CN107850597A - 用于免疫测定的细小病毒的碱预处理 - Google Patents
用于免疫测定的细小病毒的碱预处理 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测来自受试者的样品中无包膜病毒的衣壳多肽的方法,包括(a)使所述样品与碱接触,和(b)检测所述样品中的所述病毒的衣壳多肽。此外,本发明涉及预处理来自受试者的样品以检测病毒的方法,其包括使所述样品与碱接触。此外,本发明涉及与所述方法有关的试剂盒、用途和装置。
Description
发明领域
本发明涉及用于检测来自受试者的样品中无包膜病毒的衣壳多肽的方法,包括(a)使所述样品与碱接触,和(b)检测所述样品中的所述病毒的衣壳多肽。此外,本发明涉及用于预处理来自受试者的样品以检测病毒的方法,其包括使所述样品与碱接触。此外,本发明涉及与所述方法有关的试剂盒、用途和装置。
相关技术
与大多数包膜病毒相反,无包膜病毒的稳健性及其对环境影响(包括热、酸、洗涤剂等)的相对不敏感性是众所周知的。结果,发现难以分解无包膜病毒以获得病毒的组成分子来检测无包膜病毒的存在。
一组无包膜病毒的例子,细小病毒,是小的无包膜病毒,其具有包装成衣壳的线性、非节段的、单链DNA基因组。细小病毒的衣壳基本上由2至4个衣壳蛋白组成,分别称为VP1至VP2或VP1至VP4。衣壳蛋白从病毒基因组的开放阅读框中表达,其中至少一部分对于所有VP蛋白是相同的,使得VP蛋白的氨基酸序列部分相同。已知细小病毒对其衣壳具有特殊的稳定性,对宽范围的pH值、溶剂和温度不敏感(例如Yuan和Parrish(2001),Virology279:546)。
灵长类红细胞病毒(erythroparvovirus)1(细小病毒B19)作为感染人类的红细胞病毒属的成员,是传染性红斑的病原体,也称为“第五病”。该疾病的症状包括病毒感染的典型症状,如发热、头痛、恶心和腹泻。这些通常跟随有红色皮疹,特别是在脸颊上,通常不包括鼻唇沟、前额和嘴;以及在躯干和/或四肢上的红色皮疹。孕妇的细小病毒B19感染尤其关键,因为它可能导致胎儿水肿和贫血的发生。
细小病毒B19感染的免疫学诊断通常在血液样品中进行,检测病毒衣壳蛋白。所使用的方法包括样品的酸性预处理,旨在分解病毒颗粒以增加测定的灵敏度(WO2008/072216)。为了相同的目的也使用离液盐(JP 2007-278902)。然而,酸处理引起可逆的变性,使病毒颗粒至少部分重新组装。此外,来自血液样品的潜在混杂的免疫球蛋白也可能复性,因此不能被有效除去。离液盐可能会干扰检测反应,并且如果被除去,则可能会使衣壳和混杂物复性。此外,它们的使用在包含不锈钢模块的装置中可能是关键的,因为它们会导致腐蚀。
要解决的问题
因此,本发明的目的是提供检测细小病毒的改进手段和方法。
发明概述
该问题是通过具有独立权利要求的特征的本发明的手段和方法解决。在从属权利要求中列出了可以以分离的方式或以任意组合的方式实现的优选实施方案。
因此,本发明涉及用于检测来自受试者的样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的方法,包括
(a)使所述样品与碱接触,和
(b)检测所述样品中的所述病毒的所述衣壳多肽。
如下文中所使用的,术语“具有”、“包括”或“包含”或其任何任意的语法变体以非排他的方式使用。因此,这些术语可以指的是除了由这些术语引入的特征之外在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况,以及存在一个或多个另外的特征的情况。作为例子,表述“A具有B”、“A包括B”和“A包含B”都可以指的是除了B之外在A中不存在其他要素的情况(即,A唯一地并且排他地由B组成),以及除了B之外在实体A中存在一个或多个另外的要素(例如要素C、要素C和D乃至另外的要素)的情况。
此外,如在下文中使用的,术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或相似的术语与可选特征组合使用,而不限制更多的可能性。因此,由这些术语引入的特征是可选的特征,并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的,本发明可以通过使用替代特征来执行。类似地,由“在本发明的实施方案”或类似表述中引入的特征旨在为可选特征,而不对本发明的进一步实施方案进行任何限制,对本发明的范围没有任何限制,并且对于以这种方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征相结合的可能性没有任何限制。此外,如果没有另外指出,术语“约”涉及指示值±20%。
在一个实施方式中,本发明的用于检测无包膜病毒的衣壳多肽的方法是体外方法。此外,它可以包括除了上面明确提到的那些步骤以外的步骤。例如,进一步的步骤可涉及例如获得用于步骤a)的样品,或者在步骤b)中计算测量值或校正的测量值。此外,所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。因此,在一个实施方式中,用于检测无包膜病毒的衣壳多肽的方法包括以下步骤:
(a)使样品与碱接触,由此产生允许样品与所述碱相互作用的反应混合物,
(b)任选地中和所述反应混合物,
(c)加入至少两种特异性结合所述衣壳多肽的结合化合物,所述至少两种结合化合物之一为捕获化合物,以及所述至少两种结合化合物之一为检测化合物,
(d)通过将所述反应混合物与所述结合化合物混合形成免疫反应添混物(admixture),
(e)将所述免疫反应添混物保持足够的时间,使得存在于所述样品中的所述衣壳多肽与所述至少两种结合化合物发生免疫反应以形成免疫反应产物,和
(f)检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
如本领域技术人员将理解的,检测受试者样品中病毒的衣壳多肽通常将指示病毒的存在。因此,在一个实施方式中,用于检测无包膜病毒的衣壳多肽的方法是用于检测来自受试者的样品中的无包膜病毒的方法,包括
(a)使所述样品与碱接触,
(b)检测所述样品中的所述病毒的衣壳多肽,
(c)检测所述病毒。
在一个实施方式中,在上述方法中,通过非尺寸区分检测方法来检测衣壳多肽,即,在一个实施方式中,检测所述衣壳多肽的特征而不检测被检测分析物的分子量的方法。因此,在一个实施方式中,前述方法包括夹层免疫测定法,尤其是双抗体夹心免疫测定法,例如,夹心ELISA或夹心ECLIA。
术语“病毒”是本领域技术人员所理解的。如本文所用,术语“无包膜病毒”涉及具有衣壳作为最外覆盖物的病毒;因此,在一个实施方式中,无包膜病毒是未被脂质膜包围的病毒。在一个实施方式中,无包膜病毒是呼肠孤病毒(Reovirus),杯状病毒(Calcivirus),微小核糖核酸病毒(Picornavirus),细小病毒(Parvovirus),圆环病毒(Circovirus),多瘤病毒,乳头瘤病毒或腺病毒。在一个实施方式中,无包膜病毒是人致病病毒。因此,在另一个实施方式中,无包膜病毒是人致病性呼肠孤病毒,人致病性杯状病毒,人致病性微小核糖核酸病毒,人致病性细小病毒,人致病性圆环病毒,人致病性多瘤病毒,人致病性乳头瘤病毒或人类致病性腺病毒。
在一个实施方式中,无包膜病毒是细小病毒科(Parvoviridae)的病毒。术语“细小病毒科”,也被统称为“细小病毒(Parvoviruses)”,是技术人员已知的。病毒科细小病毒科(Parovoviridae)有两个亚科,浓核病毒亚科(Densovirinae)和细小病毒亚科(Parvovirinae),浓核病毒亚科包括Ambidensovirus,短颈浓核病毒(Brevidensovirus),Hepandensovirus,Iteradensovirus和Penstyldensovirus属;和细小病毒亚科包括Amdoparvovirus,Aveparvovirus,Bocaparvovirus,Copiparvovirus,Dependoparvovirus,赤细胞病毒(Erythroparvovirus),Protoparvovirus,Tetraparvovirus属。因此,术语“细小病毒科病毒”涉及基于基因组相似性分类或可分类的病毒,作为所述病毒家族的成员。在一个实施方式中,病毒是亚科细小病毒亚科(Parvovirinae)的病毒。在另一个实施方式中,病毒是赤细胞病毒属的病毒。在另一个实施方式中,病毒是灵长类赤细胞病毒1(Primateerythroparvovirus 1)(细小病毒B19)。
本领域技术人员理解在本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”。在一个实施方式中,该术语涉及使本发明的化合物,特别是碱与样品或另外的化合物物理接触,从而使该化合物和另外的化合物相互作用。如本文所用,术语“反应混合物”涉及使第一化合物与第二化合物(例如,碱与样品)接触的任何混合物,允许所述第一和第二化合物反应。
如本文所用,术语“碱”涉及诱导水溶液中的pH升高的化合物。在一个实施方式中,该碱是布伦斯特-劳里碱。在另一个实施方式中,碱是在水溶液中包含或产生氢氧根离子的化合物。在另一个实施方式中,碱是碱金属氢氧化物,例如LiOH、NaOH、KOH或RbOH;或碱土金属氢氧化物,例如Be(OH)2、Mg(OH)2或Ca(OH)2。在另一个实施方式中,碱具有至多4的pKB值,在一个实施方式中至多3,在另一个实施方式中至多2。在另一个实施方式中,碱是氢氧化钠或氢氧化钾。
在一个实施方式中,使样品与碱接触包括在至少10.5的pH下温育所述样品,在另一个实施方式中在至少11的pH下,在另一个实施方式中,在至少11.5的pH下,在另一个实施方式中在至少11.7的pH下。如本领域技术人员所理解的,在强碱性pH下长时间温育可能导致多肽(包括衣壳多肽)的水解。因此,在一个实施方式中,样品在至多14的pH下进行温育,在另一个实施方式中至多13。在另一个实施方式中,将样品在12±1.5的pH下温育,在一个实施方式中为11.5±1的pH,在另一个实施方式中为11.5±0.5的pH。在一个实施方式中,根据DIN EN ISO 10523(2012年4月)确定水溶液的pH。因此,在一个实施方式中,使样品与碱接触是使样品与如上所述pH的缓冲液接触,在一个实施方式中,缓冲液包含具有至少一个pKB在上述pH下的缓冲化合物。
在一个实施方式中,使样品与碱接触包括在碱存在下将样品温育至少2分钟,在一个实施方式中至少5分钟,在另一个实施方式中至少9分钟。如本领域技术人员将理解的,在强碱性pH下长时间温育可引起多肽(包括衣壳多肽)的水解。因此,在一个实施方式中,样品在碱存在下温育少于两小时,在一个实施方式中少于一小时,在另外的实施方式中少于30min。因此,在一个实施方式中,样品在碱存在下温育2分钟至60分钟,在一个实施方式中为5分钟至20分钟,在进一步实施方式中为9分钟至15分钟。
因此,在一个实施方式中,使样品与碱接触包括在12±1.5的pH下将样品温育2分钟至60分钟,在一个实施方式中为5分钟至20分钟,在另一个实施方式中为9分钟至15分钟。在另一个实施方式中,使样品与碱接触包括在11.5±1的pH下使样品温育2分钟至60分钟,在一个实施方式中为5分钟至20分钟,在另一个实施方式中为7分钟至15分钟。在另一个实施方式中,使样品与碱接触包括在11±0.5的pH下使样品温育2分钟至60分钟,在一个实施方式中为5分钟至20分钟,在另一个实施方式中为9分钟至15分钟。
在一个实施方式中,使样品与碱接触包括在10℃至50℃的温度,在一个实施方式中20℃至45℃,在另一个实施方式中30℃至40℃,在另一个实施方式中,在37±3℃的温度下温育所述样品。
如将理解的,具体取决于所使用的结合化合物的性质,在使碱处理的样品与结合化合物接触之前中和碱是有利的。因此,在一个实施方式中,该方法包括在步骤b)中检测衣壳多肽之前中和碱的另外步骤。然而,中和也可能是不必要的,例如,如果碱处理的样品在碱处理后强烈稀释和/或在使用的结合化合物对碱性条件不敏感的情况下。在一个实施方式中,将样品中和至pH 8±2,在一个实施方式中和至pH 7±2,在另一个实施方式中和至pH7±1。本领域技术人员知晓在水溶液中中和碱的适当方法。在一个实施方式中,中和是通过加入在适当的pH下缓冲的缓冲化合物来完成的。在一个实施方式中,在样品与本发明的结合化合物接触之前进行中和。在另一个实施方式中,本发明的结合化合物包含在用于中和的中和溶液中,即在使所述病毒与结合多肽接触的同时进行中和。
在一个实施方式中,变性的多肽在碱处理后不从样品中被除去,特别是在中和碱后。在进一步的实施方式中,变性的多肽不通过加入离液剂,特别是离液洗涤剂例如十二烷基硫酸钠来溶解。然而,本发明设想,在碱处理之后,加入弱的洗涤剂,在一个实施方式中非离子型洗涤剂,以确保固体表面的润湿。
如本文所用,术语“检测”是指定性或定量地检测样品中待检测的病毒的衣壳多肽的至少一个特征,在一个实施方式中为免疫学特征。在一个实施方式中,根据本发明的特征是衣壳多肽的结构特征,其便于检测样品中的衣壳多肽,例如借助于与所述特征特异结合的结合化合物。在一个实施方式中,所述特征便于通过免疫学手段鉴定衣壳多肽,在进一步的实施方式中,定量衣壳多肽。典型的可用特征是便于区分所述衣壳多肽与存在于样品中的其它化学化合物的特征。在一个实施方式中,检测衣壳多肽是确定衣壳多肽是否以高于所述方法的检测极限的效价存在或不存在。确定给定方法的检测极限的方法是本领域技术人员已知的,并且包括例如,稀释滴定实验。在另一个实施方式中,检测是半定量或定量检测样品中衣壳多肽或病毒的量或效价。为了定量检测,将检测衣壳多肽或病毒的绝对量或精确量,或检测衣壳多肽或病毒的相对量。在一定的情况下可以检测的相对量是可以或应该被检测的准确量。在所述情况下,可以检测衣壳多肽或病毒存在的量相对于第二样品是否增加或减少,所述第二样品包含第二种量,在一个实施方式中预定量的所述衣壳多肽或病毒。
如本领域技术人员将理解的,衣壳多肽的检测将取决于所选择的测定形式。在一个实施方式中,该测定是夹心测定,其中分析物例如,病毒,其衣壳体或其衣壳多肽与结合于固体表面的捕获化合物结合,并且其中捕获的分析物的量通过如下文所述的检测化合物与所述捕获的分析物的结合来检测。在一个实施方式中,捕获和/或检测化合物是抗体,并且夹心测定是夹心免疫测定。如技术人员将理解的,在一个实施方式中,分析物的可检测特征可以不止一次地存在于分析物上;在这种情况下,捕获化合物和检测化合物都可以识别所述特征;或捕获化合物识别第一特征并且检测化合物识别第二特征,即结构上不同的特征。然而,分析物的特定可检测特征可能仅存在于分析物上一次;在这样的情况下,在一个实施方式中,捕获化合物识别第一特征,并且检测化合物识别第二特征,即结构上不同的特征。
在一个实施方式中,所检测的病毒和/或衣壳多肽的特征是包含在所述病毒的衣壳多肽中的表位。如本文所用,术语“衣壳多肽”涉及本发明病毒衣壳中包含的任何可检测量的多肽。在另一个实施方式中,术语衣壳多肽涉及作为病毒衣壳的结构组分的多肽,其中在一个实施方式中,衣壳的结构组分是形成结构正常衣壳和/或用于形成感染性病毒颗粒所需的组分。在进一步的实施方式中,衣壳多肽是以每衣壳至少5个拷贝存在于病毒衣壳中的多肽,在一个实施方式中,每衣壳至少10个拷贝。在一个实施方式中,病毒是细小病毒,并且衣壳多肽是病毒VP1、VP2、VP3和VP4衣壳多肽中的至少一种。因此,在一个实施方式中,用于检测本发明的细粒病毒科病毒的衣壳多肽的方法包括检测病毒VP1、VP2、VP3和VP4衣壳多肽中的至少一种。
本发明的方法包括检测无包膜病毒的衣壳多肽,在一个实施方式中,如上所述的细小病毒科的病毒;因此,在一个实施方式中,在所述方法中待检测的“分析物”是所述衣壳多肽。如技术人员将理解的,该方法可以进一步包括检测另外的分析物,例如,一个或多个另外的衣壳多肽。如技术人员还将理解的,在一个实施方式中,检测作为分析物的病毒衣壳多肽包括检测所述衣壳多肽的寡聚体和/或可包括检测完整的衣壳。
在一个实施方式中,检测衣壳多肽包括使样品与结合化合物接触。如本文所用,术语“结合化合物”涉及与本发明的分析物结合的化学分子,在一个实施方式中是衣壳多肽。在一个实施方式中,结合化合物是有机分子或其复合物,在进一步的实施方式中是生物大分子,特别是多肽或其复合物。在一个实施方式中,结合化合物是抗体,特别是单克隆抗体。因此,如本文所用,术语“免疫反应产物”在一个实施方式中涉及在本发明的至少一种抗体和衣壳多肽之间的特异性复合物。在一个实施方式中,结合化合物以足够的亲和力间接或直接结合本发明的分析物,以允许检测包含分析物和结合化合物的复合物。在一个实施方式中,分析物/结合化合物复合物的解离常数(Kd)为至多10-7mol/L,在进一步的实施方式中为至多10-8mol/L,在进一步的实施方式中为至多10-9mol/L。在一个实施方式中,结合化合物以足够的亲和力间接或直接结合本发明的衣壳多肽,以允许检测包含衣壳多肽和结合化合物的复合物。在一个实施方式中,结合化合物是与分析物特异性结合的化合物,特别是与本发明的衣壳多肽结合的化合物。在一个实施方式中,结合化合物特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽;因此,在一个实施方式中,结合化合物结合衣壳多肽的表位,所述衣壳多肽未经本文其它地方所述的碱处理而变性。在进一步的实施方式中,结合化合物与连续(线性)表位结合,即由分析物的氨基酸序列中连续的氨基酸形成的表位,例如,衣壳多肽。因此,在一个实施方式中,结合化合物是不与分析物的构象表位结合的结合化合物。在一个实施方式中,特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物是通过下文所述的方法鉴定的结合化合物。
如本领域技术人员将理解的,术语“特异性结合”或其语法变体用于指示存在于样品中的其他化合物(通常为生物分子)不显著结合本发明的配体,特别是结合化合物;在一个实施方式中,这不排除化学化合物,例如,干扰化合物结合到与未参与与所述分析物相互作用的结合化合物的区域。在一个实施方式中,结合化合物与分析物以外的化合物的结合水平导致分别为对分析物的亲和力的至多10%或更少,5%或更少,2%或更少,或1%或更少的结合亲和力。
在一个实施方式中,检测衣壳多肽包括借助捕获化合物将衣壳多肽捕获到固体表面。如本文所用,术语“捕获化合物”涉及附着到或适合于附着到如本文其他地方所述固体表面的结合化合物。如本领域技术人员将理解的,将捕获化合物附着到固体表面并且使所述固体表面结合的捕获化合物与样品接触允许特异地分离由所述捕获化合物(如果存在的话)结合的分析物与所述样品中包含的其他化合物。将结合化合物,例如生物分子,通常是多肽附着到固体表面的方法是本领域熟知的并且包括例如通过疏水性相互作用的结合、生物素化和通过固定化的链霉抗生物素蛋白的结合、共价结合、抗体-抗原相互作用等,或者这些相互作用的组合。在一个实施方式中,捕获化合物也可以是捕获复合物。在一个实施方式中,捕获化合物是抗体。在进一步的实施方式中,捕获化合物是单克隆抗体。在另一个实施方式中,捕获化合物是抗体,即捕获抗体,特别是单克隆抗体。在一个实施方式中,捕获抗体与生物素共价偶联。
在一个实施方式中,检测衣壳多肽包括使所述衣壳多肽与检测化合物接触。如本文所用,术语“检测化合物”涉及结合到如本文其他地方所指定的指示剂的结合化合物。在一个实施方式中,检测化合物不结合到固体表面并且不适合结合到固体表面。在一个实施方式中,检测化合物是直接结合本发明分析物的化合物,在一个实施方式中,是结合衣壳多肽。在一个实施方式中,检测化合物也可以是检测复合物。本领域技术人员知晓如何将结合化合物或结合复合物与指示剂结合,这取决于所选择的指示剂。在一个实施方式中,检测化合物中结合剂与指示剂之间的键是共价键。在一个实施方式中,检测化合物是抗体,即检测抗体。在另一个实施方式中,检测化合物是单克隆抗体。在另一个实施方式中,检测化合物是与包含钌离子的复合物(例如三(2,2'-双吡啶基)钌(II)-络合物)共价偶联的抗体,特别是单克隆抗体。
在一个实施方式中,由捕获化合物包含的结合剂和检测化合物的结合化合物是不相同的。
如本文所用,术语“指示剂”涉及适于使包含所述指示剂的分子或复合物的存在可检测的化合物。通常,指示剂具有可检测的性质,通常是光学或/和酶学性质。但是,也可以设想,所述可检测的性质是发射放射性的性质。
如本文所用,术语“光学性质”涉及可以由光学仪器检测的任何性质。具体而言,光学可确定的性质可以是或可以包括选自反射性质、透射性质、发射性质、散射性质、荧光性质、磷光性质、衍射性质和偏振性质的至少一种性质。本发明设想的其他光学性质是颜色、荧光、发光或折射。在一个实施方式中,本文所指的光学可确定的性质是指可被光学检测的化学化合物的性质,例如光吸收、光发射、光缓解或与其相关的性质。将会理解的是,如本文所使用的检测光学可确定性质包括检测之前未检测到的性质的存在,检测之前检测到的性质的缺失以及检测性质的量化变化,即检测与至少一种光学性质的变化程度相关的信号强度的变化。可以理解,在一个实施方式中,术语“光学可确定的性质”还涉及电化学发光,其也被称为电致化学发光。
如本文所用,术语“酶促性质”涉及借助生物催化从底物产生可检测产物的指示剂的性质。因此,通常通过在所述指示剂中存在具有所述酶性质的多肽来赋予酶性质。典型地,所述酶性质是至少一种选自磷酸酶活性(例如在碱性磷酸酶中)、过氧化物酶活性(例如在辣根过氧化物酶中)和糖苷酶活性(例如在β-半乳糖苷酶中)的酶活性。酶活性的典型底物是本领域众所周知的。典型地,所述酶活性产生具有如上所述的可确定的光学性质的产物,或/和所述酶活性产生可由电仪器测定的产物。
如本文所用,术语“固体表面”涉及适于结合本发明的捕获化合物且适于例如通过物理方式从样品分离的任何合适的固体表面。在一个实施方式中,所述固体表面是珠粒的表面,在一个实施方式中,是微珠例如磁性或顺磁性微珠。在一个实施方式中,所述表面适于改善捕获化合物的结合,例如通过共价或非共价地附着到结合捕获化合物的亚结构的分子。结合捕获化合物的亚结构的典型分子是,例如抗体、链霉抗生物素蛋白、复合镍离子等。在另一个实施方式中,固体表面通过共价或非共价键结合所述捕获化合物,例如,通过疏水相互作用。因此,在一个实施方式中,所述固体表面是多簇板的表面。在一个实施方式中,将多簇板的表面预处理以增加结合捕获化合物的亲和力和/或能力。合适的预处理是本领域已知的。
如本文所用,术语“样品”涉及疑似包含本发明的病毒或其组成部分的样品。在一个实施方式中,样品是疑似包含本发明病毒的衣壳多肽的样品。在一个实施方式中,样品是或包含体液样品,来自组织或器官的样品,或洗涤/漂洗液的样品或从外或内体表面获得的拭子或涂片。在一个实施方式中,本发明的方法包括作为样品的粪便,尿液,唾液,脑脊液,血液,血清,血浆或泪液的样品。样品可以通过使用刷子,(棉花)拭子,刮刀,漂洗/洗涤液,穿刺活检装置,用针或刺血针穿刺空腔或通过手术器械来获得。然而,作为本发明的样品,还包括通过众所周知的技术,包括在一个实施方式中从泌尿生殖道,肛门周围区域,肛管,口腔,上呼吸消化道和表皮获得的样品。可通过溶解技术如匀浆和/或通过分离技术如过滤或离心从体液或组织或器官获得无细胞液。在一个实施方式中,样品从已知包含本发明的病毒和/或病毒衣壳多肽的体液获得,即在一个实施方式中,血液、血浆、血清、唾液等。可以理解,为了实施本发明的方法,可以进一步处理样品。特别地,细胞可以通过本领域已知的方法和手段从样品中除去。在一个实施方式中,样品是包含免疫球蛋白的样品,在一个实施方式中,是血液、血清或血浆样品。
如本文所用,术语“受试者”涉及动物,在一个实施方式中是哺乳动物,在另一个实施方式中是灵长类动物,在另一个实施方式中是人。在一个实施方式中,根据本发明的受试者是疑似感染细小病毒的受试者;因此,在一个实施方式中,受试者是显示出本领域技术人员已知的以及如本文其他地方所述细小病毒感染症状中至少一种,在进一步的实施方式中至少两种的受试者。然而,也设想该受试者是小孩的亲属、家庭成员、玩伴和/或监护人,其中所述小孩被诊断为感染了细小病毒。
如本文所用,术语“抗体”包括由至少两种完整抗体形成的单克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段(只要它们表现出如本文它处所述的所需结合活性即可)。在一个实施方式中,抗体是单克隆抗体。在一个实施方式中,抗体是全长抗体或抗体片段。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列,抗体(免疫球蛋白)可以归入不同的类别。有五种主要类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中几种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的,并且通常描述于例如Abbas等人,Cellular and Mol.Immunology,第4版,W.B.Saunders,Co.(2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”,“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用,是指以其基本上完整形式的抗体,而不是如下所定义的抗体片段。这些术语特别指具有包含Fc区的重链的抗体。在一个实施方式中,“抗体片段”包含完整抗体的一部分,其包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子,纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,每个片段具有单个抗原结合位点和残余的“Fc”片段,其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方式中,双链Fv种类由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中,一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接,使得轻链和重链可以以类似于在双链Fv种类中的“二聚”结构缔合。正是在这种构型中,每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以限定抗原结合位点。总共六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使是单一的可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管其亲和力低于整个结合位点。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段,所述片段包含与在相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以致不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头,这些结构域被迫与另一个链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。例如,在EP 0 404 097中更完整地描述了双抗体,WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9(2003)129-134;和Hollinger等人,PNAS USA 90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9(2003)129-134。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体,即群体中包含的各个抗体除了可以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外是相同的。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方式中,这样的单克隆抗体通常包括包含结合分析物的多肽序列的抗体,其中通过包括从多个多肽序列中选择单个分析物结合多肽序列的方法获得分析物结合多肽序列。例如,选择过程可以是从许多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的合并物中选择独特克隆。应当理解,选择的靶标结合序列可进一步改变,例如以改善对靶标的亲和力、将靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等,并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。
有利地,在本发明的基础上发现,碱处理导致无包膜的病毒衣壳,例如,细小病毒衣壳分解,导致在检测这些衣壳多肽的方法中的信号强度增加。此外,与大多数其他多肽相比,衣壳多肽即使在强碱处理后也保持可溶。因此,发现碱性预处理增加衣壳多肽的特异性信号,而干扰化合物的信号减少。
上述定义比照适用于以下情况。以下进一步的定义和解释也适用于本说明书中所描述的所有实施方案。
本发明进一步涉及用于预处理来自受试者的样品以检测病毒的方法,其包括使所述样品与碱接触。
预处理来自受试者的样品的方法还可以包括除了明确提及的步骤之外的步骤。此外,该方法在一个实施方式中是体外方法。在一个实施方式中,待检测的病毒是无包膜病毒,在另一个实施方式中,是如上文所述的细小病毒科(Parvoviridae)的病毒。
本发明还涉及用于检测样品中的病毒的试剂盒,其包含碱和至少一种,在一个实施方式中至少两种特异性结合所述病毒的结合化合物。
如本文所用,术语“试剂盒”是指可以包装或不包装在一起的本发明的上述化合物、工具或试剂的集合。试剂盒的组分可以由单独的小瓶包含(即作为独立部分的试剂盒)或尤其是结合剂提供在单个小瓶中。此外,应该理解,本发明的试剂盒将被用于实施上述的方法。在一个实施方式中,设想所有组分以直接使用的方式被提供用于实施上述方法。此外,在一个实施方式中,试剂盒包含用于实施所述方法的说明书。说明书可以通过用户手册以纸质或电子形式提供。另外,手册可以包括用于解释使用本发明的试剂盒执行上述方法时获得的结果的使用说明。在一个实施方式中,试剂盒包含至少两种结合化合物,其中至少一种结合化合物是捕获化合物,并且其中至少一种结合化合物是检测化合物。在一个实施方式中,试剂盒中包含的至少一种捕获化合物包含生物素标签。在另一个实施方式中,试剂盒中包含的至少一种检测化合物包含钌标签。而且在一个实施方式中,试剂盒还包含中和工具,例如,缓冲液。在一个实施方式中,待检测的病毒是无包膜病毒,在另一个实施方式中,如上文所述,是细小病毒科(Parvoviridae)的病毒。
此外,本发明涉及碱在预处理受试者样品用于检测无包膜病毒的免疫测定中的用途;并且本发明涉及碱在利用免疫测定法检测受试者的样品中无包膜病毒中的用途。
此外,本发明涉及用于鉴定特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物的方法,其包括
a1)使所述结合化合物与碱处理的衣壳多肽接触,
a2)检测所述结合化合物与步骤a1)的所述碱处理的衣壳多肽的结合,
b1)使所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽和碱处理的衣壳多肽接触,
b2)检测所述结合化合物与步骤b1)的所述碱处理的衣壳多肽的结合,
c)比较步骤a2)中所述结合化合物的结合与步骤b2)中所述结合化合物的结合,
d)基于步骤c)的比较鉴定特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物。
此外,本发明涉及用于鉴定特异性结合(ⅰ)未碱处理的衣壳多肽或(ⅱ)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物的方法,包括
a1)使所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽接触,
a2)检测所述结合化合物与步骤a1)的所述未碱处理的衣壳多肽的结合,
b1)使所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽和碱处理的衣壳多肽接触,
b2)检测所述结合化合物与步骤b1)的所述未碱处理的衣壳多肽的结合,
c)比较步骤a2)中所述结合化合物的结合与步骤b2)中所述结合化合物的结合,
d)基于步骤c)的比较鉴定特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物。
在实施方式中,鉴定本发明的结合化合物的方法是体外方法。此外,它们可以包括除了上面明确提到的那些之外的步骤。例如,进一步的步骤可涉及,例如,首先鉴定与衣壳多肽结合的结合化合物;或提供衣壳多肽和碱处理的衣壳多肽。此外,所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。
在一个实施方式中,如上文所指出的,衣壳多肽是无包膜病毒的衣壳多肽,在另一个实施方式中,是细小病毒科(Parvoviridae)的病毒的衣壳多肽。因此,在一个实施方式中,检测所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽和/或碱处理的衣壳多肽的结合是基本上根据上文和实施例中的描述进行的。如本领域技术人员将理解的,用于鉴定本发明的结合化合物的方法基本上是竞争测定法,其中碱处理的衣壳多肽与未碱处理的衣壳多肽竞争结合结合化合物。因此,碱处理和未碱处理的衣壳多肽在一个实施方式中除了碱处理以外是相同的。
因此,在鉴定与(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽特异性结合的结合化合物的所述方法中,如果步骤a2)中所述结合化合物的结合与步骤b2)中所述结合化合物的结合没有显著不同,则结合化合物被鉴定为特异性结合碱处理的衣壳多肽。然而,如果步骤a2)中所述结合化合物的结合显著高于步骤b2)中所述结合化合物的结合,则结合化合物被鉴定为特异性结合碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽。在另一个实施方式中,所述结合化合物的结合通过使潜在结合化合物/衣壳多肽复合物与一般识别所述结合化合物来源的化合物类别的化合物(例如,抗小鼠抗体)接触来检测。
相应地,在鉴定特异性结合(i)未碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物的所述方法中,如果步骤a2)中所述结合化合物的结合与步骤b2)中所述结合化合物的结合没有显著不同,则结合化合物被鉴定为与未碱处理的衣壳多肽特异性结合。然而,如果步骤a2)中所述结合化合物的结合显著高于步骤b2)中所述结合化合物的结合,则结合化合物被鉴定为与碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽特异性结合。在另一个实施方式中,通过将潜在结合化合物/衣壳多肽复合物与一般识别所述结合化合物来源的化合物类型的化合物(例如抗小鼠抗体)接触来检测所述结合化合物的结合。
如以上技术人员将会理解的,用于鉴定结合化合物的两种方法都适合于鉴定与碱处理的和未碱处理的衣壳多肽结合的结合化合物。如本领域技术人员还将理解的,在将要鉴定结合碱处理的衣壳多肽的结合化合物的情况下,对此,不需要是否也结合了未碱处理的衣壳多肽的知识,步骤b1)至c)可以从用于鉴定如上所述的特异性结合(ⅰ)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物的方法中省略。因此,本发明还涉及用于鉴定结合化合物结合碱性处理的衣壳多肽的方法,在一个实施方式中,所述结合化合物特异性结合碱性处理的衣壳多肽的方法,包括
a1)使所述结合化合物与碱处理的衣壳多肽接触,
a2)检测所述结合化合物与步骤a1)的所述碱处理的衣壳多肽的结合,和
b)基于步骤a2)中结合的检测,鉴定与碱处理的衣壳多肽结合的结合化合物。
此外,本发明还涉及用于检测样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的分析装置,其包括具有样品处理单元的分析单元,所述分析单元适于使得以下步骤执行:
(a)将施加到所述样品处理单元的样品与碱接触,
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
在一个实施方式中,分析单元的样品处理单元连接到控制器单元,所述控制器单元适于指导执行如上所述的步骤。
如本文所用,术语“装置”涉及一种工具系统,该工具系统至少包括前述相互可操作地连接以便获得检测结果的工具。上面结合本发明的方法公开了使样品与碱接触并检测衣壳多肽的优选工具。如何以操作方式连接该工具将取决于包括在装置中的工具的类型。在一个实施方式中,该工具由单个装置组成。
在一个实施方式中,样品处理单元包括用于样品的容器。容器可以直接接触样品,或者可以是用于接收样品的另外的工具的容器,其中所述另外的工具可以是例如多孔板,可以将样品或多个样品应用于该多孔板。此外,在一个实施方式中,样品处理单元包括碱,例如以干燥形式或在连接到定量给料机构的贮存器中,例如,连接到泵的管道。任选地,样品处理单元可以包括中和工具,用于在样品与所述碱接触之后降低样品的pH。在一个实施方式中,样品处理单元包括至少一个检测化合物,例如以干燥的形式或在连接于定量给料工具的贮存器中,例如连接到泵的管道。在进一步的实施方式中,样品处理单元包括用于混合的工具和用于调节反应混合物温度的工具。
在一个实施方式中,检测的结果可以通过用户的视觉检查或者通过在适当的装置上执行检测测量来获得。在一个实施方式中,本发明装置的分析单元还包括本发明的用于检测衣壳多肽,在一个实施方式中,用于检测本发明的衣壳多肽的量的检测单元。适合作为根据本发明的检测单元的工具是本领域技术人员已知的,并且包括,例如,光度测量装置。
在一个实施方式中,本发明的装置还包括连接到检测单元的数据输出单元。在一个实施方式中,数据输出单元适于输出由检测单元获得的数据。合适的数据输出单元是本领域技术人员已知的,并且包括简单的输出单元,例如指示灯或显示器,指示在检测阈值以上检测到衣壳多肽。然而,输出单元也可以是评估装置的接口,其中所述接口可以是任何种类的传输数据的工具,包括例如像USB之类的线缆连接,像无线LAN、蓝牙之类的无线连接,或诸如通过即时消息传送、电子邮件等的数据传送的间接连接。
在一个实施方式中,本发明的装置是分析系统的一部分,所述分析系统还包括评估装置。如本领域技术人员将理解的,评估装置可以包括在与本发明的装置相同的外壳中,例如,作为评估单元,或者可以是单独的装置。在一个实施方式中,评估装置包括被编程为从本发明的装置的输出单元接收输出数据并且执行提供对所述输出数据的评估的逻辑操作的微处理器。输出数据的评估可以包括例如校正在一个或多个对照检测反应中测量的值的数据,统计计算,例如计算两个或更多个并行检测反应的平均值,校正稀释因子的数据,比较输出数据与参考值,编译列表中的数据等。在一个实施方式中,评估装置还包括数据存储单元。在另一个实施方案中,所述数据存储单元包括参考值,例如,在参考值数据库中。此外,在一个实施方式中,如上所述,数据存储单元适于存储从本发明的装置接收的输出数据。
在一个实施方式中,在应用自动检测所述病毒的衣壳多肽的工具的情况下,由所述自动操作工具获得的数据可以通过例如计算机程序进行处理,以建立诊断(即,识别感染无包膜的病毒的受试者)。典型的用于检测的工具结合涉及上述本发明的方法的实施方式被公开。在这种情况下,工具是可操作地连接的,因为系统的用户由于手册中给出的指示和解释而将量的确定结果和其诊断值放在一起。本领域技术人员将认识到如何在没有进一步的创造性技能的情况下连接该工具。典型的装置是可以在没有专业临床医生的特定知识的情况下应用的装置,例如仅需要装载样品的测试条或电子装置。结果可以作为参数诊断原始数据的输出给出,优选作为绝对或相对量给出。应理解这些数据将需要临床医生的解释。然而,还设想了专家系统装置,其中输出包括处理后的诊断原始数据,其解释不需要专门的临床医生。装置的进一步实施方式包括分析单元/装置(例如,生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振装置、NMR光谱仪、质谱仪等)或根据本发明的方法在上面提到的评估单元/装置。
当在分析装置、计算机或计算机网络上执行该程序时,本发明还公开并提出了一种计算机程序,该计算机程序包括用于在本文公开的一个或多个实施方式中执行根据本发明的方法的计算机可执行指令。具体地,该计算机程序可以存储在计算机可读数据载体上。因此,具体地,可以通过使用计算机或计算机网络,优选地通过使用计算机程序来执行如上所示的一个,一个以上或者甚至全部的方法步骤。
本发明还公开并提出了一种具有程序代码工具的计算机程序产品,以便当在分析装置、计算机或计算机网络上执行程序时,在本文公开的一个或多个实施方式中执行根据本发明的方法。具体地,程序代码工具可以存储在计算机可读数据载体上。
此外,本发明公开并提出了一种具有存储在其上的数据结构的数据载体,该数据载体在加载到计算机或计算机网络中之后,例如进入计算机或计算机网络的工作存储器或主存储器中后,可以执行根据本文公开的一个或多个实施方式。
本发明进一步提出并公开了一种计算机程序产品,该程序产品具有存储在机器可读载体上的程序代码工具,以便当在计算机或计算机网络上执行该程序时执行根据本文公开的一个或多个实施方式的方法。如本文所使用的,计算机程序产品将该程序称为可交易产品。产品通常可以以任意格式存在,例如纸质格式或计算机可读数据载体上。具体地,计算机程序产品可以分布在数据网络上。
最后,本发明提出并公开了一种调制数据信号,该调制数据信号包含可由计算机系统或计算机网络读取的指令,用于执行根据本文公开的一个或多个实施方式的方法。
优选地,参照本发明的计算机实现的方面,可以通过使用计算机或计算机网络来执行根据本文公开的一个或多个实施方式的方法的一个或多个方法步骤或者甚至是所有的方法步骤。因此,通常,可以通过使用计算机或计算机网络来执行包括提供和/或处理数据的任何方法步骤。通常,这些方法步骤可以包括任何方法步骤,典型地除了需要手动工作的方法步骤(例如提供样品和/或执行实际测量的某些方面)之外。
具体地,本发明还公开了:
-包括至少一个处理器的计算机或计算机网络,其中所述处理器适于执行根据本说明书中描述的实施方式中的一个的方法,
-计算机可加载的数据结构,其适于在数据结构正在计算机上执行的同时执行根据本说明书中描述的实施方式之一的方法,
-计算机程序,其包括用于在计算机程序在计算机上或在计算机网络上执行时执行根据本说明书中描述的实施方式之一的方法的程序工具,
-包括根据前述实施方式的程序工具的计算机程序,其中程序工具被存储在计算机可读的存储介质上,
-存储介质,其中数据结构被存储在所述存储介质上,并且其中所述数据结构适于在已经加载到计算机或计算机网络的计算机的主存储和/或工作存储器之后执行根据本说明中描述的实施方式中的一个的方法,以及
-具有程序代码工具的计算机程序产品,其中程序代码工具可以被存储或已存储在存储介质上,用于如果程序代码工具在计算机或计算机网络上执行,则执行根据本说明书中描述的实施方式之一的方法。
此外,本发明涉及碱在制造用于诊断具有无包膜病毒的受试者的感染的装置、试剂盒或组合物中的用途。
总结本发明的发现,以下实施方式是优选的:
1.一种检测来自受试者的样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的方法,
(a)使所述样品与碱接触,
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
2.如实施方式1的方法,其中所述检测衣壳多肽包括借助捕获化合物,在一个实施方式中借助捕获抗体捕获至少一种衣壳多肽至固体表面。
3.如实施方式1或2的方法,其中所述方法还包括使所述衣壳多肽与检测化合物接触,在一个实施方式中与检测抗体接触。
4.如实施方式1至3中任一项的方法,其中所述捕获抗体和/或所述检测抗体是单克隆抗体。
5.如实施方式2至4中任一项的方法,其中所述捕获化合物和/或检测化合物是特异性结合(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物。
6.如实施方式1至5中任一项的方法,其中所述检测所述病毒包括在夹心免疫测定中检测所述病毒。
7.如实施方式1至6中任一项的方法,其中所述样品是粪便样品或体液样品,在一个实施方式中是粪便、尿液、唾液、脑脊液、血液、血清或血浆样品。
8.如实施方式1至7中任一项的方法,其中所述样品是包含免疫球蛋白的样品,在一个实施方式中是血液、血清或血浆样品。
9.如实施方式1至8中任一项的方法,其中所述碱为布伦斯台德-洛里碱,在一个实施方式中为在水溶液中包含或产生氢氧根离子的化合物,在另一个实施方式中为碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。
10.如实施方式1至9中任一项的方法,其中所述碱基具有至多4,在一个实施方式中至多3,在另一个实施方式中至多2的pKB值。
11.如实施方式1至10中任一项的方法,其中所述碱是氢氧化钠或氢氧化钾。
12.如实施方式1至11中任一项的方法,其中所述使所述样品与碱接触包括在至少10.5,在一个实施方式中至少11,在另一个实施方式中至少11.5,在另一个实施方式中至少11.7的pH下温育所述样品。
13.如实施方式1至12中任一项的方法,其中所述使所述样品与碱接触包括在所述碱存在下将所述样品温育至少2分钟,在一个实施方式中至少5分钟,在另一个实施方式中至少9分钟。
14.如实施方式1至13中任一项的方法,其中所述使所述样品与碱接触包括在10℃至50℃的温度下,在一个实施方式中为20℃至45℃,在另一个实施方式中为30℃至40℃,在另一个实施方式中37±3℃的温度下温育所述样品。
15.如实施方式1至14中任一项的方法,其中所述方法包括在步骤b)中检测所述病毒之前中和所述碱的另外步骤。
16.如实施方式1至15中任一项的方法,其中所述检测衣壳多肽包括检测存在于所述病毒衣壳中的多肽,在一个实施方式中,包括检测病毒VP1、VP2和VP3衣壳多肽中的至少一种。
17.如实施方式1至16中任一项的方法,其中所述方法包括在使所述病毒与结合多肽接触之前或同时中和所述碱的步骤。
18.如实施方式1至17中任一项的方法,其中在所述进一步中和所述碱的步骤之后,不从样品中除去变性的多肽。
19.如实施方式1至18中任一项的方法,其中,利用非尺寸区分检测方法来执行检测所述病毒。
20.如实施方式1至19中任一项的方法,其中所述无包膜病毒是细小病毒科(Parvoviridae)的病毒,在另一个实施方式中,所述病毒是细小病毒亚科(Parvovirinae)的病毒。
21.如实施方式1至20中任一项的方法,其中所述无包膜病毒是赤细胞病毒属的病毒。
22.如实施方式1至21中任一项的方法,其中所述无包膜病毒是灵长类赤细胞病毒1(细小病毒B19)。
23.如实施方式1至22中任一项的方法,其中所述受试者是哺乳动物,在一个实施方式中是灵长类动物,在另一个实施方式中是人。
24.如实施方式1至23中任一项的方法,其中所述受试者是疑似感染无包膜病毒的受试者,在另一个实施方式中,所述受试者感染细小病毒科的病毒。
25.一种预处理来自受试者的样品以检测无包膜病毒的方法,包括使所述样品与碱接触。
26.一种用于检测样品中的无包膜病毒的试剂盒,其包含碱和至少一种,在一个实施方式中至少两种特异性结合所述病毒的结合化合物。
27.如实施方式26的试剂盒,其中所述试剂盒包含至少两种所述结合化合物,并且其中至少一种结合化合物是捕获化合物,并且其中至少一种结合化合物是检测化合物。
28.如实施方式27的试剂盒,其中所述至少一种捕获化合物包含生物素标记。
29.如实施方式27或28的试剂盒,其中所述至少一种检测化合物包含钌标记。
30.如实施方式26至29中任一项的试剂盒,其中至少一种结合化合物是抗体,在一个实施方式中是单克隆抗体。
31.如实施方式27至30中任一个的试剂盒,其中所述捕获化合物中的至少一种和所述检测化合物中的至少一种是抗体,在一个实施方式中是单克隆抗体。
32.碱在预处理受试者样品以用于免疫测定来检测无包膜病毒中的用途。
33.碱在借助免疫测定检测受试者样品中的无包膜病毒中的用途。
34.一种鉴定特异性结合(ⅰ)未碱处理的衣壳多肽或(ⅱ)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物的方法,包括
a1)使所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽接触,
a2)检测所述结合化合物与步骤a1)的所述未碱处理的衣壳多肽的结合,
b1)使所述结合化合物与未碱处理的衣壳多肽和碱处理的衣壳多肽接触,
b2)检测所述结合化合物与步骤b1)的所述未碱处理的衣壳多肽的结合,
c)比较步骤a2)中所述结合化合物的结合与步骤b2)中所述结合化合物的结合,
d)基于步骤c)的比较鉴定特异性结合(i)未碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的结合化合物。
35.如实施方式34的方法,其中如果步骤a2)中所述结合化合物的结合显著高于步骤b2)中所述结合化合物的结合,则鉴定为所述结合化合物特异性结合(a)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽。
36.一种用于检测样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的分析装置,包括具有样品处理单元的分析单元,所述分析单元适于引起执行以下步骤:
(a)将施加到所述样品处理单元的样品与碱接触,
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
37.一种用于检测样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的分析装置,包括具有样品处理单元的分析单元,所述分析单元连接到控制器单元,所述控制器单元适于指导执行以下步骤:
(a)将施加到所述样品处理单元的样品与碱接触,
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
38.一种分析系统,包括实施方式36或38的分析装置和评估装置。
附图简述
本发明的其他可选特征和实施方式将在随后的优选实施方式的描述中,优选结合从属权利要求更详细地公开。其中,如技术人员将认识到的,相应的可选特征可以以孤立的方式以及以任何可行的组合来实现。本发明的范围不受优选实施方式的限制。图中示意性地描绘了实施方式的各个方面。
在图中:
图1示出了筛选识别(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽生物素化的病毒样颗粒的抗体的原理。A)预先筛选;B)预先筛选后,识别碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽的抗体的结合;C)仅识别未碱处理的衣壳多肽的抗体的结合。(1):生物素化的病毒样颗粒,(3):钌化的抗小鼠检测抗体,(2):候选抗体(结合化合物),(4)碱处理的衣壳多肽。
实施例
实施例1
单克隆抗细小病毒B19衣壳抗体的产生
a)小鼠免疫
用CFA(完全弗氏佐剂)配制的100μg重组B19病毒样颗粒(VLP)(Diarect,Freiburg,德国)对NMRI小鼠进行腹膜内初次免疫。用于免疫的重组B19VLP由B19衣壳蛋白VLP1和VLP2组成。在6周和10周后进行两次进一步的腹膜内免疫步骤,每只小鼠施用与IFA(不完全弗氏佐剂)混合的100μg B19VLP。随后,小鼠被静脉内施用50μg B19VLP加强三次并且2天后处死动物,分离脾细胞并用于融合。
b)融合和克隆
脾细胞与骨髓瘤细胞的融合通过使用聚乙二醇的标准程序进行。简言之,在RPMI-1640中将1×108个脾细胞与约2×107个骨髓瘤细胞(P3x63-Ag8.653)混合并离心(10min,250×g)。细胞用RPMI-1640洗涤一次并再次离心。之后,将1mL的PEG(聚乙二醇)加入到细胞沉淀中并通过移液混合。1min后在37℃的水浴中滴加5ml RPMI-1640,混合混悬液,用RPMI-1640填充至30ml并离心(10min,180×g)。将细胞重悬于选择培养基(补充有10%FCS,100U/mL IL-6,2mM L-谷氨酰胺,100μM NEAA,1mM丙酮酸钠,24μM 2-巯基乙醇,1x氮芥/次黄嘌呤的RPMI-1640(Sigma-Aldrich))。在37℃培养24h后,将细胞接种到96孔细胞培养板中。大约10天后,测定原代培养物的特异性抗体的产生(如下所述)。使用流式细胞仪(FACSAria,BDBiosciences)通过单细胞分选克隆选择的原代培养物。细胞克隆在补充有10%FCS,50U/mLIL-6,2mM L-谷氨酰胺,100μM NEAA,1mM丙酮酸钠和24Μm 2-巯基乙醇的RPMI-1640中生长。所建立的单克隆杂交瘤细胞系如下所述重新测试其特异性。
c)结合B19VLP的抗体的筛选(ELISA)
为了确定抗体在杂交瘤细胞培养上清液中的特异性,将用重组抗生物素蛋白(MicroCoat,Bernried,德国)预包被的96孔板在室温(RT)下用300ng/mL生物素化的B19VLP包被1h。随后,用0.9%NaCl/0.05%洗涤平板。洗涤后,加入100μL/孔待测定的抗体溶液(培养上清液)并在RT温育1h。用0.9%NaCl/0.05%洗涤后,加入100μL/孔的多克隆绵羊抗小鼠Fcγ抗体(100ng/mL)的辣根过氧化物酶标记的F(ab')2片段检测结合的样品抗体。在RT下温育1h后,如上所述洗涤平板。最后,加入100μl/孔的(Roche)。在RT温育30min后,在405nm和492nm处测量消光。
该筛选导致在ELISA中选择与B19VLP结合的抗体。在以下描述的分析中进一步表征抗体的选择。
d)结合B19VLP的抗体的筛选(Elecsys)
在碱性条件下温育样品导致病毒衣壳的解离和衣壳蛋白的至少部分解折叠。因此用于测定的合适的抗体优选地针对抗原的线性和非结构性表位(参见图1A)。在第一轮中,使用包括生物素化的病毒样颗粒(1)和钌化的抗小鼠检测抗体(3)的抗体筛选测定法来筛选候选抗体(2)。
在第二轮中,检测合适的候选者在检测碱性条件下预温育的病毒样颗粒方面的能力(4)(图1B和C)。在这些实验中,游离的NaOH-或HCl-预处理的病毒样颗粒与生物素化的未处理的病毒(如结合于固相的颗粒)竞争。适合测定设计的抗体应结合两种抗原,导致信号减弱(图1B),而构象特异性抗体应不受影响(图1C)。
表1:合适的单克隆抗细小病毒B19衣壳抗体的选择
至于表1,如果天然VLP有效地与固相结合的VLP竞争结合待研究的抗体,则信号减小的结果被设定为100%“信号减小”。观察抗体2.053,可以看到天然的VLP完全替代固相结合的VLP(100%信号减小)。另一方面,当变性的VLP(用1.4M NaOH处理)与天然固相结合的VLP竞争结合抗体2.053时,信号减小至仅57%。这意味着对于这种抗体,变性的VLP不与天然的VLP完全竞争。换句话说,抗体2.053不能有效地识别变性的VLP或只能较小程度地识别变性的VLP,因此在用NaOH预处理之后在病毒抗原检测测定中不适合作为结合组分。相反,例如抗体2.061以有效的方式结合VLP的两种变体,因为NaOH变性的VLP能够完全(100%)与天然VLP竞争结合抗体2.061。
从这些结果中,抗体2.061,2.068,2.081和2.106(以及更低程度的2.111和2.127)被鉴定为与(ⅰ)碱处理的衣壳多肽或(ⅱ)碱处理的衣壳多肽和未碱处理的衣壳多肽结合的抗体。
e)所选的抗B19单克隆抗体的中等规模生产
通过将相应的杂交瘤接种到CellLine生物反应器(Integra)中产生所选的mAbs。按照生物反应器制造商的说明进行生产。
实施例2
生物素和钌部分与单克隆抗体的偶联
来自所选的克隆的细胞培养上清液经过三步层析步骤纯化:首先对蛋白质A进行亲和层析,然后进行离子交换层析,最后进行负亲和层析以除去痕量的牛IgG,或者,通过应用大小排阻层析法进行精制步骤。
用N-羟基-琥珀酰亚胺活化的生物素和钌标记分子分别在5-30mg/mL的蛋白浓度下修饰融合多肽的赖氨酸ε-氨基。标签/蛋白质比例从2:1到10:1(mol:mol)变化,取决于各自的抗体。反应缓冲液是50mM磷酸钾pH 8.4,150mM KCl。反应在室温下进行15min,并通过加入缓冲的L-赖氨酸至终浓度10mM终止。为了避免标记的水解失活,在干燥的DMSO(Sigma-Aldrich,Germany)中制备各自的储备溶液。反应缓冲液中高达5%的DMSO浓度被所研究的所有融合蛋白良好耐受。偶联反应后,通过使粗蛋白缀合物通过凝胶过滤柱(例如Superdex200HiLoad)来除去未反应的游离标记。
实施例3
通过碱性预处理提高细小病毒B19检测测定的灵敏度
在自动2010和cobas e 411分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中评估细小病毒B19检测的灵敏度。是罗氏集团的注册商标。利用样品预培养以双抗体夹心形式进行测量。
2010和cobas e 411中的信号检测基于电化学发光。生物素缀合物(即捕获抗体)固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上,而检测抗体携带络合的钌阳离子(在氧化还原态2+和3+之间切换)作为信号部分。在特定分析物的存在下,显色钌络合物桥接到固相上,在铂电极处激发后在620nm处发光。信号输出是相对光单位。
通过双组分预处理评估具有不同pH的样品预温育的效果。组分1(PT1)含有不同浓度的HCl或NaOH或等渗NaCl作为对照,组分2(PT2)含有洗涤剂和还原剂。后者没有变化。预温育9min后,加入试剂缓冲液(200mM Hepes,150mM NaCl,10mM EDTA,0.01%甲基异噻唑啉酮,0.20%Tween20,0.30%牛血清白蛋白,pH6.8)和生物素化和钌化抗体。与对照实验(试剂1)相比,在碱性条件(试剂3至5)下的预温育导致信号增加,对照实验与活性样品(#2-7)中的酸性预处理相当或优于对照实验(试剂1)。另外,非特异性交叉干扰样品(#8)信号在试剂3至5中被减少为背景(样品#1),而酸性预温育不会减少来自非特异性相互作用的信号。碱性预温育的正面效果对于pH>10.5(试剂3-5)是可见的,而较低的预温育pH(试剂6)不会导致信号增加和非特异性信号的抑制。
Claims (15)
1.一种用于检测来自受试者的样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的方法,包括
(a)使所述样品与碱接触,和
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
2.权利要求1所述的方法,其中所述检测衣壳多肽包括借助捕获化合物将至少一种衣壳多肽捕获到固体表面。
3.权利要求1或2的方法,其中所述方法进一步包括使所述衣壳多肽与检测化合物接触。
4.权利要求2或3的方法,其中所述捕获化合物和/或检测化合物是与(i)碱处理的衣壳多肽或(ii)碱处理的衣壳多肽和非-碱处理的衣壳多肽特异性结合的结合化合物。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述检测所述病毒包括在夹心免疫测定中检测所述病毒。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述样品是粪便样品或体液样品。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述碱是氢氧化钠或氢氧化钾。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述使所述样品与碱接触包括在至少10.5的pH下温育所述样品。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述使所述样品与碱接触包括在所述碱存在下将所述样品温育至少2分钟。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述检测衣壳多肽包括检测所述病毒VP1、VP2和VP3衣壳多肽中的至少一种。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述无包膜病毒是细小病毒科的病毒,在一个实施方式中是灵长类红细胞病毒1(细小病毒B19)。
12.一种预处理来自受试者的样品以检测无包膜病毒的衣壳多肽的方法,包括使所述样品与碱接触。
13.一种用于检测样品中的无包膜病毒的衣壳多肽的试剂盒,其包含碱和至少一种特异性结合所述病毒的结合化合物。
14.碱在预处理受试者样品以用于检测无包膜病毒的衣壳多肽的免疫测定中;或用于借助免疫测定来检测受试者样品中的无包膜病毒的衣壳多肽中的用途。
15.一种用于检测样品中无包膜病毒的衣壳多肽的分析装置,其包含具有样品处理单元的分析单元,所述分析单元适于引起执行以下步骤:
(a)将施加到所述样品处理单元的样品与碱接触,和
(b)检测所述样品中所述病毒的衣壳多肽。
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