WO2005111620A1 - Ｂ型肝炎ウィルスの検出方法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウィルスの検出方法 Download PDF

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WO2005111620A1
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hepatitis
treating
hbv
virus
antigen
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PCT/JP2005/009158
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Chiharu Oue
Noboru Maki
Tatsuji Kimura
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Advanced Life Science Institute, Inc.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B

Definitions

  • the present invention provides a method for treating an HBV-containing specimen for detecting or quantifying a hepatitis B virus (hereinafter referred to as “HBV”) antigen with high sensitivity, and an HBV using the treatment method. It relates to a method for detecting or quantifying an antigen.
  • HBV hepatitis B virus
  • HBV is the first virus identified as the causative virus of post-transfusion hepatitis, and is transmitted by blood transfusion during surgery. Therefore, diagnosing the presence or absence of HBV infection in blood is extremely important for screening transfusion blood.
  • an antibody detection method for detecting an antibody against HBV present in a sample there are an antibody detection method for detecting an antibody against HBV present in a sample, an antigen detection method for detecting an antigen of HBV, and a method for detecting a gene of HBV.
  • HBV gene detection methods include NAT (nucleic acid amplification method) and DNA probe method, which are currently widely used in clinical practice.
  • NAT nucleic acid amplification method
  • DNA probe method DNA probe method
  • the NAT test methods such as the PCR method and the TMA method are highly sensitive detection methods for detecting gene fragments.
  • the procedure requires a processing time of as long as two hours, which is complicated because it involves multiple operation steps. Power!
  • the complexity of such operations has increased the chances of contamination and increased the possibility of false positive samples.
  • skill is required to obtain a stable quantitative value.
  • the development of automated equipment has reduced contamination measures and shortened the processing time for DNA extraction.Since expensive equipment is still required, it has become widespread except for facilities that process large amounts of specimens. Absent.
  • the DNA primer must match the target gene, several primers need to be used, which raises the cost per test compared to immunoassays. There is a title.
  • HBV antigen testing has used the HBs antigen detection method for blood screening, and the HBe antigen measurement method has been widely used as an HBV proliferation marker.
  • HBc antigen In addition to vigorous antigen testing, a method for directly detecting the HBV core antigen (HBc antigen) has also been developed. Usuda et al. (Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998) have developed a method for detecting HBc antigen in serum using a monoclonal antibody specific for HBV core (HBc) antigen. It was shown to have clinical utility as well as the NAT test for detecting the viral genome described above. Such an HBc antigen detection system is relatively tolerant to contamination because no amplification operation is added during the detection process.
  • the method still has problems in several respects. Since the process of sample processing for measurement is complicated and time-consuming, it becomes a problem when it is used for applications such as screening and monitoring. In other words, HBs polyclonal antibody treatment (37 ° C, 2 hours), centrifugation (10 minutes), removal of supernatant, treatment of specimen (serum), concentration of virus particles and removal of serum components It requires multi-step treatments such as surfactant treatment, alkali treatment (35 minutes), and addition of a neutralizing agent. Since such a process is a very skillful operation, a skill level is required to obtain reproducibility, and a processing time of at least about 3 hours is required. In addition, since there are steps such as centrifugation operation and supernatant removal, automation is difficult and simultaneous large-scale processing is difficult, so that it is suitable for applications requiring large-scale processing in terms of operation.
  • HBV core-related antigen (HBcr antigen) measurement method International Publication WO 02/14871 A1 for simultaneously measuring HBe antigen and HBc antigen, and HBV forming virus-like particles of HBV P22cr antigen (HBV p22cr antigen) assay (PCT / JP03 / 11389) developed Has been getting better. These methods are still inadequate when compared to force gene assays, which are more sensitive than HBc antigen measurements.
  • Patent Document 1 JP-A-8-50133
  • Patent Document 2 International Publication WO 02/14871 A1 Publication
  • Non-Patent Document 1 Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998
  • the immunoassay is simple and inexpensive to measure
  • the current HBe antigen assay used as a proliferation marker measures the HBe antigen present as an immune complex in the presence of the HBe antibody. Can not do it.
  • the HBe antigen assay has a correlation with the amount of HBV DNA, the pretreatment is complicated as described above, and furthermore, it has not been applied to clinical tests due to insufficient sensitivity.
  • the sample is pretreated using a surfactant and heat (56-70 ° C)! ⁇ , Measured after destroying antibodies and virus particles.
  • an object of the present invention is to provide an HBV core-associated antigen (HBe and HBe antigen) even in the presence of an HBV antibody, for use in screening for hepatitis B and monitoring in the treatment of chronic hepatitis B patients. And a pretreatment method for quantifying HBV p22cr antigen and the like, and a measurement method using the same. That is, it is intended to provide an HBV antigen detection system that can be easily applied to a large-scale processing system such as automation with a simple pretreatment in a shorter time.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, (a) detection of HBV antigens in a sample using a probe with a simple operation only in a short time was performed. A method for treating HBV-containing samples that can be placed in a suitable state, and (b) detection of HBV antigens in the samples For this purpose, we focused on a treatment method that can simultaneously inactivate antibodies against host-derived HBV antigens that compete with the capture probe and detection probe by a short and simple treatment.
  • treatment of the sample with an acidifying agent to measure HBV antigen and (d) treatment of a surfactant, a protein denaturing agent, and a reducing agent in addition to the treatment, the HBV antigen present in the sample is measured.
  • a surfactant, a protein denaturing agent, and a reducing agent in addition to the treatment, the HBV antigen present in the sample is measured.
  • a method for treating an HBV-containing sample comprising dissociating an HBV antigen and inactivating an antibody that binds to the HBV antigen by treating with a treating agent containing HBV.
  • a method for immunologically detecting an HBV antigen comprising:
  • Diagnostic agent or diagnostic kit containing the following acidifying agent (1) and at least one substance selected from the group consisting of (2) in the treating agent that processes the specimen to detect HBV antigen .
  • amphoteric surfactant an alkyl group and a tertiary
  • Min or quaternary ammonium salt in the molecule Surfactants, nonionic surfactants, and protein denaturants.
  • Protein denaturing agent amphoteric surfactant having alkyl group and tertiary amamine or quaternary ammonium salt in the same molecule, alkyl group and tertiary amamine or quaternary ammonium salt
  • a treating agent containing a combination of two or more of a cationic surfactant, a protein denaturant, a nonionic surfactant, and a reducing agent having a salt in the same molecule
  • a method for treating an HBV-containing specimen comprising dissociating the HBV antigen and inactivating the antibody against the HBV antigen.
  • the virus particles of HBV can be easily released in a short time to release a virus antigen in a state suitable for a so-called immunological measurement method for detecting an antigen using a probe such as an antibody. It becomes possible to inactivate antibodies against the antigen.
  • HBV antigens are detected using a probe such as an antibody by treating a sample containing HBV according to the method shown by the present invention. It is possible to detect and quantify in a short time and with high sensitivity.
  • the problems such as precipitation due to acid treatment can be eliminated, proteins can be efficiently destroyed, and virus antigens can be released easily and in a short time, resulting in significantly improved sensitivity. It is possible to achieve the effect.
  • FIG. 1 is a view showing the results of examining the effect of an acidifying agent (hydrochloric acid) concentration in sample treatment.
  • Samples in the method for treating an HBV antigen-containing sample according to the present invention include biological blood such as whole blood, plasma, serum, urine, saliva, and cerebrospinal fluid, and liver tissue. .
  • the infectious particles of HBV are thought to be Dane particles with a structure of 42nm in diameter.
  • the outer lipoprotein is the HBs antigen
  • the protein that forms a nucleoside (core particle) with a diameter of 27 nm inside is the HBc antigen.
  • HBV p22cr antigen as a protein that forms nucleoside-like particles of HBV. It is thought that this molecule forms a core-like particle and has an HBs antigen outside thereof.
  • Hepatitis B is generally diagnosed by detecting HBs antigen or HBe antigen. However, they do not accurately reflect the time of infection or the amount of infectious particles. For this reason, it is necessary to measure HBc antigen, HB core-related antigen and HBV p22cr antigen which form virus particles or virus-like particles.
  • the HBc antigen and the p22cr antigen are present as proteins forming virus particles, and an anti-HBV antibody forms an immune complex with the HBe antigen and the like.
  • an anti-HBV antibody forms an immune complex with the HBe antigen and the like.
  • I) destruction of HBV particles to release HBc antigen and HBV p22cr antigen from HBV particles and to release antigen as much as possible II) Inactivates or removes antibodies against HBc antigen and HBe antigen of host-derived HBV; III) HBc antigen and HBe from interaction with other blood components other than antibodies against HBV antigen It is necessary to release antigen and HBV p22cr antigen. It is considered that it is desirable to inactivate the antibody against HBV antigen because the number of force treatment steps that can be removed by centrifugation operation or affinity column operation increases.
  • HBc antigen, HBe antigen and HBV p22cr antigen contained in a limited sample amount in the detection system can be converted from HBV particles, antibodies against HBV antigen, other blood components, etc. Release into a state increases the number of antigen molecules that can react with the probe. It is important to release the antigen to the maximum single molecule state by short and simple sample processing and to increase the reactivity with the probe.
  • Conditions for inactivating the activity of the antibody present in the sample include an alkali treatment and an acid treatment.
  • serum When serum is treated with acid, some proteins derived from serum are irreversibly denatured, and in some cases, precipitate or cloudiness may occur. For this reason, pipetting of the treated sample after acid treatment of the sample often causes obstruction such as clogging.
  • a carrier to which a probe such as an antibody that captures a target antigen during measurement is bound
  • precipitates involving denatured proteins and the like in the solid phase may be adsorbed and give false positives. The target antigen is involved in these precipitates, and the amount of antigen capable of binding to the probe is reduced, resulting in a problem that sensitivity is reduced.
  • the acidifying agent hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid and the like are suitable.
  • the concentration of the acidifying agent is preferably 0.05 N or more and 1 N or less at the time of treatment, and more preferably 0.25 N to 1 N.
  • the sample to which the acidifying agent has been added is treated at pH 2.5 or less, and most of the samples are treated at pH 2.0 or less.
  • a surfactant As one of the treating agents to be added to the acidifying agent, a surfactant is exemplified. It is known that a wide variety of surfactants have an action of destroying the higher-order structure of proteins, and have effects such as destruction of virus particle membranes, denaturation of antibodies, and solubility of insoluble proteins. However, in the presence of a mild detergent, the structural epitope of the target antigen is also broken, A major problem is that the binding to a probe such as a capture antibody is weakened and the sensitivity is reduced.
  • the temporarily denatured structure may return to its original state by diluting the concentration of the surfactant by dilution or dialysis. This means that there is an antibody derived from the sample that competes with the measurement probe, and it is clear that the sensitivity is reduced as a result.
  • the added calo of the surfactant has the above two-sided properties.
  • Surfactants are variously classified according to their structure and properties. For example, there are ionic and nonionic surfactants, and ionic surfactants further include anionic, cationic and amphoteric surfactants.
  • the present inventors have solved the problem of acid treatment such as precipitation and the problem of surfactant treatment such as reactivation of antibodies in a specimen by combining an acidifying agent and a surfactant. As a result, it has been found that it has a large sensitivity increasing effect on the detection of HBV antigen.
  • an amphoteric surfactant having an alkyl group and a tertiary amine or a quaternary ammonium salt in the same molecule or an alkyl group and a tertiary amine or quaternary amine It has been found that the use of a cationic surfactant having a high-grade ammonium salt in the same molecule has a remarkable effect.
  • an acidifying agent and an amphoteric surfactant having a single-chain alkyl group having 12 or more carbon atoms and a tertiary amine or quaternary ammonium salt in the same molecule or A remarkable effect can be obtained by combining a cationic surfactant having 12 or more single-chain alkyl groups and a tertiary amine or quaternary ammonium salt in the molecule.
  • a treating agent comprising an acidifying agent and the above-mentioned surfactant may be added to a nonionic interface such as a polyoxyethylene isootatyl ether ether such as TritonXlOO or a polyoxyethylene sorbitan alkyl ester such as Tween20.
  • a nonionic interface such as a polyoxyethylene isootatyl ether ether such as TritonXlOO or a polyoxyethylene sorbitan alkyl ester such as Tween20.
  • activators addition of protein denaturants such as urea and thiourea, and addition of reducing agents such as cysteine, cysteamine, dimethylaminoethanethiol, getylaminoethanethiol, diisopropylaminoethanethiol and dithiothreitol. was found to be more preferable.
  • the present invention provides a method comprising: (1) an acidifying agent, (2) an alkyl group and And tertiary amine or quaternary ammonium salt in the same molecule, and an amphoteric surfactant, or an alkyl group and a tertiary amine or quaternary ammonium salt in the same molecule.
  • Antibodies that release HBV antigens and bind to HBV antigens when treated with a cationic surfactant, a nonionic surfactant, a protein denaturant, and a treating agent containing (3) a reducing agent Provided is a method for treating an HBV-containing specimen, characterized by inactivating HBV.
  • the amphoteric surfactant having an alkyl group and a tertiary amine or a quaternary ammonium salt in the same molecule includes N-dodecyl- ⁇ ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammonium- O-1-Propanes norehone 1 ⁇ (N-dodecy N, N-dimethy-t 3-ammonio- ⁇ -propanesulfonate), N-fafacil- ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammono-1- Propane sulfonate (N-dodecy N, N-dimethy-t 3-ammonio- ⁇ -propanesulfonate), N-fafacil- ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammono-1- Propane sulfonate (
  • Examples of the cationic surfactant having an alkyl group and a tertiary amamine or a quaternary ammonium salt in the same molecule include decyltrimethylammonium chloride ((Decyltrimethylammonium Chloride)).
  • Such an alkyl group and a tertiary amine or quaternary ammonium salt are added in the same molecule.
  • the concentration of the amphoteric surfactant or cationic surfactant during the treatment is preferably 0.1% or more and 15% or less, more preferably 0.5% to 10%.
  • Acidifying agents and nonionic surfactants added to amphoteric surfactants or cationic surfactants having an alkyl group and a tertiary amine or quaternary ammonium salt in the same molecule Suitable are polyoxyethylene isootatyl ethers such as Triton XlOO, polyoxyethylene nor ether ethers such as NP40, or polyoxyethylene sorbitan alkyl esters such as Tween80, and the concentration thereof is appropriate.
  • the concentration at the time of treatment is preferably 1% or more and 7.5% or less, more preferably 1% or more and 5% or less.
  • a cationic surfactant having an alkyl group and a tertiary amamine or quaternary ammonium salt in the same molecule
  • concentration thereof is preferably 0.5 M or more, more preferably 1 M or more and less than 8 M in the concentration at the time of treatment.However, when solubility does not matter, for example, If urea is added in powder form to the sample processing tube in advance, up to 10M can be used.
  • Other substances added to the acidifying agent include protein denaturants such as urea as described above. It is known that a powerful protein denaturant has the effect of partially destroying the higher-order structure of a protein by weakening the hydrogen ion bond. It is possible to denature. It also has the effect of solubilizing insoluble precipitates, for example, by solubilizing a recombinant protein expressed in Escherichia coli from the inclusion body, which is an insoluble fraction. However, in the presence of protein denaturants such as urea, the structural epitope of the target antigen is also broken, and the antigen is captured. There is also a disadvantage that the binding to a probe such as an antibody for capture is weakened, and the sensitivity is reduced.
  • the denaturing action of a protein denaturant such as urea is often reversible, and the temporarily denatured structure may return to its original state by diluting the protein denaturant concentration by dilution or dialysis. is there. This clearly indicates that there is an antibody derived from the sample that competes with the measurement probe, resulting in a decrease in sensitivity.
  • the addition of a protein denaturant such as urea has the duality as described above.
  • the present inventors By combining the acid treatment and the protein denaturing agent treatment, the present inventors have solved the problems of the acid treatment such as precipitation and the problems of the protein denaturing agent treatment such as reactivation of the antibody in the sample. To complete another invention of the present invention.
  • urea which is one of the protein denaturants
  • the concentration of the protein denaturant is preferably 1 M or more, more preferably 1.5 M or more and 8 M or less in the concentration at the time of processing.
  • a nonionic surfactant such as polyoxyethylene isooctyl ethers such as Triton XlOO or polyoxyethylene sorbitan alkyl esters such as Tween 20 is added to the treating agent consisting of an acid sizing agent and a protein denaturant. It has been found that S has an effect, such as an increase in sensitivity. Further, a reducing agent can be added to a treating agent comprising an acidifying agent and a protein denaturing agent.
  • the present invention provides a method for preparing a specimen containing hepatitis B virus (HBV) using (1) an oxidizing agent, and (2) an alkyl group and a tertiary amine or quaternary ammonium.
  • HBV antigen release and treatment with HBV antigen by treating with an amphoteric surfactant or an alkyl group and a cationic surfactant containing a -Palm salt in the same molecule, or a treating agent containing a protein denaturing agent
  • An object of the present invention is to provide a method for treating an HBV-containing sample, which comprises inactivating a binding antibody.
  • the treatment temperature in the method for treating an HBV-containing specimen according to the present invention is a force that can be used even at a high temperature, preferably 20 ° C to 50 ° C, more preferably 25 ° C to 42 ° C.
  • the most Preferred are those having an alkyl group and a tertiary amine or a quaternary ammonium salt in the same molecule! / Amphoteric surfactant or an alkyl group and a tertiary amine or quaternary ammonium salt.
  • a treating agent to be combined with an acidifying agent an alkyl group, an amphoteric surfactant having a tertiary amine or a quaternary ammonium salt in the same molecule
  • a treatment agent such as a cationic surfactant, a protein denaturant, a nonionic surfactant, a reducing agent, or an anionic surfactant having a quaternary or quaternary ammonium salt in the molecule.
  • a treatment agent such as a cationic surfactant, a protein denaturant, a nonionic surfactant, a reducing agent, or an anionic surfactant having a quaternary or quaternary ammonium salt in the molecule.
  • the method for immunologically detecting an HBV antigen comprises: contacting an HBV-containing sample with a treating agent containing an acidifying agent and a surfactant and Z or a protein denaturant; And a step of inactivating the antibody that binds to the HBV antigen (first step) and a step of detecting the HBV antigen using a probe that binds to the HBV antigen (second step).
  • a probe used for detection for example, an antibody may be any as long as it has a constant and high affinity capable of specifically binding to the HBV antigen.
  • one of the probes for capturing the HBV core-related antigen in the sample treated in the first step is desirably a monoclonal antibody such as HB44, HB114, or HB61.
  • probe refers to a polyclonal antibody obtained by immunizing experimental animals such as mice, rats, guinea pigs, egrets, -birds, goats, sheep, and horses, and spleen cells from immunized individuals.
  • Human antibodies infected with HBV monoclonal antibodies produced by hybridomas obtained by isolating and fusing with myeloma cells, etc., or monoclonal antibodies produced by spleen cells and cells obtained by immortalizing leukocytes in blood with EB virus, , Polyclonal antibodies produced by chimpanzees, etc., cDNAs of immunoglobulins from mice, humans, etc., variable region gene fragments obtained from chromosomal DNA, or immunoglobulins. Shows high specificity and affinity for HBV antigens, such as variable region gene fragments constructed by combining cDNA and part of chromosomal DNA with artificially generated sequences. Is a molecule.
  • the HBV antigen forms an immune complex by, for example, an antigen-antibody reaction with the monoclonal antibody as described above.
  • This immune complex is formed by a sandwich method using two kinds of antibodies.
  • the presence of the HBV antigen can be detected as a signal by a colorimetric method or a chemiluminescent method using the labeling enzyme present in the immune complex.
  • the fluorescent substance can be incorporated into the immune complex by directly binding the fluorescent substance to the antibody, and the fluorescence can be detected as a signal.
  • the present invention provides a kit for diagnosing HBV infection using the above-described immunological detection method.
  • This diagnostic kit contains an acidifying agent, a protein denaturing agent, and a Z or surfactant in a treating agent for treating a specimen containing HBV. It is preferable that the kit contains a probe such as an antibody that binds to the antigen of HBV.
  • Oxidizing agent concentration HBV antigen negative sample or HBV antigen positive sample (# 990277, # 990544, # 990623, # 990768) Add 100% hydrochloric acid aqueous solution to 100 ⁇ 1 and incubate at room temperature for 10 minutes The test was performed using the measurement method described below with 100 1 as a measurement sample.
  • anti-HBV core-related antigen monoclonal antibody HB44, HB114, HB61 mixed at a ratio of 2: 1: 1
  • 1001 at a concentration of 4 ⁇ g / ml.
  • Emission intensity was measured with a luminometer (DIA-IATRON, Luminous CT-9000D), and the results are shown in Fig. 1.
  • the hydrochloric acid concentration shown in FIG. 1 was represented by the concentration at the time of processing after mixing the sample (Sample) and the processing agent.
  • HBV antigen-positive specimens (# 990277, # 990544) are hardly detectable for HBV core-related antigen activity even after incubation at room temperature for 10 minutes in a solution containing no hydrochloric acid. Relevant antigen activity was observed, peaking at 0.25 to 1.0 N. In addition, although examination was performed using sulfuric acid instead of hydrochloric acid, almost the same results were obtained.
  • nonionic surfactants such as TritonXlOO and Tween 20
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • LDS Lithium dodecyl Sulfate
  • Surfactants having a steroid skeleton, such as CHAPS showed no improvement in reactivity.
  • N-lauroyl sarcosine nadoxycholic acid was also studied. In the presence of the acidifying agent, sufficient solubility was obtained.
  • An increase in the measurement sensitivity was observed by adding a cationic surfactant having a platinum salt in the same molecule.
  • the acidifying agent was removed from the treating agent for the acidifying agent and the surfactant, and the treatment was carried out only with an effective surfactant, the measurement sensitivity was greatly reduced. From this, it was considered that the increase in measurement sensitivity was based on the acidifying agent, and was greatly increased by adding a surfactant.
  • Triton X-114 0.5 170 11857 2856 27651
  • HBV antigen-negative sample or HBV antigen-positive sample (# 990277, # 990544, # 990768) Dissolve urea, one of the protein denaturants, in 1.0 N hydrochloric acid aqueous solution in 100 ⁇ 1 and add 100 1 to the mixture. After incubation at room temperature for 10 minutes, 1001 was used as a measurement sample and examined by the method described in Example 1. The ratio of the immunoreactivity of each HBV antigen-positive sample to the immunoreactivity of an HBV antigen-negative sample (absorbance of HBV antigen-positive sample, absorbance of ZHBV antigen-negative sample) was determined and is shown in Table 6.
  • Reduce HBV antigen-negative specimen (Normal plasma) or three HBV antigen-positive specimens (# 990277, # 990544, # 990768) 100 1 to a solution containing 1.0N hydrochloric acid, 1.5M urea, 5.0% TritonX100, 1.5% C16APS A solution 1001 containing a mixture of dithiothreitol, cysteamine hydrochloride and getyl aminoethanethiol hydrochloride was added to the mixture, and the mixture was incubated for 10 minutes at room temperature. We studied using the method described (Table 7).
  • the concentration of the reducing agent used here was represented by the concentration at the time of processing the sample.
  • the present invention provides a simple and highly operable sample processing method for detecting or quantifying HBV antigen in blood with high sensitivity, and a method for detecting or quantifying HBV using the same. Diagnosis of the presence or absence of HBV infection enables rapid and accurate screening of blood for transfusion. In addition, a diagnostic kit can be provided, which greatly contributes to the efficiency of HBV antigen detection.

Abstract

  血清中のＢ型肝炎ウイルス(HBV)抗原を検出または定量する方法、ならびにこれらの検出および定量に用いられる極めて簡易で操作性が高い検体処理方法の提供。   Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)を含む検体を、（１）酸性化剤、および（２）蛋白質変性剤、またはアルキル基および第３級アミンもしくは第４級アンモニウム塩を分子中に有している両性界面活性剤または陽イオン界面活性剤を含有する処理剤で処理することにより、HBV抗原の遊離とHBV抗原に結合する抗体の破壊を行うことを特徴とするHBV含有検体の処理方法。　

Description

明 細 書
B型肝炎ウィルスの検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、血中の B型肝炎ウィルス（以下、「HBV]という。）抗原を高感度で検出ま たは定量するための、 HBV含有検体の処理方法および該処理方法を用いる HBV抗 原の検出または定量方法に関するものである。
背景技術
[0002] HBVは、輸血後肝炎の原因ウィルスとして最初に同定されたウィルスであり、手術 時の輸血によって感染する。そのため、輸血用血液のスクリーニングにとって、血液 の HBV感染の有無を診断することが極めて重要である。
かかる HBV感染の診断法としては、検体中に存在する HBVに対する抗体を検出す る抗体検出法、 HBVの抗原を検出する抗原検出法、または HBVの遺伝子を検出す る方法がある。
[0003] 力かる検出方法のうち HBV遺伝子の検出方法には、 NAT (核酸増幅法)や DNAプ ローブ法があり、現在広く臨床現場で用いられている。また、 NAT検査の普及により 、 HBV DNA量と HBVキャリアの病態との関連が注目され、抗ウィルス剤による治療後 のモニタリングには NAT検査が主に利用されてきている。
[0004] PCR法および TMA法等の前記 NAT検査法は、遺伝子断片を検出するには高感 度な検出方法である。しかしながら、検体中から HBVゲノム DNAを抽出する際、用手 法において処理時間が 2時間も必要であり、複数回の操作工程を含むなど煩雑であ る。力！]えて、このように操作が複雑であるために、コンタミネーシヨンの機会が増え、偽 陽性検体の生じる可能性を増加させている。また、安定した定量値を得るためには熟 練を要するという問題もある。近年、自動化機器の開発により、コンタミネーシヨン対 策や DNA抽出の処理時間の短縮がなされてきた力 依然として高価な機器を必要と するため、検体を多量処理する施設以外には一般に普及はしていない。さらに、 DNAプライマーが標的遺伝子と一致しなければならな 、ため、プライマーを数種類も 使用する必要があり、検査あたりのコストが免疫測定法と比較して高くなるといった問 題点がある。
[0005] HBV遺伝子検査にはこのような問題があるため、ウィルス抗原検出法が注目され ている。従来、 HBV抗原検査では、血液スクリーニングのために HBs抗原検出法が 利用されており、 HBVの増殖マーカーとしては HBe抗原測定法が汎用されてきた。
[0006] 力かる抗原検査に加え、 HBVコア抗原 (HBc抗原）を直接検出する方法も開発され た。 Usudaら（Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998)は、 HBVコア（HBc) 抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中の HBc抗原を検 出する方法を開発し、前記のウィルスゲノムを検出する NAT検査法と同様に臨床的 有用性を持つことを示した。かかる HBc抗原検出系は、検出過程で増幅処理操作が 加わらないため、コンタミネーシヨンに対し比較的寛容である。
[0007] し力しながら、前記方法にもいくつかの点で問題が残されている。測定のための検 体処理の工程が繁雑であり、かつ時間が力かることからスクリーニングおよびモニタリ ングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち、検体 (血清）の処理のた めに、ウィルス粒子の濃縮と血清成分の除去のために HBsポリクローナル抗体処理（ 37°C、 2時間）、遠心操作（10分間）、上清の除去、界面活性剤処理、アルカリ処理（ 35分間）、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。かかる工程は、非常 に熟練を要する作業であるため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また 最低約 3時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程がある ために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており、操作面においても 大量処理を必要とする用途に適して 、な 、。
[0008] また押原らは、 HBsポリクローナル抗体での処理を行わずに、アルカリ処理、プロナ ーゼ処理、非イオン界面活性剤であるノ-デット P40 (NP-40)およびメルカプトエタノ ールの添カ卩により HBc抗原の測定を行う方法を開発している（特開平 8-50133)。しか しながら力かる方法も感度が低ぐ HBV-DNAとして 2.2pg/mlの検出感度であり、 DNAの量としては 105から 106コピー/ ml程度と考えられる。
[0009] 前記 HBc抗原検出法に加え、 HBe抗原と HBc抗原を同時に測定する HBVコア関連 抗原（HBcr抗原）の測定法（国際公開 WO 02/14871 A1)や HBVのウィルス様粒子を 形成する HBVの p22cr抗原（HBV p22cr抗原）の測定法（PCT/JP03/11389)が開発さ れてきている。これらの方法は HBc抗原の測定より高感度である力 遺伝子測定法と 比較すると未だ十分とは言えない状況にある。
[0010] 特許文献 1：特開平 8-50133号公報
特許文献 2 :国際公開 WO 02/14871 A1公報
特許文献3 0171^03/11389明細書
[0011] 非特許文献 1： Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 免疫測定法は操作が簡便で安価に測定できるが、増殖マーカーとして用いられて Vヽる現行の HBe抗原測定法では、 HBe抗体の存在下では免疫複合体として存在する HBe抗原を測定することができない。また、 HBe抗原測定法は、 HBV DNA量と相関は あるものの、前記のように前処理が繁雑であり、さらに感度不足のため臨床試験に応 用されていない。
[0013] 一方、 HBVコア関連抗原の測定や HBV p22cr抗原の測定では、界面活性剤と熱（ 56-70°C)を用いて検体の前処理を行！ヽ、抗体やウィルス粒子を破壊した後に測定し ている。
しかしながら、力かる方法においても、検体を off-boardで処理する必要があり、完全 自動化は困難である。
[0014] 従って、本発明の課題は、 B型肝炎のスクリーニングや B型慢性肝炎患者の治療に おけるモニタリングなどに用いるため、 HBV抗体の存在下においても HBVコア関連抗 原（HBeおよび HBe抗原）や HBV p22cr抗原等を定量するための前処理方法および それを用いた測定方法を提供することにある。すなわち、より短時間に簡便な前処理 で、自動化などの大量処理システムに容易に適用可能な HBV抗原検出系を提供す ることにめる。
課題を解決するための手段
[0015] そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、（a)検 体中の HBV抗原を短時間の簡単な操作のみで、プローブを用いた検出に適した状 態にすることが可能な HBV含有検体の処理方法および (b)検体中の HBV抗原の検 出のために、捕捉用プローブや検出用プローブと競合する宿主由来の HBV抗原に 対する抗体を短時間で簡単な処理により、同時に不活化させ得る処理方法に着目し た。また、（c) HBV抗原を測定するため、検体の酸性化剤による処理、および (d)該 処理に加えて界面活性剤、蛋白質変性剤、還元剤の処理により、検体中に存在する HBV抗原を、ウィルス粒子または免疫複合体力も遊離させることができ、同時に検体 中に存在する HBVに対するヒト抗体も不活化され、そして、（e)該処理法により、抗体 のようなプローブを用いた免疫測定法に最適な検体を提供することができることを見 出した。さら〖こ、 （f) HBV抗原を含む検体中の HBV抗原をウィルス粒子力も遊離し、 同時に検体中に存在する HBVに対するヒト抗体をも不活化する処理剤によって検体 を処理する工程を提供し、該処理工程を含む HBV抗原を免疫学的測定法によって 検出および定量する方法、ならびに (g)該処理剤を含む HBV抗原の測定キットを提 供できることを見出し、カゝかる知見に基いて、本発明の完成に到達した。
力べして、本発明によれば、次の 1〜3に示す、
1. HBVを含む検体を、
(1)酸性化剤、および
(2)界面活性剤および Zまたは蛋白質変性剤
を含有する処理剤で処理することにより、 HBV抗原の解離と HBV抗原に結合する抗 体の不活化を行うことを特徴とする HBV含有検体の処理方法。
2. HBV抗原の免疫学的検出方法であって、
(1)前項 1に記載の HBV含有検体の処理を行う工程、および
( 2) HBV抗原に結合するプローブを用 ヽて HBV抗原を検出する工程
を含む HBV抗原の免疫学的検出方法。
3. HBV抗原を検出するために検体を処理する処理剤中に下記の（1)の酸性化剤お よび (2)の群力 選択される少なくとも 1種の物質を含む診断薬または診断薬キット。
(1)酸性化剤。
(2)アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を分
子中に有して 、る両性界面活性剤、アルキル基および第 3級ァ
ミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を分子中に有して 、る陽イオン 界面活性剤、非イオン界面活性剤、ならびに蛋白質変性剤。
が提供される。
[0017] さらに、 HBV含有検体の処理方法の好ましい実施態様として、次の 1)または 2)を 挙げることができる。
すなわち、
1) HBVを含む検体を、
(1)酸性化剤、および
(2)蛋白質変性剤、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同 分子中に有している両性界面活性剤、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級 アンモ-ゥム塩を同分子中に有している陽イオン界面活性剤、または非イオン界面 活性剤の 、ずれかを含有する処理剤
で処理することにより、 HBV抗原の解離と HBV抗原に結合する抗体の不活化を行う HBV含有検体の処理方法。
2) HBVを含む検体を、
(1)酸性化剤、および
(2)アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有して V、る両性界面活性剤、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を 同分子中に有している陽イオン界面活性剤、蛋白質変性剤、非イオン界面活性剤、 または還元剤のいずれかの 2種以上の組み合わせを含有する処理剤
で処理することにより、 HBV抗原の解離と HBV抗原に対する抗体の不活ィ匕を行うこと を特徴とする HBV含有検体の処理方法。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、抗体などのプローブを用いて抗原を検出するいわゆる免疫学的 測定方法に適した状態に、 HBVのウィルス粒子力も簡便に、短時間でウィルス抗原 を遊離させ、 HBV抗原に対する抗体を不活ィ匕することが可能となる。また、本発明に よって示される方法によって、 HBVを含む検体を処理することにより、抗体などのプロ ーブを用いて抗原を検出する ヽゎゆる免疫学的測定方法に従 ヽ HBV抗原を簡便、 短時間でかつ高感度に検出および定量することが可能となる。さらに、本発明によれ ば、酸性化剤に加えて界面活性剤等の使用により酸処理による沈殿等の問題を解 消し、蛋白質を効率よく破壊し、簡便、かつ短時間でウィルス抗原を遊離させ、著しく 優れた感度向上効果を奏することが可能である。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]検体処理において酸性化剤 (塩酸)濃度による効果を検討した結果を示す図で ある。
符号の説明
[0020] 一▲一 HBV抗原陽性検体 (#990277)
一△一 HBV抗原陽性検体 (#990544)
—♦— 健常人血清 (Normal serum;
一口 健常人血漿 (Normal plasma)
発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明に係る HBV抗原含有検体の処理方法における検体としては、全血、血漿、 血清、尿、唾、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などを挙げることができ る。
[0022] HBVの感染性粒子は直径 42nmの構造の Dane粒子だと考えられている。その外皮 のリポ蛋白が HBs抗原であり、内部の直径 27nmのヌクレオ力プシド（コア粒子）を形成 する蛋白が HBc抗原である。この他に、 HBVのヌクレオ力プシド様の粒子を形成する 蛋白として HBV p22cr抗原があるが、この分子がコア様粒子を形成し、その外側に HBs抗原を持って ヽると考えられる。
[0023] B型肝炎の診断は、 HBs抗原の検出または HBe抗原の検出により行われるのが一 般的である。しかしながら、これらは感染時期や感染粒子の量を正確に反映するもの ではない。このため、ウィルス粒子またはウィルス様粒子を形成している HBc抗原、 HBコア関連抗原や HBV p22cr抗原を測定することが必要である。
[0024] 検体中では HBc抗原、 p22cr抗原はウィルス粒子を形成する蛋白として存在してお り、また抗 HBV抗体により HBe抗原などと免疫複合体の形成がみられる。この中で、 HBc抗原、 HBe抗原や HBV p22cr抗原を検出するためには、 I) HBV粒子を破壊して 、 HBc抗原や HBV p22cr抗原を HBV粒子カゝら遊離させると共に抗原をできるだけ単 分子化する、 II)宿主由来の HBVの HBc抗原、 HBe抗原に対する抗体を不活ィ匕また は除去する、 III) HBV抗原に対する抗体以外の他の血中成分との相互作用から HBc 抗原、 HBe抗原や HBV p22cr抗原を遊離させることが必要である。 HBV抗原に対する 抗体は、遠心操作やァフィユティーカラム操作などで除去できる力 処理工程が増え ることから不活ィ匕することが望ま 、と考えられる。
[0025] 検出系の中で限られた検体量に含まれている HBc抗原、 HBe抗原や HBV p22cr抗 原を、 HBV粒子、 HBV抗原に対する抗体、他の血中成分などから最大限単分子の状 態に遊離させることが、プローブと反応可能な抗原分子数を増カロさせることとなる。短 時間かつ簡易な検体処理により、抗原を最大限単分子の状態に遊離させ、プローブ との反応性を高めることが重要である。
[0026] 検体中に存在する抗体の活性を失活させる条件は、アルカリ処理、酸処理などが 知られている。血清などを酸処理すると、一部の血清由来蛋白質などは不可逆的に 変性し、場合によっては沈殿や白濁を生じることがある。このため、検体の酸処理後、 処理検体のピペッティング操作では、詰まりなどの障害になることが多ぐまた、測定 の際に標的とする抗原を捕捉する抗体などのプローブが結合している担体や固相に 変性蛋白質などを巻き込んだ沈殿が吸着し、擬陽性を呈することがある。カロえて、そ れらの沈殿物の中に標的とする抗原が巻き込まれ、プローブと結合可能な抗原量の 減少のため、感度が低下するという問題も生じる。
[0027] 本発明は、酸性化剤に他の物質を添加することによって、酸処理による沈殿や白 濁などの防止や、擬陽性の防止および感度の上昇を達成することができる。
ここで酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、トリクロル酢酸などが 、適当である。特に、酸性化剤濃度は、処理時濃度で 0.05N以上 1 N以下が好ましぐ さら〖こ 0.25 N〜l Nが好ましい。この場合酸性化剤を加えた検体は pH2.5以下、ほと んどの検体で pH2.0以下で処理していることになる。
[0028] 前記酸性化剤に添加する処理剤の 1つとして界面活性剤が挙げられる。多種多様 な界面活性剤が蛋白質の高次構造を壊す作用をもつことが知られており、ウィルス 粒子膜の破壊、抗体の変性、不溶性蛋白質の可溶ィ匕などの効果がある。しかしなが ら、カゝかる界面活性剤の存在下では、標的とする抗原の構造ェピトープも壊れ、抗原 捕捉用抗体などのプローブとの結合が弱められ、感度が低下することが大きな問題と なる。
[0029] また、一方で界面活性剤の変性作用は可逆的であることが多ぐ希釈や透析などに よって界面活性剤濃度を薄めることによって一時的に変性した構造が元に戻る場合 がある。このことは、測定用プローブと競合してしまう検体由来の抗体が存在すること となり、結果として感度低下となることが明らかである。つまり、界面活性剤の添カロは、 以上のような二面性をもっている。また界面活性剤は、それらの構造や性質によって 様々に分類される。例えば、イオン性および非イオンの界面活性剤があり、イオン性 界面活性剤としてはさらに陰イオン、陽イオン、両性界面活性剤などが挙げられる。
[0030] 本発明者らは、酸性化剤と界面活性剤を組み合わせることで、沈殿物などの酸処 理の問題点、検体中抗体の再活性化などの界面活性剤処理の問題点が解消され、 HBV抗原の検出に関して大きな感度上昇効果を示すことを見出した。
特に界面活性剤のなかで、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥ ム塩を同分子中に有して 、る両性界面活性剤、またはアルキル基および第 3級ァミン もしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有して 、る陽イオン界面活性剤を用いる ことにより、顕著な効果を奏することを見出した。
さらに酸性化剤と、炭素数 12個以上の一本鎖アルキル基および第 3級ァミンもしく は第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有している両性界面活性剤、または炭素数 12 個以上の一本鎖アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモニア塩を同分子 中に有している陽イオン界面活性剤を組み合わせることにより、著しく顕著な効果が 得られる。
[0031] さらに、酸性化剤と前記界面活性剤からなる処理剤に、 TritonXlOOなどのポリオキ シエチレンイソオタチルフエ-ルエーテル類や Tween20などのポリオキシエチレンソ ルビタンアルキルエステル類などの非イオン界面活性剤の添加や、尿素、チォ尿素 などの蛋白質変性剤の添加や、システィン、システアミン、ジメチルアミノエタンチォ ール、ジェチルアミノエタンチオール、ジイソプロピルアミノエタンチオール、ジチォス レイトールなどの還元剤の添加が、さらに好ましいことを見出した。
[0032] つまり本発明は、 HBVを含む検体を、 (1)酸性化剤、ならびに（2)アルキル基およ び第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有して 、る両性界面活性 剤、またはアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に 有している陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、さらに蛋白質変性剤、および (3)還元剤を含有する処理剤で処理することにより HBV抗原の遊離と HBV抗原に結 合する抗体の不活化を行うことを特徴とする HBV含有検体の処理方法を提供する。
[0033] アルキル基および第 3級ァミンまたは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有して ヽ る両性界面活性剤としては、 N-ドデシル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンス ノレホネ1 ~~ト (N— Dodecyト N,N— dimethyト 3— ammonio—丄一 propanesulfonate)、 N—ァ ファ シル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホネート（
N—Tetradecy卜 N,N— dimethy卜 3— ammonio— 1— propanesulfonate)、 N—へキサァンノレ -Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホネート（
N—Hexadecyl—N,N— dimethyl— 3— ammonio— 1— propanesulfonate)、 N—ォクタァンノレ -Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホネート（
N—Octaaecyト N,N— mmethyト《3— ammonio— 1— propanesulfonateノなと 適当 fc-Do
[0034] また、アルキル基および第 3級ァミンまたは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有し て ヽる陽イオン界面活性剤としては、デシルトリメチルアンモ -ゥムクロライド（（ Decyltrimethylammonium Chloride)、ドデシノレトリメチノレアンモ -ゥムクロライド ( Dodecyltrimethylammonium Chloride)、テトラアシノレトリメチノレアンモ -ゥムクロライド ( Tetradecyltrimethylammonium Chloride)、へキサデシノレトリメチノレアンモ -ゥムクロラ イド (Hexadecyltrimethylammonium Chloride)、アシノレトリメチノレアンモ-ゥムブ口マイ ド (Decyltrimethylammonium Bromide)、ドデンノレトリメチノレアンモ -ゥムブロマイド ( Dodecyltrimethylammonium Bromide)、テトラテシノレトリメチノレアンモ -ゥムブロマイド (Tetradecyltrimethylammonium Bromide)、へキサテンノレトリメチノレアンモ-ゥムブロ マイド (Hexadecyltrimethylammonium Bromide)、ラウリノレピリジ -ゥムクロライド Lauryl pyridinium Chloride)、テトラテシノレピリジ-ゥムクロライド (Tetradecyl pyridinium Chloride)、セチノレピリジ-ゥムクロライド（Cetyl pyridinium Chloride)など が適当である。
[0035] このようなアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中 に有している両性界面活性剤または陽イオン界面活性剤の処理時濃度は、 0.1%以 上 15%以下が好ましぐさらに、 0.5%〜10%が好ましい。
酸性化剤、ならびにアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を 同分子中に有している両性界面活性剤または陽イオン界面活性剤に添加する非ィ オン界面活性剤としては、 TritonXlOOなどのポリオキシエチレンイソオタチルフエ-ル エーテル類や NP40などのポリオキシエチレンノ-ルフエ-ルエーテル類または Tween80などのポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類などが適当であり、 それらの濃度は、処理時濃度で 1%以上 7.5%以下が好ましぐさらに 1%以上 5%以 下が好ましい。
[0036] 酸性化剤、ならびにアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を 同分子中に有している両性界面活性剤または陽イオン界面活性剤に添加する蛋白 質変性剤としては、尿素、チォ尿素などが適当であり、それらの濃度は、処理時濃度 で 0.5M以上が好ましぐさらに 1M以上 8M未満が好ましいが、溶解性などが問題と ならな 、場合、たとえば検体処理用チューブに予め粉末で尿素を添加しておくなど の場合は、 10Mまでは使用可能である。
[0037] 酸性化剤、ならびにアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を 同分子中に有して ヽる両性界面活性剤または陽イオン界面活性剤に添加する還元 剤としては、システィン、システアミン、ジメチルアミノエタンチオール、ジェチルァミノ エタンチオール、ジプロピルアミノエタンチオール、ジチオスレィトールなどが適当で あり、それらの濃度は、処理時濃度で 0.25mM以上 lOOOmM以下が好ましぐさらに 1.5mM以上 200 mM以下が好ましい。
[0038] 酸性化剤に添加する他の物質としては前記の如ぐ尿素などの蛋白質変性剤が挙 げられる。力かる蛋白質変性剤は、水素イオン結合を弱めることにより、蛋白質の高 次構造を部分的に壊す作用をもつことが知られており、ウィルス粒子膜の破壊ゃ検 体中の標的抗原に対する抗体を変性させることが可能である。また、例えば大腸菌 で発現させた組換え蛋白質を、不溶性分画であるインクルージョンボディーから可溶 化させるなど、不溶性沈殿物を可溶ィ匕させる効果をもっている。しかしながら、尿素な どの蛋白質変性剤の存在下では、標的とする抗原の構造ェピトープも壊れ、抗原捕 捉用抗体などのプローブとの結合が弱められ、感度が低下するという難点もある。
[0039] また、一方で尿素などの蛋白質変性剤の変性作用は可逆的であることが多ぐ希釈 や透析などによって蛋白質変性剤濃度を薄めることによって一時的に変性した構造 が元に戻る場合がある。このことは、測定用プローブと競合してしまう検体由来の抗 体が存在することとなり、結果として感度低下となることが明らかである。つまり、尿素 などの蛋白質変性剤の添加には、以上のような二面性をもっている。
本発明者らは、酸処理と蛋白質変性剤処理を組み合わせすることにより、沈殿物な どの酸処理の問題点、検体中抗体の再活性化などの蛋白質変性剤処理の問題点が 解消されることを見出し、本発明のもうひとつの発明を完成させるに至ったものである
[0040] 本発明者らは、蛋白質変性剤のひとつである尿素を処理時 1M以上を添加すること によって、酸処理による沈殿物の形成を、大きく減少させることを見出した。この蛋白 質変性剤としては、尿素、チォ尿素などが適当である。また蛋白質変性剤濃度は、処 理時濃度で 1M以上が好ましぐさらに 1.5M以上 8M以下が好ましい。さらに、酸性 ィ匕剤と蛋白質変性剤からなる処理剤に、 TritonXlOOなどのポリオキシエチレンイソォ クチルフエ-ルエーテル類や Tween20などのポリオキシエチレンソルビタンアルキル エステル類などの非イオン界面活性剤を添加することにより感度の上昇などの効果 力 Sあることを見出した。さらに酸性化剤と蛋白質変性剤からなる処理剤に還元剤を添 加することも可能である。
[0041] 上述のことをまとめると、本発明は、 B型肝炎ウィルス (HBV)を含む検体を、（1)酸 性化剤、ならびに（2)アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を 同分子中に有して ヽる両性界面活性剤またはアルキル基および陽イオン界面活性 剤、あるいは蛋白質変性剤を含有する処理剤で処理することにより HBV抗原の遊離 と HBV抗原に結合する抗体の不活ィ匕を行うことを特徴とする HBV含有検体の処理方 法を提供するものである。
[0042] さらに、本発明に係る HBV含有検体の処理方法における処理温度は、高温でも可 能である力 好ましくは 20°C〜50°C、さらに好ましくは 25°C〜42°Cである。
また、本発明において酸性化剤と組み合わせる処理剤のうち、界面活性剤で最も 好ましいものはアルキル基および第 3級ァミンまたは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子 中に有して!/、る両性界面活性剤あるいはアルキル基および第 3級ァミンまたは第 4級 アンモニア塩を同分子中に有して 、る陽イオン界面活性剤であり、その他の処理剤と しては蛋白質変性剤である。この 2つの処理剤に非イオン界面活性剤を加え、それ に還元剤をカ卩えることにより、処理の効果の上昇が見られた (実施例 4参照)。このこと は処理剤の組み合わせ力 処理の効果の上昇につながることを示したものである。例 えば、酸性化剤と組み合わせる処理剤としては、アルキル基と、第 3級ァミンまたは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有している両性界面活性剤、アルキル基と、第 3級 ァミンまたは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有している陽イオン界面活性剤、蛋 白質変性剤、非イオン界面活性剤、還元剤、または陰イオン界面活性剤などの処理 剤がある。これらのうち 2種以上の処理剤を組み合わせ、酸性化剤と同時に処理する ことにより、効率よく HBVを含む検体を処理することが可能である。
[0043] 本発明に係る HBV抗原の免疫学的検出方法は、 HBV含有検体を酸性化剤と、界 面活性剤および Zまたは蛋白質変性剤とを含有する処理剤と接触させることにより、 HBV抗原の解離と HBV抗原に結合する抗体の不活ィ匕を行なう工程 (第一工程)と HBV抗原に結合するプローブを用いて HBV抗原を検出する工程 (第二工程）とから なるものである。
前記第二工程において、検出に用いるプローブ、例えば抗体は HBV抗原に特異的 に結合するものである力 一定の高い親和性を示すものであればよい。例えば、前記 第一工程で処理された検体中の HBVコア関連抗原を捕捉するプローブの一つは HB44、 HB114、 HB61などのモノクローナル抗体であることが望ましい。
[0044] ここでいうプローブとは、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、 -ヮトリ、ャギ、ヒッジ、ゥ シなどの実験動物を免疫して得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から脾臓細 胞などを分離し、ミエローマ細胞などと融合させることによって得られるハイプリドーマ が産生するモノクローナル抗体、または脾臓細胞、血中白血球を EBウィルスによって 不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、 HBVに感染しているヒト、チンパ ンジ一などが産生しているポリクローナル抗体、マウス、ヒトなどのィムノグロブリンの cDNA、染色体 DNAから得られる可変領域遺伝子断片、またはィムノグロブリンの cDNA、染色体 DNAの一部と人工的に作製した配列とを組み合わせることによって構 成される可変領域の遺伝子断片などカゝら遺伝子組み換えによって構成される、 HBV 抗原に高い特異性、親和性を示す分子である。
[0045] 本発明に係る HBV抗原の免疫学的検出方法にぉ ヽて、 HBV抗原は、例えば、前 記の如きモノクローナル抗体との抗原抗体反応により免疫複合体となる。この免疫複 合体は、 2種の抗体によるサンドイッチ法などで形成される。この免疫複合体中に存 在する標識酵素を発色法、化学発光法により、 HBV抗原の存在をシグナルとして検 出することができる。また、蛍光物質を直接抗体に結合させることなどにより、免疫複 合体中に蛍光物質を取り込ませ、その蛍光をシグナルとして検出することもできる。 さらに、本発明は上述の免疫学的検出法を用い、 HBVの感染を診断するキットを提 供する。この診断キットは、 HBVを含む検体を処理する処理剤中に、酸性化剤と蛋白 質変性剤および Zまたは界面活性剤を含む。またキットには、 HBVの抗原に結合す る、抗体のようなプローブを含む方が好ましい。
実施例
[0046] 以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも本発明は、これら の実施例等により限定されるものではない。
[0047] 実施例 1
酸件化剤濃度: HBV抗原陰性検体または HBV抗原陽性検体（#990277、 # 990544、 #990623、 #990768) 100 ^ 1に、各種濃度の塩酸水溶液 100 1を添加して 、室温で 10分間インキュベーションを行い、その 100 1を測定試料として、以下に記 す測定法を用いて検討した。
96穴マイクロプレート（FluoroNunc Module, Maxisoap surface)に、抗 HBVコア関連 抗原モノクローナル抗体（HB44、 HB114、 HB61を 2: 1:1の比率で混合）を 4 μ g/mlの 濃度で 100 1を加え、 4°Cでー晚インキュベートした。
[0048] 0.15M NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 pH7.3で 2回洗浄後、 0.5%カゼインナトリウム を含む 10mMリン酸緩衝液 pH7.1を 350 1カ卩ぇ 2時間インキュベートした。ブロッキン グ液除去後、中和剤を含む反応緩衝液 100 μ 1と各々の検体処理法で得られた測定 試料を各ゥエルにカ卩ぇ攪拌しながら室温で 2時間反応させ、 0.05% Tween20を含む 10mMリン酸緩衝液 pH7.3 (洗浄液） 350 1で 6回洗浄し、さらにアルカリホスファタ一 ゼ (ALP)標識したモノクローナル抗体（HB91と HB110の同量混合） 100 1を添カ卩して 室温で 30分間反応させた。洗浄液で 6回洗浄し、基質溶液 (TROPIX, CDP-star with Emerald II) 100 μ 1を加え 20分間インキュベートした。
[0049] ルミノメーター (DIA-IATRON, Luminous CT-9000D)で発光強度を測定し、その結 果を図 1に示す。尚、図 1に示す塩酸濃度は、検体 (Sample)と処理剤を混合後の処 理時濃度で表した。
HBV抗原陽性検体（#990277、 #990544)は、塩酸を含まない溶液で室温 10分間 インキュベーションを行なってもほとんど HBVコア関連抗原活性を検出できなカゝつた 力 処理時の塩酸濃度 0.05Nよりコア関連抗原活性が認められ、 0.25〜1.0 Nでピー クとなった。また、塩酸の代わりに硫酸を用いて検討したが、ほぼ同様な結果が得ら れた。
[0050] 実飾 12
酸件化剤共存下に: ける各 界商活件剤濃度: HBV杭原陰件檢体または HBV杭 原陽性検体（#990277、 #990544、 #990768) 100 1に、各種界面活性剤を溶解し た 1.0 N塩酸濃度の水溶液を 100 1添加して、室温で 10分間インキュベーションを行 い、その 100 1を測定試料として、実施例 1で採用した方法で検討した。検討結果を 表 1〜表 5に示す。また、各表中、測定値の下線部は判定基準を超えたケースである ことを示す。
[0051] 表 1〜表 5によれば、 3例の検体のうち少なくとも 1例が、各々の検体の判定基準より 高い反応性を示した界面活性剤を添加効果あり、と判断した。その結果、塩酸または 硫酸のような酸性化剤とともに各種界面活性剤を添加すると、 HBV抗原陽性検体中 のコア関連抗原免疫活性が大きく上昇した界面活性剤が認められた。添加効果が認 められたのは、アルキル基と、第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中 に有して!/、る両性界面活性剤またはアルキル基と、第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ -ゥム塩を同分子中に有して 、る陽イオン界面活性剤であった。
[0052] また、 TritonXlOOや Tween 20のような非イオン界面活性剤にも添加効果が認めら れた。陰イオン界面活性剤である Sodium dodecyl sulfate (SDS)、 Lithium dodecyl sulfate (LDS)は、 0.5%以上の濃度で検体との反応中に白濁したが中和剤を含む反応 緩衝液を添加した後溶解し、効果を確認することができた。 CHAPSのようなステロイド 骨格を有する界面活性剤は、反応性の向上を示さなカゝつた。他に、 N-lauroyl sarcosine Naゃデォキシコール酸なども検討した力 酸性化剤との共存では溶解性 が十分でな力つた。
[0053] 酸性化剤にアルキル基と第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を同分子中に有 している両性界面活性剤またはアルキル基と第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム 塩を同分子中に有している陽イオン界面活性剤を添加することにより測定感度の上 昇が認められた。この酸性化剤と界面活性剤の処理剤から酸性化剤を除き、効果の あった界面活性剤のみで処理を行ったが測定感度は大きく低下した。このことから測 定感度の上昇は酸性化剤を基礎とし、界面活性剤を添加することにより大きく上昇す るものと考えられた。
[0054] [表 1]
系
陰性サンプル 陽性サンヲル 健常人血清
濃度 (％)
無添加
洗剤効果の判定基準
に添加した界面活性剤
才クチル卜リメチルアンモニゥ厶クロライド
デシルトリメチルアンモニゥ厶クロライド
)。 ドデシルトリメチルアンモニゥムクロライド
テトラデシルトリメチルアンモニゥムクロライド
〔 へキサデシルトリメチルアンモニゥムクロライド
ラウリルピリジニゥムクロライド
2]
HBV陰性サンプル HB 陽性サンプル
健常人血清 #990277 #990544 #990768 濃度 (％)
無添加 0 136 11014 2634 34595 洗剤効果の判定基準 15420 3688 48433
0.5N HCIに添加した界面活性剤
へキシルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 253 12044 4302 27024
(Hexyltnmethylammonium Bromide)
1 249 10241
[CH3(CH2)5N(GH3)3]Br 46Q2 28610
2 214 7842 4301 22250
5 107 5165 3577 13782 ォクチルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 136 Π316 3528 32491
(Oct ltnmethylammonium Bromide)
[CH3(CH 7N(CH3)3]Br 1 103 8832 3424 23472
2 198 6652 3268 16111
5 57 2596 793 3769 デシルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 146 10862 2868 26087
(Decyltrimethylammmonium Bromide)
[CH3(CH2)9N(CH3)3]Br 1 103 9975 3308 16957
2 58 6988 2558 10411
5 80 4466 2677 8274 ドデシルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 165 14345 3673 30367
(Dodecyltnmethylammmonium Bromide)
1 116 9962 4581 29491
2 216 15309 5578 26777
5 190 10204 5402 17091 亍トラデシルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 209 16926 6645 43S41 ί retradecyltrimethylammmonium Bromiaeノ
[CH3(GH2)13N(CH ] Br ' 278 16655 6869 37064
2 401 14375 6827 29279
5 294 13023 3300 24118 へキサデシルトリメチルアンモニゥムブロマイド 0.5 227 18706 8451 56923
(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)
[CH3(CH2)15N(CH3)3]Br 1 254 19937 7813 35855
2 244 15221 4128 27210
5 602 11052 2539 Π021 3]
HBV陰性サンプル HBV陽性サンプル
健常人血清 #剛277 #990544 #990768 濃度 (¾)
無添加 α 148 9294 2175 38028 洗剤効果の判定基準 13941 3263 57042
0.5N HCIに添加した界面活性剤
3-[3- (クロマイドプロフィル)ジメチル アンモニォ 0.5 192 10068 2306 28850
]-1-プロパンスルホネート 1 185 9429 1498 19808
(3-[3-(Cholamidopropyl)dimethyl-ammontoJ- 2 185 7Β23 1205 17336
1 -propane sulfonate; 5 122 6911 881 14768
N-ドデシル- N, N-ジメチル -3-アンモニォ- 0.5 171 17118 5251 43825
1-プロパンスルホネート 1 170 26990 7945 50648
(N-Dodecyl-N, N- dimethyト 3 - ammonio— 2 116 28246 7316 55167
1-propanesulfonate 5 1 3 32885 9698 47512
CH3(CH2)1l fCH3)2CiCH2)3S03]
N—亍トラデシル— N. N-ジメチル— 3—アンモニォ- 0.5 135 17307 5976 48591 卜プロパンスルホネート 1 123 30527 9273 62242
(N-Tetradecyl-N, N_dimethyト ammonio -
2 212 36256 8276 66746
1— propanesulronate)
CH3(CH |3N(CH3)2[(CH2)3S03] 5 121 42918 16172 64794
N-へキサデシル- N, N-ジメチル- 3-アンモニ才- 0.5 158 26139 9224 73370
1-プロパンスルホネート 1 113 25348 7818 85287
(N-Hexadecyl-N, N- dimethyト 3- ammomo -
2 170 41969 9925 75342
1-propanesulfonate)
CH3(CH2)l5N(CH3)2[(CH，）3S03] 5 161 35782 H9J6 55028 ォクタデシル- N-ジメチル -3-アンモニォ- 0.5 269 21151 11844 67221 卜プロパンスルホネート 1 206 20731 9871 57204
(N-Octadecyl-N. N— dimethyト 3-ammomo—
2 2Β3 24829 13125 73931
1 - propanesulfonate)
CH,(CH;jJ17NCCH3)2[(CH?)3S03] 5 229 34152 11351 7771_9
4]
非イオン性
HBV陰性サンプル HBV暘性サンプル 健常人血清 #990277 #990544 #990768 濃度 (％)
無添加 0 180 10750 2494 39102 洗剤効果の判定基準 16125 3741 58653
0.5N HCIに添加した界面活性剤
Triton X-100 0.5 233 14133 2817 35471
1 174 14708 2871 33252
2 181 14034 3128 39651
5 160 17943 3504 38406
Triton X-114 0.5 170 11857 2856 27651
1 188 12349 2412 27956
2 160 12364 2874 29669
5 155 12854 2166 33038
Tween 20 0.5 205 12619 2732 34325
1 205 12781 2639 29741
2 232 18025 3703 58099
5 202 35451 8842 95495
Tween 60 0.5 240 11401 4234 49473
1 194 17189 4315 64879
2 245 18620 10542 137707
5 209 25964 7551 144107
Tween 80 0.5 234 13184 3086 39029
1 115 13639 3532 51167
2 216 20826 7126 98056
5 236 43646 15778 173578
Bridj 35 0.5 175 11862 2797 34825
1 197 10424 2009 45445
2 289 16694 2912 43862
5 259 7897 2659 43319
MEGA-10 0.5
1 145 9680 2793 29472
2 253 14129 4328 45222
5 332 20245 10125 85021
5] 陰イオン性
HBV陰性サンプル HBV陽性サンプル
健常人血清 #990277 #990544 #990768 濃度 '。）
無添加 0 167 7793 2679 26761 洗剤効果の判定基準 11690 4019 40142
0.5N HCIに添加した界面活性剤
ソデュ一厶ドデシルサルファイト 0.5 160 12516 3772 53253
(Sodium Dodecyl Sulfate) 1 152 18948 5767 84477
CH3CCH2)1lOS03Na 2 204 45240 13482 168004
5 301 31229 16960 168734 リチウムドデシルサルファイト 0.5 196 14409 4239 53651
(Lithium Dodecyl Sulfate) 1 135 20956 6324 46040
CH3CCH2)nOS03Li 2 236 29248 10044 89739
5 448 37765 23853 199795
[0059] 実飾 13
酴件 Tに: ける ；
HBV抗原陰性検体または HBV抗原陽性検体（#990277、 #990544、 #990768) 100^1に、蛋白質変性剤のひとつである尿素を 1.0 N塩酸水溶液に溶解し、その 100 1を添カ卩して、室温で 10分間インキュベーションを行い、その 100 1を測定試料とし て、実施例 1で述べた方法で検討した。各々の HBV抗原陽性検体の免疫活性を、 HBV抗原陰性検体の免疫活性に対する比率 (HBV抗原陽性検体の吸光度 ZHBV 抗原陰性検体の吸光度)を求め、表 6に示した。
[0060] 尿素を添加すると、酸性化剤のみと比較して、約 1.5〜3倍に上昇する検体が確認さ れた。また、酸性化剤のみの処理時において、血清蛋白質などが変性し沈殿や白濁 を生じることがあり、ピペッティング操作の障害や、沈殿物が大きな擬陽性の原因に なることも多い。さらに、これらの沈殿物の中に目的とする抗原が巻き込まれることに よる感度の低下も考えられる。尿素を処理時 1M以上添加することによって、このよう な沈殿物形成を大きく減少させることができることが判明し、特に処理時 1.5M以上 8M以下の添加でより効果が認められた。尿素は約 10M溶液までは溶解したが、保 存条件による析出等の問題もあることから、溶液として使用する場合、処理時濃度は 処理液量と検体量の比に依存してくる。
[0061] [表 6] S/N比
HBV陰性サンプル HBV陽性サンプル
健常人血清 #990277 #990544 #990768 濃度 (M)
無添加 0 1 .0 59.3 20.8 205.9 尿素 0.5 1 .0 59.2 25.8 233.9
1 1 .0 86.4 39.6 258.1
1 .5 1 .0 88.7 47.7 279.5
2 1 .0 81 .1 46.2 225.6
2.5 1 .0 76.5 52.4 227.5
3 1 .0 75.9 58.9 200.8
3.5 1 .0 74.0 66.8 1 95.2
[0062] 実施例 4
酴件イ^ II、 白皙 件剤、非イオン界商活件亂アルキル 第 3級ァミンまたは 第 4級アンモニゥム 同分早中に有している雨件界商活件剤の共存下における還 ^剤の
HBV抗原陰性検体 (Normal plasma)または 3例の HBV抗原陽性検体（ # 990277、 #990544、 #990768) 100 1に、 1.0N塩酸、 1.5M尿素、 5.0% TritonX100、 1.5% C16APSを含む溶液に還元剤であるジチオスレィトール、システアミン塩酸、ジェチル アミノエタンチオール塩酸を混合した溶液 100 1を添カ卩して、室温で 10分間インキュ ベーシヨンを行い、その 100 1を測定試料として、実施例 1で述べた方法を用いて検 討した (表 7)。
[0063] ここで用いた還元剤の濃度は、検体の処理時の濃度で表した。 HBV抗原陰性検体
(Normal serum)では、還元剤を添カ卩してもほとんどそのシグナルの変化は認められ なかったが、 HBV抗原陽性検体 #990544では、検体処理時 5mM以上の還元剤濃 度からシグナルの上昇が認められ、ジェチルアミノエタンチオール塩酸濃度が 10mM で 2例 (#990544, #990768)の検体で 30%以上の上昇が認められた。
[0064] [表 7]
Figure imgf000024_0001
(Dithiothreitoi) 0.05 215 16755 86 7318 74 51370 74
0.1 200 19439 100 7135 72 47065 68
0.2 189 21361 110 9807 100 53818 78
0.5 189 18538 95 8790 89 55879 81
1 196 18238 94 13611 138 64518 93
5 296 17429 90 26295 267 70368 102
2-アミノエタンチオール 0.1 252 13812 71 7545 77 58117 84
/ヽイド口クロライド 0.2 197 16516 85 5269 53 42168 61
(2-Aminoethanethiol 0.5 329 18105 93 10643 108 66214 96
Hydrochloride) 1 287 20352 105 9690 98 76393 110
5 240 15830 81 11015 112 61630 89
10 221 15632 80 15193 154 74164 107
2-ジェチルアミノエタンチオール 0.1 332 21571 111 9573 97 67205 97
/ヽイド口クロライド 0.2 306 14409 74 10069 102 フ 7701 112
(2-Diethyiaminoethanethiol 0.5 346 23030 118 11571 11フ 73442 106
Hydrochloride) 1 279 18300 94 8898 90 78826 114
5 323 14745 76 15063 153 81674 118
10 212 20377 105 15370 156 932t3 135
本発明は、血中の HBV抗原を高感度に検出または定量するための、簡便で操作性 が高 、検体処理方法およびそれを用いた HBVの検出または定量方法を提供するも のであり、血液の HBV感染の有無を診断し、輸血用血液のスクリーニングを迅速適確 に行なうことができる。また、診断薬キットを提供することもでき、 HBV抗原の検出の能 率ィ匕に寄与するところ極めて大き 、。

Claims

請求の範囲 [1] B型肝炎ウィルスを含む検体を、
(1)酸性化剤、および
(2)界面活性剤および Zまたは蛋白質変性剤
を含有する処理剤で処理することにより、 B型肝炎ウィルス抗原の解離と B型肝炎ウイ ルス抗原に結合する抗体の不活ィヒを行うことを特徴とする B型肝炎ウィルス含有検体 の処理方法。
[2] 前記界面活性剤および/または蛋白質変性剤にさらに還元剤を添加してなる請求 項 1に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[3] 前記界面活性剤が、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモニゥム塩を 同分子中に有してレ、る両性界面活性剤、アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4 級アンモニゥム塩を同分子中に有している陽イオン界面活性剤、ならびに非イオン性 界面活性剤からなる群より選択される少なくとも一種の界面活性剤である請求項 1ま たは 2に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[4] 前記界面活性剤のアルキル基の炭素数が炭素数 12個以上である請求項 3に記載 の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[5] 前記酸性化剤が、塩酸、硫酸、酢酸、トリクロ口酢酸またはトリフルォロ酢酸である請 求項 1に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[6] 前記炭素数 12個以上のアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム 塩を同分子中に有している両性界面活性剤が、 N -ドデシル- N, N -ジメチル- 3 -アン モニォ— 1_プロ/くンスノレホ不ート (N-Dodecyト N,N_dimethyh-3— ammonio— l_propanes ulfonate)、 N_テトラデシル- Ν,Ν-ジメチル- 3 -アンモニォ -卜プロパンスルホネ一ト（N- Tetradecyl-N , N-dimethyl-3-ammonio- 1 -propanesulfonate)、 N—へキサデシノレ— N , Ν— ジメチル -3-アンモニォ - 1 -プロパンスルホネート（Ν- Hexadecyl- Ν,Ν-dimethy卜 3- am monio-1- propanesulfonate)、または N-ォクタデシノレ- N，N-ジメチル- 3-アンモニォ -1 一プロノ ンスノレホネート (N—Octadecyl—N，N— dimethyト 3— ammonio—1— propanesulfonate )である請求項 4に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[7] 前記炭素数 12個以上のアルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモニゥム
正された用紙 (繊 ιΐ9υ 塩を分子中に有している陽イオン界面活性斉 I」が、デシルトリメチルアンモニゥムクロラ イド（（Decyltrimethykmmonium Chloride)、ドデシルトリメチルアンモニゥムクロライド（ D 0 decyltrimethylammonium Chloride)、テトラデンノレトリメチノレアンモ -ゥムクロライド ( Tetradecyltrimethylammonium Chloride)、へキサテンノレトリメチノレアンモニゥムクロラ イト (Hexadecyltrimethylanmionium Chloride)、デンノレトリリメチノレアンモニゥムプ 'ロマ イト (Decyltrimethylammonium Bromide)、ドテシノレトリノチノレアンモニゥムブロマイド ( D 0 decyltrimethylammonium Bromide)、テトラテシノレトリメチノレアンモニゥムフロマイド 、 i 'etradecyltrimethylammonium Bromide)、へキサデシノレトリメチノレアンモニゥムブ口 マイト (Hexadecyltrimethylammonium Bromide)、ラウリノレピリシニゥムクロライド (Laury 1 yridinium Chloride)、テトラデシノレピリジニゥムクロライド (Tetradecyl pyridinium Chi oride)、またはセチルピリジニゥムクロライド（Cetyl pyridinium Chloride)である請求項 4に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[8] 前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンイソォクチルフ： Xニルエーテル類、 ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル類、ポリオキシェチレンソルビタンアルキ ルエステル類、 Bridj35、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、 MEGA- 10、またはデ カノィル— N—メチルグルタミドである請求項 3に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の 処理方法。
[9] 前記蛋白質変性剤が、尿素またはチォ尿素である請求項 1に記載の B型肝炎ウイ ルス含有検体の処理方法。
[10] 前記還元剤が、システィン、システアミン、ジメチルアミノエタンチオール、ジェチル アミノエタンチオール、ジイソプロピルアミノエタンチオール、またはジチオスレイト一 ルである請求項 2に記載した B型肝炎ウィルス含有検体の処理方法。
[11] B型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法であって、
(1)請求項 1または 2に記載の B型肝炎ウィルス含有検体の処理を行う工程、および
(2) B型肝炎ウィルス抗原に結合するプローブを用いて B型肝炎ウィルス抗原を検出 する工程
を含む B型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法。
[12] B型肝炎ウィルス抗原を検出するために、検体を処理する処理剤中に下記の（1)
τ正された用紙 (繊1 ) を含む B型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法。
[12] B型肝炎ウィルス抗原を検出するために、検体を処理する処理剤中に下記の（1) の酸性化剤とおよび (2)の群カゝら選択される少なくとも 1種の物質を含む診断薬また は診断薬キット。
(1)酸性化剤。
(2)アルキル基および第 3級ァミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を分 子中に有して 、る両性界面活性剤、アルキル基および第 3級ァ ミンもしくは第 4級アンモ-ゥム塩を分子中に有して 、る陽イオン 界面活性剤、非イオン界面活性剤、ならびに蛋白質変性剤。
[13] 前記（2)の物質にさらに還元剤を添加してなる請求項 12に記載の診断薬または 診断薬キット。
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