JP4855126B2 - パルボウイルスｂ１９抗原測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中のパルボウイルスＢ１９抗原を高感度に検出若しくは測定する方法及び検出若しくは測定する試薬若しくはキットに関する。

パルボウイルスは飛沫感染し、赤芽球で増殖する病原性ウイルスであり、その症状・疾患として、（１）伝染性紅斑（りんご病）（２）関節炎（３）造血障害発作（４）胎児水腫（hydrops fetal）などが知られている。

パルボウイルスＢ１９（parvovirus B19）は、1975年にCossartらによって発見されたウイルスである（非特許文献１参照）。当該ウイルスはパルボウイルス科のパルボウイルス属に位置する一本鎖DNAウイルスで20nmの正20面体構造でエンベロープを持たない小型のウイルスである。

Ｂ１９ウイルスは、加熱（60℃30 分）、酸（pH3）、クロロホルム，有機溶剤、界面活性剤処理に抵抗する。そのため血液製剤製造工程中でのＢ１９除去が困難であることから、赤十字血液センターでは原料血漿へのＢ１９ウイルス混入を減らすことを目的に、1997 年よりすべての献血血液についてReceptor Mediated Hemagglutination（RHA）検査法によるＢ１９ スクリーニング検査を実施している（非特許文献２参照）。その他のパルボウイルスＢ１９抗原の測定法としては、ＰＣＲ法によりウイルス遺伝子を増幅して測定する方法がある（非特許文献３参照）。また微量の抗原を抗パルボウイルスＢ１９抗体で測定する方法として、検体をｐＨ4.0以下の酸性条件で処理した後、免疫反応にあたってアルカリで検体を中和してから行う方法（特許文献１参照）等が報告されている。
特開２００１−３４３３８８ Cossart, Y.E., et al.: Parvovirous-like particles in human sera. Lancet,1: 72- 73, 1975 武田芳於他、献血血液のＲＨＡ検査による第VIII因子製剤原料血漿からのパルボウイルスＢ１９除去効果、Japanese Journal of Transfusion Medicine, 1: 27-31, 2002 斉藤由美子他、ヒトパルボウイルスＢ１９感染の診断へのＰＣＲの応用及びＥＬＩＳＡによる抗体測定、臨床病理，2： 203-208, 1993

ＲＨＡ検査はその原理上３〜５日間のウイルス血症期には有効だが、それに続いてＢ１９抗体の産生が始まると（抗原抗体複合期）Ｂ１９のreceptorであるＰ抗原と抗体が競合し、ＲＨＡ反応は著しく阻害され、当該期間に献血されたパルボウイルスＢ１９陽性検体はＲＨＡ検査では検出できない。

ＰＣＲ法による検査は、ターゲットであるパルボウイルスＢ１９遺伝子を増幅して測定する方法であり高感度な測定法ではあるが、測定するウイルスを抽出するための装置や増幅するための装置を必要とし、測定には多大な時間と高価な器機を必要とする。また、測定対象の検体へのコンタミネーションにより偽陽性が発生するおそれがある。

Ｂ１９抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によっても、ヒトパルボウイルスを検出することが可能であるが、検体中に存在するＢ１９に結合する因子、例えば抗体、Globoside(blood group antigen P)、Ku80、Integrin α5β1等の影響により十分な測定感度を得ることが困難である。

上記特許文献１は、パルボウイルスＢ１９抗原を高感度に測定する免疫測定方法を開示しているが、当該測定方法では検体を塩酸等の酸で処理した後、アルカリ性溶液で所望のｐＨに中和する必要がある。このような工程は、全自動血液スクリーニングシステムに本方法を適用する上で大きな障害となる。

本願発明は、上記のようなＲＨＡ検査およびＰＣＲ法に伴う問題点を有さないヒトパルボウイルスＢ１９抗原の免疫測定方法であって、酸性溶液による処理工程およびアルカリ性溶液による中和工程を含まない、簡便且つ高感度な測定方法を提供するものである。

本発明者らは、Ｂ１９抗原の免疫学的測定に際して予め検体をグアニジンで処理することにより、高感度にパルボウイルスＢ１９抗原を測定し得ることを見出した。

本発明はかかる知見に基づいて、検体をグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を含む溶液で処理することを特徴とするヒトパルボウイルスＢ１９抗原の免疫学的測定方法を提供するものである。

本発明において使用されるグアニジン塩としては、グアニジン塩酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩等があげられ、グアニジン誘導体としては、グアニジノ安息香酸、グアニジノグルタル酸、グアニジノコハク酸、グアニジノ酢酸、グアニジノプロピオン酸、グアニジノベンズイミダゾール等があげられる。

検体処理のために添加するグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体の濃度は最終濃度として0.1〜1Ｍの範囲であることが好ましく、また、そのｐＨは４．５〜６．５の範囲であることが好ましい。

本発明において使用する免疫測定方法は、競合法、サンドイッチ法等の公知のいずれの方法であってもよいが、特にサンドイッチ法が好ましい。

本測定方法において用いる抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、これら抗体はＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂等の抗体フラグメントであってもよい。

抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の作製用抗原または測定標準として用いられるヒトパルボウイルスＢ１９抗原は、公知の方法、例えば特開平７−１４７９８６号に記載されている方法にしたがって作製することができる。

サンドイッチ法で用いる固相としては、周知のマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられる。標識抗体への標識剤としては、蛍光物質、発光物質、酵素、放射性同位元素等が挙げられる。固相又は標識物への抗体を結合させる方法としては、周知の物理的吸着方法、化学的な反応による結合方法が挙げられる。

本願発明は、Ｂ１９抗原の免疫学的測定に際して予め検体をグアニジンで処理することにより、高感度にパルボウイルスＢ１９抗原を測定し得るとの予期せぬ効果を奏するものである。

特開平１１−３４４４９３号公報は、測定可能な濃度域が一定濃度範囲に限定される凝集反応を利用した免疫的測定法において、グアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を反応系に共存させることにより測定可能な範囲が拡大することを教示している。

本発明においてグアニジン類を用いる目的はあくまで凝集法特有の問題を解決するものであり、凝集法に限らず免疫測定法一般においてヒトパルボウイルスの測定感度を改善する本願発明の効果は特開平１１−３４４４９３により予見し得るものではない。

特開平２００１−３３４４５号公報には、ウイルス抗原試薬の調製において、ウイルス抗原をタンパク質変性剤で処理した後に酸化剤で希釈または透析することにより当該ウイルス抗原の抗原活性を改善し得ることが記載されている。

本願発明は、検体をグアニジン類で処理することにより、検体中に含まれる免疫反応に影響する因子を排除することによってパルボウイルス抗原の免疫測定方法の検出感度を改善するものであり、その目的、機作および構成が異なることから本願発明の効果は特開平２００１−３３４４５により予見し得るものではない。

特開平１１−１０８９３２号公報には、ウイルスを含む検体を陰イオン界面活性剤とグアニジンを含む蛋白変性剤との並存下で処理する方法が示されている。かかる方法は、検体中の蛋白質のみならずウイルスのエンベロープ膜蛋白質を強力に破壊し、膜内中の抗原蛋白質を曝露させ、中和処理後に免疫反応により当該抗原蛋白質を測定する方法に関するもので、その明細書中にはパルボウイルスの記載も認められるが、実施例に列挙されているのはＣ型肝炎ウイルスのみであり、本願発明のグアニジンのみによるエンベロープ膜を有さないパルボウイルス含有検体処理の有効性を何ら示唆するものではない。

特開平８−５０１３３号公報は、外殻を有するウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスの殻内タンパク質ＨＢｃＡｇの免疫測定方法において、ＨＢｃＡｇ抗体に結合し、免疫測定を阻害する内因性の抗ＨＢｃＡｇ抗体を予めタンパク質変性剤で不活性化した後に外殻を破壊し、露出したＨＢｃＡｇを検出する方法を開示している。

本願発明の測定対象であるパルボウイルスは外殻タンパク質を有さず、したがって特開平８−５０１３３号に記載されたタンパク質変性剤による前処理をパルボウイルスの免疫測定において適用する合理的理由はない。

特開平７−１５１７５３号公報は、同一アッセイ系における抗原抗体反応時間の相違に起因する測定誤差、即ち「アッセイドリフト」の影響を回避することを目的として反応系にグアニジンを添加することを開示している。

特開平７−１５１７５３号公報に記載された発明の目的は、パルボウイルス抗原の簡便且つ高感度な測定方法を提供する本願発明の目的と全く異なるものであり、したがって本願発明の効果は特開平７−１５１７５３号公報の記載に基づき予見し得るものではない。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

ABBOTT PRISM システム
米国Abbott LaboratoriesのPRISM アナライザーを用いて実施した実施例を示す。システムは、輸血用血液の安全性を向上させ、効率的な血液供給を行うために開発された全自動血液スクリーニングシステムである。独自の化学発光免疫測定法による優れた感度と特異性に加え、160検体／時という大量検体の処理を実現する。

本システムでは、1検体あたり２つのウエル（インキュベーションウエルとリアクションウエル）を有するリアクショントレイ（16検体用）にて、化学発光免疫測定を実施する。

本法の原理は、インキュベーションウエル上で、検体、検体希釈液、及び抗原あるいは抗体を固相化したマイクロパーティクル懸濁液をインキュベーションし、検体中の抗体あるいは抗原を特異的にマイクロパーティクル上の抗原あるいは抗体に反応させる(一次反応)。反応生成物は、リアクションウエルに移送され、リアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着される。この反応生成物は、アクリジニウム標識コンジュゲートにより検出される(二次反応)。このコンジュゲートは、アクチベータ溶液の存在下で化学発光を引き起こし、それを光電子増倍管で検出するものである。

以下、［パルボウイルス測定プロトコール］PRISMアナライザー上でのステップを示す。

１）一次反応 リアクショントレイのインキュベーションウエル上で、以下に示す容量の検体、検体希釈液、及び抗パルボウイルス抗体を固相化したマイクロパーティクル懸濁液を混合する。

検体(血清、または血漿) 50uLまたは、100uL
検体希釈液（Guanidine 溶液） 50uL
抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクル懸濁液 50uL

２）インキュベーション 37℃、18分間インキュベーションし、検体中の抗体あるいは抗原を特異的にマイクロパーティクル上の抗原あるいは抗体に反応させる。

３）移送／洗浄 移送／洗浄液（トランスファーウォッシュ液）300uLを2回で、反応生成物をインキュベーションウエルからリアクションウエルに移送し、リアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着させると同時に洗浄する。

４）二次反応 アクリジニウム標識コンジュゲート（アクリジニウム化抗パルボウイルス抗体）溶液 50uLをリアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着し洗浄された反応生成物に滴下する。

５）インキュベーション 37℃、22.7分間インキュベーションし、反応生成物とアクリジニウム標識コンジュゲートの反応を進行させ、検体中にパルボウイルス抗原が存在した場合、抗体固相化マイクロパーティクル−パルボウイルス抗原−コンジュゲート複合体を形成させる。

６）洗浄 コンジュゲート浄液（コンジュゲートウォッシュ液）200uLを1回、次いで100uLを3回で、未反応のコンジュゲートを洗い流し、複合体を浄化する。

７）アクリジニウムの活性化 アクチベータ溶液 50uLを滴下し、複合体上のアクリジニウムを活性化する。

８）検出 アクリジニウムの活性化により引き起こされた化学発光を光電子増倍管で検出する（化学発光度は、RLU（相対的化学発光単位）値として数値化される）。

実施例1 以下に実施例１で用いる試薬の調製に関して記述する。

１）パネル検体の調製：陽性検体（パルボウイルス Ｂ１９ DNAレベル10¹³ IU/mL）を陰性検体（パルボウイルス Ｂ１９ DNAレベル0 IU/mL）にて希釈し、10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷ IU/mLの感度パネルを調製した。

２）検体希釈液（Guanidine 溶液）の調製：クエン酸／リン酸緩衝液にグアニジン濃度が２Mとなるようにグアニジン塩酸塩を溶解させ、ｐHを5.5に調整した。

３）抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクルの調製：反応pH 6.1（50ｍM MES緩衝液）容量10mLで、Merck社製蛋白質固相化用マイクロパーティクル（顆経0.4ミクロン）固形分1.0％、EDAC（N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride）0.3mg／mL、Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 0.45mg／mLの存在下、抗体0.5mg／mLを固相化した。室温で2時間反応後10ｍM リン酸、150ｍM NaClで洗浄し、オーバーコート緩衝液（10ｍM リン酸、150ｍM NaCl、1% BSA、5％ショ糖、0.1％ Proclin 300, pH 7.2）中に固形分1.0％で保管した。PRISMアッセイ時は、マイクロパーティクル希釈液（10ｍM リン酸、150 mM NaCl, 13.6％ショ糖、0.05% Tween20, 0.1% NaN3、pH 7.0）にて固形分0.2％に調製した。

４）トランスファーウォッシュ液の調製：50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.1% NaN3, pH 8.0の溶液を調製した。

５）アクリジニウム標識コンジュゲートの調製：反応pH 8.0（100ｍM PBS緩衝液）容量0.2mLで、Acridinium ester、250ug/mLと抗体5mg／mLを室温で3時間反応させた。10ｍM リン酸、150 mM NaClで透析後、TSKgel G300SWXL(トーソー株式会社)のカラムクロマトグラフィー、移動相0.1％CHAPS／PBS,ｐH6.3、流速1.0ｍL/分で主要ピークを分取して精製した。PRISMアッセイ時は、アクリジニウム標識コンジュゲート希釈液（10ｍM リン酸、150 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween20、0.1% NaN₃、pH 7.0）にて蛋白質濃度100ng/mLに調製した。

６）コンジュゲートウォッシュ液の調製：60mM Borate, 150 mM NaCl, 0.01% Lithium Dodecyl Sulfate, 0.1% NaN3, pH 8.5の溶液を調製した。

７）アクチベータ溶液の調製：A液（0.4％ Hydrogen Peroxide/0.06% Diethylenetriaminepentaacetic acid）とB液（0.3N Sodium Hydroxide）を等量、用事混合して調製した。

実施例１： パルボウイルス陰性、パルボウイルス Ｂ１９ DNAレベル：10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷ IU/mLの感度パネルを上述のABBOTT PRISMシステム［パルボウイルス測定プロトコール］に従いPRISM上で測定した。グアニジン処理の有無で比較した結果を表１に示す。抗体は抗パルボウイルスＢ１９マウスモノクローナル抗体Ｍａｂ−８およびＭａｂ−１０を用いた。

抗体Ｍａｂ−８／Ｍａｂ−１０およびＭａｂ−１０／Ｍａｂ−１０いずれの組合わせにおいてもグアニジン溶液で希釈することにより検出感度が大きく改善されることが確認された。

実施例２： パルボウイルス Ｂ１９陽性検体（パルボウイルス Ｂ１９ DNA陽性検体21種）を上述のABBOTT PRISMシステム［パルボウイルス測定プロトコール］に従いPRISM上で測定した。グアニジン処理の有無で比較した結果を表２に示す。 測定に使用した各試薬は、実施例1で作製したものものを用いた。 各検体中の抗パルボウイルス Ｂ１９抗体（IgG及びIgM）の陽性・陰性の判定を併せて示す。尚、抗体測定方法は、デンカ生研株式会社製キットの添付文書に従った。

抗パルボウイルス抗体陽性検体中では、パルボウイルス抗原（主にキャプシド構造蛋白質VP1、VP2）に抗体が結合していると予想されるが、本願発明の方法ではグアニジン処理によりこれら因子間相互作用が破壊され、検査用抗体（抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクル、及びアクリジニウム標識コンジュゲート）による抗原の直接的な認識が可能になった。

実施例３： 検体希釈液（Guanidine 溶液）の濃度並びにｐＨの最適化検討
実施例１の２)に示す検体希釈液（Guanidine 溶液）のグアニジン濃度とリン酸緩衝液又はクエン酸／リン酸緩衝液によるｐＨ調整を検討した。2）以外の試薬は、実施例1で作製したものものを用いた。検討に用いたのはパルボウイルス Ｂ１９陽性パネル（ DNAレベル：10¹⁰）並びに陰性パネルを用いた。ｐH５．５〜６．５の検討は、クエン酸緩衝液で実施、ｐH４．５〜６．０はクエン酸／リン酸緩衝液で実施した。

ｐＨ４．５〜６．５の範囲で所望の効果が得られ、好ましくは５．５〜６．５の範囲であることが確認された。

Claims (4)

1. 検体をｐＨ４．５〜６．５のグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を含む溶液で処理することを特徴とするヒトパルボウイルスＢ１９抗原の免疫学的測定方法。
2. 検体を処理するグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体の測定時における最終濃度が０．１〜１ Ｍである請求項１記載の免疫学的測定方法。
3. 固相化抗体と標識抗体によるサンドイッチ法による請求項１又は２記載の免疫学的測定方法。
4. 免疫学的測定時にｐＨ４．５〜６．５に調整されるグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を含む検体希釈液を含む、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原の免疫学的測定用キット。