WO2004022585A1 - 粒子形成能を有するhbvプレコア蛋白質 - Google Patents

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Abstract

粒子形成能を有するHBＶプレコア蛋白およびその測定手段を提供する。HBVのウイルス（様）粒子を形成する新規なHBVプレコア蛋白を同定した。本発明はこの新規なHBVプレコア蛋白を提供する。さらにこのＨＢＶプレコア蛋白によって形成される、コア様粒子、ウイルス様粒子を提供する。このウイルス様粒子はワクチン、治療薬に利用できる。さらに本発明はＨＢＶプレコア蛋白の測定法および抗HBVプレコアタンパク抗体の測定法を提供する。　　

Description

明 細 書 粒子形成能を有する H B Vプレコア蛋白質 技術分野
本発明は、 HBVウィルスのコア様粒子形成が可能な HBVプレコア蛋 白に関する。 背景技術
ウィルス感染の診断は、 主にウィルスやウィルス関連成分 （蛋白 や核酸） を検出する方法と、 ウィルス感染によ り生体が産生する特 異抗体を測定する方法とによって行われる。 B型肝炎ウィルス （HB V) 感染においては、 HB s抗原 ·抗体、 HBc抗体、 HBe抗原 · 抗体、 HB V- DNAなどの診断マーカーが臨床検査法と して導入されている。
通常、 HBV感染の有無は HB s抗原や HB c抗体により知ることができ る。 また、 HBVの感染性のみならず、 HBVキア リアの病態や予後、 治 療の効果判定の指標としては、 HBe抗原 · 抗体、 HBV- DNA量の測定が 用いられる。 中でも HBe抗原 · 抗体免疫測定法は操作が簡便で安価 なため最も汎用されているが、 HB e抗原を産生 · 分泌できないプレ コア変異株では、 HB e抗原が陰性であっても HBVの増殖が旺盛で、 感 染性ゃ免疫原性が強く病態も活動的な症例が存在する。 一方、 野生 株や変異株にかかわらず、 HBVの増殖 ·複製状態を反映する HBV- DNA 量の測定が重要となるが、 前処理法や測定法が煩雑で、 再現性や安 定性に欠けるという問題点がある。
最近、 HBVコア関連抗体 （HBc抗体および HBe抗体） の存在下や変 異株の出現にかかわらず、 HBVの増殖 ·複製状態を反映すると考え られる HBVコア関連抗原を測定する方法が開発された。 K imuraら（Jo urnal of Cl inical Microbi o l ogy , 40 , 439-445 , 2002) は、 丽コ ァ関連抗原 （HBc抗原及び HBe抗原を含む HBVプレコア/コァ遺伝子産 物） に対して特異性を有するモノ ク ローナル抗体を用いて、 簡便な 前処理法によ り血清中の HBc抗原と HBe抗原を同時に検出する免疫測 定方法を開発し、 ウィルスゲノムを検出する NAT検査法と相関を持 つこ とを示した。
これまでの文献報告では、 HBVプレコア/コァ遺伝子は全長 212ァ ミ ノ酸残基（ァミ ノ酸番号 ： 一 29〜： L83 ( HBc抗原の一番目のアミノ 酸を 1 と した場合。 以下同様） ）からなるタンパクをコードし、 そ の N末端には 19残基のシグナルぺプチドを有する。 シグナルぺプチ ドとは疎水性のァミ ノ酸残基からなり、 分泌蛋白が膜に結合するた めのシグナル配列として機能する。 ここでは一 29〜一 11番目のアミ ノ酸からなる配列を指す。
プレコア蛋白は翻訳されると小胞体膜を通過し 19残基のシグナル ペプチド切断後、 C末端核酸結合ドメインが切断され HBe抗原（アミ ノ酸番号 ： 一 10〜： 149 )となり血中に分泌される。 従来この HBe抗原 は血中ではアルブミ ンゃ γ—グロブリ ンなどの血淸蛋白と結合して 存在すると考えられ、 HBV粒子を形成しているとの報告はなかった 。 また HBe抗原は、 免疫寛容の維持、 ウィルス複製の抑制などにか かわっているとの報告も見られるが、 HBVの複製には不可欠ではな く、 その生物学的役割については不明な点が多い。
また、 HBVプレコァ /コア遺伝子は 2番目の転写開始シグナルを持 ち、 この開始シグナルから転写翻訳された産物は HBc抗原（ァミ ノ酸 番号 ： 1〜183 )となり、 HBV pregenome RNAを取り込みな力 Sらゥィ ルスキヤプシドを形成し、 HBs抗原からなる外皮（エンベロープ）を まとった後、 細胞外に完全ウィルス粒子 （Dane粒子） と して放出さ れる。 この HBc抗原のうち、 1 一 144番目のアミノ酸が存在すれば、 コア粒子の形成が起こることが報告されているが、 感染性のゥィル スのコァ粒子を形成している分子は 1 —183番目のアミ ノ酸配列の 蛋白から構成されていると考えられている。
上記のよ うに HBe抗原と HBe抗原は、 大部分共通の配列を持つ蛋白 でありながら大きく異なる性質を持っている。 この性質の違いに重 要な働きをしているのは HBe抗原のァミ ノ酸一 7番目にあるシステ イン残基である。 このシスティンは同じ分子内のアミノ酸 61番目の システィ ン残基とジスルフィ ド結合を形成し、 e抗原性を獲得する ( M. Nassa l and A. Ri eger , Journa l of Vi ro l ogy , 67； 4307 - 4313 ， 1993 )。 _ 7番目のシスティンを他のアミノ酸に変異させるなど してこのジスルフィ ド結合を形成できないようにすると、 HBe抗原 のコ ンフオメーシ ョ ンはと らないこ と力、らも このジスルフィ ド結合 の重要性が示されている。
一方 HBe抗原は 1番目のアミノ酸部位から転写翻訳されるためァ ミノ酸一 7番目にあるシスティ ン残基を持たず、 HBeコ ンフオメ一 シヨ ンをと り 、 2分子の HBe蛋白がァミ ノ酸 61番目のシスティ ン残 基どう しのジスルフィ ド結合形成によ りホモ 2量体となり、 ウィル スキヤプシ ド (コア粒子) を形成する。
HBV患者血清中に存在する HBVコァ関連抗原は、 主に感染性を有す る Dane粒子を構成する HBe抗原 （アミ ノ酸番号 ： 1 〜183) 、 および 、 HBe抗原とァミ ノ酸配列上はほとんど同様であるが HBe抗原とは抗 原性が異なる分泌性の HBe抗原 （アミ ノ酸番号 ： — 10〜： 149) に大別 される。 しかしながら、 この他に血中のマイナー分子として HBe抗 原性を示すプレ HBe抗原 （アミ ノ酸番号 ： — 29〜149) の存在が TAKA HASHI ( Journal o f I mmuno l ogy , 147 , 3156 - 3160， 1991 ) によ り 明らかにされている。
彼らはプールした血清を超遠心で分離し、 上清よ り抗 HBeモノク 口ーナル抗体のァフィニティーカラムで HBe抗原性を持つ蛋白を精 製し、 その配列を決定した。 H B e抗原蛋白質は前述したように、 ゥィルス粒子を形成せず血中に存在すると考えられる。 彼らも HBV の外皮蛋白である HB s抗原を剥離 （破壊） する処理あるいはウィル ス粒子、 コア粒子を破壌するような処理を行わずに精製した HBe抗 原配列を決定しており、 彼らが証明したシグナル配列を持つ HBe抗 原 （アミノ酸番号 ： 一 29〜： 149) は血清中に遊離して存在すると考 えられる。
また一方で、 Dane粒子の中には、 HBV- DNAを含まない空粒子 （SAK AMOTO et al . Laboratory Invest igat ion , 48 , 678 - 682， 1983) や スプライシングを受けた通常より短い HBV-DNAを含む複製不可能な 欠損粒子力 S存在すること ( TERRE et al . Journal of Virology , 65， 5539-5543 , 1991) が報告されているが、 その粒子を形成している HBVタンパクの詳細な解析は行われていない。
このように、 これらの文献で解析されている血中での HBVコァ関 連抗原の生化学的分析は十分とはいえず、 HBVの増殖 · 複製状態を 反映すると考えられる HBVコア関連抗原のウィルスマーカーと して の血中における存在様式は未解明のままである。 発明の開示
臨床的有用性の高い HBVの NAT検査には、 現在 PCR法及び TMA法があ るが、 検査コス トが高く付く上に操作が煩雑であることが問題点と して挙げられる。 また、 遺伝子増幅法を用いているため、 増幅用プ ライマーが標的 DNAと一致しないと偽陰性を引き起こす。 一方、 免 疫測定法は操作が簡便で安価に測定できるが、 増殖マーカーと して の現行の HBe抗原測定法では、 HBe抗体の存在下では免疫複合体と し て存在する HBe抗原を測定できないし、 HBe抗原を産生 · 分泌できな ぃプレコア変異株、 コアプロモーター変異株では、 HBe抗原が陰性 となる。 また、 HBc抗原測定法は、 HBV-DNA量と相関はあるものの、 前処理が繁雑で感度不足のため臨床応用されていない。
従って本発明の目的は、 B型肝炎のスク リ一二ングゃ B型慢性肝 炎患者の治療におけるモニタリ ングなどに臨床応用されると考えら れる HBVコア関連抗原を生化学的に分析し、 HBVの増殖 · 複製状態を 反映する血中の HBVコア関連抗原の分子種を同定することである。
こ う した解析によ り、 HBV感染患者の診断等に有用な分子種を発 見し、 新たな診断薬を開発することができる。
また、 HBVコア関連抗原の存在様式およびその役割を解析するこ とで、 新たな HBVワクチン、 治療薬の開発につなげることができる 本発明は、 血中の HBV粒子及び HBV関連蛋白をショ糖密度勾配遠心 法や ELI SA、 電気泳動法等を用いることで、 HBVコア関連抗原を分離 精製し、 従来報告されている HBe抗原及び HBc抗原とは異なる抗原を 単離し、 質量分析法により新規なコア様粒子を形成する分子を同定 した。 本発明の 1つの態様はウィルス様粒子形成能のあるシグナル 配列の全部または一部を含む HBVプレコア蛋白を提供することであ る。
ここで一部とは 19残基のシグナル配列のうち N末側からの 1残基 以上の配列である。 またこの HBVプレコア蛋白の C末端はァミノ酸 番号で 150番目以降の RRRGRのいずれかの部位で切断されたものであ る。 さらにシグナル配列あるいは HBe配列部分 （アミ ノ酸番号 ： ー1 0〜149) に変異を含んでも良く、 許容される変異はコア様粒子を形 成できる範囲ならば構わない。 この HBVプレコア蛋白は、 最も好ま しく は配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ ドであ る。 さ らに本発明は上記の HBVプレコア蛋白を含んでなる HBVコァ様粒 子または HBVウィルス様粒子を提供する。
またこの HBVプレコア蛋白、 あるいはこの蛋白から構成された HBV コア様粒子、 HBVウィルス様粒子を含む HBV診断薬あるいはキッ トを 提供する。
さ らにこの HBVプレコア蛋白を測定する方法、 あるいは診断薬、 診断キッ トを提供する。
この HBVプレコァ蛋白の測定法は HBVプレコア蛋白を露出させるェ 程、 HBVプレコア蛋白を認識するプローブと結合させる工程を含ん でもよい。 また HBVプレコァ蛋白を露出させる工程が界面活性剤の 処理または添加であっても良い。 この界面活性剤は限定されず非ィ オン性界面活性剤も有効であるが、 特に陰イオン性界面活性剤が適 している。 また陰ィオン性界面活性剤に両ィオン性界面活性剤を加 えたもの、 さらに非イオン性界面活性剤を加えたものも効果がある さ らに前記 HBVプレコア蛋白に結合するプローブがアミノ酸番号 の一 28〜一 11の配列に結合するプローブであっても構わない。 この プローブが抗体であっても良い。
また、 抗 HB s抗体によ り免疫沈降を行い、 沈降物中の HBVプレコア /コアタンパクを測定することによ り、 遊離の HB e抗原を除いた粒 子状 HBVプレコア/コアタンパクのみを特異的に測定することも可 能である。 この免疫沈降は HB s抗原に結合するプローブを用いた分 離法によって置き換えることもできる。
上記の測定法によ り測定した HBVプレコア蛋白の測定値に HBe抗原 の値が含まれている場合に、 HB e抗原の測定値を減算するこ とによ り検体中の粒子状 HBVプレコア蛋白の値を算出し、 測定することも 可能である。 さ らにその値より HB e抗原の測定値を減算することに よ り検体中の粒子状 HBVプレコア蛋白の正確な値を測定することも 可能である。 この測定した粒子状 HBVプレコア蛋白の定量値は HBV感 染の病態マーカ一と して利用できる。
さらに本発明は陰ィオン性界面活性剤および HBVプレコァ蛋白の —28〜： 150番目のアミノ酸を認識する抗体を含む測定キッ トおよび H B e抗原を測定するキッ トを含む診断薬を提供する。
本発明の別の形態として HBVプレコア蛋白を含んでなる HBVヮクチ ン、 および治療薬を提供する。
これらに加え、 本発明は粒子状 HBVプレコアタンパクに対する抗 体を測定する方法、 あるいは診断薬、 診断キッ トを提供する。
これらには上記の HBVプレコアタンパク粒子を抗原と して用いる こ とができる。 この粒子は血清中などから密度勾配遠心、 免疫沈降 などで精製することで得られ、 界面活性剤等でエンベロープを除去 することで、 丽プレコアタンパク抗原を露出させることができる 。 また、 リ コンビナントタンパクにより、 粒子状 HBVプレコアタン パクを製造することも可能で'ある。
この抗原を用いるこ とによ り、 HB c抗体、 HBe抗体とは異なる粒子 状 HBVプレコアタンパクに対する抗体を測定することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 HBVプレコア蛋白、 HBe抗原、 シグナル配列を持つ HBe抗 原、 および HB c抗原のァミ ノ酸の領域と各抗原の血液中での様態を 示す図である。
図 2は、 ショ糖密度勾配遠心法にて分離した HB e抗原陽性血清の H BV抗原、 HBV DNAの挙動を示す図である。 各分画中の HBVコア関連抗 原 （黒正方形） 、 HBc抗原（暴）、 HB s抗原（◊)、 HB e抗原 （口）、 およ び HBV DNA (〇）をそれぞれ示し、 分画の密度を破線で示す。 図 3は、 ショ糖密度勾配遠心法にて分離した HBVコア関連抗原ピ 一ク画分を再びショ糖密度勾配遠心法にて分離したときの H B V抗 原、 HBV DNAの挙動を示す図である。 各分画中の HB Vコア関連抗原
(黒正方形） 、 HBc抗原（參）、 HBs抗原 （◊)、 および HBV DNA (〇）を それぞれ示し、 分画の密度を破線で示す。
図 4は、 HBV抗原のゲルろ過での挙動を示す図である。 上図、 シ ョ糖密度勾配遠心法にて分離した HB Vコア関連抗原ピーク画分を、 未処理のままゲルろ過した場合。 下図、 同じサンプルを 3 % NP-40 処理後ゲルろ過した場合。 各分画中の HBVコア関連抗原 （黒正方形 ) 、 HBc抗原（き）量を示す。 分子量マーカーの溶出位置を上部に示 す。
図 5は、 HBe抗原陽性血清およびその密度勾配遠心分画をウェス タンブロ ッ ト解析した結果を示す電気泳動図であり、 図面代用写真 である。 密度勾配遠心分画 1〜20がショ糖濃度 10〜60%に相当する 。 HB50は HBc抗原にのみ反応し、 HB91は HBc抗原 HBe抗原両方に反応 するモノ ク ローナル抗体である。
図 6は、 それぞれの症例での粒子状プレコアタンパクの全プレコ ァ /コアタンパクに対する比率を示す図である。 HBe抗原陽性例を （ 眷） で、 HBe抗体陽性例を （〇） で示す。 発明の実施の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明で新規に同定した HBVプレコア蛋白とは、 シグナル配列を 含み且つ HBVのウィルス様粒子を形成するこ とのできる蛋白質であ る。 血液中の本発明の蛋白質の主な分子は分子量 22000ダルトンか らなる p22抗原である。 p22抗原の代表的なアミノ酸配列は配列番号 1 に記載される 178ァミノ酸からなる HBVのプレコア抗原に類似の抗 原である。 この抗原を特異的に認識する抗体を取得し、 検体前処理 法と組み合わせて測定系を構築することによ り、 抗体存在下でも HB Vコア関連抗原を測定することが可能となる。
一般的に HBVプレコア/コア蛋白と呼ばれ得るものには HBe抗原 （H BV e蛋白） 、 HBe抗原 （HBVコア蛋白） および他の HBVプレコア Zコ ァ遺伝子産物がある。 本発明において 「HBVプレコア蛋白」 と呼ぶ 場合には、 特に断らない限りシグナル配列を含み粒子形成能を有す る HBVプレコァ /コア遺伝子産物である蛋白を示す。 この代表的なも のは配列表 1に示す蛋白である。 また、 「HBVコア関連抗原」 は HB e 抗原 （HBVコア蛋白） 、 HBe抗原 （HBV e蛋白） を含む HBVプレコア/ コア遺伝子産物を示す。
まず、 B型肝炎患者血清をショ糖密度勾配遠心法にて分画し、 各 分画の HBVコア関連抗原を測定したところ、 HB e抗原と同様の密度 1. 05付近に一つのピークを、 密度 1. 17付近の HBe抗原と HBV-DNAとほぼ 同じ分画に、 もう一つのピークを検出できる。 さ らに、 密度 1. 17付 近のピークを低勾配のショ糖密度勾配遠心法にて再分画すると、 HB c抗原と HBV-DNAは同じ分画にピークを示すが、 HBVコア関連抗原は これよ りわずかに低密度分画にピークを示し、 その分画にはウィル スの外被蛋白である HB s抗原が検出できる。
すなわち、 B型肝炎患者血清中には、 感染性を示す Dane粒子のほ かに、 少し比重の軽い HBVコア関連抗原からなるウィルス様粒子が 存在すると考えられる。
また、 その HBVコア関連抗原からなる粒子と Dane粒子を含む画分 をゲルろ過にかけると、 HBe抗原と HBVコア関連抗原からなる粒子が それぞれボイ ド画分に溶出する。 また、 同じ画分をノニデッ ト P-40 ( NP-40： ナカライテスタ） 処理し、 外被蛋白の H B s抗原を剥が した後、 ゲルろ過にかけると、 HB e抗原と HBVコア関連抗原からなる 粒子はやはりそれぞれボイ ド画分に溶出する。 このことは、 HBc抗 原と HBVコア関連抗原からなる各々の粒子が、 外被蛋白の HBs抗原を 剥がされる界面活性剤処理によっても壊されない強固なキヤプシ ド 構造を形成していることを示している。
つぎに、 ウェスタンプロ ッ ト法を用いた解析から、 その HBVコア 関連抗原は HBc抗原とほぼ同じ 22000ダルト ンの分子量を示したが、 HBc抗原が有する C末端核酸結合領域に特異的なモノク ローナル抗 体 （HB50) には反応しない。 つまり、 この HBVコア関連抗原は、 そ の分子量から C末端核酸結合領域を含まず、 シグナル配列の切断さ れていないプレコア遺伝子産物 （p22抗原） と考えられる。
p22抗原を SDS-PAGE法にて分離後、 ポリ アク リルアミ ドゲルよ り 切出し、 マ ト リ ッ クス支援型レーザー脱離イオン化 （MALDI ) 質量 分 ίΠ"法 ( Carr et al . し arrent Prot ocol s in Mo l ecular Bio logy , John Wi l ey & Sons , Inc.， New York Uni t s , 1997) ίこよ り ァミ ノ 酸配列を決定すると、 ρ22抗原は配列番号 1に記載の 178ァミ ノ酸か らなる HBVプレコア蛋白であることが明らかとなった。
このアミ ノ酸配列を決定した HBVコア関連抗原を以下 HBVプレコア 蛋白と呼ぶが、 本発明の HBVプレコア蛋白は従来 TAKAHASHIら （Jour nal of Immunol ogy , 147 , 3156 - 3160， 1991) によって報告されて いた HBVプレコア蛋白 （プレ HBe抗原） と比較すると N末 （一 29番目 ) のメチォニンを欠いており、 _ 28番目のグルタミンがァセチル化 されている。 また C末側は HBe抗原の C末である 149番目のパリ ンに アルギニンが結合しており、 少なく とも 150番目までが存在してい る。 この HBVプレコア蛋白は HBV核酸結合部位のうち SPRRRを含む部 位を認識するモノク ローナル抗体 HB50では認識されないことから、 154番目までのァミノ酸を含む可能性がある。
本発明の HBVプレコア蛋白が不完全ウイルス粒子 （ウィルス様粒 子） を形成することから、 このタンパクがキヤプシド形成にあたり
HBc抗原と競合してウィルス複製を阻害することが容易に推測され る。 したがって、 本発明は HBVプレコア蛋白を用いた HBV治療薬の可 能性を提示する。
本発明の HBVプレコア蛋白は HBV感染患者の体内で、 HBVゥィルス 様粒子を形成している。 また本発明は、 この HBVプレコア蛋白が完 全 HBVウィルス粒子中に存在することも示唆している。 すなわち、 H BVプレコア蛋白が HBc抗原と共に HBVヌク レオキヤプシドを形成して いると考えられる。 したがって、 この HBVプレコア蛋白を測定する ことは HBV感染の診断、 肝炎や肝硬変あるいは肝癌の病態の診断、 マーカーとして役立つと考えられる。
本発明の HBVプレコア蛋白と既知の HBe抗原、 HBc抗原はその機能 やアミノ酸配列が異なる。 しかしながら、 機能的に似ている性質や ァミノ酸配列の重複があるため、 この HBVプレコァ蛋白を測定する ためには、 HBe抗原、 HBc抗原と区別して測定することが必要である 。 ただし、 後述の実施例 7に示すよ うにこの HBVプレコア/コア蛋白 と H B c抗原の量の比は 12 : 1〜158 : 1と最低でも 12倍以上の開きが める。
本発明の HBVプレコア蛋白と HBe抗原あるいは Takahashiらの報告 しているシグナルぺプチ ドを持つ HBe抗原との違いは、 機能的に前 者が HBVのコア様粒子 （ウィルス様粒子） を形成しているのに対し 、 後者が遊離の状態で血液中では血清蛋白と結合して存在している 点である。 このコア様粒子 （ウィルス様粒子） を形成するという機 能に関してはこの HBVプレコア蛋白と HBc抗原は、 ほぼ同じ機能を有 している。 この HBVプレコア蛋白は粒子形成という性質を持つこと から、 HBe抗原よ りは HBc抗原に近い構造を有しているものと推測さ れ、 アミノ酸一 7番目のシスティンと 61番目のシスティン間のジス ルフィ ド結合は形成されていないものと考えられる。
後述の実施例 9に示すように HBVコア関連抗原測定系によ り検出 された HBVコア関連抗原 （HBVプレコア/コアタンパク） を従来の HBc 抗原測定法や HBe抗原測定法で測定した場合、 HBc抗原や HBe抗原は 検出されなかった。 これは次のようなことを示していると考えられ る。 ① HBVコア関連抗原は本願発明の HBVプレコアタンパクを多く含 んでいる。 ②従来取得されていた HBc抗原や HBe抗原に結合する抗体 が HBVプレコァタンパクに結合しないものがあり、 HBVプレコア抗原 の抗原性が HBc抗原や HBe抗原と異なる。
このことは本発明の HBVプレコアタンパクは従来の HBc抗原測定法 や HBe抗原測定法ではほとんど検出されていなかったこ とを示して いる。 つまり木村らの HBVコア関連抗原測定法によ り始めて測定可 能となったと考えられる。 HBVプレコアタンパクは HBVコア関連抗原 測定法によつて検出できる。 この測定系の特徴は界面活性剤で HBV プレコアタンパクを含んだ検体を処理し、 界面活性剤の存在下で抗 体と反応させることである。 そのため、 HBVプレコアタンパク上の 抗原ェピトープは界面活性剤の存在下で安定であることが必要であ る。 さらに抗体も界面活性剤の存在下で機能的に安定な抗体を使用 する必要がある。
このような抗体の認識するェピトープは HBVコア蛋白のアミノ酸 1 —19番目、 21— 40番目、 31— 49番目、 131— 140番目のリニアェピ トープ、 および 1 一 81番目の構造ェピトープが適当である。 これら のェピトープを認識する抗体を組み合わせることによつて HBVプレ コアタンパクを測定することが可能となった。 これらのェピトープ を認識する抗体を 2つ以上組み合わせることによつて HBVプレコア タンパクを検出することができるが、 特に好適な組み合わせはアミ ノ酸 21— 40番目 と 31— 49番目、 1 —19番目 と 21— 40番目、 21— 40番 目 と 31— 49番目のェピトープを認識する抗体の組み合わせであり、 これらの組み合わせに他のェピトープを認識する抗体を加えること によって、 検出感度が上昇する。
検出に用いる抗体は界面活性剤の存在下で上記のェピトープと結 合するこ とができる抗体でなければならない。 HBVプレコアタンパ ク測定に用いる界面活性剤は陰イオン性界面活性剤が好適であるが 、 陰イオン性界面活性剤と両イオン性界面活性剤の組み合わせ、 陰 イオン性界面活性剤、 両ィオン性界面活性剤および非イオン性界面 活性剤を組み合わせることによ り さ らに感度が上昇する。 陰イオン 性界面活性剤の中では SDSがもっとも好適であつたが、 その他の陰 ィォン性界面活性剤も効果があり、 SDSを他の構造の類似した陰ィ ォン性界面活性剤に置き換えることにより、 HBVプレコアタンパク の上記のェピトープを露出させ、 抗体と結合できる状態にすること ができる。
また本発明の HBVプレコア蛋白と既知の HBe抗原、 Takahashiらの 報告しているシグナルぺプチドを持つ HBe抗原、 HBc抗原のァミ ノ酸 配列に関する相違点は図 1 に示した。 HBVプレコア/コア蛋白は本発 明よ り一 28〜150番目のアミ ノ酸配列からなるポリぺプチドが代表 的なものであると考えられる。 これに対し、 HBe抗原は一 10〜 149番 目のアミ ノ酸配列、 シグナルぺプチ ドを持つ H B e抗原はー29〜14 9番目のァミ ノ酸配列、 HBc抗原は 1 —183番目のアミノ酸配列から なるポリぺプチドで構成されている。
上記のようなことから、 本発明の HBVプレコア蛋白と HBe抗原、 シ ダナルぺプチドを持つ HBe抗原、 HBc抗原を分離して測定するのは容 易ではないが、 そのウィルス (様) 粒子を形成できるかできないか の機能と、 アミノ酸配列の違いを利用して分離することが可能であ る。 まず本発明の HBVプレコア蛋白と HBe抗原あるいはシグナルぺプチ ドを持つ HBe抗原を分離するためには、 この HBVプレコア蛋白は HBV 様粒子を形成しており、 HBe抗原あるいはシグナルぺプチドを持つ H B e抗原は遊離の状態 （本願では抗体と結合している HB e抗原も遊離 とする） で存在しているという特徴を利用する。 実際には、
( 1 )ウィルス粒子を破壊する処理を行う前に測定した測定値とゥ ィルス粒子を破壊する処理を行った後に測定した測定値を比較する 方法がある。 つまり ウィルス粒子を破壊する処理を行った後に測定 した測定値からウィルス粒子を破壌する処理を行う前に測定した測 定値を引く ことによって測定可能である。
( 2 )またウィルス (様) 粒子を分離して、 その中に含まれている H BVプレコア蛋白を測定する方法もある。 このウィルス （様） 粒子を 分離する方法には、 例えば密度勾配遠心で遊離の抗原の分画とウイ ルス （様） 粒子を形成している分画を分ける方法があり、 ウィルス
(様） 粒子の含まれている分画の HBVプレコア/コア蛋白を測定すれ ばよい。 この密度勾配遠心で遊離の抗原とウィルス （様） 粒子を分 離する方法以外にも、 ウィルス （様） 粒子を特異的に濃縮する方法 や遊離の抗原を特異的に除く方法を用い、 分離後に HBVプレコア/コ ァ蛋白の量を測定すればよい。
このような方法のひとつと して、 例えば抗 HBs抗体による免疫沈 降法があげられる。 抗 HBs抗体によ り免疫沈降を行い、 沈降物中の H BVプレコア/コアタンパクを測定することによ り HB e抗原を除いた粒 子状 HBVプレコア/コアタンパクのみを特異的に測定することも可能 である。
また HBVプレコア蛋白と HB e抗原はコア （様） 粒子 （ウィルス （様 ) 粒子） の形成の機能で類似しているため、 分離して測定するため には構成するアミ ノ酸配列が異なる部分に特異的に結合 （認識） す るプローブを使い分ける方法が考えられる。 つま り、 HBVプレコア 蛋白を選択的に測定するためには、 一 29〜一 10番目のアミ ノ酸に結 合するプローブを使用すればよく、 HBc抗原を選択的に測定するた めには 151〜； 183番目に結合するプローブを使用すればよい。
また、 両方に結合するプローブを使用し、 HBVプレコア蛋白 + HBc 抗原の抗原量を測定し、 その後いずれかの抗原 （蛋白） を特異的に 測定し、 減算することによつても、 それぞれの抗原 （蛋白） の量を 測定可能である。
実際上、 検体中の HBVプレコア蛋白の測定には、 ウィルス様粒子 の破壊を行い、 HBVプレコア蛋白を露出させる工程が必須である。 この工程ではウィルスの外皮蛋白質である HBs抗原の剥離を行い、 H BVプレコア蛋白を遊儺させる処理剤を使用する。 処理の方法と して は、 アルカリ処理があり、 NaOH等の処理によ り、 HBs抗原がはがれ 、 HBVの内部の抗原が遊離する。 また他の処理剤と しては界面活性 剤力 S使用可能であり、 Tr i t on X—100や Nonide t P—40のような非ィ才 ン性界面活性剤や SDSやサルコシンン酸ナ ト リ ウムのような陰ィォ ン性界面活性剤が適当である。 さ らに特許 3171827号に出願されて いるような陰ィォン性界面活性剤と他の界面活性剤の組み合わせも 有効である。
このウイルス様粒子の破壌、 HBVプレコア蛋白の露出の工程を行 わずに、 一 29〜149のァミノ酸を認識するプローブで測定を行う と 遊離の HBe抗原あるいはシグナルぺプチドを持つ H B e抗原をも測 定すること となる。 そのため遊離の抗原とウィルス様粒子の分離を 行わずに、 検体中の抗原蛋白を測定した場合は、 界面活性剤等によ る処理を行った測定値から界面活性剤などの処理を行わずに測定し た HBe抗原の測定値を減算したものが、 粒子状 HBVプレコア/コア蛋 白の測定値となると考えられる。 界面活性剤によるウィルス粒子の破壊、 HBVプレコア蛋白の露出 (露呈） の後、 HBVプレコア蛋白を認識するプローブによる測定の 工程がある。 この工程ではアミノ酸配列の一 28〜： L50番目を認識す るプローブを用いることにより、 HBVプレコア蛋白の測定が可能で ある。 プローブとしてはこのプレコア蛋白に結合するものであれば よく、 抗体、 レセプター、 アブタマ一、 リガンドなどが使用可能で 測定法と しては,、 HBVプレコア蛋白とプローブの結合を利用した ものであれば良く、 代表的なものと しては酵素抗体免疫法などがあ る。 HBVプレコア蛋白と HBc抗原を分離して測定するためには、 HBV プレコア蛋白は一 28〜一 11を認識するプローブを使用し、 HBc抗原 は 15卜 183を認識するプローブを使用すればよい。 しかしながら、 共通領域である 1- 150を認識するプローブで HBVプレコア蛋白と HBc 抗原の合計の量を測定し、 それから 151- 183を認識するプローブを 用い、 HBc抗原の量を測定し、 合計の量から減算することによって も、 HBVプレコア蛋白を定量することは可能である。 実施例
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、 これによつて本 発明の範囲を制限するものではない。
実施例 1 . HBVコア関連抗原のショ糖密度勾配遠心法による分画 ( A) 10〜60 %ショ糖密度勾配遠心法による分画
TNE緩衝液 [ lOmM Tr i s-HCl (pH7. 5 ) , 150mM NaCl , lmM EDTA] にシ ョ糖をそれぞれ 10 % , 20 % , 30% , 4 0%， 50 % , 60 %と溶解させ、 密度の重い 60%ショ糖液から順に 1 , 7mlづつ、 12mlの超遠心チュー ブに注意深く重層させ、 室温で 6時間放置した。
HBe抗原陽性血清 lmlを作製したショ糖密度勾配液の上に重層し、 Sw40Tiローター （Beckman) を用いて、 33.4Krpm、 4 °Cで 15時間の 超遠心分離の後、 上から 300 μ 1づっ 40分画した。 それぞれの画分の 密度を計算し、 HBVコア関連抗原 （PCT出願 ： PCT/JP01/06947) 、 ΗΒ c抗原 （PCT出願 ： PCT/JP01/06947) 、 HBs抗原 （ダイナボッ ト） 、 H Be抗原 （ダイナボッ ト） 、 HBV- DNA PCR (ロシュ · ダイァグノステ イ ツク） を測定したところ、 HBVコア関連抗原の一部は HBe抗原と同 様の密度にピークを示したが、 大部分の HBVコァ関連抗原は HBV- DNA
PCRのピーク付近に検出された（図 2 )。
(B) 低勾配のショ糖密度勾配遠心法による再分画
30%, 40%, 50%のショ糖液を、 密度の重い 50%ショ糖液から順 に 3.4mlづっ、 12mlの超遠心チューブに注意深く重層させ、 室温で 6時間放置する。 （A) の 24番目 と 25番目のピーク画分を T E緩衝 液 [10mM Tris-HCl(pH8.0) , ImM EDTA]で 2倍に希釈後、 作製したシ ョ糖密度勾配液の上に重層し、 Sw40Tiローター （Beckman) を用い て、 33.4Krpm、 4 °Cで 15時間の超遠心分離の後、 上から 300 μ 1づ つ 40分画した。 それぞれの画分の密度を計算し、 HBVコア関連抗原
(PCT出願 ： PCT/JP01/06947、 実施例 5 ) 、 HBc抗原 （PCT出願 ： PCT /JP01/06947, 実施例 6 ) 、 HBs抗原、 HBV- DNA PCRを測定したとこ ろ、 HB Vコァ関連抗原のピークは HBV-DNA PCRのピークより も低 密度分画に位置し、 その分画には H B s抗原が含まれていた （図 3 ) 。 各々のピークを透析後、 4 °Cで保存した。
実施例 2. NP - 40処理によるゲルろ過
前記実施例 1の（A)によ り分画したピーク画分 （24-25番） を 0.15 M NaClを含む 10mMリ ン酸緩衝液 （ρΗ7· 3) (PBS)で平衡化された Super ose 6 HR(Amersham)を用いてゲルろ過したところ、 HBVコア関連抗 原と HBc抗原の粒子がそれぞれボイ ド画分に溶出した （図 4上図） 。 一方、 前記実施例 1の （A) によ り分画したピーク画分 （24-25番 ) に NP- 40が最終濃度 3 %となるよ うに加え、 HBs抗原を剥ぎ取るた めに 37°Cにて 15分間処理した。 0. 15M NaC lを含む 10mMリ ン酸緩衝液
( pH7. 3 ) ( PBS )で平衡化された Supero s e 6 HR ( Amer sham) を用いて これをゲルろ過したところ、 HBVコア関連抗原と HBc抗原からなる裸 の粒子がそれぞれボイ ド画分に溶出した （図 4下図） 。 Super o s e 6
HRのボイ ド画分は分子量 40，000，000以上であり、 これらの分子は ウィルスキヤプシ ド様粒子構造をとっているものと考えられる。
実施例 3 . ウェスタンブ P ッ ト法による解析
HBe抗原陽性血清を実施例 1の （A) に記載の方法と同様にしてシ ョ糖密度勾配遠心を行い、 上清から 600 μ 1づっ 20分画する。 この分 画および HBe抗原陽性血清を用いて SDS- PAGEを行い、 PVDF膜 （ィモ ビロン、 Mi l l ipo r e ) に転写した後、 HBc抗原と HBe抗原両方を認識 するモノクローナル抗体耶 91と HBc抗原の C末端核酸結合領域に特 異的なモノク口ーナル抗体 HB50を用いたウェスタンブロ ッ トによ り 、 分子量約 22000ダルト ンの H B Vコア関連抗原を検出した （図 5 上図） 。 また、 この HBVコア関連抗原は HB91には反応するが HB50と は反応しないことが明らかになった （図 5下図） 。
HB 5 0抗体はェピトープ解析によ り、 168-176番目のアミ ノ酸 （S QSPRRRRS) を認識することがわかっているが、 この他に 141- 159番 目のペプチ ド、 ( STLPETTVVRRRGRSPRRR) および 150 - 167番目のぺプチ ド （RRRGRSPRRRTPSPRRRR) にも反応することがわかっている。 これ らのペプチドの共通配列は SPRRRであり、 少なく ともこの配列が HB5 0抗体との結合に必要である。 つま り、 この SPRRR配列は 1 5 5番目 以降に存在するため、 本願発明の HBVプレコア/コア蛋白は 155番目 以降の配列を欠いているものと考えられる。 このことは HB50抗体を 標識抗体と して単独で用いている HBc抗原測定系でのピークが HBVプ レコア/コア蛋白のピークと重ならないことからも明らかである （ 図 2、 図 3 ) 。
実施例 4. MALDI質量分析によるアミ ノ酸配列の解析
実施例 1 (A) に記載の方法によって得られた HBVコア関連抗原画 分を、 0.15M NaClを含む 10mMリ ン酸緩衝液 （pH7.3)(PBS) で平衡化 された Superose 6 HR (Amersham) を用いてゲルろ過したところ、 H BVコア関連抗原と HBc抗原からなる粒子がボイ ド画分に溶出した。 このボイ ド画分を 1% NP-40, 20%ショ糖を含む TNE緩衝液 [10mM Tr is - HCl(pH7.5)，150mM NaCl,lmM EDTA] 上に重層し、 Sw40Tiロータ 一 (Beckman) を用いて、 33.4Krpm、 4 °Cで 15時間の超遠心分離後 、 HBVコア関連抗原粒子を含むペレツ トを回収した。
このペレツ トを SDS- PAGEにて分離し、 22kDaの HBVコア関連抗原の バンドを切り 出し、 ト リプシン消化後、 Voyager- DE STR (Applied Biosystems) にて MALDI- T0F質量分析を行った。 その結果、 配列番 号 2、 3、 4、 5および 6の配列に相当する 5つのペプチドを検出 した。 この うち配列番号 2のぺプチドは N末端ァセチル化されてい た。
実施例 5. HB Vコア関連抗原 (プレコア/コアタ ンパク） の検 出および測定法
抗 HBVコァ抗原モノ ク口ーナル抗体 HB44 (認識部位 31 - 49ァミノ酸 ) 、 HB61 (認識部位 131— 140アミノ酸） および HB114 (認識部位 1-8 1アミノ酸） を終濃度がそれぞれ 2， 1， 1 μ g/mlになるよ うに 0· 5 M NaCl, 0.1M炭酸緩衝液 （ρΗ9· 6) で希釈し、 黒色 96ウェルマイク 口プレー ト （ヌンク社） にっき 100 μ 1/ゥエル分注し、 4°Cで一晚 静置した。 0.15M NaClを含む 10mMリ ン酸ナト リ ウム緩衝液 （pH7.4 )0.4mlで 2回洗浄し、 ブロ ッキング液 （0.5%カゼインナト リ ウム , 3 %ス ク ロース， 150mM NaCl，10mMリ 酸緩衝液 （pH7.4) ) 0.4ml を添加し、 さ らに室温で 2時間静置した。 ブロ ッキング液を除去後 、 真空乾燥した。
血清 100 μ ΐに、 処理液 （15%SDS、 2%Tween60) を 50 μ ΐ添加し、 70 °Cにて 30分間処理をおこない、 その 50μ 1を測定試料とした。
上記ゥエルに反応緩衝液 100μ 1と測定試料 50μ 1を'加え、 室温で 2時間反応させた。
洗浄液 （0.05%Tween20，0.15M NaCl，10mMリ ン酸ナト リ ゥム緩衝液 (ρΗ7· 4))0.4mlで 5回洗浄後、 アルカ リ フォスファターゼ （A P) 標識モノ ク ローナル抗体 HB91 (認識部位卜 19アミ ノ酸） および HB11 0 (認識部位 21- 40アミ ノ酸） をそれぞれ 0.1 μ g/ml、 0.5//g/mlに希 釈し、 100 μ 1/ゥエル添加し、 室温 1時間反応させた。 洗浄液 0.4ml で 6回洗浄後、 発光基質として CDP-Star with Emerald II(TR0PIX 社） 溶液 ΙΟΟμ Ιを加え室温 20分間反応させた後、 発光を測定した。
実施例 6. HBc抗原の測定
(A) 抗体固相プレートの作製
HBc抗原および HBe抗原の両方に反応する 3種のモノ ク ローナル抗 体 HB44 (認識部位 31- 49アミ ノ酸） 、 HB61 (認識部位 131 - 140ァミ ノ 酸） および HB114 (認識部位 1-81アミ ノ酸） をマイク ロタイタープ レートウエルに感作し、 固相化する。 PBSで洗浄後、 カゼインを含 む溶液でブロ ッキングし、 この溶液を除いた後、 乾燥させる。
(B) 検体の前処理
50 μ ΐの前処理液 （15% ドデシル硫酸ナト リ ウム [SDS]、 3 % CHAP S、 1 %へキサデシルト リ メチルアンモニゥムブロマイ ド） を 100 μ 1の検体 （血清、 血漿など） と混合し、 70°Cにて 30分処理する。
(C) 1次反応
各抗体固相ゥ； nルに 100 μ 1の反応緩衝液 （ρΗ8·0) および前処理 した検体を 50 μ 1加え、 穏やかに撹拌しながら室温 2時間反応させ る。 (D) 2次反応
ゥヱルを洗浄後、 アル力リ フォスファターゼ標識 HB50 (認識部位 168- 176ァミ ノ酸） モノ ク ローナル抗体を含む溶液を 100 μ 1加え、 室温 1時間反応させる。
(Ε) 基質反応
ゥエルを洗浄後、 CDP Star wi th Emerald I I ( Appl i ed B iosys t em s) を ΙΟΟ μ Ι加え、 室温 20分間反応後各ゥエルの発光量をマイク ロ プレー トルミ ノメーターで測定する。
実施例 7 . 検体中の HBVプレコア蛋白、 HBe抗原、 HBc抗原の測定 とその比率の計算
前記実施例 1 ( A)の方法に従って、 血清 7検体についてショ糖密 度勾配遠心法により分画を行った。 それぞれの検体において、 低密 度の遊離の HBe抗原を含んでいる分画 （例えば図 1では 1-19分画程 度） と高密度のウィルス粒子を含んでいる分画 （例えば図 1では 20 分画以上） に分けて、 実施例 5および実施例 6の方法で各抗原の測 定を行った。
低密度の画分を実施例 5の方法で測定すると、 この画分はウィル ス粒子を含んでいない遊離の HBe抗原を測定している。 また高密度 の画分を実施例 5の方法で測定する と、 この測定方法は HBc抗原と 粒子状プレコア蛋白をあわせて測定しているので、 実施例 5で測定 した値から実施例 6の値を減算することにより粒子状 HBVプレコア 蛋白の値が計測可能である。 このよ うにして測定、 計算した HBe抗 原、 HBc抗原、 HBVプレコア蛋白のそれぞれの検体中の比を計算した (表 1 ) 。 表 1.
Figure imgf000023_0001
HBVプレコア蛋白 ： HBe抗原は 13:1〜： 1:40であり、 検体によってい ずれかの抗原、 蛋白を多く含むものが異なっている。 一方、 HBVプ レコア蛋白 ： HBe抗原は 12:：！〜 158:1の範囲であり、 すべての検体で HBVプレコア蛋白を多く含んでいる。
表 2 . 密度勾配遠心による HBe抗原、 HBc抗原、 および粒子状 HBVプレコアタ ンパクの分別測定
HBc饥ノ京 HBV レコア/コアタノノヽク 粒子状プレ： 3ァ タンパク 横体名 低 度 r¾密度 咼ぉ、度比 低密度 咼 度 咼 度比 比
A B Β/ (Α+Β) C D D/(C+D) E=D-B E/(C+D)
/ ， ノ
pg/ml pg/ml % pg/ml pg/ml % pg/ml %
BBI PHM901-06 809 1,038 56% 1,038 56%
BBI PHM907-10 22,735 2,297 9% 2,297 9%
BBI PHM921-06 1,436 1,410 50% 1,410 50%
BBI PHM922-12 100 902 90% 12,977 9,910 43% 9,007 39% t 13し Jr" HBVD 7O-11 oi l / ,4(J 丄 υυ% , 丄/ , U4o 丄， ，丄 1U Q 889,703 27%
Nabi SB0408-J 3,066 164,303 98% 753,697 1,771,119 70% 1， 606，816 64%
BBI PHM935A- 14 1,685 171,323 99% 291,285 4,690,058 94% 4,518,735 91%
BBI PHM935A-16 107 3,511 97% 63,713 573,768 90% 570,257 89%
ProMedDx #9990776 1,921 63,059 97% 487,502 805,856 62% 742,797 57%
ProMedDx #10149975 117 3,605 97% 1,708,934 43,372 2% 39,767 2%
01 1670 3,199 105,916 97% 226,685 137,038 38% 31,122 9%
01 1351 98 13,630 99% 768,967 351,768 31% 338,138 30%
01 3567 539 22,518 98% 1,639,314 354,521 18% 332,004 17%
01 2296 31 2,172 99% 386,067 36,338 9% 34,166 8%
01 1188 12 578 98% 1,393 2,088 60% 1,509 43%
01 2877 108 4,863 98% 79,403 72,987 48% 68,124 45%
それぞれの分画の HB c抗原、 HBVコア関連抗原測定値および、 それ から計算される粒子状プレコアタ ンパク濃度を表 2に示す。 定量可 能であった全例で HB c抗原の 90%以上は高密度分画に存在した。 低密 度分画に存在する HBVプレコア Zコアタンパクは HBe抗原であり、 高 密度分画中 HBVプレコア コアタンパクは HBc抗原および粒子状 HBV プレコアタンパクである。 したがって、 高密度 HBVプレコア/コア タンパク濃度よ り HBc抗原濃度を減じることにより、 粒子状プレコ ァタンパク濃度を算出することができる。
実施例 8 . 検体中の遊離および粒子状 HBVプレコァ コアタ ンパ ク、 および HB c抗原の分別測定とその比率
HBVダイ レク ト- Magキッ ト （JSR株式会社） の 「反応バッファー」 50 μ 1、 「HBV補足粒子」 （抗 HBs抗体固相化磁気ビーズ） 50 μ 1、 お よび検体 200 μ 1を混合し室温 30分間振と う し、 HB s抗原を含む HBV関 連粒子を結合させた。 これを強力な磁石によ り磁気ビーズを分離し 、 上清を除いた。 この上清には遊離 HB e抗原が含まれる。 残った磁 気ビーズに 15% SDS溶液を 60 /z 1加え、 70°C 10分加熱することによ り 、 結合していた粒子状 HBVプレコア/コアタ ンパクを溶出した。 こ れを強力な磁石によ り磁気ビーズを分離し、 抽出物を取り出した。
この上清および沈殿抽出物中の HBVプレコア/コアタンパクおよ び HBcAgをそれぞれ実施例 5、 実施例 6の方法で測定し、 検体中の HB e 抗原、 HB c抗原、 粒子状 HBVプレコアタンパクのそれぞれの濃度およ び比率を計算した。 結果を表 3に示す。 表 3 . HBs抗体免疫沈降による HBe抗原、 HBe抗原、 および粒子状 HBVプレコア
HBc抗原 HBVプレコア/コアタンパ 検体名 上清 沈殿 沈殿比 上清 沈殿 沈
A B B/ (A+B) C D D/(
/ -f
pg/m丄 pg/ml % pg/ml pg/ml
BBI PHM901-06 5 69 93% 2,151 948
BBI PHM907-10 5 207 98% 29,728 2,219
BBI PHM921-06 3 76 96% 2,723 1,307
BBI PHM922-12 46 749 94% 20,025 10,364
BCP HBV6278 - 11 5 「,2 o3 o8 118,840 96% 4,958,186 941,077
Nabi SB0408-J 4,296 116,834 96% 1,382,054 1,829,461
BBI PHM935A-14 8,671 188,535 96% 1,636,481 3,370,973
BBI PHM935A-16 959 7,800 89% 482,713 591,319
ProMedDx #9990776 6,264 52,270 89% 1,646,640 1,184，289
ProMedDx #10149975 477 4,522 90% 2,094,278 146,459
01 1670 2,877 137,930 98% 540,397 177,755
01 1351 535 32,615 98% 2,168,349 414,203
01 3567 1,409 40,800 97% 5,325,365 325,486
01 2296 198 5,319 96% 1,036,210 59,531
01 1188 23 692 97% 5,171 2,151
01 2877 555 11,692 95% 161,907 126,510
定量可能であった全例で HB c抗原の 90%以上は沈殿に存在した。 す なわち、 HBs抗原に覆われた粒子は、 ほぼ全て免疫沈降される。 上 清中に存在する HBVプレコア/コアタンパクは HB e抗原であり、 沈殿 中 HBVプレコァ Zコァタンパクは HB c抗原および粒子状 HBVプレコア タンパクである。 したがって、 沈殿中 HBVプレコア/コアタンパク 濃度より HBc抗原濃度を減じることにより、 粒子状プレコアタンパ ク濃度を算出するこ とができ る。 この濃度および比率は実施例 7に 示した密度勾配遠心による分別測定結果と非常に似通った値となつ ており、 双方の測定法で粒子状プレコアタンパクの分別測定ができ ることを示している。
実施例 9 . 粒子状 HBVプレコアタンパク比の病態による違い
実施例 8 と同様にして HBVキャリ アおよび B型肝炎の様々な病態に おける血清検体計 81例について、 遊離および粒子状 HBVプレコア Z コアタ ンパク、 および HB c抗原を分別測定し、 粒子状 HBVプレコアタ ンパクの全プレコア/コァタンパク （HBe抗原 + HBc抗原 +粒子状 HB Vプレコアタンパク） に対する比率を比較した。 結果を図 6に示す
HB e抗原陽性例では急性肝炎で高く無症候性キヤリ ァゃ肝硬変で は低い傾向が認められた。 また、 HB e抗体陽性例では、 慢性肝炎や 肝癌例で高く、 急性肝炎治癒後や肝硬変で低い傾向が認められた。 これらの結果から、 粒子状プレコアタンパクを測定することによ り 、 B型肝炎の診断、 治療に有用な知見を得ることができ、 さらに HBV や B型肝炎の病態の解明に役立てることができる。 こ う した知見を 通して、 B型肝炎の治療薬の開発にも有用な知見が得られる。
実施例 10. 検体処理法の比較
種種の検体前処理液を作製し、 実施例 6 と同様にして前処理液だ けを変化させ HBV陽性血清 5検体の検体処理および HB c抗原の測定を 行い、 各処理法の効果を比較した。
このうち SDS， N-Lauroyl sarcosin - Na, Deoxychol ic Acid_Naは 陰イオン性界面活性剤であり、 n- Decyl trimethyl ammonium-Brは 陽イオン性界面活性剤である。 検体処理中の各界面活性剤の終濃度 は前処理液中の 1 Z 3に、 HBc抗原測定系における 1次反応中の終 濃度は 1ノ 9 となる。
表 4. 各処理法での HBc抗原 ELISAでの反応 （発光量）
Figure imgf000028_0001
この結果力 ら処理液と して SDS， N-Lauroyl sarcosin-Na, Deoxyc holic Acid-Naなどの陰イオン性界面活性剤が適していることが明 らかとなつた。 このうち特に SDSが適している。 一方 n- Decyl trime thyl ammonium- Brなどの陽ィォン性界面活性剤を単独で用いること は、 陰性検体でのパックグラウンドも高く、 この測定系には適さな い （表 4 ) 。 表 5. 各処理法での HBc抗原 ELISAでの反応 （発光量）
Figure imgf000029_0001
この結果から前処理液と して 15% SDSに加え、 両性界面活性剤で ある CHAPSあるいはさ らに非ィォン性界面活性剤である Triton-XlOO などを加えることによ り、 前処理の効果がさ らに高くなることが明 らかとなつた （表 5 ) 。
実施例 11. 粒子状 HBVプレコアタンパクの抗原性
抗 HBcモノ ク ローナル抗体 （Anti- HBc( j3 ) 2A22特殊免疫研究所） を 1 g/mlに 0.5M NaCl, 0.1M炭酸- Na緩衝液（pH9.6)で希釈し、 96ゥ 'エルマイク ロプレート （NUNC社） に 100 1/ゥエル分注し、 4°Cー晚 静置した。 PBSで洗浄後、 カゼインを含む溶液でブロ ッキングし、 この溶液を除いた後、 検体溶液を 100μ 1/ゥエル加え、 室温 1時間反 応させた。 洗浄液で洗浄後、 l g/mlのビォチン標識 2Α22モノ ク ロ ーナル抗体を 100μ 1/ゥエル加え、 室温 1時間反応させた。 洗浄液で 洗浄後、 10,000倍希釈のペルォキシダーゼ標識アビジン （Vector社 ) を、 ΙΟΟμ Ι/ゥ ル加え、 室温 1時間反応させた。 洗浄液で洗浄後 、 0PD(SIGMA社）/過酸化水素溶液を 100 μ 1/ゥエル加え、 室温 30分間 呈色反応させた。 1M硫酸を 100μ 1/ゥヱル加え、 反応を停止させた 後、 420 nm吸光度を測定した。 この測定系では、 約 2 ng/mlの HBcAgを検出可能であった。 実施例 1 ( A) の HBVコア関連抗原のピーク分画を 1% NP- 40で処理してェンべ ロープを除去した後、 10倍希釈し（HBVコア関連抗原含量約 150 ng/m 1 )上記の測定を行ったが、 HBc抗原は検出されなかった。
また、 同じ検体を臨床的に用いられている HBe抗原測定系 （ダイ ナボッ ト社） にて測定したが、 やはり HBe抗原は検出されなかった 。 したがって、 本発明の粒子状 HBVプレコアタンパクは、 HBc抗原、 HBe抗原とは異なる抗原性を有している と考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . HBVのコア様粒子形成能を有する、 シグナル配列の全部また は一部を含む HBVプレコア蛋白。
2 . HBVのコア様粒子形成能を有する、 アミ ノ酸配列の N末端が 一 28番目であり C末端が 150番目から 154番目のいずれかである、 HB Vプレコァ蛋白。
3 . 配列番号 1 に記載されたアミ ノ酸配列からなる請求項 1 に記 載の HBVプレコア蛋白。
4 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の HBVプレコア蛋白を含 んでなる HBVコア （様） 粒子または HBVウィルス （様） 粒子。
5 . 請求項 1〜 3 のいずれか 1項に記載の HBVプレコア蛋白を含 んでなる HBVワクチン、 または治療薬。
6 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の HBVプレコア蛋白を含 んでなる HBV診断薬または診断キッ ト。
7 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の HBVプレコア蛋白を測 定する方法。
8 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の HBVプレコア蛋白を露 出させる工程、 HBVプレコア蛋白を認識するプローブと結合するェ 程を含む請求項 7に記載の方法。
9 . 前記 HBVプレコア蛋白を露出させる工程が界面活性剤の処理 または添加である請求項 7または 8に記載の方法。
10. 前記界面活性剤が陰イ オン性界面活性剤、 または陰イオン性 界面活性剤および両ィオン性界面活性剤、 または陰イオン性界面活 性剤、 両イオン性界面活性剤および非ィオン性界面活性剤のいずれ かである請求項 7〜 9のいずれか 1項に記載の方法。
11. 前記 HBVプレコァ蛋白に結合するプ口一ブがァミノ酸配列の 一 28〜一 11に結合するプローブまたは請求項 1〜 3のいずれか 1項 に記載の HBVプレコァ蛋白に特異的に結合し、 HBe抗原あるいは HBc 抗原には結合しないプローブである請求項 7〜10のいずれか 1項に 記載の方法。
12. 前記 HBVプレコア蛋白に結合するプローブが抗体である請求 項 7〜： 11のいずれか 1項に記載の方法。
13. 前記抗体がアミノ酸配列の 1番目から 19番目を認識する抗体 、 21番目から 40番目を認識する抗体、 31番目から 49番目を認識する 抗体、 130番目から 140番目を認識する抗体、 1播目から 81番目の構 造領域を認識する抗体の中から選択される 2つ以上の抗体の組み合 わせである請求項 7〜 12のいずれか 1項に記載の方法。
14. 抗 HBs抗体等の HBs抗原に結合するプローブによ り （免疫） 沈 降し、 沈降物中の HBVプレコア/コアタンパクを測定することにより 、 粒子状 HBVプレコア/コアタンパクを測定する方法。
15. 請求項 7〜 13のいずれか 1項に記載の方法によ り測定した HB Vプレコア蛋白の測定値に HBe抗原の値が含まれている場合に、 HBe 抗原の測定値を減算することによ り算出する検体中の粒子状 HBVプ レコア/コア蛋白の値を測定する方法。
16. 請求項 7〜： L5のいずれか 1項に記載の方法によ り測定した HB Vプレコア/コア蛋白の測定値より HBc抗原の測定値を減算すること によ り算出する検体中の粒子状 HBVプレコァ蛋白の値を測定する方 法。
17. 請求項 7〜： 16のいずれか 1項に記載の方法で測定した HBVプ レコア蛋白の定量を HBV感染あるいは B型肝炎の病態マーカーと し て利用する方法。
18. 陰ィォン性界面活性剤および HBVプレコア蛋白の一 28〜： L50番 目のアミ ノ酸を認識する抗体を含む測定キッ トおよび HBe抗原を測 定するキッ トを含む診断薬。
19. 陰ィォン性界面活性剤および HBVプレコア/コアタンパクの一 28〜： 150ァミ ノ酸を認識する抗体、 および粒子状 HBVプレコア/コア タンパクと HBe抗原を分離する抗体を含む測定キッ トおよび診断薬
20. 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の HBVプレコァタンパク に対する抗体を検出する方法。
21 . HBVプレコアタンパクを含む粒子状 HBVプレコアタンパクに対 する抗体を測定する測定キッ トおよび診断薬。
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