JP3534417B2 - Hiv抗原及びhiv抗体の同時決定方法 - Google Patents
Hiv抗原及びhiv抗体の同時決定方法Info
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Description
イムノアッセイによるHIV感染の診断方法に関する。
て引き起こされる後天性免疫不全症である。これまでに
知られる病原体はHIV1及びHIV2株である。両株は形態、
細胞親和性、T細胞のCD4受容体との相互作用、CD4細胞
に対するそれらのin vitroでの細胞変性効果、それらの
一般的なゲノム構造及び疾患AIDSを引き起こす能力にお
いて類似する(Clavel,1987,AIDS 1,135−140)。しか
しながら、免疫学的な関係の程度はごく小さいものであ
り、一般に、HIV1特異的抗体はHIV2といかなる交差反応
も示さない。最も一般的なHIV1グループMサブタイプに
加えて、さらなるHIV1サブタイプ、サブタイプ0が知ら
れている(Myersら,Lot Alamos data bank,1994;Sharp
ら,AIDS Suppl.8,pp.27−42,1994)。HIV1−SubOとHIV1
との関係の程度はHIV1−SubOとHIV2とのものよりもかな
り高い。しかしながら、HIV1に対する抗体はHIV1−SubO
の対応する抗原とはある程度しか交差反応しない。HIV1
−SubO特異的抗体の大部分はHIV1グループM抗原とも反
応しない。
することができる。感染の早期において、HIV抗体に適
合しないHIV抗原を既に検出することができる。抗体陽
転期においては、HIV抗原は僅かに陽性又は陰性であり
得、すなわち検出することができない。IgMクラスのHIV
抗体はこの段階で検出可能であるのに対して、IgGクラ
スのHIV抗体は検出することができないか、又は僅かに
陽性であるだけである。次の段階においては、症状はな
いが、主としてIgG型のHIV抗体が検出可能であり、これ
に対してHIV抗原は一般に生じない。同じことが臨床期
の疾患の進行過程に当てはまる。
陽性又は陰性になる可能性があり、これに対してHIV抗
原は陰性のままであるか、又は患者の免疫系の崩壊を伴
うウイルスの攻撃の増加のために再度陽性として検出さ
れる可能性がある。したがって、(患者に応じて)過程
が非常に異なるものであり得るこれらの異なる段階の
間、抗原又は抗体の検出が誤って陰性の結果を示し得る
瞬間が常に存在する。
体試験(IgG及びIgM)を、例えばEP−A−0 280 211に
記載されるブリッジ試験様式で頻繁に行う。抗原は、一
般には、HIV1/HIV1−SubOについてはgp160、gp120、gp4
1であり、かつHIV2についてはgp140、gp110、gp36であ
るいわゆるエンベロープ領域(env)の抗原が、それぞ
れウイルスのコアを形成する抗原p24(HIV1)及びp26
(HIV2)と共に用いられる。抗原p24及びp26は、いわゆ
るgag領域がコードする。これらの試験は、列挙された
抗原に対する抗体が存在する場合に陽性信号を示す。疾
患の早期及び後期段階において、すなわち、遊離p24及
びp26抗原が存在するときに、患者の免疫系が未だに十
分な抗体を産生しないでいるか、又は患者の免疫系が消
耗して構築される抗体の数が検出されるのに十分なもの
ではないために、しばしば抗体を検出することができな
い。
は、一般には別々に行われる。患者の抗原力価は感染の
早期段階及びAIDSの最終段階においてのみ増加し、その
ためp24はこれらの段階においてのみ確実に検出するこ
とができる。
断上関連する期間全体を単独で網羅することができる試
験がないことである。
この病原体に対する抗体を同時に検出することができ
る。このような抗原及び抗体を同時に検出するための手
順はDE 42 36 189 A1に開示されている。しかしなが
ら、HIV感染の全ての段階を診断の上で完全に網羅しよ
うとする試みは記載されていない。
HIVp24抗原、HIVgp41抗体及びHIV2gp36抗体(いずれの
場合も、env遺伝子のタンパク質に対する抗体)を同時
に検出するための組み合わせ試験が記載されている。し
かしながら、この試験では、p24又はenvタンパク質に対
する抗体を含まないHIV陽性サンプルは陽性として検出
されない。全ての抗体ではなくgp41を単独で用いること
で陽性HIV1サンプルを検出することができ、これはウェ
スタンブロット法において不完全なバンドパターンを示
し、かつgp41バンドの染色がないことを特徴とするサン
プルが広範囲に及ぶためである。
IV1感染を検出するための診断試験を記載している。こ
の試験で、p24抗原、(gag領域に由来する)p17に対す
るIgG抗体及びpol遺伝子によってコードされる逆転写酵
素(RT)に対するIgG抗体を検出することができる。し
かしながら、この手順はHIV1感染の検出のみを可能に
し、上で用いられる2種類の抗原に対する低アフィン
(low−affine)IgM抗体のみを含む抗体陽転血清は検出
されない。envタンパク質に対する抗体を含む抗体陽転
血清も検出されない。感染の早期においてHIV抗原力価
が減少した後には、しばしばenvタンパク質gp41に対す
るIgM抗体のみが生じる。この場合、Hashidaらの試験は
偽陰性結果を示す。
の完全な同時検出を確実に可能にする最新の診断試験系
は存在しない。
可能な全ての段階の正確で、信頼の置ける完全な検出を
単一の試験として可能にするHIV感染の改善された試験
を開発することにある。また、この試験はHIV1、HIV1−
SubO及びHIV2の同時測定をも可能にする。
方法であって、HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はH
IV2のp26抗原、HIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2のenv
領域に対する少なくとも1種類の抗体、並びにHIV、HIV
1−SubO及び/又はHIV2に由来するpol及び/又はgag領
域に対する少なくとも1種類の抗体の特異的検出を用い
るイムノアッセイによる方法によって達成される。本発
明による方法を用いることで、上記検体のうちの1つだ
けが既に現れているHIV感染を確実に検出することが可
能である。
又はHIV2のp26抗原の検出並びにHIV−env領域に対する
少なくとも1種類の抗体の検出と組み合わせた、特には
HIVのpol領域の、遺伝子産物に対する抗体の検出によ
り、これまでの残念な診断上のギャップを埋めることが
できることが示されている。驚くべきことに、HIV1、HI
V1−SubOのp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原の検出並び
にHIV−env領域に対する少なくとも1種類の抗体の検出
と組み合わせた、HIVの逆転写酵素(RT)に対する抗体
を検出するHIV感染の検出方法が特に適することが立証
されている。
み合わせ試験によるHIV感染の検出は同時に行われる。
組み合わせ試験(combination test)という用語は、HI
V抗原及びHIV抗原に対する抗体を同時に検出できること
を意味する。この試験を用いることで、全てのHIV感染
の段階を確実に網羅することができる。抗原又は抗体及
びそれらの対応する特異的受容体結合を本発明に従って
選択することにより、本発明による方法を実施すること
ができる。
一試験を用いて達成することができる。加えて、受容体
を適切に選択することによりHIV1グループMのHIV1サブ
タイプの広範な検出が可能である。この試験は、好まし
くは、不均一イムノアッセイの原理に基づくものであ
る。しかしながら、液相及び固相を分離しない濁度試験
のような均一法を考えることもできる。
R2は、測定しようとするHIV1−p24及び/又はHIV2−p26
に特異的に結合する受容体である。R3及びR4受容体とし
て用いられる受容体はHIV1、HIV2又はHIV1−SubOのenv
領域の1つもしくは幾つかの抗原である(HIV1/HIV1−S
ubOについてはgp160、gp120、gp41、HIV2についてはgp1
40、gp110、gp36)。R3及びR4として好ましく用いられ
る受容体はgp41及び/又はgp36又はそれらの断片であ
る。R5及びR6として用いられる受容体はHIV1、HIV2、又
はHIV1−SubOのpol又はgag領域に由来する1つもしくは
幾つかの抗原であるが、受容体R1又はR2と反応する可能
性があるp24又はp26のエピトープ又は配列であってはな
らない。HIV1、HIV2又はHIV1−SubOのpol領域の抗原が
受容体R5又はR6として好ましく用いられる。逆転写酵素
(RT)が受容体R5及びR6として特に好ましく用いられ
る。
段階を確実に検出することを可能にする。これは、感染
の早期又は後期段階にのみ存在するHIVの特定の検体
(例えば、それぞれ、p24及びp26抗原)はもちろん、無
症候段階に生じる検体及びより長期間にわたって検出可
能な検体、例えば、env遺伝子産物gp160、gp120もしく
はgp41に対する抗体及pol遺伝子産物逆転写酵素、イン
テグラーゼもしくはプロテアーゼに対する抗体、又はga
g遺伝子産物p17もしくはp15に対する抗体の検出を可能
にする。
びグループMの全てのHIV1サブタイプを含むHIV1−SubO
による感染を任意に検出することができる。このような
手順のためには、R1及びR2として選択された受容体がHI
V1のp24抗原に特異的に結合する。この場合、R1及びR2
の選択は、HIV1−p24及びHIV1−SubO−p24の認識及び結
合を可能にするものでなければならない。これには、全
てのHIV1グループMサブタイプ及びHIV1サブタイプ0が
検出されるようにR1及びR2に数種類の受容体を用いるこ
とが必要となることがある。加えて、HIV1、HIV2及びHI
V1−SubOを同時に検出するため、HIV2のp26抗原をも特
異的に認識する、対応する交差反応性受容体又はさらな
る受容体R1及びR2のいずれかが用いられる。用いられる
受容体R1及びR2の総数は選択されるエピトープの交差反
応性又は相同性に存在する。うまく選択した場合、用い
られる受容体の数を減少させることが可能である。HIV1
及びHIV1−SubOのenv遺伝子産物に対する抗体に特異的
に結合する受容体はR3及びR4受容体として用いることが
できる。gp41抗原(それぞれ、HIV1及びHIV1−SubO)又
はそれらの断片もしくはエピトープが特に適する。R3及
びR4として用いられるさらなる受容体はHIV2のenv遺伝
子産物に対する抗体を特異的に認識するものである。gp
36抗原又はそれらの断片もしくはエピトープが特に適す
る。HIV1及びHIV1−SubOのgag又はpol遺伝子産物に対す
る抗体を特異的に認識する受容体−受容体R1及びR2と反
応し得るp24のエピトープは除く−がR5及びR6受容体と
して適する。HIV2を認識するため、HIV2のgag又はpol遺
伝子産物に対する抗体に特異的に結合するさらなるR5及
びR6受容体をさらに用いることができる。R5及びR6に好
ましい受容体は、それぞれ、HIV1及びHIV1−SubOのpol
遺伝子産物、並びにHIV2のpol遺伝子産物に対する抗体
を認識する受容体である。3種類の可能性のあるpol遺
伝子産物逆転写酵素、インテグラーゼ及びプロテアーゼ
に対する受容体R5及びR6のうち、該逆転写酵素に対する
抗体を認識する受容体が特に好ましい。
の受容体として、又は様々な受容体の混合物の形態で用
いる上記HIV感染の検出方法である。混合物が用いられ
る場合、それらの受容体は、好ましくは、それぞれp24
及びp26の異なるエピトープを認識する。受容体混合物
を用いるのは、1つの単一試験組成物を用いて異なるHI
Vサブタイプを確実に認識する−p24抗原の場合にはHIV1
グループMサブタイプ及びHIV1−SubOを認識する−ため
である。
感染にも適する。
ブタイプの感染に用いることもできる。
HIV1−SubO及びHIV2陽性サンプルを1つの試験調製物で
確実に認識することを保証するため、各々異なる受容体
の混合物の形態で用いることもできる。しかしながら、
これらの異なる受容体が検出しようとする抗原又は検出
しようとする抗体に結合する際に互いを大きく妨害する
ことがないことを常に確実なものとしなければならな
い。R3及びR4として好ましい受容体は各々が同じエピト
ープを提示するものである。これは、検出しようとする
抗体の抗原結合部分が受容体R3及びR4の両者に連結する
ことを確実なものとする。要求に応じて、異なるエピト
ープの組み合わせを用いることもできる。例えば、組換
えgp41をR3として用いることができ、gp41から誘導され
るペプチド又はポリハプテン−WO96/03652に記載される
ようなもの−をR4として用いることができる。これは受
容体R5及びR6に当てはめることもできる。要求に応じ
て、異なるエピトープの組み合わせを用いることができ
る。しかしながら、同じエピトープを有する受容体が好
ましい。
される。液相中で試験試薬を用いるいわゆる湿式試験に
加えて、タンパク質又は抗体の検出に適する全ての通常
の乾式試験様式を用いることもできる。これらの乾式試
験又は、例えばEP−A−0 186 799に記載されるような
試験片では、全ての試験成分を単一の担体上に結合させ
る。
セイとして行い、受容体R1及びR2で抗原を検出する際に
はサンドイッチ原理に従う。検出しようとする抗原(こ
こでは、それぞれp24及びp26)はR1及びR2によりサンド
イッチのように両面に結合される。受容体R3、R4、R5及
びR6による抗体の結合は架橋試験原理に従う。検出しよ
うとする抗体は受容体R3及びR4を架橋する。同じことが
受容体R5及びR6に当てはまる。両試験手順、サンドイッ
チ及び架橋試験、は同じ試験調製物内で互いに妨害する
ことなく同時に行うことができる。したがって、全ての
受容体をサンプルと共にインキュベートし、その手順を
数工程で行うことも可能である。検出反応に先立つ、未
結合受容体及びサンプル成分を単離するための洗浄工程
は有利ではあるが、必須のものではない。固相への結合
に適する受容体R1、R3及びR5は液相において結合させる
ことが可能であり、又は予め固相に結合させることもで
きる。受容体R1ないしR6全ての全体インキュベーション
が好ましい。R1、R3及びR5が結合し得る固相は予め存在
していてもよく、又は後に添加し、あるいは拡散もしく
は搬送により後に到達してもよい。
の間にサンドイッチが、固相・R3・HIV抗env抗体・R4の
間に架橋が、及び固相・R5・HIV抗gag/pol抗体・R6の間
に架橋が形成される。続いて、不均一イムノアッセイの
場合には固相を液相から分離し、必要であれば固相を洗
浄し、R2、R4及びR6の標識を測定する。標識は大部分が
固相で測定されるが、液相において測定することもでき
る。
め固相に結合している場合、サンプル及び対応する受容
体、すなわちR2、R4及びR6を固相結合受容体R1、R3及び
R5に添加し、一緒にインキュベートする。最初に固相の
存在下もしくは非存在下においてサンプルを受容体R1、
R3及びR5と接触させ、次工程で受容体R2、R4及びR6を添
加することもできる。
用いるイムノアッセイによる、HIVに対する抗体の検出
方法である。受容体R1及びR2はこの純粋な抗体の試験で
は用いない。R3及びR4として用いられる受容体は、前に
組み合わせ試験において記述したようなHIV1、HIV2又は
HIV1−SubOのenv範囲の1つもしくは幾つかの抗原(HIV
1/HIV1−SubOについてはgp160、gp120、gp41、HIV2につ
いてはgp140、gp110、gp36)である。gp41及び/又はgp
36又はそれらの断片が受容体R3及びR4として好ましく用
いられる。R5及びR6として用いられる受容体は−前に組
み合わせ試験において記述したように−HIV1、HIV2又は
HIV1−SubOのpolもしくはgag領域に由来する1つもしく
は幾つかの抗原である。R5及びR6として用いられる受容
体は、好ましくは、HIV1、HIV2又はHIV1−SubOのpol領
域に由来するものである。逆転写酵素(RT)が受容体R5
及びR6として用いるのに特に好ましい。
る受容体の特性は組み合わせ試験のものに類似し、その
ためここでは別々に述べることはしない。以下に示され
る受容体R1及びR2に関する詳細は、上述のHIV抗体及びH
IV抗原の組み合わせ試験に当てはまる。受容体R3、R4、
R5及びR6に関する詳細は、組み合わせ試験はもちろんの
こと、HIV抗体の検出方法にも当てはまる。
bOのp24抗原に、又はHIV2のp26抗原に特異的に結合する
抗体である。p24又はp26への特異的な結合に適する全て
のサブクラスの抗体を用いることができる。完全な抗体
の代わりに、Fab、Fab'又はF(ab')2断片のような断
片を用いることももちろん可能である。
を示さない限り、ポリクローナルであってもよい。しか
しながら、抗p24及び抗p26抗体の特異性に対してなされ
る要求がHIVサブタイプの認識に関して大きいはずであ
ることから、モノクローナル抗体が好ましく用いられ
る。したがって、本発明の主題はp24抗原に対するモノ
クローナル抗体にも関する。これらの抗体の特性は以下
の段落のうちの1つにより詳細に記載される。
的結合系を介した間接的なものであってもよい。固相へ
のR1の直接結合は専門家に公知の方法に従う。結合が特
異的結合系を介して間接的に行われる場合、R1はp24又
はp26に対する抗体及び特異的結合系の反応パートナー
からなるコンジュゲートである。この場合、特異的結合
系は互いに特異的に反応することが可能な2つの反応パ
ートナーからなる。それらの結合能力は免疫学的反応又
は異なる特異的反応に基づくものであり得る。好ましく
用いられる特異的結合系はビオチン及びアビジン又はビ
オチン及びストレプトアビジンの組み合わせである。好
ましいさらなる組み合わせは、ビオチン及び抗ビオチ
ン、ハプテン及び抗ハプテン、抗体のFc断片及びこのFc
断片に対する抗体又は炭水化物及びレクチンである。し
たがって、特異的結合に適するこの対の反応パートナー
の一方はR1受容体を形成するコンジュゲートの一部であ
る。
ーティングである。この特異的結合系の他方の反応パー
トナーの不溶性担体物質への結合は、専門家に公知の通
常の方法に従って行うことができる。この場合、共有結
合はもちろんのこと、吸着性結合が適切である。ポリス
チレン又は類似のプラスチックから作製された試験管又
はマイクロタイタープレートであって、その内面に特異
的結合系の反応体がコートされているものが固相として
の使用に適する。特に好ましい他の適切な物質は粒子サ
イズの物質、例えば、ラテックス粒子、磁性粒子、モレ
キュラーシーブ材料、ガラス体、プラスチック管等であ
る。紙のような多孔性の層状担体を担体として用いるこ
ともできる。特に好ましいものは、同様に上述の特異的
結合系の対応する結合パートナーをコートした磁性ビー
ズである。検出反応のため、試験反応が完了した後、こ
れらの微粒子を液相から、例えば濾過、遠心により、又
は、磁性粒子の場合には、磁石により分離することがで
きる。
原にそれぞれ、又はHIV2のp26抗原に特異的に結合する
1種類の抗体、並びに標識からなる。R1受容体の場合と
同様に、p24又はp26に特異的に結合するのに適する全て
のサブグラスの抗体を用いることができる。完全な抗体
の代わりに、Fab、Fab'又はF(ab')2断片のようなそ
れらの断片ももちろん用いることができる。これらの抗
体はポリクローナルであってもモノクローナルであって
もよい。R1の場合と同様に、モノクローナル抗体が好ま
しく用いられる。以下の段落のうちの1つに記載される
ようなp24抗原に対する本発明によるモノクローナル抗
体がR2については特に好ましい。R1及びR2において用い
られる抗体が、それぞれ、p24及びp26抗原の少なくとも
2つの異なるエピトープを認識することが重要である。
受容体R1及びR2の両者は、p24及びp26に特異的かつ同時
に結合してサンドイッチを形成するのに適するものでな
ければならない。したがって、R1及びR2における抗体成
分によって認識されるエピトープは空間的に切り離され
ていなければならない。これは、R1及びR2によって認識
されるエピトープが重複していてもよいが、両受容体が
p24又はp26抗原に同時に結合することができることを確
実にするものでなければならないということを意味す
る。両受容体がp24又はp26に結合する際に互いを大きく
妨害するものではないという条件が常に満たされていな
ければならない。
R2用の受容体と同じものを用いることもできる。特定数
のR1受容体は固相への結合に適するものであり、残りの
R1受容体は固相への結合に適するものではなく、代わり
に標識を担持する。同じことがR2にも通用する。サンド
イッチは、固相・R1・p24・R2及び固相・R1(R2エピト
ープ)・p24・R2(R1−エピトープ)の方向で形成する
ことができる。
直接検出可能な物質、例えば、化学発光、電気化学発
光、蛍光もしくは放射性物質、又は金属ゾル、ラテック
スもしくは金粒子が用いられる。酵素又はハプテン(例
えば、ジゴキシゲニン)のような他の分子又は蛍光染
色、例えばフルオレセイン、も標識として好ましい。特
に好ましい標識は、WO96/03651に記載されるような電気
化学発光金属キレートである。ルテニウム錯体が金属キ
レートとして好ましく用いられ、これもまたWO96/03651
に開示されている。標識方法は専門家に公知であり、こ
こでさらに説明する必要はない。標識は−一般に公知で
あるように−化学発光、蛍光もしくは放射性物質又は金
属ゾル、ラテックスもしくは金属粒子を測定することに
より、又は酸素によって変換された基質を測定すること
により検出する。
ることもでき、このさらなる受容体はシグナル生成基と
カップリングし、R2の標識、例えばジゴキシゲニンのよ
うなハプテン、と特異的に結合する。ハプテン標識、特
にジゴキシゲニン標識受容体の生成はWO96/03423に記載
されている。
は放射性物質又は酵素又は金粒子の検出は専門家に公知
の方法に従って行う。例えば、R2の標識に特異的に結合
する抗体又は抗体断片をさらなる受容体として用いるこ
とができる。この間接標識検出を適用する場合、R2の標
識は好ましくはジゴキシゲニン又は異なるハプテンであ
る;この検出は、ペルオキシダーゼ又は上述のような異
なる標識で標識した、ジゴキシゲニン又はそのハプテン
に対する抗体を用いて行う。
はそれらの断片が好ましく用いられる。したがって、本
発明の主題は、HIV1のp24抗原に特異的に結合し、かつ
それに対してサンドイッチを形成するのに十分な親和性
を有するモノクローナル抗体にも関する。モノクローナ
ル抗体は、専門家に公知のタンパク質を検出するための
全ての試験、例えば、サンドイッチ試験において用いる
ことができる。
リンクラス(Ig)に属し得る。これらのモノクローナル
抗体は、好ましくは、IgG1クラスに属する。さらなる成
分、例えば、酵素もしくはハプテンのような標識又は不
均一イムノアッセイにおいて固相への抗体の結合に必要
な結合パートナーのカップリングは、IgG1抗体で好まし
く行うことができる。抗体断片、例えば、F(a
b')2、Fab'又はFab断片の産生はIgG1クラスでは問題
にならない。
は、完全な抗体並びに免疫試験及び他の手順において通
常適用されるそれらの断片、例えば、F(ab')2、Fa
b'又はFab断片を意味する。また、抗原結合特性が明ら
かに影響を受けることがない限り、モノクローナル抗体
の修飾によって産生される抗体も含まれる。遺伝子工学
の手段により、例えば、マウスにおいて通常産生される
モノクローナル抗体の一部を適切なヒト抗体配列で置換
してイムノアッセイにおける非特異的結合を最小にする
ことができる。このようなキメラモノクローナル抗体の
産生手順は、例えばAntibody Engineering,J.McCaffert
y,H.R.Hoogenboom and D.J.Chiswell,The Practical Ap
proach Series,Series Editor:B.D.Hammes,Oxford Univ
ersity Press,1996から、専門家に公知である。
されるp24のエピトープが必須であり、これはそれらが
全てのサブタイプの認識に必須であるためである。p24
エピトープについては、Gittiら(Science 1996,Vol 27
3,p.231−235)からの構造情報を基礎として用いること
ができる。したがって、以下に記載される抗体のよう
な、同じエピトープ−又はこれらのエピトープと重複す
るエピトープ−を認識する、異なった様式で産生される
抗体も本発明によるものである。このようなエピトープ
は、例えば、ペップスキャン(Pepscan)法により特徴
付けることができる。本願の実施例4には、本発明によ
る抗体のエピトープマッピングの正確な手順が記載され
ている。本発明による抗体が結合するp24のエピトープ
領域は、好ましくは、以下のアミノ酸配列の群から選択
される。これらの配列は配列決定プロトコルにも記載さ
れており、配列番号1−36を参照されたい。
プに特異的に結合する、HIV1 p24抗原に対するモノク
ローナル抗体に関する。
は34によるp24エピトープに特異的に結合する、HIV1 p
24抗原に対するモノクローナル抗体である。これらの配
列は上記リストにおいて太字で示されている。
は本発明のさらなる主題を表す。
mAb<p24>M−6A9/5、mAb<p24>M−4B1/1、mAb<p24
>M−6D9/4、mAb<p24>M−2E7/3又はmAb<p24>M6A9
/5から産生させることができる。モノクローナル抗体mA
b<p24>M−4B1/1(寄託番号DSM ACC2299)、mAb<p2
4>M−6D9/4(寄託番号DSM ACC2300)及びmAb<p24>
M−6D9/4(寄託番号DSM ACC2300)及びmAb<p24>M
−2E7/3(寄託番号DSM ACC2301)はGerman collection
of microorganism and cell culture(“Deutsche Sam
mulung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSM
Z)GmbH,Mascheroder Weg 1b,D−38124 Braunschweig)
に1997年2月26日に寄託された。モノクローナル抗体mA
b<p24>M6A9/5はDSM ACC2310(寄託番号)としてDSMZ
に1997年6月11日に寄託された。
り、細胞系mAb<p24>M−6A9/5から産生される抗体が
系列(sequential)エピトープは認識しないが、p24の
原体(conformation)エピトープには結合することが示
された。
ACC2301)から産生される抗体が配列番号9によるペプ
チドに相当するエピトープに結合することが示された
(Gittiら1996,Science 273,231−235によるp24構造情
報)。関わる実際のエピトープはさらに小さいことも示
すことができた。mAb<p24>M−2E7/3がp24に特異的に
結合するためには、11個のアミノ酸のみを含む配列番号
34によるエピトープで十分である。
ACC2300)から産生される抗体が配列番号3によるペプ
チドに相当するエピトープに結合することが示された。
特異的結合に必要なエピトープはさらに小さいことも示
されている:mAb<p24>M−6D9/4がp24に特異的に結合
するためには、15個のアミノ酸を含む配列番号31による
エピトープで十分である。
ACC2299)が配列番号17によるエピトープに相当するエ
ピトープに結合することが示された。
から産生される抗体は、従来特徴付けられているHIV1の
p24エピトープだけではなくHIV1−SubOのp24エピトープ
にも結合する。HIV1及びHIV1−サブタイプ0のp24抗原
を同時に認識するためには、これらの細胞系から産生さ
れる抗体が特に適する。実施例5では、本発明による抗
体のp24サブタイプ認識に関する試験が示されている。
これらの2つの抗体のうち、mAb<p24>M−4B1/1は固
相側で、すなわち、受容体R1として好ましく用いられ、
mAb<p24>M−6D9/4は受容体R2として好ましく用いら
れる。
は、抗体mAb<p24>4B1/1及びmAb<p24>6A9がR1とし
て、並びにmAb<p24>2E7/3及びmAb<p24>6D9/4がR2と
して好ましく用いられるが、これは、この組み合わせが
異なるHIV1及びHIV1−サブタイプ0ウイルス単離体の最
も包括的な認識を保証するためである(実施例5を参照
されたい)。
る抗体、好ましくはモノクローナル抗体、例えば、モノ
クローナル抗体抗体mAb<p24>M−6A9/5(DSM ACC231
0)、mAb<p24>M−4B1/1(DSM ACC2299)、mAb<p24
>M−6D9/4(DSM ACC2300)又はmAb<p24>M−2E7/3
(DSM ACC2301)である。「等しい様式で結合する」と
は、ここでは、これらの抗体が寄託されたモノクローナ
ル抗体と同じ親和性で、又はそれに匹敵するほど高い親
和性でp24に結合することを意味する。これは、例え
ば、BIAcore又は実施例4による2段階サンドイッチE
LISAで適切な試験を行う際に検出することができる。
抗体、好ましくはモノクローナル抗体、例えば、寄託さ
れた抗体mAb<p24>M−6A9/5(DSM ACC2310)、mAb<
p24>M−4B1/1(DSM ACC2299)、mAb<p24>M−6D9/
4(DSM ACC2300)又はmAb<p24>M−2E7/3(DSM ACC
2301)である。これは、例えば、抗体の交差反応性を、
例えばELISA競合実験又はBIAcoreを用いる試験によ
り、測定することで検出することができる。好ましく
は、これらの抗体はp24に対する高親和性を有する。
のうちの少なくとも1種類の、HIV感染を検出するため
の診断試験における使用である。本発明のさらなる主題
は、同様に上に記載される、HIV感染を検出するための
本発明による組み合わせ試験における前述の抗体の使用
である。
ように−適切な試験動物、例えば、マウス、ラット、ウ
サギを単離p24(ヒト組織から単離したもの又は組換
体)で免役し、続いて免役した動物の脾臓細胞をミエロ
ーマ細胞と融合させることにより産生させることができ
る。脾臓細胞に加えて、リンパ球源として、免役した動
物(好ましくは、マウス又はラット)に由来する末梢血
リンパ球(PBL)又はリンパ腺の細胞を用いることがで
きる。免役については、p24から誘導される合成ペプチ
ドを、これは単独で用いることも担体に結合させること
もできるが、所望の抗体を産生させるために単離p24の
代わりに用いることができる。
提供者からのリンパ球を不死化することができる。抗p2
4抗体を産生するこのようなリンパ球は、ヒトミエロー
マ細胞系との融合、他は抗体産生ハイブリドーマ細胞へ
のエプシュタイン・バーウイルス(EBV)形質転換のい
ずれかにより不死化することができる(Monoclonal Ant
ibody and Immunosensor Technology,A.M.Campbell,Els
evier Verlag 1991;Monoklonale Antikrper,J.H.Pete
rs,H.Baumgarten,Springer Verlag 1990;Monoclonal An
tibody Production Techniques and Applications,ed.L
awrence B.Schook,Marcel Dekker Verlag 1987)。
V1−SubO及び/又はHIV2−env領域に由来する抗原に対
する抗体に特異的に結合させるのに適する抗原である。
この抗原は、好ましくはgp41又はgp120(HIV1)及びgp3
6又はgp110(HIV2)に対する抗体への結合に適するもの
であり、特に好ましくはそれぞれgp41及びgp36に対する
抗体への結合に適するものである。「抗原」という用語
は、HIV−env遺伝子産物に対する抗体に特異的に結合す
ることが可能な分子である。関わる抗原は天然抗原に相
当し得る。したがって、ウイルスからの単離又は組換え
による方法で産生させることができる。検出しようとす
る抗体に特異的に結合させるのに適する、合成又は組換
えで産生させたペプチドを用いることもできる。また、
この抗原は他のリガンド、例えば、脂質又は糖によって
誘導体化することもできる。アミノ酸交換(D及びLア
ミノ酸又は同類分子)又はアミノ酸の欠失もしくは挿入
も可能である。試験手順に有利なさらなる抗原修飾、例
えば、WO96/03652に記載されるポリハプテンの産生は専
門家が容易に見出すことができる。唯一の条件は、修飾
に関わらず、測定しようとする抗体が修飾抗原への特異
的な結合に依然として適するものであるということであ
る。これは、R3に属する抗原上の抗体の結合部位が保存
されなければならないことを意味する。
相への結合は特異的結合系を介した間接的なものであ
る。固相へのR3の直接的及び間接的結合は、上述の受容
体R1のものと同様である。
−env領域に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合
させるのに適する抗原、並びに標識からなる。この抗原
は、好ましくはgp41又はgp120及びgp36又はgp110に対す
る抗体への結合に適するものであり、特に好ましくは、
それぞれgp41及びgp36に対する抗体への結合に適するも
のである。抗原の定義に加えて抗原の条件はR3受容体に
ついて記述したものと同じである。好ましくは、同じ抗
原が受容体R3及びR4の「抗原成分」として用いられる。
しかしながら、異なる抗原を用いることも可能である。
しかしながら、R3及びR4の抗原成分の両者が測定しよう
とする同じ抗原に結合させるのに適するものであること
は確実なものとしなければならない。1つの条件は、測
定しようとする抗体が2つの受容体R3及びR4を常に架橋
するということである。
件は上述のR2の標識のものと同じである。好ましくは、
同じ標識がR2及びR4に用いられる。
HIV2のpol又はgag領域の抗原ではあるが、受容体R1又は
R2と反応する可能性のあるp24又はp26のエピトープ又は
配列ではない抗原に対する、測定しようとする抗体に特
異的に結合させるのに適する抗原からなる。この抗原
は、好ましくはpol領域の遺伝子産物に対する抗体、特
に好ましくは逆転写酵素(RT)に対する抗体に結合させ
るのに適するものである。比較的本来の構造を有する、
ヘテロ二量体である(51及び66kDaの2つのサブユニッ
トからなる)天然逆転写酵素(RT)が特に適切である。
しかしながら、これらのサブユニットを別々に用いるこ
ともできる。例えばMllerらがJ.Biol.Chem.264/24:1
3975−13978(1989)に記載したような発現クローンに
よって発現された組換え産生精製RTが特に好ましく用い
られる。HIV1及びHIV2−RTの間の、これらの2つのタン
パク質の約60%、部分的には100%の一致という高程度
のアミノ酸相同性のため、一般には、HIV2抗体によって
も認識される十分なHIV1−RTが存在する。HIV2−RTは、
任意に、単独で、又は追加的に用いることができる。RT
の代わりに、受容体R1又はR2と反応するp24又はp26のエ
ピトープは除くgag領域の遺伝子産物に対する抗体に結
合させるのに適する抗原を用いることができる。この抗
原は、好ましくは、gag−p17に対する抗体に結合させる
のに適するものである。受容体R3及びR4に対して示され
る「抗原」という用語の定義が、特異性を除いて、R5に
も当てはまる:受容体R5の場合、この抗原は確かに、HI
V−gag又はpol遺伝子産物に対する抗体に特異的に結合
させるのに適する分子である。
は特異的結合系を介した間接的なものである。固相への
R5の直接的又は間接的結合は上述の受容体R1及びR3のも
のと同様である。
HIV2のpol又はgag領域の抗原に対する、測定しようとす
る抗体に特異的に結合させるのに適する抗原からなる。
この抗原は、好ましくはpol領域の遺伝子産物に対する
抗体、特に好ましくは逆転写酵素(RT)に対する抗体に
結合させるのに適するものである。R5に対して上に示さ
れる抗原の特性に関する詳細がR6にも当てはまる。受容
体R5に対して示される「抗原」という用語の定義がR6に
も当てはまる。好ましくは、同じ抗原が受容体R5及びR6
の「抗原成分」として用いられる。しかしながら、異な
る抗原を用いることも可能である。しかしながら、R5及
びR6の抗原成分の両者が測定しようとする同じ抗体への
結合に適するものであることを確実なものとしなければ
ならない。測定しようとする抗体がこれらの2つの受容
体R5及びR6に連結するという条件が常に存在する。
件は上述の受容体R2及びR4の標識のものに類似する。好
ましくは、同じ標識がR2、R4及びR6に用いられる。
は別々に用いることができ、又は、好ましくは、架橋オ
リゴマーもしくはWO96/03652によるポリハプテン(これ
らの抗原を有する担体分子もしくは粒子)として用いる
こともできる。これはIgMの認識を改善する。
用いることができる。好ましいサンプルは、全血、血
清、血漿、尿、唾液等の体液である。
用途に応じて−さらなる添加物、例えば、バッファー、
塩、界面活性剤、タンパク質添加物、例えば、RSA及び
タンパク質断片、例えば、ペプトンを含んでいてもよ
い。必要とされる添加物は専門家に公知であり、又は専
門家が容易に見出すことができる。
薬キットであり、これは、HIV1、HIV1−Sub0のp24抗原
及び/又はHIV2のp26抗原に特異的に結合させるのに適
しており、かつ固相に結合し、又はそれに結合させるの
に適する少なくとも1種類の受容体R1を含み、HIV1、HI
V1−Sub0のp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に特異的に
結合させるのに適しており、かつ標識を担持する少なく
とも1種類の受容体R2を含み、ここでR1及びR2によって
認識されるエピトープは異なり、env領域に由来する抗
原に対する、測定しようとするHIV1、HIV1−Sub0及び/
又はHIV2抗体に結合させるのに適しており、かつ固相に
結合し、又はそれに結合させるのに適する少なくとも1
種類の受容体R3を含み、env領域に由来する抗原に対す
る、測定しようとするHIV1、HIV1−Sub0及び/又はHIV2
抗体に特異的に結合させるのに適しており、かつ標識を
担持する少なくとも1種類の受容体R4を含み、pol又はg
ag領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−Sub0及び/又はHIV2抗体に特異的に結合させ
るのに適しており、かつ固相に結合し、又はそれに結合
させるのに適する少なくとも1種類の受容体5を含み、
pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−Sub0及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合させるのに適しており、かつ標識を担持する少なくと
も1種類の受容体R6を含み、これに加えて必要であれば
他の通常の添加剤を含む。
5、mAb<p24>M−4B1/1、mAb<p24>M−6D9/4及び/
又はmAb<p24>M−2E7/3から産生される抗体が受容体R
1及びR2として用いられる、上述の試薬キットである。
及びR6に加えて必要であればさらなる通常の添加物を含
む、上述のHIV抗体に対する抗体を検出するための試薬
キットである。受容体R1及びR2は含まれない。
験片であり、これは、HIV1、HIV1−Sub0のp24抗原及び
/又はHIV2のp26抗原に特異的に結合させるのに適して
おり、かつ固相に結合し、又はそれに結合させるのに適
する少なくとも1種類の受容体R1を含み、HIV1、HIV1−
Sub0のp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に特異的に結合
させるのに適しており、かつ標識を担持する少なくとも
1種類の受容体R2を含み、ここでR1及びR2によって認識
されるエピトープは異なり、env領域に由来する抗原に
対する、測定しようとするHIV1、HIV1−Sub0及び/又は
HIV2抗体に対して特異的であるのに適しており、かつ固
相に結合し、又はそれに結合させるのに適する少なくと
も1種類の受容体R3を含み、env領域に由来する抗原に
対する、測定しようとするHIV1、HIV1−Sub0及び/又は
HIV2抗体に特異的に結合させるのに適しており、かつ標
識を担持する少なくとも1種類の受容体R4を含み、pol
又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようとす
るHIV1、HIV1−Sub0及び/又はHIV2抗体に特異的に結合
させるのに適しており、かつ固相に結合し、又はそれに
結合させるのに適する少なくとも1種類の受容体R5を含
み、pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しよ
うとするHIV1、HIV1−Sub0及び/又はHIV2抗体に特異的
に結合させるのに適しており、かつ標識を担持する少な
くとも1種類の受容体R6を含み、これらに加えて必要で
あれば他の通常の添加剤を含む。
含むことに加えてさらなる通常の添加物を必要とする、
HIVに対する抗体を検出するための試験片である。受容
体R1及びR2は含まれない。
トー測定:エピトープマッピングに最適のmAb試験濃度
の決定は実施例4.2に記載される手順に従って行う。
トー測定。
トー測定。
トー測定。
p24>モノクローナル抗体と幾つかのペプチド混合物と
の反応。
ype0(参照番号1557319、Boehringer Mannheim GmbH、
ドイツ)の使用説明書に記載される手順と同様に行う。
受容体R1ないしR6を除いて、Boehringer Mannheim comp
any GmbHからのEnzymun test anti−HIV 1+2+Subt
ype0の試薬及びバッファーを用いる。この試験は、機器
ES700(製造者:Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ)を
用いて25℃、100μlのサンプル容積で、ストレプトア
ビジン被覆試験管内において、2段階サンドイッチELIS
Aの原理に従って行う。以下の試薬を用いる: ・インキュベーションバッファー:トリス25mM pH7.5;
ウシ血清成分 ・結合バッファー:トリス25mM pH7.5;ウシ血清成分 ・結合体:ペルオキシダーゼ(POD)標識ヒツジ抗ジゴ
キシゲニン抗体 ・基質:ABTS 基質溶液(100ミリモル/lリン酸/クエン
酸バッファー、pH4.4中の2.2'アジノ−ジ[3−エチル
ベンズチアゾリンスルホネート]1.9ミリモル/l、過ホ
ウ酸ナトリウム3.2ミリモル/l) 以下の物質を受容体R1ないしR6として用いる(Bi=ビ
オチンの略語、Dig=ジゴキシゲニンの略語): ・R1:mAb<p24>M−6A9/5−IgG−Bi、mAb<p24>M−4
B1/1−IgG−Bi ・R2:mAb<p24>M−6D9/4−IgG−Dig、mAb<p24>M−
2E7/3−IgG−Dig ・R3:Enzymun test anti−HIV 1+2+Subtype0、参
照番号1557319、Boehringer Mannheim Germanyにおいて
用いられるペプチドに従うgp36−、gp41−ペプチド−Bi
及びポリハプテン−Bi ・R4:Enzymun test anti−HIV 1+2+Subtype0、参
照番号1557319、Boehringer Mannheim Germanyにおいて
用いられるペプチドに従うgp36−、gp41−ペプチド−Di
g及びポリハプテン−Dig ・R5:RT、参照番号1465333、Boehringer Mannheim Germ
anyから生成したRT−Bi ・R6:RT、参照番号1465333、Boehringer Mannheim Germ
anyから生成したRT−Dig 活性化したビオチン及びジゴキシゲニン誘導体を用い
る必要な誘導体化は、教科書から採用され、かつ専門家
に公知の手順に従って行った。RT又は抗体の誘導体化の
ために好ましく用いられる物質は、D−ビオチン−ε−
アミノヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミド及
びジゴキシゲニン−3−カルボキシメチルエーテル−ε
−アミノヘキサノイル−N−ヒドロキシスクシンイミド
である。
50−300ng/ml、ペプチド5−50ng/ml)をインキュベー
ションバッファーと共にストレプトアビジン被覆管に移
し、120分間インキュベートする。数回の洗浄工程及び
結合体との60分間のインキュベートの後、基質溶液を添
加し、60分後に生じた染料溶液の吸光値を422nmで測光
することで決定する。
Biomedica Inc.、ブリッジウォーター、USA(BBI)か
らの市販されているHIV抗体陽転パネルを測定し、BBIが
配布するデータと比較した(表1)。
(BBIデータ) 抗HIV試験1:Abbott HIV1/2、製品番号3A77(BBIデー
タ) 抗HIV試験2:Gen.Sys.HIV1/2、製品番号0230(BBIデー
タ) 組み合わせ試験1:抗p24抗体、gp41及びgp36(説明は以
下を参照) 組み合わせ試験2:抗p24抗体及びRT(説明は以下を参
照) 組み合わせ試験3:抗p24抗体、gp41、gp36及びRT(説明
は以下を参照) 3つの組み合わせ試験は、用いられる個々の抗原以外
は同じ試薬を用いる同一の条件下で行った。試験手順は
実施例1と同様である。基本的な物質は(実施例1と同
様に)商業的に入手可能なEnzymun test anti−HIV 1
+2+Subtype0(参照番号1557319、Boehringer Mannhe
im、ドイツ)の試薬及び25℃での適用であった。以下の
抗体又は抗原を組み合わせ試験1ないし3に用いた。
1−IgG−Bi及びEnzymun test anti−HIV 1+2+Subt
ype0からのビオチン化合成ペプチド及びポリハプテン
(gp41及びgp36)、mAb<p24>M−6D9/4−IgG−Dig、m
Ab<p24>M−2E7/3−IgG−Dig及びEnzymun test ant
i−HIV 1+2+Subtype0からのジゴキシゲニン化合成ペ
プチド及びポリハプテン(gp41及びgp36) ・組み合わせ試験2: mAb<p24>M−6A9/5−IgG−Bi、mAb<p24>M−4B1/
1−IgG−Bi及びビオチン化組換えHIV逆転写酵素 mAb<p24>M−6D9/4−IgG−Dig、mAb<p24>M−2E7
/3−IgG−Dig及びジゴキシゲニン化組換えHIV逆転写酵
素 ・組換え試験3(本発明によるもの) R1:mAb<p24>M−6A9/5−IgG−Bi、mAb<p24>M−4
B1/1−IgG−Bi R3:Enzymun test anti−HIV 1+2+Subtype0から
のビオチン化合成ペプチド及びポリハプテン(gp41及び
gp36) R5:ビオチン化組換えHIV逆転写酵素 R2:mAb<p24>M−6D9/4−IgG−Dig、mAb<p24>M−
2E7/3−IgG−Dig R4:Enzymun test anti−HIV 1+2+Subtype0から
のジゴキシゲニン化合成ペプチド及びポリハプテン(gp
41及びgp36) R6:ジゴキシゲニン化組換えHIV逆転写酵素 全ての試験について信号/カットオフ比を示す(カッ
トオフ指数、coi)。これらのデータは以下のように解
釈する:0.9未満の値は陰性、0.9と1.0との間の値は移行
領域及び値≧1.0は陽性。カラム“日”は最初の血液採
取が登録されてからの経過日数を示す。用いられるパネ
ルは異なる検体(抗原及び抗体)を含み、これらは
“日”の下に示される期間の後の抗体陽転期に生じる。
(組み合わせ試験3)が感染の全ての段階を完全に検出
することがわかる。
V1サブタイプの認識が確実なものとなる。試験手順、試
薬組成及び評価は、実施例2に記載される本発明による
組み合わせ試験3におけるものと同じである。サンプル
として、以下に列挙される全てのHIV1ウイルス単離体
(グループM及びサブタイプ0)を希釈したが、これは
全ての非希釈単離体が同じ最大信号を生じ、したがって
差異を示さなかったためである。
の抗原及び抗体を確実に検出することがわかる。
マッピング 4.1ペプチド合成 HIV−p24ウイルスタンパク質のアミノ酸配列の関連部
分配列を、バッチペプチド合成機、例えば、Applied Bi
osystems A431又はA433を用いるフルオレニル−メチル
−オキシカルボニル−(Fmoc)−固相ペプチド合成によ
り生成させた。このために、各々4.0当量の以下のFmoc
アミノ酸誘導体を用いる: これらのアミノ酸又はアミノ酸誘導体をN−メチルピ
ロリドンに溶解する。ペプチドを400〜500mgの4−
(2',4'−ジメトキシフエニル−Fmoc−アミノメチル)
−フェノキシ樹脂(Tetrahedron Letters 28(1987),2
107)上に0.4−0.7ミリモル/gの負荷(JACS 95(197
3),1328)で積み重ねる。Fmoc−アミノ酸誘導体のカッ
プリング反応は、20分の間に、4ジシクロヘキシルカル
ボジイミド当量及び4N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
当量で、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中で行
う。各々の合成工程の後、Fmoc基をジメチルホルムアミ
ド中の20%ピペリジンを用いて20分以内に分離する。こ
れらのペプチドが分子内ジスルフィド架橋を含む場合、
そのFmoc保護ペプチド配列を固相上で酸化した後、ヘキ
サフルオロイソプロパノール/ジクロロメタン中で人工
スペーサーをヨウ素とカップリングさせる(Kober et a
l.,The Peptide Academic Press,New York,1981,pp.145
−47);続いて、N末端Fmoc保護基を分離し、スペーサ
ーに加えてN末端ビオチンをカップリングさせる。
の開裂−リジンのフェニルアセチル保護基は除く−を、
20mlのトリフルオロ酢酸、0.5mlのエタンジチオール、1
mlのチオアニソール、1.5のフェノール及び1mlの水を用
いて40分で室温を行う。続いて、この反応溶液を300ml
の冷却ジイソプロピルエーテルと混合し、ペプチドを完
全に沈殿させるために0℃で40分間保存する。沈殿を濾
過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、少量の50%酢
酸で溶解した後、凍結乾燥する。得られた物質を、Delt
a−PAK RP C18材料を用いて対応する勾配(溶出液A:
水、0.1%トリフルオロ酢酸、溶出液B:アセトニトリ
ル、0.1%トリフルオロ酢酸)を上回る分離用HPLC(カ
ラム50×300mm、100Å、15μ)により、120分で精製す
る。溶出した物質の正体をイオンスプレー(ionic spra
y)質量分析によりチェックする。
n test anti−HIV 1+2(BM 1 165 062)と同様に行
った。試験原理はストレプトアビジン技術を用いる2段
階サンドイッチELISAに従う。しかしながら、ヒト血清
の代わりに異なるモノクローナル<p4>抗体を用い、ビ
オチン化ペプチド又は組換えp24で測定した。検出は<
マウスIgG>−POD(BM 1 431 323)を用いて行う。残り
のさらなる試薬、例えば、洗浄液、ストレプトアビジン
管、ABTS等はそのままにした。測定は、Boehringer Man
nheim製の自動Enzymun 分析機ES22又はES600で行っ
た。
上述の試験概念で行った。ビオチン化組換えp24(200ng
/mlの初期量)を抗原として用いた。
いる。
回るパターンで合成した25個のアミノ酸を有するN末端
ビオチン化ペプチド(配列番号1−30のペプチド)で行
った。まず最初に、各々5種類の異なるビオチン化ペプ
チドを含む6種類の異なるペプチド混合物A−F(ペプ
チド当たりの使用量:60ng/ml)で大まかなマッピングを
間接的試験概念を用いて測定した。
のペプチド混合物と特異的に結合する(図式的な表示は
図5を参照)。
ペプチド(使用量:100ng/ml)を間接的試験概念で別々
に用いた。
最も多くの広範囲にわたる相同性があるため、p24(Sub
0)と交差反応するであろう。
ングをペプチド3(=配列番号3)、3A(=配列番号3
1)、3B(=配列番号32)及びmAb<p24>M−6D9/4;ペ
プチド9(配列番号9)、9A(=配列番号33)、9B(=
配列番号34)及びmAb<p24>M−2E7/3;これに加えて、
ペプチド17(配列番号17)、17A(=配列番号35)、17B
(=配列番号36)及びmAb<p24>M−4B1/1で行った。
さらに絞り込むことはできないことがわかる。mAb<p24
>M−2E7/3のエピトープは以下の配列に最小化するこ
とができる: 9B(配列番号34)EEAAEWDRVHP mAb<p24>M−6D9/4のエピトープは−重要なシグナル
を失うことなく−以下の配列まで短くすることができ
る: 3A(配列番号31)QAISPRTLNAWVKVI 実施例5:モノクローナル抗体p24抗体によるHIVサブタイ
プの認識 この試験は、Enzymun test anti−HIV 1+2+Subt
ype0(参照番号1557319、Boehringer Mannheim、ドイ
ツ)の原理に従う実施例1及び2に従って行った。しか
しながら、HIVサブタイプの認識を試験するため、受容
体R1及びR2、すなわち、p24に対するモノクローナル抗
体のみを用いた。使用量は各々250ng mAb/mlであっ
た。
ローナル抗体mAb<p24>M−6A9/5が各々R1として、す
なわち、固相側での使用に適することが示される。モノ
クローナル抗体mAb<p24>M−6D9/4及びmAb<p24>M
−6D9/4は、R2としての、すなわち検出側での使用に好
ましく適する。HIV1及びHIV1−Sub0のp24の効率的な同
時認識のためには、4種類全ての抗体が一緒に好ましく
用いられる。
Claims (20)
- 【請求項1】HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はHIV
2のp26抗原、HIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2のenv領
域に対する少なくとも1種類の抗体、並びにHIV1、HIV1
−SubO及び/又はHIV2のpol及び/又はgag領域に対する
少なくとも1種類の抗体の特異的検出を用いるイムノア
ッセイによりHIV感染を診断するための方法であって、
前記gag領域がp24/p26の配列を含まない、前記方法。 - 【請求項2】HIV感染の検出を不均一イムノアッセイに
より行う、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】検出のために、HIV1、HIV1−SubOのp24抗
原及び/又はHIV2のp26抗原に特異的に結合でき、かつ
固相に結合しているか又はそれに結合するのに適する少
なくとも1種類の受容体R1、 HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に
特異的に結合するのに適し、かつ標識を有する少なくと
も1種類の受容体R2、ここで、R1及びR2により認識され
るエピトープは異なるものである、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに結合す
るのに適する少なくとも1種類の受容体R3、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の受容体
R4、 pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに
結合するのに適する少なくとも1種類の受容体R5、及び pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の
受容体R6を用い、必要により液相から固相を分離して該
2つの相のうちの一方で標識の測定を行う、請求項1又
は2記載の方法。 - 【請求項4】受容体R1及びR2がHIV1のp24抗原に特異的
に結合でき、受容体R3及びR4がenv領域の抗原に対す
る、測定しようとするHIV1抗体に特異的に結合でき、か
つ受容体R5及びR6がgag又はpol領域の抗原に対する、測
定しようとするHIV1抗体に特異的に結合できる。請求項
2又は3記載の方法。 - 【請求項5】受容体R5及びR6がpol領域の抗原に対す
る、測定しようとするHIV1抗体に特異的に結合できる、
請求項3又は4記載の方法。 - 【請求項6】受容体R5及びR6がHIV逆転写酵素に対する
抗体に特異的に結合できる、請求項3〜5のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項7】受容体R5及びR6がgag−p17抗原に対する抗
体に特異的に結合できる、請求項3〜5のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項8】HIV1−SubOの感染も検出される、請求項1
〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】グループMの全てのHIV1サブタイプの感染
も検出される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】受容体R1及びR2が、各々、HIV1、HIV1−
SubOのp24抗原の異なるエピトープ及び/又はHIV2のp26
抗原の異なるエピトープを認識する幾つかの受容体の混
合物である、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - 【請求項11】HIVに対する抗体を検出することを含むH
IV感染を診断するための方法であって、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに結合す
るのに適する少なくとも1種類の受容体R3、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の受容体
R4、 pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに
結合するのに適する少なくとも1種類の受容体R5、及び pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の
受容体R6を用い、必要により液相から固相を分離して該
2つの相のうちの一方で標識の測定を行う、ここで、前
記gag領域はp24/p26の配列を含まない、前記方法。 - 【請求項12】配列番号3、9、17、31又は34記載のp2
4エピトープに特異的に結合する、HIV1 p24抗原に対す
るモノクローナル抗体。 - 【請求項13】細胞系mAb<p24>M−6A9/5(寄託番号D
SM ACC2310)、mAb<p24>M−4B1/1(寄託番号DSM A
CC2299)、mAb<p24>M−6D9/4(寄託番号DSM ACC230
0)又はmAb<p24>M−2E7/3(寄託番号DSM ACC2301)
から産生される、HIV1 p24抗原に対するモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項14】細胞系mAb<p24>M−6A9/5(DSM ACC2
310)、mAb<p24>M−4B1/1(DSM ACC2299)、mAb<p
24>M−6D9/4(DSM ACC2300)又はmAb<p24>M−2E7
/3(DSM ACC2301)から産生されるモノクローナル抗体
と同じ様式でp24に結合する、HIV1 p24抗原に対するモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項15】細胞系mAb<p24>M−6A9/5(DSM ACC2
310)、mAb<p24>M−4B1/1(DSM ACC2299)、mAb<p
24>M−6D9/4(DSM ACC2300)又はmAb<p24>M−2E7
/3(DSM ACC2301)から産生されるモノクローナル抗体
と同じエピトープに結合する、HIV1 p24抗原に対する
モノクローナル抗体。 - 【請求項16】請求項13〜15のいずれかに記載の少なく
とも1種類のモノクローナル抗体を使用する、請求項1
〜10のいずれか1項に記載のHIV感染を診断するための
方法。 - 【請求項17】モノクローナル抗体mAb<p24>M−6A9/
5(寄託番号DSM ACC2310)と組み合わせて、請求項12
記載の少なくとも1種類のモノクローナル抗体を使用す
る、請求項16に記載のHIV感染を診断するための方法。 - 【請求項18】HIV感染を検出するための試薬キットで
あって、 HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に
特異的に結合するのに適し、かつ固相に結合しているか
又はそれに結合するのに適する少なくとも1種類の受容
体R1、 HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に
特異的に結合するのに適し、かつ標識を有する少なくと
も1種類の受容体R2、ここで、R1及びR2により認識され
るエピトープは異なるものである、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに結合す
るのに適する少なくとも1種類の受容体R3、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に結合するのに適
し、かつ標識を有する少なくとも1種類の受容体R4、 pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に結合するの
に適し、かつ固相に結合しているか又はそれに結合する
のに適する少なくとも1種類の受容体R5、及び pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の
受容体R6を含み、これらに加えて必要であれば他の通常
の添加物を含む、ここで、前記gag領域はp24/p26の配列
を含まない、試薬キット。 - 【請求項19】細胞系mAb<p24>M−6A9/5(DSM ACC2
310)、mAb<p24>M−4B1/1(DSM ACC2299)、mAb<p
24>M−6D9/4(DSM ACC2300)又はmAb<p24>M−2E7
/3(DSM ACC2301)から産生される抗体を受容体R1及び
R2として用いる、請求項19記載の試薬キット。 - 【請求項20】HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はH
IV2のp26抗原に特異的に結合するのに適し、かつ固相に
結合しているか又はそれに結合するのに適する少なくと
も1種類の受容体R1、 HIV1、HIV1−SubOのp24抗原及び/又はHIV2のp26抗原に
特異的に結合するのに適し、かつ標識を有する少なくと
も1種類の受容体R2、ここで、R1及びR2により認識され
るエピトープは異なるものである、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに結合す
るのに適する少なくとも1種類の受容体R3、 env領域に由来する抗原に対する、測定しようとするHIV
1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結合する
のに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の受容体
R4、 pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ固相に結合しているか又はそれに
結合するのに適する少なくとも1種類の受容体R5、及び pol又はgag領域に由来する抗原に対する、測定しようと
するHIV1、HIV1−SubO及び/又はHIV2抗体に特異的に結
合するのに適し、かつ標識を有する少なくとも1種類の
受容体R6を含み、これらに加えて必要であれば他の通常
の添加物を含む、ここで、前記gag領域はp24/p26の配列
を含まない、試験片。
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