JP5836569B2 - Hcv抗原抗体組み合わせアッセイ用の試薬 - Google Patents
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Description
本発明は全般に、HCV感染の検出及び診断用のイムノアッセイに関連する。特に本発明は、検体中のHCV抗原及び抗HCV抗体の同時検出のための非イオン系洗剤の使用に基づく組み合わせイムノアッセイ、試薬及びキットに関連する。
一本鎖RNAウイルスであるC型肝炎ウイルス(HCV)は、血液感染の非A非B型肝炎の病原因子である。HCVの慢性的活動性感染はしばしば、肝硬変及び肝細胞癌に進行する。疫学的研究により、HCVは世界で1億7000万人を超える人々が感染しており、進行して最終的に死に至る慢性疾患の発症率が高い(症例の50%超)ことが示されている。しかしながら、この疾患は主に血液感染であるため、血液検体中の病原体を識別し、輸血による疾患伝播を排除することが可能である。HCV病原体に曝露した後、最初のうちはウイルスの存在の証拠はない(すなわち検出可能なウイルスRNA又は血清マーカーがない)。この期間は「ウィンドウ期間」(WP)と呼ばれる。一般に、HCVに曝露してから10日後にウイルスRNAが検出可能になるが、一方、抗HCV抗体は約70日後に検出可能になる(Busch MP and Dodd RY,Transfusion 40(10):1157〜1160,2000)。HCV感染の拡大を防ぐためには、この観測可能な事実を考慮に入れ、検出ウィンドウを狭め得るような、信頼できる血液スクリーニング検査を確立することが非常に重要である。HCV RNAを検出する核酸増幅検査(NAT)の市販開始以来、輸血後HVC感染率は劇的に減少した。他の方法は、患者血清又は血漿中における、HCVコア抗原(Ortho HCVコア抗原ELISA(Ortho HCV Core Antigen ELISA)、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社(Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.)、ニュージャージー州ラリタン(Raritan))又はHCVポリペプチドに対する抗体(Ortho HCV 3.0 ELISA(Ortho HCV 3.0 ELISA)、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン)の存在を検出するための、血液の血清学的スクリーニングに基づく。
本発明は、検体中のHCV抗原及び抗HCV抗体の同時検出を行うための組み合わせイムノアッセイ、試薬及びキットを目的とする。
本発明は、HCV抗原抗体組み合わせイムノアッセイ、並びに関連する方法、試薬及びキットを目的とする。
CH3−(CH2)n−N+−(CH3)2O−
により特性付けられるN−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドである。
式中、アルキル鎖の長さは数字nで定義され、これは9〜13の範囲、又は好ましくは10〜12の範囲であり得、更に好ましくは、nは11である。数字「n」は少なくとも9であり、好ましくは少なくとも10であり、更に好ましくは少なくとも11である。
以下の実施例は、洗剤のラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)、並びにそれが抗原アッセイでのHCVコア抗原の放出を達成することにおける効率、及びHCV抗体アッセイとの適合性を調べることにより、本発明の利点及び重要性を詳細に説明するものである。HCVコア抗原及びHCV抗体の同時測定における洗剤のラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)使用についても記載される。
Ortho HCVコア抗原ELISA検査システム
ヒト血清又は血漿中のC型肝炎ヌクレオカプシドコア抗原(HCVコア抗原)を検出するために、Ortho HCVコア抗原ELISA(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン)が使用された。抗原を捕捉するために、マイクロウェル固相上にコーティングされたモノクローナル抗体が使用され、その捕捉された抗原を検出するために、HRPに結合した第二のモノクローナル抗体が使用された。前処理工程なしに捕捉及び検出するために、洗剤を含んだ試料希釈剤を使用して、HCVコア抗原を曝露した。
Ortho HCV 3.0 ELISA(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州ラリタン)は、ヒト血清又は血漿中のC型肝炎ウイルスに対する抗体(抗HCV)の検出のためのものであった。マイクロウェル固相上にコーティングされた、組換え型HCV抗原c22(アミノ酸2〜120、コア領域)、c200(アミノ酸1192〜1931、NS3/NS4領域)及びNS5(アミノ酸2054〜2995)が、抗HCV抗体の捕捉に使用された。捕捉されたヒト抗HCVを検出するために、HRPに結合したマウスのモノクローナル抗ヒトIgG抗体が使用された。このフォーマットでは、試料希釈剤中に洗剤Tween20を使用した。
Chiron RIBA HCV 3.0 SIA(ノバルティス・ワクチン・アンド・ダイアグノスティックス社(Novartis Vaccines & Diagnostics)、カリフォルニア州エメリービル(Emeryville))は、ヒト血清又は血漿中のC型肝炎ウイルスに対する抗体(抗HCV)の検出に使用されるストリップイムノブロットアッセイである。抗HCV抗体を捕捉するために、HCV抗原又はペプチドc22p(アミノ酸10〜53、コア領域)、c33c(アミノ酸1192〜1457、NS3領域)、5−1−1及びc100ペプチド(それぞれアミノ酸1694〜1735及び1920〜1935、NS4領域)並びにNS5(アミノ酸2054〜2995)が、検査ストリップ上に個々の帯として固定された。マウスのモノクローナル抗ヒトIgG抗体がHRPに結合され、次いで捕捉されたヒト抗HCVを検出した。このアッセイは、Ortho HCV 3.0 ELISA反応性試料の個々の抗原に対する抗体特異性反応性に関する追加情報を提供する。
アミノ酸10〜アミノ酸45のHCVコアタンパク質配列をカバーするよう、2つのペプチド誘導体が合成された。HCC5Nについては、配列は配列番号:1に示されている(N−末端は、アセチル化によりブロックされたアミノ基ではなく、遊離アミノ基を有する)。HCC5NにはC末端にNorLeucine及びCysの2つの残基があり、これらはHCVコアタンパク質に属していない。HCC5−bについては、配列は配列番号:2に示されている(N−末端は遊離アミノ基を有する)。HCC5−bにはC末端にGly及びLysの2つの残基があり(ビオチン)、これらはHCVコアタンパク質に属していない。HCC5Nは更に、還元性条件下でHCC5NのC末端Cysを介してSMCC活性化BSAに結合していた。
本研究では4つのモノクローナル抗体が使用された。モノクローナル抗体C11−3、C11−7及びC11−14の調製及びエピトープ認識部位については、欧州特許公報第EP 0 967 484 A1号に記述されている。これらモノクローナル抗体のエピトープ認識部位のいずれも、HCVのアミノ酸10〜45の範囲内にはなかった。モノクローナル抗HCV抗体12F11が、組換え型c22に対して産出された。12F11の認識部位は、HCVのアミノ酸58〜72付近であった(コア抗原)。抗体C11−14及び12F11は、標準手順を使用してホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合された。
(1)抗c22及び抗c33cが減損した抗HCV試料
試料WHO Hu−a−c33c、41530822、41530832及び41530883は、最初に、Ortho HCV 3.0 ELISAによって抗HCV強反応性、またOrtho HCVコア抗原ELISAによって非反応性であった。クロマトグラフィー樹脂が組換え型HCVコア抗原c22(Ortho HCV 3.0 ELISAに使用されているコーティング抗原の1つと同じ抗原)に結合した親和性カラムに試料を通すことによって、抗体の抗c22部分(抗HCVコア)を減損させた。
HCVコア抗原反応検体ロット16は、血漿プールであり、Ortho HCV 3.0 ELISAによって抗HCVが非反応性であり、PCRによってHCV RNAが反応性であり、Ortho HCVコア抗原ELISAによってHCVコア抗原が反応性であった試料から作られていた。HCVコア抗原試料9160834は、ボストン・バイオメディカ(Boston Biomedica)社(BBI)から得た血漿試料である。この試料は、Ortho HCV 3.0 ELISAによって抗HCVに対して非反応性であり、Versant bDNA(バイエル(Bayer)社)によって約36,379,940IU/mL又は189,175,500コピー/mLでHCV RNAに対して反応性であり、Ortho HCVコア抗原ELISAに対して反応性であった。
本研究で試験されたHCV血清変換パネルはすべて市販されているものであり、米国のセラケア・ライフ・サイエンシス社(SeraCare Life Sciences, Inc.)(BBIダイアグノスティックス(BBI Diagnostics))、及び米国のゼプトメトリックス社(ZeptoMetrix Corporation)(旧社名:インパス・バイオクリニカル・パートナーズ社(Impath/BioClinical Partners, Inc.))から購入された。HCV血清変換パネルは、HCVに感染した個体から採取されたヒト血液試料の一連の採血から構成されていた。試料は、抗HCV非反応性から反応性までの一周期をカバーしていた。
アッセイは、Ortho HCV 3.0 ELISAキットの試薬を使用して実施された。洗剤Tween−20、BSA、カゼイン、酵母抽出液及びその他のタンパク質を含有するリン酸系緩衝液から構成される試料希釈剤150μLと、試料50μLとを、各ウェルに加えた。このプレートを37℃で60分間インキュベートし、次にPBS/Tween20含有の洗浄緩衝液で5回洗った。その後、HRP結合マウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体200μLを各ウェルに加えた。このプレートを37℃で60分間インキュベートし、続いて6回洗った。200μLのOPD/基質(OPD錠剤1錠(シグマ(Sigma)社、カタログ番号P−8287)をELISA基質緩衝液6mLに溶解)を各ウェルに加え、このプレートを室温の暗所で30分間インキュベートした。4NのH2SO4停止溶液を50μL/ウェルの比率で加えた。プレート分光測光法リーダーを使用して、493nmでODを記録した。アッセイのカットオフ設定は、平均マイナスプラス0.6のODのHCV 3.0 ELISAから適応された。アッセイの例外は次の事項であった。
(1)「ELISA−1」では、洗剤Tween 20を含有する試料希釈剤がキットから得られた。一方、「ELISA−2」では、この洗剤はN−ラウリルサルコシン(NLS)に置き換えられ、「ELISA−3」では、洗剤はラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)に置き換えられた。
(2)「ELISA−1」では、キットに供給されているHRP結合マウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体を、使用前に1:3に希釈した。「ELISA−2」及び「ELISA−3」では、キットに供給されている結合抗体を、使用前に1:2に希釈した。
Agサンドイッチアッセイ形式においては、ビオチンで標識された抗原が複合体として使用された。ビオチン−抗原複合体が、固相に捕捉されているヒト抗HCV抗体に結合して、Ag−Ab−Agサンドイッチが形成された。このサンドイッチ複合体は次に、続くインキュベーションにおいてHRP結合したストレプトアビジンによって検出された。
実施例3に示されているHCVコア抗原の検出は、モノクローナル抗体−HCVコア抗原−モノクローナル抗体のサンドイッチELISAであった。試料にさらされたHCVコア抗原が、プレート上にコーティングされた2つのモノクローナル抗HCVコア抗体によって捕捉され、別の2つのHRP標識されたモノクローナル抗HCV抗体によって検出された。
HCVコア抗原/抗HCV抗体組み合わせELISAが、実施例2で使用されたものと同じプレート上で実施された。プレートは、モノクローナル抗HCV抗体C11〜3及びC11〜7、HCC5−BSA並びにrNS3(h)でコーティングされた。試料希釈剤は、20mMのリン酸緩衝液(pH7.3)、0.5Mの塩化ナトリウム、1mMのEDTA、1%の洗剤LDAO、1%のBSA、0.03%の酵母抽出液、及び0.01%の変性スーパーオキシダーゼジスムターゼ(SOD)、200μg/mLのマウス免疫グロブリンG(IgG)並びに0.1%の2−クロロアセトアミドで構成されていた。抗体/抗原複合体は、10mMのリン酸緩衝液(pH7.3)中に、HRP標識された抗HCVモノクローナル抗体C11−14(4μg/mL)及びHRP標識されたモノクローナル抗体12F11(4μg/mL)、HCC5−ビオチン(5ng/mL)並びにrNS3(h)−ビオチン(60ng/mL)、142mMの塩化ナトリウム、3mMの塩化カリウム、0.1%の洗剤Tween 20、1.5%のBSA、20%の加熱不活性化した新生仔ウシ血清、0.03%のフェリシアン化カリウム、100ug/mLのマウス免疫グロブリンG(モノクローナル)並びに0.1%の2−クロロアセトアミドで構成されていた。HRP標識されたストレプトアビジン複合体は、HRP−ストレプトアビジン(ジャクソン・イムノリサーチ社、カタログ番号016−030−084)をCD−1(PBS中のカゼインブロッカー、ピアース社カタログ番号37528、Tween 20を0.05%以下、EDTAを2mM以下添加)で1:8,000に希釈したもので構成されていた。
(1) 検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出するためのイムノアッセイにおいて、
N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を提供することであって、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも第一HCVタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二HCVタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が1つの同じ信号生成手段を含む、ことと、
前記検体を前記洗剤の存在下で、前記捕捉抗原、前記検出抗原、前記捕捉抗体、及び前記複合抗体に接触させることにより、前記捕捉抗原と、前記検出抗原と、前記検体中に存在する抗HCV抗体との間でサンドイッチ複合体を形成し、前記捕捉抗体と、前記複合抗体と、前記検体中に存在するHCV抗原との間で複合体を形成することと、
前記複合体の形成の結果として前記信号生成手段から生成される信号を測定し、これにより前記検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出することと、
を含む、イムノアッセイ。
(2) 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、式CH3−(CH2)n−N+−(CH3)2O−によって特徴付けられ、式中、nは9〜13の範囲である、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(3) 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)である、実施態様2に記載のイムノアッセイ。
(4) 前記第一HCVタンパク質及び第二HCVタンパク質が、コア抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4、及びNS5からなる群から独立して選択される、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(5) 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二HCVタンパク質領域に結合する、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(6) 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が両方とも前記HCVコア抗原である、実施態様5に記載のイムノアッセイ。
(7) 捕捉抗原と検出抗原との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも、HCVタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(8) 前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるHCVタンパク質から誘導される、実施態様7に記載のイムノアッセイ。
(9) 前記第一ペプチド断片又は前記第二ペプチド断片の少なくともいずれか一方が、前記HCVコア抗原の断片である、実施態様8に記載のイムノアッセイ。
(10) 前記第一組の前記捕捉抗体が、2つ以上の抗体を含む、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(12) 前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、実施態様1に記載のイムノアッセイ。
(13) 検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出するためのキットにおいて、
N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と複合抗体との第一組を含み、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、第一HCVタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が第二HCVタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記複合抗体が1つの同じ信号生成手段を含む、キット。
(14) 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、式CH3−(CH2)n−N+−(CH3)2O−によって特徴付けられ、式中、nは9〜13の範囲である、実施態様13に記載のキット。
(15) 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)である、実施態様14に記載のキット。
(16) 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が、コア抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4、及びNS5からなる群から独立して選択される、実施態様13に記載のキット。
(17) 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二HCVタンパク質領域に結合する、実施態様13に記載のキット。
(18) 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が両方とも前記HCVコア抗原である、実施態様17に記載のキット。
(19) 捕捉抗原と検出抗原との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、HCVタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、実施態様13に記載のキット。
(20) 前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるHCVタンパク質から誘導される、実施態様19に記載のキット。
(22) 前記第一組の前記捕捉抗体が、2つ以上の抗体を含む、実施態様13に記載のキット。
(23) 捕捉抗体と複合抗体との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記複合抗体が、前記第二HCVタンパク質、又は異なるHCVタンパク質に特異的に結合する、実施態様13に記載のキット。
(24) 前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、実施態様13に記載のキット。
Claims (22)
- 検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出するためのイムノアッセイにおいて、
式CH3−(CH2)n−N+−(CH3)2O−によって特徴付けられ、式中、nは9〜13の範囲である、N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と標識抗体との第一組を提供することであって、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも第一HCVタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記標識抗体が第二HCVタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記標識抗体が1つの同じ信号生成手段を含む、ことと、
前記検体を前記洗剤の存在下で、前記捕捉抗原、前記検出抗原、前記捕捉抗体、及び前記標識抗体に接触させることにより、前記捕捉抗原と、前記検出抗原と、前記検体中に存在する抗HCV抗体との間でサンドイッチ複合体を形成し、前記捕捉抗体と、前記標識抗体と、前記検体中に存在するHCV抗原との間で複合体を形成することと、
前記複合体の形成の結果として前記信号生成手段から生成される信号を測定し、これにより前記検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出することと、
を含む、イムノアッセイ。 - 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)である、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一HCVタンパク質及び第二HCVタンパク質が、コア抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4、及びNS5からなる群から独立して選択される、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記標識抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二HCVタンパク質領域に結合する、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が両方とも前記HCVコア抗原である、請求項4に記載のイムノアッセイ。
- 捕捉抗原と検出抗原との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が両方とも、HCVタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるHCVタンパク質から誘導される、請求項6に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一ペプチド断片と前記第二ペプチド断片との少なくともいずれか一方が、前記HCVコア抗原の断片である、請求項7に記載のイムノアッセイ。
- 前記第一組の前記捕捉抗体が、2つ以上の抗体を含む、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 捕捉抗体と標識抗体との第二組が提供され、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記標識抗体が、前記第二HCVタンパク質、又は異なるHCVタンパク質に特異的に結合する、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 検体中のHCV抗原及び抗体を同時に検出するためのキットにおいて、
式CH3−(CH2)n−N+−(CH3)2O−によって特徴付けられ、式中、nは9〜13の範囲である、N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドを含む非イオン系洗剤、捕捉抗原と検出抗原との第一組、捕捉抗体と標識抗体との第一組を含み、前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、第一HCVタンパク質の第一ペプチド断片を含み、前記捕捉抗体及び前記標識抗体が第二HCVタンパク質に特異的に結合し、前記検出抗原及び前記標識抗体が1つの同じ信号生成手段を含む、キット。 - 前記N−アルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドが、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)である、請求項12に記載のキット。
- 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が、コア抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4、及びNS5からなる群から独立して選択される、請求項12に記載のキット。
- 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が同じであり、前記捕捉抗体及び前記標識抗体が、前記第一ペプチド断片の外側の前記第二HCVタンパク質領域に結合する、請求項12に記載のキット。
- 前記第一HCVタンパク質及び前記第二HCVタンパク質が両方とも前記HCVコア抗原である、請求項15に記載のキット。
- 捕捉抗原と検出抗原との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗原及び前記検出抗原が、HCVタンパク質の第二ペプチド断片を含み、前記第二ペプチド断片は、前記第一ペプチド断片とは異なる、請求項12に記載のキット。
- 前記第一ペプチド断片及び前記第二ペプチド断片が、異なるHCVタンパク質から誘導される、請求項17に記載のキット。
- 前記第一ペプチド断片と前記第二ペプチド断片との少なくともいずれか一方が、前記HCVコア抗原の断片である、請求項18に記載のキット。
- 前記第一組の前記捕捉抗体が、2つ以上の抗体を含む、請求項12に記載のキット。
- 捕捉抗体と標識抗体との第二組を更に含み、前記第二組の前記捕捉抗体及び前記標識抗体が、前記第二HCVタンパク質、又は異なるHCVタンパク質に特異的に結合する、請求項12に記載のキット。
- 前記捕捉抗原及び前記捕捉抗体が、固相に付着している、請求項12に記載のキット。
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