018014587895-pct00003
* 음성 샘플은 신호 대 백그라운드 계산을 위한 백그라운드로서 정의됨.

Claims (16)

  1. 하기 단계를 포함하는, 대상으로부터의 샘플에서의 외피-비보유 바이러스 (non-enveloped virus) 의 캡시드 폴리펩티드의 검출 방법:
    (a) 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것이 포획 화합물 (capture compound) 에 의해 고체 표면에 하나 이상의 캡시드 폴리펩티드를 포획하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 캡시드 폴리펩티드와 검출 화합물 (detector compound) 을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 검출 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 포획 화합물이 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물인, 검출 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 검출 화합물이 (i) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 또는 (ii) 알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물인, 검출 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것이 샌드위치 면역검정에서 상기 바이러스를 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 대변 샘플 또는 체액 샘플인, 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인, 검출 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것이 상기 샘플을 pH 10.5 이상에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플과 염기를 접촉시키는 것이 상기 샘플을 상기 염기의 존재 하에 2 분 이상 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 것이 바이러스 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 폴리펩티드 중 하나 이상을 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피-비보유 바이러스가 파보비리데 과 (family Parvoviridae) 의 바이러스인, 검출 방법.
  13. 샘플과 염기를 접촉시키는 것을 포함하는, 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드의 검출을 위해 대상으로부터의 샘플을 전처리하는 방법.
  14. 염기, 및 외피-비보유 바이러스에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 화합물을 포함하는, 샘플에서의 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트.
  15. 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 면역검정에서 사용하기 위해 대상의 샘플을 전처리하는데 사용되거나; 면역검정에 의해 대상의 샘플에서 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는데 사용되는 염기를 포함하는 키트.
  16. 샘플 처리 유닛을 갖는 분석 유닛을 포함하는, 샘플에서의 외피-비보유 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치로서, 상기 분석 유닛이 하기 단계 수행이 초래되도록 조정되는 분석 장치:
    (a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용한 샘플과 염기를 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 샘플에서 상기 바이러스의 캡시드 폴리펩티드를 검출하는 단계.
KR1020187004098A 2015-08-11 2016-08-11 면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리 KR101978102B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15180536.3A EP3130922A1 (en) 2015-08-11 2015-08-11 Alkaline pretreatment of parvoviruses for immunoassays
EP15180536.3 2015-08-11
PCT/EP2016/069150 WO2017025603A1 (en) 2015-08-11 2016-08-11 Alkaline pretreatment of parvoviruses for immunoassays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180030629A KR20180030629A (ko) 2018-03-23
KR101978102B1 true KR101978102B1 (ko) 2019-05-13

Family

ID=53879365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187004098A KR101978102B1 (ko) 2015-08-11 2016-08-11 면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20180164314A1 (ko)
EP (2) EP3130922A1 (ko)
JP (1) JP6491794B2 (ko)
KR (1) KR101978102B1 (ko)
CN (1) CN107850597B (ko)
BR (1) BR112018000689A2 (ko)
ES (1) ES2742875T3 (ko)
WO (1) WO2017025603A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001343388A (ja) 2000-06-05 2001-12-14 Fujirebio Inc ヒトパルボウイルスｂ１９抗原の免疫測定方法
JP2007278902A (ja) 2006-04-07 2007-10-25 Abbott Japan Co Ltd パルボウイルスｂ１９抗原測定方法
WO2008072216A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Biotrin Intellectual Properties Limited A method for detecting human parvovirus antigen
JP2011112631A (ja) 2009-11-30 2011-06-09 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白検出のための試料の前処理方法及び前処理用試薬キット
WO2014032990A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Qiagen Gmbh Method of determining the presence or absence of a target nucleic acid in a cell sample

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02219591A (ja) * 1989-02-21 1990-09-03 Kanebo Ltd 抗ヒトパピローマウイルスモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ並びに該抗体の製造方法
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3615675B2 (ja) * 1999-07-23 2005-02-02 明治乳業株式会社 アデノウイルス抗原の検出方法
CN103900894A (zh) * 2008-06-06 2014-07-02 华盛顿大学 用于从溶液浓缩颗粒的方法和系统
CN102081018A (zh) * 2009-11-30 2011-06-01 希森美康株式会社 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法
US20110151435A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Abaxis, Inc. Novel assays for detecting analytes in samples and kits and compositions related thereto
CN102181550B (zh) * 2011-04-18 2014-07-09 深圳康美生物科技股份有限公司 一种检测多种病原微生物的方法和试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001343388A (ja) 2000-06-05 2001-12-14 Fujirebio Inc ヒトパルボウイルスｂ１９抗原の免疫測定方法
JP2007278902A (ja) 2006-04-07 2007-10-25 Abbott Japan Co Ltd パルボウイルスｂ１９抗原測定方法
WO2008072216A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Biotrin Intellectual Properties Limited A method for detecting human parvovirus antigen
JP2010513865A (ja) 2006-12-15 2010-04-30 バイオトリン・インテレクチュアル・プロパティーズ・リミテッド ヒトパルボウイルス抗原の検出方法
JP2011112631A (ja) 2009-11-30 2011-06-09 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白検出のための試料の前処理方法及び前処理用試薬キット
WO2014032990A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Qiagen Gmbh Method of determining the presence or absence of a target nucleic acid in a cell sample

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Michael E Hagensee et al, Journal of Virology(1993), vol 67, no 1, pp 315-322.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3130922A1 (en) 2017-02-15
JP2018528418A (ja) 2018-09-27
WO2017025603A1 (en) 2017-02-16
BR112018000689A2 (pt) 2018-09-18
EP3335047B1 (en) 2019-06-19
CN107850597A (zh) 2018-03-27
EP3335047A1 (en) 2018-06-20
US20180164314A1 (en) 2018-06-14
JP6491794B2 (ja) 2019-03-27
CN107850597B (zh) 2021-06-04
ES2742875T3 (es) 2020-02-17
KR20180030629A (ko) 2018-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220057393A1 (en) Methods for reducing interferences
EP3111218B1 (en) Protein l based bioassay method for determining presence of soluble antibodies in a sample and kit therefor
JP7308914B2 (ja) ウイルス抗原の血清学的検出方法
US11327077B2 (en) Pretreatment method for rapid detection of HCV core antigen
WO2023017817A1 (ja) 免疫測定方法、検体希釈液、及びイムノクロマトグラフィーキット
WO2022265065A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片
KR101978102B1 (ko) 면역검정을 위한 파보바이러스의 알칼리 전처리
WO2022031611A1 (en) Compositions and methods for determining coronavirus neutralization titers
JP7105970B1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット
CA3217475A1 (en) Devices, methods, and kits for diagnosing sars cov-2 infection
BR112020015686A2 (pt) Métodos para determinar um analito, para melhorar a especificidade da detecção de um analito e para identificar uma amostra, kit, dispositivo para determinar um analito, usos de uma composição e de pelo menos um primeiro e um segundo composto detector de um analito

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant