KR101828767B1 - Ｈｃｖ 항원-항체 조합 분석용 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플 내 HCV 항원 및 항-HCV 항체의 동시 검출을 위한 조합 면역분석, 시약 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 조합 면역분석법에서는 재조합 HCV 항원에 의한 항-HCV 항체의 포획과 같은 다른 시약의 성능을 저해하지 않으면서 샘플 내 비리온으로부터 HCV 코어 항원을 효과적으로 노출 또는 방출시키는 비이온성 세제를 사용한다.

Description

ＨＣＶ 항원-항체 조합 분석용 시약{Reagents for HCV antigen-antibody combination assays}
본 발명은 일반적으로 HCV 감염의 검출 및 진단을 위한 면역분석법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 샘플 내의 HCV 항원 및 항-HCV 항체의 동시 검출을 위한 비이온성 세제의 사용을 기초로 한 조합 면역분석법, 시약 및 키트에 관한 것이다.
단일 가닥 RNA 바이러스인 C형 간염 바이러스 (HCV)는 혈액 매개 비-A형, 비-B형 간염의 병인체이다. HCV의 만성 활동성 감염은 종종 간경화 및 간세포 암종으로 진행한다. 역학 연구는 HCV가 세계적으로 1억7천만 명 초과의 사람을 감염시키고, 최종적으로 사망에 이르게 하는 (환자의 50% 초과) 만성 질병을 높은 빈도로 유발함을 보여주었다. 그러나, 주로 혈액 매개 질병이기 때문에, 혈액 샘플에서 병원체를 확인하고 수혈을 통한 질병 전염을 방지할 수 있다. HCV 병원체에 대한 노출 후에, 초기에는 바이러스가 존재한다는 증거가 존재하지 않는다. 즉, 검출가능한 바이러스 RNA 또는 혈청학적 마커 (marker)가 존재하지 않는다. 이것은 "항체 미검출 기간 (window period)" (WP)으로 언급된다. 일반적으로, HCV에 노출된 지 10일 후에, 바이러스 RNA를 검출할 수 있지만, 항-HCV 항체는 약 70일이 더 지나야 검출가능하게 된다 (Busch MP and Dodd RY, Transfusion 40(10): 1157-1160, 2000). HCV 감염의 전파를 방지하기 위해, 이와 같은 관찰가능한 사실을 고려하고, 항체 미검출 기간을 단축시키는 신뢰할 수 있는 혈액-스크리닝 시험을 확립하는 것이 대단히 중요하다. HCV RNA를 검출하는 핵산 증폭 시험 (NAT)의 상업화에 의해, 수혈 후 HVC 감염률이 극적으로 감소하였다. 다른 방법은 환자 혈청 또는 혈장에서 HCV 코어 항원 (Ortho HCV 코어 항원 ELISA, 오르토-클리니칼 다이어그노스틱스, 인크. (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., 미국 뉴저지주 라리탄)) 또는 HCV 폴리펩티드에 대한 항체 (Ortho HCV 3.0 ELISA, 오르토-클리니칼 다이어그노스틱스, 인크.)의 존재를 검출하기 위한 혈액의 혈청학적 스크리닝을 기초로 한다.
문헌 [Seme et al., J. Clin . Virol . 32(2): 92-101, 2005]에서 수행된 조사에 따르면, 1세대 HCV 코어 항원 분석은 핵산 기술 (NAT)과 대등한 감도 및 검출 한계로 HCV 감염을 검출한다. 상기 분석법들은 현재의 3세대 HCV 항체 스크리닝 분석보다 40 내지 50일 더 일찍 HCV 감염을 검출한다. 혈액 스크리닝을 위해 설계된 1세대 HCV 코어 항원 분석이 항체 미검출 기간을 유의하게 단축시켰지만, 이것은 단지 혈청전환전 (pre-seroconversion) 또는 초기 혈청전환후 (early post-seroconversion) 시기에 코어 항원을 검출할 뿐이다. 또한, 1세대 HCV 코어 항원 분석은 항원이 후기 혈청전환 시기에 항-코어 항체와 면역-복합체를 형성할 때 코어 항원을 검출할 수 없다. 명백하게, 혈청전환전 시기에 HCV 코어 항원뿐만 아니라 혈청전환 시기에 항-HCV 항체를 검출하여 WP를 유의하게 단축할 수 있는 조합 혈청 분석을 확립하는 것이 바람직하다. 이러한 조합 혈청 시험은 특히 장비 또는 수행능력의 결여 때문에 NAT 시험을 실시할 수 없는 환경에서 유용한 혈액 스크리닝 방법일 수 있다.
상기 HCV 항원 및 항체 조합 분석은 WP의 단축이라는 측면에서 현재의 3세대 혈청학적 혈액 스크리닝 방법 (Ortho HCV 3.0 ELISA, 오르토-클리니칼 다이어그노스틱스, 인크.)에 대한 유의한 개선이 될 것이다. 그러나, 성공적인 항원 항체 조합 분석에 대한 한 가지 문제는 재조합 HCV 항원에 의한 항-HCV 항체의 포획을 저해하지 않으면서 HCV 비리온을 붕괴시키고 항원을 방출시킬 적절한 세제를 선택하는 것이다.
본 발명은 샘플 내 HCV 항원과 항-HCV 항체의 동시 검출을 위한 조합 면역분석법, 시약 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 조합 면역분석법의 독특한 특징은 주로 샘플의 사전 처리 없이 샘플 내의 비리온으로부터 HCV 코어 항원을 효과적으로 노출 또는 방출시키면서도 재조합 HCV 항원에 의한 항-HCV 항체의 포획을 저해하지 않아 HCV 코어 항원 및 항-HCV 항체의 동시 측정을 허용하는 비이온성 세제의 사용에 있다.
본 발명의 조합 분석에서 사용하기에 적합한 비이온성 세제는 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드 패밀리의 멤버이다. 바람직한 실시 형태에서, 조합 분석에서는 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)를 사용한다. 다른 실시 형태에서, LDAO의 유도체 또는 기능적 또는 화학적 동등물이 사용된다.
따라서, 본 발명은 샘플 내 HCV 항원 및 항-HCV 항체의 동시 검출을 위한 다양한 방식의 조합 면역분석법, 관련 시약 및 키트를 제공한다.
본 발명은 HCV 항원-항체 조합 면역분석법, 및 관련 방법, 시약 및 키트에 관한 것이다.
HCV 항원-항체 조합 면역분석법 또는 "조합 (combo)" 분석은 단일 분석으로 샘플 내 HCV 항원 및 항-HCV 항체 둘 모두를 동시에 검출하는 면역분석법을 나타낸다. 항원/항체 조합 분석 방법은 HCV 혈청전환의 초기 단계 동안 존재하는 항원성 및 면역원성 HCV 항체 및 항원을 확인하고 사용하여, 검출 정확도를 증가시키고 항체 미검출 기간 동안 결과 오류의 발생률을 감소시킬 수 있다는 사실에 기초한다.
본 발명은 적어도 부분적으로는, 초기 HCV 감염을 감도 높고 정확하게 검출하기 위한 조합 면역분석법에 사용하기에 적합하고 효과적인 비이온성 세제의 확인에 기초한 것이다. 상기 세제는 시험 샘플 내의 HCV 바이러스 입자를 효과적으로 붕괴시키고, 그 결과, 방출된 코어 항원은 모노클로날 항체 프로브에 의해 효과적으로 포획되고 검출된다. 그런 한편으로 세제는 조합 분석 동안 고상에 코팅된 재조합 항원을 침출시키거나 항-HCV 항체의 포획을 저해함으로써 항체 검출에 나쁜 영향을 주지 않는다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 조합 분석은 단일 분석에서 샘플 내의 HCV 항원 (코어 항원 포함)과 항-HCV 항체 둘 모두의 동시 검출을 허용한다. HCV 항원 또는 항-HCV 항체를 별개로 검출하는 분석을 포함하는 기존의 분석에 비해, 본 발명의 조합 분석은 2회의 별개의 분석을 실시할 필요가 없고, HCV 검출을 위한 개선된 감도 및 특이성을 제공한다.
본 발명에 따르면, 조합 면역분석법에 사용하기 적합한 비이온성 세제는 양쪽-이온성 또는 양쪽이온성 세제로도 알려진, N-알킬-N-알킬'-N-메틸-아민 옥사이드 패밀리의 멤버를 포함한다. 상기 알킬기는 일반적으로 각각 15개 이하의 탄소 원자를 함유한다.
한 실시 형태에서, 세제는 N-알킬-N-알킬'-N-메틸-아민 옥사이드이고, 여기서 알킬기는 9 내지 13개의 탄소 원자를 함유하는 단일쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, 다른 알킬기 ("알킬"기)는 1 내지 13개의 탄소 원자를 함유하는 단일쇄 또는 분지쇄 알킬기이다. 다른 실시 형태에서, N-알킬-N-알킬'-N-메틸-아민 옥사이드의 알킬기 중 하나 또는 둘 모두는 치환 알킬기이다.
바람직한 실시 형태에서, 세제는 하기 화학식을 특징으로 하는 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드이다:
CH3 - (CH2)n - N+ - (CH3)2O-
여기서, 알킬 사슬의 길이는 수 n에 의해 규정되고, n은 9 내지 13, 또는 바람직하게는 10 내지 12일 수 있고, 보다 바람직하게는 n은 11이다. 수 "n"은 적어도 9; 바람직하게는 적어도 10; 보다 바람직하게는 적어도 11이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에서, HCV 조합 면역분석법에 사용되는 비이온성 세제는 화학식 CH3 - (CH2)11 - N+ - (CH3)2O-의 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)이고, 이는 다음과 같은 구조로 표시된다:
Figure 112010032504751-pat00001
비이온성 세제는 조합 분석에 임의의 적절한 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 세제는 샘플을 검출 시약, 예를 들어 포획 항원 및 항체와 접촉하도록 하기 전에 시험 샘플에 첨가될 수 있다. 별법으로, 세제는 검출을 위한 다른 시약의 첨가와 동시에 시험 샘플과 혼합될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세제는 샘플을 포획 항원 및 항체와 접촉시키기 전에 생물학적 시험 샘플의 희석 또는 현탁을 위해 사용되는 용액 (또는 "희석제")으로 제공된다. 비이온성 세제가 분석에 제공되는 방식과 무관하게, 시험 샘플과 접촉할 때 용액 혼합물 중 세제의 농도는 0.1% - 2% (w/v), 바람직하게는 0.3% (w/v) 이상 1% (w/v) 이하, 보다 바람직하게는 약 0.5% (w/v)이어야 한다.
본 발명의 조합 면역분석을 사용하여 HCV에 대해 시험될 수 있는 생물학적 샘플은 HCV 비리온, 항원 또는 항체를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플을 포함한다. 샘플은 특히 생물학적 유체 또는 조직, 예를 들어 체액, 예를 들어 전혈, 건조된 전혈, 혈청, 혈장, 또는 다른 혈액 성분, 예를 들어 적혈구, 백혈구 및 혈소판; 소변, 타액, 뇌척수액, 간 조직 등일 수 있다. 샘플은 분석에 사용하기 전에 임의의 적절한 방식으로 처리될 수 있다.
본 발명에 따르면, 조합 면역분석의 항-HCV 항체 검출부는 일반적으로 샘플 내의 항-HCV 항체에 결합하고 따라서 이를 "포획"하는 적어도 하나의 (즉, 하나 이상의) 포획 항원을 이용한다. 포획 항원은 일반적으로 HCV 게놈에 의해 코딩되는 HCV 단백질로부터 유도된 항원성 펩티드 (하나 이상의 에피토프 함유)이다. 전체 HCV 게놈의 서열 및 코딩되는 HCV 다중단백질 (polyprotein) 서열은 GenBank에 기탁되었고 (각각 기탁번호 #M62321 및 #AAA45676), 당업계의 숙련자가 이용가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "HCV 단백질"은 HCV 게놈에 의해 코딩되는 천연 전장 단백질 (예를 들어, 구조 또는 비구조 단백질, 또는 구조 또는 비구조 단백질의 전구체) 및 2개의 천연 HCV 단백질 또는 그의 단편의 인공 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에서 "NS3/NS4"로도 언급되는 NS3 및 부분적인 NS4의 융합체)를 모두 포함함을 주목하여야 한다.
HCV-감염 개체로부터 채취한 샘플에 존재하는 항원에 대해 본 명세서에서 사용되는 용어 "HCV 항원" 또는 "HCV 항원들"은 전장 HCV 단백질 또는 그의 항원성 단편일 수 있다.
일반적으로 말하면, HCV 단백질의 펩티드 단편은 길이가 적어도 6 또는 7개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 8, 또는 적어도 9, 또는 적어도 10개의 아미노산; 보다 바람직하게는 적어도 12, 15 또는 20개의 아미노산일 때 항원성이고 각각의 항체에 결합하여 포획할 수 있다. 포획 HCV 항원은 1 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 용어 "에피토프"는 당업계에서 잘 이해되고 있고, 항체에 결합하고 면역 반응을 일으킬 수 있는, 항원의 표면 상의 분자 구역 또는 구조 결정자를 의미한다. 포획 항원은 재조합 방식으로 또는 통상적인 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 포획 항원은 코어 항원, E1, E2, NS2, NS3, NS4, 또는 NS5로부터 선택되는 HCV 단백질의 항원성 단편이다. 바람직한 실시 형태에서, 포획 항원은 코어 항원, 또는 아래 실시예에서 예시되는 바와 같은 NS3/NS4 융합 단백질로부터 유도된다. 다른 실시 형태에서, 동일하거나 상이한 HCV 단백질로부터 유도될 수 있는 2개 이상의 펩티드가 포획 항원으로서 사용된다.
포획 항원은 분석을 수행하기 전에 고상에 코팅될 수 있다. 별법으로, 포획 항원은 예를 들어 칵테일 (cocktail) ELISA 방식에서 포획 항원이 액상 내 항-HCV 항체와 복합체를 형성한 (즉, 포획한) 후에 고상에 대한 부착을 매개할 수 있는 적절한 시약, 예를 들어 비오틴과 콘쥬게이팅된다.
본 발명의 면역분석에 사용하기 적합한 고상의 예는 다공성 및 비다공성 물질, 예를 들어 라텍스 입자, 자성 입자, 비드, 막, 및 미량역가 웰을 모두 포함한다. 고상 물질의 선택은 요구되는 분석 방식을 기초로 하여 결정될 수 있다.
포획 항원이 시험 샘플과 접촉할 때, 항-HCV 항체가 샘플에 존재할 경우, 상기 항체는 포획 항원에 결합한다. 포획 항원에 의해 포획된 항체, 즉 포획된 항체는 많은 방법을 사용하여 검출할 수 있다.
한 방법은 포획된 HCV 항체를 인식하여 결합하는 제2 항체를 이용한다. 제2 항체, 예를 들어 항-인간 IgG는 신호 생성 수단에 콘쥬게이팅된다. 제2 항체가 포획된 (제1) 항체에 결합하면, 신호 생성 수단은 측정가능한 신호를 생성하고, 이것은 시험 샘플 내의 제1 항체의 존재를 나타낸다.
다른 방법은 신호 생성 수단에 콘쥬게이팅될 수 있고 "검출 항원"으로도 언급되는 제2 항원을 이용한다. 하나의 공통 에피토프가 포획 항원과 검출 항원 모두에 존재하는 한, 포획 항원처럼 검출 항원도 1 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 검출 항원을 사용할 수 있다. 검출 항원이 포획된 항체에 결합하여 포획 항원-항체-검출 항원 샌드위치를 형성하면, 검출 항원 내의 신호 생성 수단은 시험 샘플 내의 항체의 존재를 나타내는 측정가능한 신호를 생성할 수 있다. 상기 "Ag 샌드위치" 방법은 2개의 별개의 항원 분자 내의 2개의 동일한 에피토프에 동시에 결합하는 항-HCV 항체의 능력을 전제로 한다. 상기 Ag-샌드위치 방법은 항-HCV 항체의 고특이적 검출을 가능하게 하고, 이러한 고특이성 때문에, 이 방법에서는 보다 큰 부피의 시험 샘플을 사용할 수 있고, 이에 따라 샘플에 존재하는 HCV 항원의 보다 민감한 검출이 가능하다.
상기 신호 생성 수단은 그 자체가 검출가능하거나 또는 하나 이상의 화합물과 반응하여 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있다. 신호 생성 수단의 예는 색소원, 방사성 동위원소, 화학발광성 화합물, 효소 (예를 들어, 알칼린 포스파타제, 산 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 리보뉴클레아제), 또는 결합쌍의 하나의 파트너 (예를 들어 비오틴 또는 스트렙타비딘)를 포함한다. 효소가 신호 생성 수단으로서 사용되는 경우에 (예를 들어, 알칼린 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제), 발색, 형광 또는 발광 기질을 첨가하면 검출가능한 신호가 생성된다.
본 발명에 따르면, 조합 분석의 HCV 항원 검출부는 일반적으로 포획 항체 및 콘쥬게이트 항체의 하나 이상의 쌍을 항체 샌드위치 방식으로 이용하여 달성된다.
콘쥬게이트 항체에는 상기한 신호 생성 수단 중 어느 하나가 부착된다. 포획 항체는 분석 수행 전에 고상, 즉 상기한 포획 항원(들)과 동일한 고상에 코팅될 수 있다. 별법으로, 포획 항체는, 콘쥬게이트 항체와 이미 결합되었거나 추후에 결합되는 HCV 항원과 포획 항체가 액상에서 복합체를 형성한 (즉, 포획한) 후에 고상에 대한 부착을 매개할 수 있는 적절한 시약, 예를 들어 비오틴과 콘쥬게이팅된다. 어느 방법에서든, 일단 포획 항체-항원-콘쥬게이트 항체 샌드위치가 형성되고 고상에 포획되면, 신호 생성 수단은 시험 샘플 내의 항원의 존재를 나타내는 측정가능한 신호를 생성할 수 있다.
각각의 쌍 내에, 각각 상이한 에피토프를 인식하는 하나 이상의 포획 항체, 및 각각 상이한 에피토프를 인식하는 하나 이상의 콘쥬게이트 항체가 존재할 수 있다. 포획 및 콘쥬게이트 항체의 동일한 항원 분자에 대한 동시 결합 및 샌드위치 복합체의 형성을 허용하기 위해서, 포획 항체 또는 항체들은 동일한 쌍 내의 콘쥬게이트 항체 또는 항체들에 의해 인식되는 것과 상이한 에피토프를 인식하여야 하지만, 각각 포획 및 콘쥬게이트 항체에 의해 인식되는 에피토프들은 항체-항원-항체 샌드위치를 형성하기 위해서 동일한 HCV 항원 내에 존재하여야 한다. 예를 들어, 포획 및 콘쥬게이트 항체는 HCV 게놈에 의해 코딩되는 임의의 HCV 단백질, 구조 또는 비구조 HCV 폴리펩티드 내의 에피토프에 대해 작용할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 코어 항원, E1, E2, NS2, NS3, NS4, 또는 NS5로부터 선택되는 HCV 단백질 내의 에피토프에 대해 작용한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 한 쌍 내의 포획 및 콘쥬게이트 항체는 HCV 코어 항원 내의 에피토프에 대해 작용, 즉, 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 포획 및 콘쥬게이트 항체의 2개 이상의 쌍이 사용되고, 그 중 적어도 하나의 쌍은 HCV 코어 항원 내의 에피토프에 대해 작용하는 포획 및 콘쥬게이트 항체를 포함한다.
포획 및 콘쥬게이트 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 또는 이들의 조합물일 수 있다. 바람직하게는, 모노클로날 항체가 사용된다.
본 발명에 따른 조합 분석을 수행하기 위해, 항-HCV 항체를 검출하기 위한 포획 항원 및 콘쥬게이트 항체 또는 검출 항원; HCV 항원을 검출하기 위한 포획 항체 및 HCV-특이적 항체 콘쥬게이트; 및 적절한 비이온성 세제가 제공된다. 시험 샘플은 세제, 포획 및 콘쥬게이트 시약과 순차적으로 또는 동시에 접촉되고, 콘쥬게이트 시약으로부터 생성된 신호는 HCV 감염의 진단과 서로 관련될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 포획 항원, 검출 항원; 포획 항체 및 콘쥬게이트 항체; 및 적절한 비이온성 세제가 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 포획 항원 및 포획 항체는 모두 고상에 코팅된다 (공유 또는 비공유 부착된다). 시험 샘플은 세제의 존재 하에 고상에 부착된 포획 시약과 접촉된다. 동시에 또는 바람직하게는 후속적으로, 콘쥬게이트 시약 (즉, 검출 항원 및 콘쥬게이트 항체)이 반응 혼합물에 첨가된다. 또한 고상에 대한 콘쥬게이트 시약의 결합의 결과로서 생성된 신호는 HCV 감염의 진단과 서로 관련될 수 있다.
포획 및 콘쥬게이트 시약은 교차반응성 및 거짓 양성 결과를 방지하도록 선택하여야 함을 유의하여야 한다. 예를 들어, 항-HCV 항체 검출을 위해 사용되는 HCV 항원은 포획 및 콘쥬게이트 항체가 작용하는 폴리펩티드와는 상이한 HCV 폴리펩티드로부터 유도된다. 별법으로, 항체 검출에 사용되는 항원이, 항체 시약의 반응 대상인 단백질과 동일한 HCV 단백질 (예를 들어, 코어 항원)로부터 유도될 때, 항체 검출에 사용되는 항원은 항원 검출에 사용되는 항체 시약에 의해 인식되지 않는 에피토프를 제시하여야 한다. 본질적으로, 분석의 항원 검출부에서 항체가 결합하는 에피토프는 HCV 항체 검출을 위해 사용되는 항원에 존재하지 않아야 한다.
또한, 본 발명은 HCV 감염의 진단을 위해 HCV 항원 및 항-HCV 항체의 동시 검출을 위한 조합 분석을 수행하기 위해 상기한 다양한 시약을 함유하는 키트를 제공한다.
실시예 :
다음 실시예는 세제 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO) 및 항원 분석에서 HCV 코어 항원의 방출 달성시의 그의 효율 및 HCV 항체 분석에 대한 그의 적합성을 조사함으로써 본 발명의 잇점 및 중요성을 상세하게 설명한다. HCV 코어 항원 및 HCV 항체의 동시 측정시에 세제 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)의 용도도 설명한다.
아래에서 제시되는 실시예는 단지 예시를 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
HCV 코어 항원 및 항- HCV 항체 검출을 위한 일반적인 시약
ORTHO HCV 코어 항원 ELISA 시험 시스템
인간 혈청 또는 혈장에서 C형 간염 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 코어 항원 (HCV 코어 항원)의 검출을 위해 Ortho HCV 코어 항원 ELISA (오르토-클리니칼 다이어그노스틱스, 인크., 미국 뉴저지주 라리탄)를 사용하였다. 마이크로웰 (microwell) 고상에 코팅된 모노클로날 항체를 항원을 포획하기 위해 사용하고, HRP에 콘쥬게이팅된 2차 모노클로날 항체를 포획된 항원의 검출을 위해 사용하였다. 전처리 단계를 수행하지 않으면서 포획 및 검출을 위해 HCV 코어 항원을 노출시키기 위해 세제-함유 시료 희석제를 사용하였다.
ORTHO HCV 3.0 ELISA 시험 시스템
Ortho HCV 3.0 ELISA (오르토-클리니칼 다이어그노스틱스, 인크., 미국 뉴저지주 라리탄)는 인간 혈청 또는 혈장에서 C형 간염 바이러스에 대한 항체 (항-HCV)를 검출하기 위한 것이었다. 마이크로웰 고상에 코팅된 재조합 HCV 항원 c22 (아미노산 2-120, 코어 구역), c200 (아미노산 1192-1931, NS3/NS4 구역) 및 NS5 (아미노산 2054-2995)를 사용하여 항-HCV 항체를 포획하였다. HRP에 콘쥬게이팅된 쥐 모노클로날 항-인간 IgG 항체를 사용하여 포획된 인간 항-HCV를 검출하였다. 이 방식은 시료 희석제 내의 세제 Tween 20을 이용한다.
Chiron RIBA HCV 3.0 SIA
Chiron RIBA HCV 3.0 SIA (노바티스 백신즈 & 다이어그노스틱스 (Novartis Vaccines & Diagnostics, 미국 캘리포니아주 에머리빌))는 인간 혈청 또는 혈장에서 C형 간염 바이러스에 대한 항체 (항-HCV)의 검출을 위해 사용되는 스트립 (strip) 면역블롯 분석이다. HCV 항원 또는 펩티드 c22p (아미노산 10-53, 코어 구역), c33c (아미노산 1192-1457, NS3 구역), 5-1-1 및 c100 펩티드 (각각 아미노산 1694-1735 및 1920-1935, NS4 구역) 및 NS5 (아미노산 2054-2995)를 항-HCV 항체의 포획을 위해 시험 스트립 상에 개별적인 밴드로서 고정시켰다. 이어서, HRP에 콘쥬게이팅된 쥐 모노클로날 항-인간 IgG 항체에 의해 포획된 인간 항-HCV가 검출되었다. 분석은 Ortho HCV 3.0 ELISA 반응성 시료의 개개의 항원에 대한 항체 특이적 반응성에 대한 추가의 정보를 제공한다.
항원
HCV 코어 단백질 서열 중 아미노산 10 내지 아미노산 45를 포함하는 2개의 펩티드 유도체를 합성하였다. HCC5N에 대해, 서열은 서열 번호 1에 제시된다 (N-말단은 아세틸화에 의해 차단된 아미노기가 아니라 유리 아미노기를 갖는다). HCC5N은 C-말단에 HCV 코어 단백질에 속하지 않는 2개의 잔기, 즉 노르류신 및 Cys을 갖는다. HCC5-b에 대해, 서열은 서열 번호 2에 제시된다 (N-말단은 유리 아미노기를 갖는다). HCC5-b는 C-말단에 HCV 코어 단백질에 속하지 않는 2개의 잔기, 즉, Gly 및 Lys(비오틴)을 갖는다. HCC5N은 환원 조건 하에서 HCC5N의 C-말단 Cys을 통해 SMCC 활성화된 BSA에 추가로 콘쥬게이팅되었다.
잔기 P1208 내지 T1657을 포함하는 재조합 HCV NS3 헬리카제 (rNS3(h))를 문헌 (Jin, Arch Biochem Biophys. 323(1): 47-53, 1995)에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 (E. coli)에 클로닝하고 발현시켰다. 단백질을 정제하기 위해 6xHis 태그를 rNS3(h)의 N-말단에 융합시켰다 (이에 의해, 서열 번호 3이 생성되고, 이것은 6xHis 태그와 rNS3(h)의 융합 단백질을 나타낸다). 비오틴 콘쥬게이팅된 rNS3(h)를 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-비오틴 (피어스 (Pierce), Cat# 21335)을 사용하여 제조하였다. 콘쥬게이팅된 단백질은 rNS3(h) 분자당 3개의 비오틴을 갖는 것으로 결정되었다.
모노클로날 항- HCV 코어 항체
4개의 모노클로날 항체를 연구에 사용하였다. 모노클로날 항체 C11-3, C11-7 및 C11-14의 생산 및 에피토프 인식 부위는 유럽 특허 공보 EP 0 967 484 A1에 기재되어 있다. 이들 모노클로날 항체의 어떠한 에피토프 인식 부위도 HCV의 아미노산 10-45 내에 속하지 않는다. 모노클로날 항-HCV 항체 12F11은 재조합 c22에 대응하여 생성되었다. 12F11의 인식 부위는 대략 HCV의 아미노산 58-72 (코어 항원)이다. 항체 C11-14 및 12F11을 표준 절차를 사용하여 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 콘쥬게이팅하였다.
HCV 시료
(1) 항- c22 및 항- c33c 고갈된 항- HCV 시료
시료 WHO Hu-a-c33c, 41530822, 41530832 및 41530883은 본래 Ortho HCV 3.0 ELISA 시험에서는 항-HCV 강한 반응성이고 Ortho HCV 코어 항원 ELISA 시험에서는 비반응성인 것으로 나타났다. 항체들 중 항-c22 부분 (항-HCV 코어)은, 크로마토그래피 수지가 Ortho HCV 3.0 ELISA에 사용된 코팅 항원의 하나와 동일한 항원인 재조합 HCV 코어 항원 c22와 콘쥬게이팅된 친화도 컬럼에 시료를 통과시킴으로써 고갈시켰다.
시료 WHO Hu-a-c22, I-20 및 360650은 본래 Ortho HCV 3.0 ELISA 시험에서는 항-HCV강한 반응성이고 Ortho HCV 코어 항원 ELISA 시험에서는 비반응성인 것으로 나타났다. 항체들 중 항-c33c 부분 (항-부분적인 NS3)은, 크로마토그래피 수지가 Chiron RIBA 3.0 SIA에서 고정된 것과 동일한 항원 (c33c)인 재조합 HCV 코어 항원 c33 및 Ortho HCV 3.0 ELISA에 사용된 코팅 항원 중 하나 (c200)의 더 짧은 버젼과 콘쥬게이팅된 친화도 컬럼에 시료를 통과시킴으로써 고갈시켰다.
(2) HCV 코어 항원 반응성 시료
HCV 코어 항원 반응성 샘플 Lot 16은 혈장 풀 (pool)로서, Ortho HCV 3.0 ELISA 시험에서는 항-HCV 비반응성, PCR에서는 HCV RNA 반응성, Ortho HCV 코어 항원 ELISA 시험에서는 HCV 코어 항원 반응성인 것으로 나타난 시료로 이루어졌다. HCV 코어 항원 샘플 9160834는 보스톤 바이오메디카 인크. (Boston Biomedica Inc.) (BBI)의 혈장 시료이다. 시료는 Ortho HCV 3.0 ELISA 시험에서는 항-HCV 비반응성, Versant bDNA (바이엘 (Bayer))에 의하면 약 36,379,940 IU/㎖ 또는 189,175,500 카피/㎖로 HCV RNA 반응성, Ortho HCV 코어 항원 ELISA에 반응성인 것으로 나타났다.
(3) HCV 혈청전환 패널
본 연구에서 시험된 HCV 혈청전환 패널은 모두 상업적으로 이용가능하고, 세라케어 라이프 사이언스, 인크. (SeraCare Life Sciences, Inc., 미국) (비비아이 다이어그노스틱스 (BBI Diagnostics)) 및 젭토메트릭스 코퍼레이션 (ZeptoMetrix Corporation, 미국) (이전의 임파쓰/바이오클리니칼 파트너스, 인크. (Impath/BioClinical Partners, Inc.))로부터 구입하였다. HCV 혈청전환 패널은 HCV로 감염된 개체로부터 채취한 인간 혈액 시료의 연속 채혈액으로 구성되었다. 시료는 항-HCV 비반응성 기부터 반응성 기까지의 기간을 포함하였다.
실시예 1: 항- HCV 항체 검출 (간접 분석 방식)
분석은 Ortho HCV 3.0 ELISA 키트로부터의 시약을 사용하여 수행하였다. 세제 Tween-20, BSA, 카제인, 효모 추출물 및 다른 단백질을 함유하는 포스페이트 기재 버퍼로 이루어진 150㎕ 시료 희석제, 및 50㎕ 시료를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅한 후, PBS/Tween20-함유 세척 버퍼로 5회 세척하였다. 이어서, 200㎕ HRP 콘쥬게이팅된 쥐 모노클로날 항-인간 IgG 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅한 후, 6회 세척하였다. 200㎕ OPD/기질 (6 ㎖의 ELISA 기질 버퍼 중의 하나의 OPD 정제 (시그마 (Sigma), Cat# P-8287))을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 4N H2SO4 중지 용액을 50㎕/웰로 첨가하였다. OD를 플레이트 분광광도 판독기를 사용하여 493 ㎚에서 기록하였다. 분석 컷오프 (cut-off) 설정은 음성 대조군 평균 + 0.6의 OD인 HCV 3.0 ELISA로부터 변용하였다. 분석의 예외적인 상황은 다음과 같았다:
(1) "ELISA-1"에서, 세제 Tween 20을 함유하는 시료 희석제는 키트로부터 유래하였고; "ELISA-2"에서, 세제는 N-라우릴 사르코신 (NLS)으로 대체되었고, "ELISA-3"에서 세제는 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)로 대체되었다.
(2) "ELISA-1"에서, 키트에 제공된 HRP-콘쥬게이팅된 쥐 모노클로날 항-인간 IgG 항체를 사용 전에 1:3으로 희석하고; "ELISA-2" 및 "ELISA-3"에서, 키트에 제공된 콘쥬게이팅된 항체를 사용 전에 1:2로 희석하였다.
표 1에 제시된 바와 같이, 항-c22 및 항-c33c 고갈된 시료 모두에서, Tween20 (항-HCV 항체 검출에 통상적으로 사용됨) 및 LDAO는 각각 신호 대 컷오프 비 ("S/C")에서 반영되는 바와 같이 NLS (일반적으로 HCV 항원 검출에 사용됨)보다 더 우수한 분석 감도를 제공하였다.
실시예 2: 항- HCV 항체 검출 ( Ag 샌드위치 분석 방식)
Ag 샌드위치 분석 방식에서, 비오틴으로 표지된 항원을 콘쥬게이트로서 사용하였다. 비오틴-항원 콘쥬게이트는 고상에 포획된 인간 항-HCV 항체에 결합하여 Ag-Ab-Ag 샌드위치를 형성하였다. 이어서, 샌드위치된 복합체를 후속적인 인큐베이션에서 HRP 콘쥬게이팅된 스트렙타비딘에 의해 검출하였다.
COSTA™ 고결합 미량역가 플레이트를 20 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.0) 중의 예비혼합된 모노클로날 항체 C11-3 및 C11-7 (각 2.2 ㎍/㎖ ) 및 HCC5N-BSA (0.1㎍/㎖) 200㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 25℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 코팅 용액을 흡인하고, PB (pH 7.0) 중의 rNS3(h) 2㎍/㎖를 200㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 25℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS/Tween 세척 버퍼로 1회 세척한 후, 300㎕/웰의 PBS/BSA 차단 용액 (PBS 중 1% 소 혈청 알부민 및 30% 수크로스)을 1시간 동안 25℃에서 첨가하였다. 플레이트를 흡인하고, 25℃에서 10% 습도로 철야 건조시키고, 건조제와 함께 주머니에 넣었다.
시료 희석제 조성물은 "ELISA-4"에서는 세제 Tween 20을, "ELISA-5"에서는 세제 N-라우릴 사르코신 (NLS)을, "ELISA-6"에서는 세제 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)를 함유한 것을 제외하고는 실시예 1에서 사용된 것과 동일하였다. 100㎕ 시료 희석제 및 100㎕ 시료를 각각의 웰에 첨가하였다. 시료 인큐베이션은 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 실시하였다. 이어서, 플레이트를 PBS/Tween20으로 5회 세척하였다. 200㎕ 비오틴-rNS3(h) (또는 "rNS3(h)-b")을 60 ng/㎖로 첨가하거나, 비오틴-HCC5 (HCC5-b)를 5 ng/㎖로 각각의 웰에 첨가하였다. 비오틴-항원을 콘쥬게이트 희석제 CD-1 (Tween 20 0.05%, EDTA 2 mM로 보충된 PBS 중의 카제인 차단제, 피어스 Cat# 37528)에 희석하였다. 비오틴-항원 인큐베이션을 진탕하면서 37℃에서 60분 동안 실시하였다. 플레이트를 5회 세척하고, CD-1 중에 1:8,000으로 희석된 HRP-스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch), Cat# 016-030-084)을 200㎕/웰로 첨가하였다. HRP-스트렙타비딘 인큐베이션을 실온에서 30분 동안 지속하였다. 이어서, 플레이트를 6회 세척한 후, 200㎕ OPD/기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 50㎕의 4N H2SO4 중지 용액의 분취액을 각각의 웰에 첨가하였다. OD를 플레이트 분광광도 판독기를 사용하여 493 ㎚에서 기록하였다. 분석 컷오프는 음성 대조군 평균 + 0.300의 OD로 결정하였다. 분석 결과를 표 2에 제시한다. 결과는 항-c33c 고갈된 시료에서 Tween20 및 LDAO는 각각 NLS보다 우수한 분석 감도를 제공함을 보여주었다. 결과는 또한 항원 샌드위치 방식 (Ag-Ab-Ag)이 간접 방식 (Ag-Ab-2nd Ab)보다 양호함을 입증한다.
실시예 3: HCV 코어 항원 검출
실시예 3에 제시된 HCV 코어 항원 검출은 모노클로날 항체-HCV 코어 항원-모노클로날 항체 샌드위치 ELISA이었다. 시료 내의 노출된 HCV 코어 항원은 플레이트 상에 코팅된 2개의 모노클로날 항-HCV 코어 항체에 의해 포획되고, 다른 2개의 HRP 표지된 모노클로날 항-HCV 항체에 의해 검출되었다.
시료 희석제를 제외하고, 실시예 3에서 사용된 ELISA 시약은 기본적으로 Ortho HCV 코어 항원 ELISA 키트로부터 유래한 것이었다. "ELISA-7"은 1.0% 세제 N-라우로일사르코신 (NLS)을 함유하는 본래의 키트 시료 희석제를 사용하였다. 그러나, "ELISA-8"은 1.0% 세제 Tween 20을 함유하는 시료 희석제를 사용하고, "ELISA-9"는 1.0% 세제 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)를 함유하는 시료 희석제를 사용하였다.
ELISA는 HCV 코어 항원 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 100uL 시료 희석제 및 100㎕ 시료를 각각의 웰에 첨가하였다. 시료 인큐베이션은 37℃에서 90분 동안 진탕하면서 수행하였다. 플레이트를 PBS/Tween20으로 5회 세척하고, 콘쥬게이트 항체를 200㎕로 각각의 웰에 첨가하였다. 콘쥬게이트 인큐베이션은 37℃에서 30분 동안 수행하였다. 플레이트를 6회 세척하고, 200㎕ OPD/기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 4N H2SO4 중지 용액을 50㎕/웰로 첨가하였다. OD를 플레이트 분광광도 판독기를 사용하여 493 ㎚에서 기록하였다. 분석 컷오프 설정은 HCV 코어 항원 ELISA와 유사, 즉, 음성 대조군 평균 + 0.300의 OD였다.
분석 결과를 표 3에 제시한다. 시료에 대해, NLS 및 LDAO는 각각 Tween20보다 우수한 분석 감도를 제공하였다.
실시예 4: HCV 코어 항원/항- HCV 조합 분석
HCV 코어 항원/항-HCV 항체 조합 ELISA를 실시예 2에서 사용된 것과 동일한 플레이트 상에서 수행하였다. 플레이트를 모노클로날 항-HCV 항체 C11-3 및 C11-7, HCC5-BSA 및 rNS3(h)로 코팅하였다. 시료 희석제는 20 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.3), 0.5M 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1% 세제 LDAO, 1% BSA, 0.03% 효모 추출물 및 0.01% 변성 수퍼옥시다제 디스뮤타제 (SOD), 200㎍/㎖ 마우스 면역글로불린 G (IgG) 및 0.1% 2-클로로아세트아미드로 구성되었다. 항체/항원 콘쥬게이트는 10 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.3), 142 mM 염화나트륨, 3 mM 염화칼륨, 0.1% 세제 Tween 20, 1.5% BSA, 20% 열 불활성화 신생 송아지 혈청, 0.03% 칼륨 시안화제2철, 100 ㎍/㎖ 마우스 면역글로불린 G (모노클로날) 및 0.1% 2-클로로아세트아미드로 된 버퍼 중의 4㎍/㎖의 HRP 표지된 항-HCV 모노클로날 항체 C11-14 및 4㎍/㎖의 HRP 표지된 모노클로날 항체 12F11, 5 ng/㎖의 HCC5-비오틴 및 60 ng/㎖의 rNS3(h)-비오틴으로 구성되었다. HRP 표지된 스트렙타비딘 콘쥬게이트는 CD-1 (Tween 20을 0.05%로, EDTA를 2 mM로 첨가한 PBS 중의 카제인 차단제, 피어스 Cat# 37528)에 1:8,000으로 희석된 HRP-스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치, Cat# 016-030-084)으로 구성되었다.
분석 프로토콜은 실시예 2에서와 동일하였다. 100 ㎕ 시료 희석제 및 100 ㎕ 시료를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅한 후, PBS/Tween20로 5회 세척하였다. 이어서, 200㎕의 항체/항원 콘쥬게이트 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 항체/항원 콘쥬게이트 인큐베이션은 37℃에서 60분 동안 진탕하면서 수행하였다. 이어서, 플레이트를 5회 세척하고, 200㎕/웰의 HRP-스트렙타비딘을 후속적으로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 6회 세척한 후, 200㎕의 OPD/기질을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 50㎕/웰의 4N H2SO4 중지 용액을 첨가하고, OD를 플레이트 분광광도 판독기를 사용하여 493 ㎚에서 기록하였다. 분석 컷오프는 0.300으로 설정하였다.
BBI HCV 혈청전환 패널에 대한 HCV 항원/항체 조합 ELISA의 분석 결과를 표 4에 제시한다. ZeptoMetrix HCV 혈청전환 패널에 대한 HCV 항원/항체 조합 ELISA의 분석 결과는 표 5에 제시한다. 초기 감염 단계에서, 항체 검출 분석에서는 검출이 음성인 반면에, HCV RNA 분석, HCV 항원 분석, 또는 HCV 항원-항체 조합 분석을 사용할 때 검출은 양성임을 알 수 있다. 예를 들어, 표 4에서 "PHV907"의 최초 채혈시로부터의 제4일, 7일 및 13일을 참조한다. 반면, 보다 후기의 감염 단계에서 (예를 들어, "PHV907"의 제164일), 항원 검출이 음성이 되고 HCV RNA의 양이 감소될 때, 항-HCV 항체가 항체 검출 분석에서 강하게 검출되고, S/C 비도 항원-항체 조합 분석에서 1을 훨씬 초과하였다. 상기 결과는 HCV 항원-항체 조합 분석이 HCV 항원 또는 항-HCV 항체 단독의 검출을 기초로 한 분석보다 더 넓은 검출 범위를 제공함을 입증한다.
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Claims (24)

  1. N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드를 포함하는 비이온성 세제, 포획 항원과 검출 항원의 제1 쌍, 포획 항체와 콘쥬게이트 항체의 제1 쌍을 제공하는 단계 - 여기서, 상기 포획 항원 및 상기 검출 항원은 둘 모두 제1 HCV 단백질의 제1 펩티드 단편을 포함하고, 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 제2 HCV 단백질에 특이적으로 결합하고, 상기 검출 항원 및 상기 콘쥬게이트 항체는 하나의 동일한 신호 생성 수단을 포함함 - 와;
    샘플을 상기 세제의 존재 하에 상기 포획 항원, 상기 검출 항원, 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체와 접촉시켜, 상기 포획 항원, 상기 검출 항원 및 상기 샘플 내에 존재하는 항-HCV 항체 사이에서 샌드위치 복합체를 그리고 상기 포획 항체, 상기 콘쥬게이트 항체 및 상기 샘플 내에 존재하는 HCV 항원 사이에서 복합체를 형성시키는 단계와;
    상기 복합체들의 형성 결과로서 상기 신호 생성 수단으로부터 생성되는 신호를 측정하여, 상기 샘플 내의 HCV 항원 및 항체를 동시에 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 HCV 항원 및 항체를 동시에 검출하기 위한 면역분석법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드는 화학식, CH3 - (CH2)n - N+ - (CH3)2O- (여기서, n은 9 내지 13의 범위임)을 특징으로 하는 면역분석법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드는 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)인 면역분석법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 제2 HCV 단백질은 코어 항원, E1, E2, NS2, NS3, NS4, 및 NS5로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 면역분석법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 상기 제2 HCV 단백질은 동일하고, 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 상기 제1 펩티드 단편 외부의 상기 제2 HCV 단백질의 구역에 결합하는 면역분석법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 상기 제2 HCV 단백질은 둘 모두 HCV 코어 항원인 면역분석법.
  7. 제1항에 있어서, 포획 항원과 검출 항원의 제2 쌍이 제공되고, 제2 쌍의 상기 포획 항원 및 상기 검출 항원은 둘 모두 HCV 단백질의 제2 펩티드 단편을 포함하고, 상기 제2 펩티드 단편은 상기 제1 펩티드 단편과 상이한 면역분석법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 펩티드 단편 및 상기 제2 펩티드 단편은 상이한 HCV 단백질로부터 유도되는 면역분석법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 펩티드 단편 및 상기 제2 펩티드 단편 중 적어도 하나는 HCV 코어 항원의 단편인 면역분석법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 쌍 내의 상기 포획 항체는 2개 이상의 항체를 포함하는 면역분석법.
  11. 제1항에 있어서, 포획 항체와 콘쥬게이트 항체의 제2 쌍이 제공되고, 상기 제2 쌍 내의 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 상기 제2 HCV 단백질 또는 상이한 HCV 단백질에 특이적으로 결합하는 면역분석법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 포획 항원 및 상기 포획 항체는 고체상(solid phase)에 부착되는 면역분석법.
  13. N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드를 포함하는 비이온성 세제, 포획 항원과 검출 항원의 제1 쌍, 포획 항체와 콘쥬게이트 항체의 제1 쌍을 포함하고, 상기 포획 항원 및 상기 검출 항원은 제1 HCV 단백질의 제1 펩티드 단편을 포함하고, 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 제2 HCV 단백질에 특이적으로 결합하고, 상기 검출 항원 및 상기 콘쥬게이트 항체는 하나의 동일한 신호 생성 수단을 포함하는, 샘플 내의 HCV 항원 및 항체를 동시에 검출하기 위한 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드는 화학식, CH3 - (CH2)n - N+ - (CH3)2O- (여기서, n은 9 내지 13의 범위임)을 특징으로 하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 N-알킬-N,N-다이메틸-아민 옥사이드는 라우릴다이메틸아민 N-옥사이드 (LDAO)인 키트.
  16. 제13항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 제2 HCV 단백질은 코어 항원, E1, E2, NS2, NS3, NS4, 및 NS5로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 키트.
  17. 제13항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 상기 제2 HCV 단백질은 동일하고, 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 상기 제1 펩티드 단편 외부의 상기 제2 HCV 단백질의 구역에 결합하는 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1 HCV 단백질 및 상기 제2 HCV 단백질은 둘 모두 HCV 코어 항원인 키트.
  19. 제13항에 있어서, 포획 항원과 검출 항원의 제2 쌍을 추가로 포함하고, 제2 쌍의 상기 포획 항원 및 상기 검출 항원은 HCV 단백질의 제2 펩티드 단편을 포함하고, 상기 제2 펩티드 단편은 상기 제1 펩티드 단편과 상이한 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 펩티드 단편 및 상기 제2 펩티드 단편은 상이한 HCV 단백질로부터 유도되는 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제1 펩티드 단편 및 상기 제2 펩티드 단편 중 적어도 하나는 HCV 코어 항원의 단편인 키트.
  22. 제13항에 있어서, 상기 제1 쌍 내의 상기 포획 항체는 2개 이상의 항체를 포함하는 키트.
  23. 제13항에 있어서, 포획 항체와 콘쥬게이트 항체의 제2 쌍을 추가로 포함하고, 상기 제2 쌍 내의 상기 포획 항체 및 상기 콘쥬게이트 항체는 상기 제2 HCV 단백질 또는 상이한 HCV 단백질에 특이적으로 결합하는 키트.
  24. 제13항에 있어서, 상기 포획 항원 및 상기 포획 항체는 고체상에 부착되는 키트.
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