JPH05504400A - 抗体または抗原の併用アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体または抗原の併用アッセイ 発明の背景 １　技術分野 本発明は、抗原および抗体の検出のための併用イムノアッセイに関する。このア ッセイの抗原部分のフォーマットは、抗原を分析するために抗体：抗原　抗体に なっている。二のアッセイの抗体部分のフォーマントは抗原、抗体、抗原である 。特定すれば、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓ、Ａｇ）および ／またはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）に対す る抗体の併用イムノアッセイに関する。

２、従来の技術 最近、血液銀行は供血された血液に関してＨＩＶおよびＨＢｓＡｇに対する抗体 の存在をスクリーニングするために、２つの異なる試験を行っている。ＨＩＶに 対する抗体を持つ血液をスクリーニングするために、酵素結合体によるイムノア ッセイを使用し、固形支持体上にコートされたＨ　Ｉ　Ｖ抗原、試料からのＨＩ Ｖに対するヒトの抗体、およびホースラディツシュのパーオキシダーゼとカップ リングしたＨＢｓＡｇに対する抗体からなる複合体を形成させる。ＨＢｓ、Ａｇ をスクリーニングするためには、サンドウィンチタイプのアッセイが通常用いら れ、ＨＢｓＡｇに対する抗体、試料からのＨＢｓＡｇ、およびホースラディソン ユパーオキシダーゼとカンプリングしたＨＢｓＡｇに対する抗体でサンドウィッ チを形成させる。

ＨＢｓＡｇ、およびＨＩＶに対する抗体、並びに池の抗原および抗体の組み合わ せに関して、一つのアッセイで試験することが望まれている。しかしながら、そ ウスるためには、一つのアッセイにおいて一つの固形支持体、例えばマイクロタ イタープレートまたはビーズ上に２つのアッセイの成分を混合している間の、そ れぞれのアッセイの特異性および感度が保持されなければならない。このことを 完全に達成する生成物は現在利用されていない。

ＥＰ−Ａ−１７３，２９５号は、ＨＢｓ、Ａｇ、およびＨＩ　Ｖに対する抗体を 同時にスクリーニングするための方法を記述している。この方法は、精製された ＨＢｓＡｇ、およびポリクローナル抗−ＨＢｓＡｇ抗体でコートされた固形支持 体と試料をインキュベートし；ＨＢｓＡｇに対するビオチン化モノクローナル抗 体、およびヒトの抗体に対するビオチン化抗体からなる検出用プローブを加え１ 次に、ストレプトアビジンを結合したホースラディツシュ　パーオキシダーゼ、 および基質を加えることにより発色させることを開示している。しかしながら、 このフォーマットのＨＩＶ部分は、試験される試料の希釈を必要とする、現在、 血液銀行で使用されている方法と同じである。

ＨＢｓＡｇ、およびＨＩＶに対する抗体を共に効果的に試験するためには、その ままの（希釈しない）試料を使用すべきである。ＨＩＶに対する抗体に関して、 そのままの試料を試験するためには、ＨＩ　Ｖ抗原が固形支持体上にコートされ 、且つ検出用試薬として使用される、アッセイフォーマットを使用されなければ ならない。このフォーマットは、上記の標識抗−ヒト抗体を含むアッセイを使用 するときに必要とされる希釈が不要である。

しかしながら、そのままの試料を試験する場合、所望の感度と特異性を達成する のは難しい。そのままの試料は高濃度の物質を含み、それらの物質はアッセイの 成分と非特異的に反応し、実験結果にまちがいを生じることになる。

ＨＩＶに対する抗体のみの試験におけるこの問題に対する幾つかの方法がある。

例えば、非特異的な相互作用に関わる混在物質を除去するために、ＨＩＶ抗原を 精製してもよい。別法として、所望の特異的抗原が優位な共通抗原である、異な る起源の抗原を用いてもよい。他の可能性としては、別の方法で非特異的に結合 するはずの試料中の抗体を、アッセイの成分と結合させ、そして非特異的なシグ ナルを生じさせるために、ＨＩＶの物質を起源とする非−ＨＩＶ抗原を加えるこ とである。

非特異的な結合を回避するために、一つの分析物のサンドウィッチタイプのアッ セイにおいて、異なる起源の試薬が過去に使用された。例えば、ベランガー（Ｂ ｅｌａｎｇｅｒ）ら、Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、４８（１９ ７３）、ｐｐ、１５−１８は、アルファ　フェトプロティンのサンドウィッチタ イプのアッセイを開示しており、ヤギ由来の抗体を固形支持体上にコートし、そ してアルファ　フェトプロティンに対するウサギの抗体を標識試薬として使用し ている。異なる起源に由来する抗体の使用は、プレート上の物質および標識試薬 が同じ起源に由来する場合に別に生じる特異的シグナルを低下させる。例えば、 固形支持体上の抗体が標識抗体として同じ動物に由来する場合、プレート上の抗 体が試料中の物質と非特異的に結合し、次に、標識抗体に非特異的に結合するこ とにより不所望のシグナルを生じるかもしれない。異なる動物を起源として使用 することにより抗体を生産する場合、プレートに非特異的に結合する物質が標識 抗体にも結合することはほとんどありえない。この理由は、物質をプレートに結 合させた抗体が、標識試薬中にも見いだされることはほとんどありえないからで ある。抗体が異なる動物種に由来する場合、それらは非特異的結合物質との親和 性、結合活性および特異的相互作用が異なる。また、試料が入手用抗体または検 出用抗体のいずれかに対する種特異的抗体を含む場合、非特異的／グナルの増大 は生ぜず、抗体は異なる起源から提供される。

異なる起源に由来する抗原を用いる、抗原　抗体：抗原−フォーマットを使用す るアッセイは、以前に記述されている（ＥＰ−Ａ−３１３，９８６号：米国で１ ９８７年に優先権主張、およびＥＰ−Ａ−３０７，１４９号：英国で１９８７年 に優先権主張）。

発明の概要 前記の１９８７年の米国の優先日前に、異なる起源の抗原の概念の有用性が認識 されていた。

今日までに、上記のタイプの併用イムノアッセイにおいて、異なる起源に由来す る抗原を使用することが、併用アッセイの他方の部分において抗原を試験する場 合の感度および特異性の増加に通じることが見いだされてきた。この発見により 、そのままの試料または最小限に希釈された試料が、抗−ＨＩＶ抗体およびＨＢ ｓＡｇの両方に関して匈時に、効果的に試験できるようになる。この併用アッセ イの達成により、抗原および抗体が、ただ一つの試料を使用する単一のアッセイ において試験できるようになり、それによって、試料が保持され、そして必要な アッセイ数が減らさる。同様に、ビオチン化抗原およびビオチン化抗体を使用す ることにより抗原および抗体それぞれの価値ある併用アッセイが成し遂げられ、 ビオチン化抗原に特異的な抗体の存在、またはビオチン化抗体と反応する抗原の 存在が信頼性をもって測定されるようになる。

特定すれば、抗体、または二次抗原に対する抗体の存在、不在、または量を測定 するための併用イムノアッセイが見いだされ、次の工程よりなる：（ａ）二次抗 原、および−次抗原に対する抗体がコートされた固形支持体に試料を接触させる ことにより、上記−次抗原、および上記二次抗原に対する抗体が試料中に存在す る場合は、それらを固形支持体上にコートされたそれぞれの免疫学的対象物と結 合させ（複合体を作らせる）；（ｂ）固形支持体上にコートされた二次抗原によ り結合した抗体の検出用試薬の形で二次抗原を添加するが、その際、上記の添加 した二次抗原と、工程（ａ）の固形支持体に結合した上記二次抗原との間で免疫 複合体を形成するような条件下で添加を実施し。

（Ｃ）固形支持体上にコートされた抗体により結合した一次抗原の検出用試薬の 形で上記−次抗原に対する抗体を添加するが、その際、上記の添加した一次抗体 と、工程（ａ）の固形支持体に結合した一次抗原との間で免疫複合体を形成する ような条件下で添加を実施し。

（ｄ）試料中の一次抗原および／または二次抗原に対する抗体の存在、不在、ま たは量を測定するために、工程（ｂ）および（Ｃ）で形成された免疫複合体の存 在、不在、または量を測定するが、その際、固形支持体上にコートされた二次抗 原が、第一の起源に由来する抗原を含み、そして検出用試薬として使用された二 次抗原が、第二の起源に由来する抗原を含み、東−の抗原と第二の抗原が異なる 。

支持体上にニートされる抗原および検出用試薬中の抗原は、別のセルラインを起 源としてよく、あるいは一方が一つのセルラインを起源とし、他方が化学的に合 成されたものでもよく、あるいは組換え遺伝子工学技術によってもよい。

支持体上にコートされ、モして／または検出用試薬中に存在する二次抗原は、起 源に関して、由来が異なる抗原の混合物でもよい。本発明で使用されるこのよう な混合物は、異なる相対量の、特定の起源の抗原を含んでもよい。支持体上の抗 原は、一つの起源にのみ由来してもよいが、検出用試薬中の抗原は２つまたはそ れ以上の起源に由来する抗原の混合物でもよく、あるいはその逆でもよい。

本発明の特定の見地によれば、ＨＢｓＡｇおよびＨＩＶに対する抗体の両方をス クリーニングするアッセイが提供される。本発明のこの様式においては、−次抗 原が肝炎ウィルスの表面抗原であり、二次抗原はＨＩＶ抗原である。

本発明の別の様式は、−次抗原、または二次抗原に対する抗体の存在、不在、ま たは量を測定する、併用イムノアッセイであり、以下の工程を含む・（ａ）二次 抗原、および−次抗原に対する抗体がコートされた固形支持体に試料を接触させ ることにより、上記−次抗原、および上記二次抗原に対する抗体が試料中に存在 する場合は、それらを固形支持体上にコートされたそれぞれの免疫学的対象物と 結合させ（複合体を作らせる）：（ｂ）検出用試薬としてビオチン化二次抗原を 添加するが、上記ビオチン化二次抗原と工程（ａ）において固形支持体に結合し た上記二次抗原に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成するような条件下で行 い。

（Ｃ）検出用試薬として上記−次抗原に対するビオチン化抗体を添加するが、上 記ビオチン化抗体と二Ｗ　（ａ）において固形支持体に結合した上記−次抗原と の間で免疫複合体を形成するような条件下で行い：（ｄ）工程（ｂ）および（Ｃ ）において形成された免疫複合体の存在、不在、または量を測定するが、 （ｄｌ）マーカー標識されたビオチン結合基質を、工程（ｂ）および（Ｃ）の支 持体に結合したビオチン化試薬との複合体に添加し、そして（ｄ２）−次抗原、 および／または二次抗原に対する抗体の存在、不在、または量を測定するために 、ビオチンと固形支持体上のビオチン結合基質の複合体の存在、不在、または量 を検出することにより行う。

本発明の後者の様式は、ＨＩＶおよび肝炎ウィルス抗原に対する抗体を測定する アッセイ、即ち一次抗原が肝炎ウィルス抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）であり、二 次抗原がＨＩＶ抗原である併用アッセイに特に有用である。好ましい態様は、ビ オチン化二次抗原と固形支持体上にコートされる二次抗原が異なる起源に由来す ることである（上記のとおり）。

上記の、この態様の工程（ｂ）および（Ｃ）は、二次抗原に対する抗体の検出用 試薬を、−次抗原の検出用試薬と混合、例えばＨＩＶ抗原と肝炎ウィルス抗原を 予め混合することにより同時に実施してもよい。工程（ａ）、（ｂ）および（Ｃ ）は、次の工程の前に一回またはそれ以上の洗浄工程を実施してもよい。

好ましい態様の詳細な説明 一般的な発明の概要の詳細については、ＨＢｓＡｇ、およびＨＩＶに特異的な抗 体の併用アッセイを引用して今説明される。概説される法則は、前記のように、 −膜化された本発明の形態に応用されうる。

本明細書中のｒＨＩ　Ｖ抗原」という言葉は、天然のＨＩＶと同じ配列かまたは 部分配列を有するポリペプチドまたは蛋白質、または天然のＨＩＶと免疫的に交 差反応するものを意味する。即ち、この言葉はこの免疫特性を有するハプテンを 包含する。ｒＨＩＶＪという言葉は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２または今後発 見されるかもしれない、他のあらゆるヒト免疫不全ウィルスを意味する。

「検出用試薬」という言葉は、本明細書中では、固形支持体に結合した試料分析 物と免疫複合体を形成させるために添加される試薬を意味する。ＨＩＶに対する 抗体の検出用試薬の一つの例は、ＨＩＶ抗原と標識物（マーカー）、例えばホー スラディツシュ　パーオキシダーゼとの結合体である。他の例としては、ビオチ ン化した（ビオチンは標識物である）ＨＩＶ抗原である。この言葉は、−次抗原 に対する抗体、例えば標識物を結合していてもいなくてもよい、ＨＢｓＡｇｌ： 対する抗体も意味する。検出用試薬が標識物を含まないか、または標識物が特定 の部分（リガンド）に対する生物学的親和性に関与する基である場合は、検出用 試薬と、固形支持体に結合した試料分析物との間に形成される複合体は、さらに 、例えば生物学的親和性により検出用試薬に対して結合する標識リガンドと複合 体を形成する。このような標識リガンドは、検出用試薬がヤギを起源とする抗体 の場合、適切な酵素、例えばホースラディツシュ　パーオキシダーゼに結合した 抗−ヤギ抗体であることができる。検出用試薬が一つの抗体ならば、固形支持体 にコートされるものと異なる起源に由来することが好ましく、例えば一方がヤギ 抗体であり、他方がマウス抗体であってよい。

異なるセルラインとは、異なる種に由来するか、または同じ種の異なる個体に由 来するセルラインを意味する。問題のセルラインは、問題の抗原、例えばひとつ または複数のＨＩＶ抗原を発現する能力を有していなければならない。

一つの好ましい態様として、ＨＩＶに感染したセルラインを、固形支持体にコー トされるＨＩＶ抗原を生産するための起源として使用し、そして異なるＨＩＶに 感染したセルラインを、ＨＩＶ抗原を検出するための起源として使用する。適切 なセルラインはその分野においてよく知られており、容易に入手することができ る。好ましいセルラインは、ＨＩＶに感染したヒトＴ−セルラインＨ９，ＭＯＬ Ｔ−３，ＣＥＭおよびＨ３Ｂである。感染したセルラインからのＨＩＶ抗原は、 ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）。

デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）、およびオルガノンテ クニカ社（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）から細胞溶解物として市販もされ ている。

別の好ましい態様においては、組換え体に由来する、ある決められた宿主由来の 抗原を、一方の抗原に用いるが両方には用いない。大腸菌宿主を使用して調製さ れた、岨換え体ＨＩＶ試薬中のバクテリア蛋白質の不純度は、両方のＨＩＶ抗原 に関して同じバクテリアの不純度が存在しない場合、非特異的なシグナルをもた らさない。昆虫を宿主として調製された、組換え体ＨＩＶ抗原、特にｇｐ１６０ は、レプリジェン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃａｒｐ、）（ケンブリー）シ、マサ チューセッツ州、米国）から市販されている。大腸菌または枯草菌を使用するこ とを含む、組換え体ＨＩＶ抗原の調製法はその分野において知られている。

別の好ましい態様においては、一方のセルラインをＨＩ　Ｖに感染したセルライ ン、例えばＨ９またはＭＯＬＴ３にし、そして他方のセルラインを組換え体宿主 セルラインにする。同様にして、一方のセルラインを組換え体宿主セルライン、 例えば大腸菌のセルラインにし、他方のセルラインを異なる組換え体宿主セルラ イン、例えば昆虫のセルライン、スポドブテラ　フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔ ｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）にすることができる。

別の態様においては、固形支持体上にコートされるＨＩＶ抗原または検出用試薬 として使用されるＨ　Ｉ　Ｖ抗原のいずれがか、化学的に合成された、ひとつま たは複数のＨＩＶ抗原を含む。慣用的なポリペプチド合成技術、例えばメリフィ ールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）合成を使用できる。例えば、ＥＰ−Ａ−２６７ ゜８０２＋２４７．５５７＋２８４．５８７：２７８．１４８＋２３１．９１４ および２４６．８２９およびＷＯ−Ａ−８７０２７７５およびＵＳ−Ａ−４，７ ３５，８９６および４．８３３．０７２を参照せよ。

固形支持体上にコートされるＨＩＶ抗原または検出用試薬として使用されるＨＩ Ｖ抗原は、異なる起源に由来するＨＩＶ抗原の混合物であってよい。即ち、好ま しい態様においては、この混合物は組換え体により生産されたＨＩＶ抗原と化合 した、感染セルライン由来のＨＩＶ抗原を含んでよい。その際、組換え体に由来 するＨＩＶ抗原が、感染セルライン由来のＨＩＶ抗原の調製および精製過程にお いて部分的に除去された抗原決定基を修正してもよい。その混合物の一部である ＨＩＶ抗原は、検出用試薬および固形支持体上にコートされるＨＩＶ抗原の両方 に存在してよい。例えば、固形支持体上にコートされるＨＩＶ抗原はＨＩＶ感染 セルライン由来でもよく、そして検出用試薬は、ＨＩＶ感染セルライン由来の、 さらに精製されたＨＩＶ抗原を化合した、組換え体によるか、または合成的に生 産されたＨＩＶ抗原を含んでも、その反対でもよい。

別の好ましい態様においては、固形支持体上にコートされるか、または検出用試 薬として使用されるＨＩＶ抗原の一方は、決められた宿主、例えば昆虫細胞由来 の岨換え体ＨＩＶ抗原と、感染セルライン由来のＨＩＶ抗原とを化合したもので ある。その際、他方のＨＩＶ抗原は異なる、決められた宿主、例えば大腸菌由来 の組換え体ＨＩＶ抗原であってよ（、感染セルライン由来のＨＩＶ抗原と化合し てもよい。使用される感染セルラインは、固形支持体および検出用試薬の両方に 使用されるものであってよい。例えば、固形支持体上にコートされるＨＩＶ抗原 は一つの宿主、例えば昆虫細胞由来の組換え体ＨＩＶ抗原と、感染セルライン上 ９由来の精製ＨＩＶ抗原との混合物であってよいが、検出用試薬は他の起源、例 えば大腸菌由来の組換え体ＨＩＶ抗原と、感染セルライン上９由来のＨＩＶ抗原 との混合物を含んでいてよい。好ましい組換え体ＨＩＶ抗原はｇｐ１６０である 。

ＨＩＶ抗原は多くの抗原、または一種類の精製抗原の混合物中に存在しうる。

ＨＩＶ−１抗原、例えばｐ１７．ｐ２４．ｐ３１．ｇｐ４１．ｇｐ５１．　ｐ５ ５゜ｇｐ１２０．ｐ２４．ｐ６６およびｇｐ１６０、および対応するＨＩＶ−２ 抗原は単独で、または混合して使用できる。好ましい態様においては、ＨＩＶ感 染細胞からＸＩＨｉｌされたウィルス溶解物の形のＨＩＶ抗原が使用される。

適切な精製ＨＩＶ成分を選択することにより、特定の抗体のみのための試験をす るためにアッセイを仕立てることができる。ｐ２４に対する抗体に特異的な試験 をするために、完全精製溶解物を固形支持体上にコートすることができ、そして 精製ｐ２４を、ＨＩＶ抗原に対する抗体の検出用試薬として添加する。他のウィ ルス成分に特異的な試験も同様にして実施してよい。

固形支持体上にコートされ、そして検出用試薬である、ＨＩＶ−１抗原またはＨ ＩＶ−２抗原を選択することにより、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２それぞれに対 する抗体を検出する。ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原の適当な組み合わせ を選択することにより、一方の抗原のみと反応する抗体、並びに両方の抗原と反 応する抗体を同時にアッセイする。例えば、ＨＩＶ−２に特定の合成ペプチドは 知られており（例えば、ＵＳ−、Ａ−４，１８２，５５６）　、ＨＩＶ−１感染 細胞の溶解物と化合できる。

検出用試薬はビオチン化された形のＨＩＶ抗原、および／またはＨＢｓＡｇに対 する抗体が好ましい。このことは、上記の工程（ｄ）が、工程（ｂ）および（Ｃ ）において形成された複合体を、マーカー標識したビオチン結合基質と反応させ ることにより、固形支持体上のビオチンと上記ビオチン結合基質との間で複合体 を形成させ、そして次に、マーカーの存在によりその複合体を測定できることを 意味する。ビオチン結合基質の例としては、抗−ビオチン抗体、ストレプトアビ ジンおよびアビジンがある。

ＨＩｖ抗原、およびＨＢｓＡｇに対する抗体のビオチン化は慣用的な手段により 実施できる。抗−ビオチン抗体はポリクローナルな起源またはモノクローナルな 起源なものが好ましく、そしてそのようなものでありえ、標準的な業者により入 手できる。

ＨＢｓＡｇに対する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかで ありえ、そして市販されているものを入手するか、または標準的な技術、例えば 高度に精製されたＨＢｓＡｇを用いてブタ、ヤギ、またはヒツジを免疫化するか 、またはマウスを免疫化して、次に血漿細胞を生産する抗体と不死のマウスミエ ローマ細胞を融合することによりモノクローナル抗体を生産できる。ＨＢｓＡｇ に対するポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体は、コーティング用、お よび／または検出用試薬として使用してよい。

ビオチン結合基質は、マーカー（標識物）に結合していることが好ましい。適切 なマーカーは、酵素（酵素の基質、補助基質、助酵素、補助因子等々）、蛍光標 識、放射性標識および化学発光標識である。ランタニド標識、例えばユーロピウ ム、タービウム、およびサマリウムキレートを使用してもよい。好ましいマーカ ーは、ホースラディツシュ　パーオキシダーゼである。

の存在および量を示すものとして測定され、かつ記録される色を発色する基質を 添加することを含む。

本発明で使用される固形支持体は、異質のもののイムノアセイにおいて通常使用 されるものである。即ち、この固形支持体はビーズ、ソート、パッド、マイクロ タイタープレートのウェルのような異なる形態を有することができる。この支持 体は孔性でも非孔性でもよい。ポリスチレン、ポリサッカライド、ナイロン、ニ トロセルロース、ポリプロピレン等々を含んでもよい。当業者は、特定の物理形 態と等価な物である材料を知るであろう。支持体上にコートされた実在物は、単 に物理的吸着と共有結合によりそこに結合していてよい。支持体と、コートされ た実在物との間の結合は、異質のもののイムノアセイに適用される通常の洗浄方 法に耐えられるであろう。

固形支持体上に複合体を形成するための反応条件は、よ（知られている。通常、 溶媒は水で、温Ｉは０−４０℃、好ましくは１５−４０℃、そしてｐＨは４−９ の間である。溶媒は洗浄剤およびｐＨを安定させるための緩衝成分を含んでもよ い。

本発明のための開発努力と関連して、ＨＩＶエンベロープ蛋白質（例えば、ＨＩ Ｖ−１の１１２０およびＨＩＶ−２のｇｐ１０５）と、対応する細胞リセプタ− （ＣＤ４）との間の相互作用の阻害剤が効果的な量で存在する場合に複合体を形 成することにより、抗原　抗体・抗原−複合体の使用による抗−ＨＩＶ抗体の試 験における非特異的な結合を低下させうろことが実現した。その量は、支持体上 にコートされた抗原と、検出用試薬中の抗原との間の結合を、不純物とじて存在 するＨＩＶ抗原抗原グセブタ−して阻害することにより非特異的な結合を低下さ せる意味で効果的である。阻害剤の添加により、抗原・抗体：抗原−フォーマッ トの抗体アッセイにおける、異なる起源に由来する抗原の使用を完全にまたは部 分的に胃き換えることができる。

この種の阻害剤は、ＣＤ４標的細胞のＨＩ　Ｖ感染のために以前に示唆された。

例えば、エリツク　デ　クレルク（Ｅｒｉｃ　Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｑ）（第６回エ イス国際学会、１９９０年６月２１日、サンフランシスコ）を参照せよ。パリソ シュ（Ｐａｒｉｓｈ　Ｃ，Ｒ，）ら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４５　（１９９０ ）１１８８）は、多（の硫酸化ポリアニオンに関して、抗−ＣＤ４　ｍＡｂの結 合を阻害する能力を試験した。ＣＤ４において、彼らはＣＤ４のｇｐ１２０結合 領域と明らかに異なるが密接に関連したポリアニオン結合部位を見つけた。一般 的に言って、知られている阻害剤は、ボリアニオニックであり、特にポリスルフ ェート化されているかまたはポリスルフすン化され（即ち、−３Ｏ３−基を露出 している）、場合により多くのＯＨ−基を含むポリマーである。適切なポリマー は、水性溶媒に可溶性であることが好ましい。特定の例としては、スルフェート 化されたポリサツカロイド、例えば硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸ベントサ ン、フコイダン、およびカラゲーナン、および硫酸ポリビニルアルコール、およ びポリアネトール　スルフォネートである。非特異的な結合の低下は特異性並び に感度に大きな効果を有する。

したがって、良好な試験を行うために、上記の阻害剤を使用する場合は、種類、 分子量、置換の程度等に関する通常の高感度がいつも得られるであろう。例えば 、良好な感度をもってＨＢｓＡｇを同時に検出するはずであれば、阻害剤の濃度 を高くする必要がないであろう。抗−ＨＩＶ抗体試験においては、硫酸デキスト ランの濃度を０．０１−０．１４％（Ｗ／Ｗ）の範囲内にするか、または他のＣ Ｄ４−ｇＴ）１２０ＨＩＶエンベロープ阻害剤を使用するならば、等価またはそ れ以上の効果を与える濃度にすることを薦める。本発明のような併用試験におい ては、上限は多くの場合低く、例えば０．１０％までにすべきである。

本発明は特に、血液、血漿および血清、またはそれらの誘導体のスクリーニング に有用である。しかしながら、抗体および感染性物質を含む他の生物！的液体に 由来する試料を試験してもよい。例えば、唾液、糞、尿、組織培養液および他の 体液またはセルラインの液体である。

本発明の一つの見地によれば、−次抗原、または二次抗原に対する抗体の検出用 キットが提供される。このキットは、二次抗原、および−次抗原に対する抗体で コートされた固形支持体、および−次抗原、および二次抗原に対する抗体の検出 用試薬を含む。コートされる実在物および検出用試薬の両方が、特に、ＨＢｓＡ ｇを一次抗原とし、モしてＨＩＶ抗原を二次抗原とする、前に特定された特定様 式を有する。このキットは場合によっては緩衝成分を含む水性懸濁液の形態か、 または凍結乾燥またはスプレー乾燥パウダーの形態で検出用試薬を含んでいてよ い。

本発明のこの見地は、請求の範囲においてより明確に定義される。以下の実施例 （１−６）は、本発明を例示する目的で提供されるものであり、この範囲に限定 されるべきではない。

実験線 方迭− ビオチン化、すべてのビオチン化は、ゲストン（Ｇｕｅｓｄｏｎ）ら（Ｊ、　Ｈ ４ｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７　（１９７９）り、１１３１−）により以前 に記述された標準的技術により、ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクンニミド（Ｂ ＮＨ５）（カルビオケム社（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）　、サンディエゴ、カリフ ォルニア州、米国）を使用して実施された。

マイクロタイタープレートのコーティング・ポリスチレン　マイクロタイタープ レートを、３段階の工程により、精製されたＨＩＶ抗原、およびＨＢｓＡｇに対 するモノクローナル抗体でコートした。第一に、ＨＢｓＡｇに対するモノクロー ナル抗体をリン酸緩衝液、Ｏ，ＬＭ、ｐＨ７，２中でコートした。４℃において １６時間インキュベート後、コーティングｆｇ液を蒸発させ、精製されたＨＩＶ 抗原を炭酸ｔｌＷＲ液、０．１Ｍ、ｐＨ９，６中でコートした。プレートを再び １２−１６時間インキュベートした後、蒸発させた。第一工程において、プレー トをブロックすることにより、イムノグロブリンおよび他の血清蛋白質の非特異 的な吸着を阻害した。ブロッキング緩衝液は０７％　子牛血清アルブミン、５％ ／ニークロース、０１％（ｗ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０　（ノグマ社（Ｓ　ｉ　ｇ ｍａ）セントルイス、ＭＯ、米国）および防腐剤を含む、Ｏ，ＬＭ　Ｔｒｉｓ、 ｐＨ−プレートのウェルに入れた。プレートをンーラーで覆い、そして３７℃に おいて６０分間インキュベートした。プレートを蒸発させ、ウェルあたり２５０ −３００μｍの洗浄緩衝液で５回洗浄した。１００μｍのビオチン化試薬（結合 体、へ）をマイクロアッセイプレートの各ウェルに添加し、そして新しいノーラ ーで覆った。次に、プレートを３７℃において６０分間インキュベートした。次 に、再びプレートを蒸発させ、そして上記のように５回洗浄した。１００μｍの ヤギ抗−ビオチン結合ＨＲＰ　（結合体Ｂ）を各ウェルに添加し、そして新しい プレートシーラーで覆った。再び、プレートを３７℃において６０分間インキュ ベートし、そして蒸発させ、そして５回洗浄した。１００μｌの基′Ｎ（過度の ○ＰＤ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを室温において暗黒下で３０分間 インキュベートした。２Ｎ　硫酸を含む１００μｌの停止液を添加し、そして発 色した色（吸収）を、４９２ｎｍにおいて６０分以内に６００−６２０ｎｍの基 準を使用してＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体をソリン社（Ｓｏｒｉｎ） （イタリア）から購入した。

高度に免疫したヤギ由来の、ＨＢ　ｓ　、Ａ、　Ｈに対するポリクローナル抗体 は標準的な技術により精製し、そしてビオチン化した。

ＨＩＶ抗原 マイクロタイタープレートのコーティングに使用されたＨＩＶ抗原（ＨＩＶ抗原 ）は、超遠心により精製された、ＨＩＶ−１に感染したＨ９細胞の溶解物に由来 した。検出用試薬中での使用のために、ビオチン化の前にセファロース抗−Ｈ９ 抗体アフィニティーカラムを通すことにより、ＨＩＶ−１精製溶解物をさらに精 製した。以下の結合体Ａの使用のため、結合しないＨＩＶ−１抗原を集め、そし てビオチン化した。最終産物は、総蛋白質に比較して、特異性の高いＨＩＶ−１ 活性を示した。セファロース抗−Ｈ９抗体アフィニティカラムは、ヒトＨ−９細 胞蛋白賀に対するヤギの抗体を、臭化シアン活性化セファ０−ス（ファルマシア 社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢＳＵｐｐｓａｌａ、スウェーデン））に共有結合 させることにより調製した。抗体は、非感染ヒトＨ−９細胞由来の免疫抗原でヤ ギを免疫化することにより調製した。ヤギは、非感染Ｈ−９細胞蛋白質に対する 力価、並びにＨ−９細胞培地に残っているかもしれない成分に対する力価を有す る抗体を生産した。そうして得られたＨＩＶ抗原はＨ−９蛋白質をほとんど完全 に欠いており、そして避けられない結果としてｇｐ４１、ｇｐ１２０、およびｇ ｐ１６０エンベロープ蛋白質の抗原決定基も欠いていた。

検出用試薬として使用されたＨＩＶ抗原　実施例１および３−６においては、ビ オチン化した組換え体ＨＩＶエンベロープ抗原（昆虫細胞において調製された、 レブリジエン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、）、ケンブリッジ、マサチュー セッツ州、米国）と混合した、ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞由来のビオチン化ＨＩＶ 抗原を、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体の検出用試薬として使用した。実施例２にお いては、ＨＩＶ抗原に対する３つの異なる検出用試薬を比較した。

ビオチン化された、ＨＢｓＡｇに対する抗体、およびビオチン化したＨＩＶ抗原 を、Ｑ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５％　Ｔｗｅｅｎ ２０．０．０４％　硫酸デキストラン、５％　子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、 酸化防止剤として０．　５％　４−ツメチルアミノアンチピリン（ＤＡＰ）　、 ２０％　正常ヤギ血清および５％　正常ヒト血清を含む水性溶媒中に溶解した混 合物（結合体Ａ）として使用した。

抗−ビオチン抗体： ホースラディッノユ　パーオキシダーゼで標識したヤギ抗−ビオチン抗体は、ジ ムド社（Ｚｙｍｅｄ　Ｃｏｒｐ、）（サウス　フラッジスコ、ＣＡ、　、米国） から購入し、そしてアッセイの間、プレートに結合したビオチンと複合体を形成 した。この抗体を前節の同じ組成物のＴｒｉｓｍ衡希釈液中で使用した。

ＨＲＰ基質、オルト−フェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）を、リン酸カリウム、ク エン酸ナトリウムおよび過酸化水素水を含むｐＨ５，０の緩衝液に溶解した。

洗浄緩衝液　リン酸ナトリウムで緩衝した食塩水で、界面活性剤を含む。

硫酸デキストラン　シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）（セントルイス、Ｍｏ、、 米国）から購入した。

実施例１ 本発明の併用アッセイと、ＨＢｓＡｇに特異性を有するファルマンア社のＨＢｓ Ａｇ　ＥＬＩＳＡアッセイ（ファルマノア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）、コロンビア、Ｍｄ　１米ｉ）とを比較した。アッセ イの性能試験は、既知量のＨＢ　Ｓ　Ａ　ｇ分析物を含むが、ＨＩＶ抗体に関し て陰性の血清試料の２倍希釈液を使用して比較された。測定された吸収を以下の 表１に示す。市販されているファルマシア社のＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳＡアッセイ は、マイクロタイタープレートのウェル上の、ＨＢｓ、Ａｇに対するモノクロー ナル抗体を利用することにより、試料中のＨＢｓＡｇを捕まえる。ＨＢｓＡｇに 対するポリクローナル抗体（ヤギ）を含む単一の結合体を化学的にホースラディ ッノユパーオキシダーゼとカップリングし、そして検出用試薬として利用するこ とにより、試料中の捕まえたＨＢｓ　Ａｇを定量する。

表１ ＨＢ　ｓ　、Ａ　ｇ陽性試料（ボール　エリッヒ研究所（ＰＡＬ″Ｌ　ＥＲＬＩ ＣＨｌＮ５ＴＩＴＵＴＥ）のＨＢｓＡｇスタンダード）の２倍希釈液を用いた、 ファルマノア社のＨＢｓ、Ａｇ　ＥＬＩＳ、Ａアッセイ対ＨＩＶ／肝炎つィルス 併用ＥＬＩＳＡ（本発明） ＨＢｓＡｇｌ１度　吸収　吸収 ｎｇ／ｍｌ　ＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳ、Ａ　本発明２、　５０　２．　１０１　２ ．　５３０１、　２５　０．　９０９　１．　６４６０、　６２　０．　６３１ 　０．８２４０、　３１　０．　２０５　０．　３６５０、　１６　０．　１２ １　０．　２６９０．００　領０３０　領０４５ 表１のデータが証明することは、本発明のアッセイにより得られた吸収がファル マシア社のＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳＡアッセイにより得られた吸収よりも一貫して 大きかったことである。試験されたすべての濃度、即ち２．５ｎｇ／ｍｌから０ ．１６ｎｇ／ｍｌまで吸収が一貫して大きかった。このことが示すことは、本発 明のアッセイが、ファルマシア社のＨＢｓＡｇ　ＥＬＩＳＡアッセイに比較して 、これらの試料中のＨＢｓＡｇを検出する感度が同等かまたは優れていること使 用する検出用試薬の異なる３つのアッセイフォーマドを評価した。感染したヒト Ｈ９Ｔセルライン由来のＨＩＶ抗原をマイクロタイタープレート上にコートして ３つ全部を評価した。検出用試薬は、（ａ）ＨＩＶ抗原白来のビオチン化Ｈ９細 胞（即ち、プレートをコーティングしたのと同じ）、（ｂ）Ｈ１〜′に感染した ＴセルラインＭＯＬＴ３由来のビオチン化ＨＩＶ抗原、そして（Ｃ）ビオチン化 された組換え体ＨＩＶ抗原（レブリジェン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ）、ケンブリッジ、マサチニーセッツ、米国、から購入し、そして昆 虫セルライン、スポドプテラ　フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇ ｉｐｅｒｄａ）により産生されたｇｐ１６０）であった。２つの既知の陽性試料 を試験した。１つの陽性試料は、ウェスタンプロットにおいてすべての主要バン ド、例えばｐ１８．ｐ２４．ｐ３２．ｇｐ４１．ｐ５１．ｐ５５．ｐ６６゜ｇｐ １２０およびｇｐ１６０を示した。他方の陽性試料は、ウェスタンプロットにお けるｐ２４のバンドが明らかに不在だったことから、ｐ２４に対する抗体を低レ ベルで含んでいた。これは一般的には、進行したエイズ患者におけるｐ２４抗原 の生産の増加、およびｐ２４抗原　抗体の複合体の形成を基に説明される。

過剰のｐ２４抗原と複合した抗体は、ウニスタンプロット上でｐ２４抗原と結合 させるために利用できないので、ｐ２４のバンドが存在しなかった。さらに、フ ァルマンア社ＶＩＲＧＯ（商標名）のＨＩＶ−Ｉ　ＥＬＩＳＡアッセイにおいて 高い非特異的シグナルを引き起こすことが知られている、６つのＨＩＶ陰性試料 を試験した。結果を以下の表２に示す。値は４９２ｎｍにおける吸収のユニット を示す。

表２ Ｈ９結合体　ＭＯＬＴ結合体　組換え体結合体陽性試料　１．３０８　１．１８ ９　１．２００ｐ２４抗体が 少ない陽性抗体　０．９６３　０．６６６　０．９６６陰性試料１　０．６１９ 　０．０２９　０．０４３陰性試料２　０．６６３　０．０２４　０．０３１陰 性試料６　０．７０１　０．０２５　０．０２９陰性試料７　０．７５４　０． ０２５　０．０２５陰性試料８　０．８２６　０．０２４　０．０３１陰性試料 ９　０．６６８　０．０２８　０．０８２２つの既知の陽性試料は、３つすべて の検出用試薬と強く反応した。しかしながら、「問題の」陰性試薬は、ＭＯＬＴ −３由来のビオチン化ＨＩ〜′抗原、またはビオチン化組換え体ＨＩＶ抗原を検 出用試薬として使用した場合に、ビオチン化Ｈ９由来のＨＩＶ抗原と比較して顕 著に低下した非特異的シグナルを与えた。

「ノイズ」中のこの顕著なドロップ、または非特異的なバックグラウンドは、本 発明の結果としての特異性の改良を示す。

実施例３、 本発明のアッセイと、ファルマノア社ＨＢｓ、Ａｇ　ＥＬＩＳＡアッセイを比較 した（実施レイ１を参照）。試験された試料は、存在するＨＢｓＡｇ　（１−５ ゜７−９．１ｌ−１３）と反応性であること、または非反応性（６，１０）であ ることが知られている、希釈されたヒト血清の放出パスルからなった。表３に挙 げられた吸収の測定値が示すことは、本発明のアッセイが、これら試料中のＨＢ ｓＡｇの検出において比較しうるちのであるかまたはより優れているものである 感度を有するということである。）（ＢｓＡｇに陰性の試料６および１０は、本 発明の併用アッセイにおいて非反応性である。

表３： 吸収　吸収 １３　３゜１７７　２．８９３ 実施例４： 本発明の併用アッセイと、アボット社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡテスト（アボット社（ 、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、）、北シカゴ、イリノイ、米国） とを、感度を評価するために比較した。アボット社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡテストは 、Ｈ９細胞由来のＨＩＶ抗原を１／４ポリスチレンビーズ上にコートして利用す ることにより、試料中のＨＩＶ抗体を捕まえる、標準的な「サンドウィッチ」ア ッセイである。捕まえられた抗体（もし存在するのならば）は、パーオキシダー ゼ酵素にカップリングしたヤギ抗−ヒトＩｇＧからなる酵素結合体の使用により 検出される。陽性の強いヒト血清を陰性血清プール（ｐｏｏｌ）中で連続的に希 釈しく１：３：９・２７　：　８１　：　２４３　＋　７２９　：　２１８７） 　、そして各希釈液に関して両アッセイで試験した。測定された吸収を表５に示 す。二の結果は、本発明の併用アッセイが、実際のＨ１〜′陽性ヒト血清中の低 レベルのＨＩＶ−１抗体の測定において、市販のアボット社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡ テストより感度が高いことを示す。

表４ ファルマンア社ＨＩＶ／肝炎併用アッセイ対アボット社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡアッ セイの、連続希釈液の比較ファルマシア社ＨＩＶ／　アボット社ＨＩＶ−１１： ３　３．２　３．３ １：９　３．２　３．０ １：２７　３．２　２．４ １：８１　２．４　１．２ １：２４３　１．　２　０．　６ １ニア２９　ｏ、８　０．　２ １：２１８７　ｏ、６　０．　１ 実施例５ 本発明のアッセイと、ＨＩ　Ｖに対する抗体のための市販されている試験である 、ファルマンア社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＬＩＳＡアッセイ（ファルマノア社（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、コロンビア、Ｍｄ、　、米国）を比較 した。

このアッセイは、Ｈ９細胞由来のＨＩＶ抗原をマイクロタイタープレートにコー トして利用することにより、試料中のＨＩＶ抗体を補まえる、標準的な「サンド ウィッチ」フォーマットである。捕まえられた抗体（もし存在するのならば）は 、パーオキシダーゼ酵素に共有結合した（ヤギ）抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖士り鎖） ポリクローナル抗体からなる酵素結合体を使用することにより検出される。陽性 の強いヒト血清を陰性血清プール（ｐｏｏｌ）中で連続的に希釈しく１３９２７ ８１・２４３　：　７２９　：　２１８７）　、そして各希釈液に関して両アッ セイで試験した。測定された吸収を表６に示す。この結果は、本発明の併用アッ セイが、実際のＨＩ　Ｖ陽性ヒト血清中の低レベルのＨＩＶ−１抗体の測定にお いて、市販のファルマノア社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡテストより感度が高いことを示 す。

表５ ファルマシア社ＨＩＶ／肝炎併用アッセイ対ファルマ／ア社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＩＡ アンセイの連続希釈液の比較ファルマノア社ＨＩＶ／　ファルマンア社ＨＩＶ− １１・２７　３．　２　３．　２ １：８１　３．１　２．１ １：２４３　３．　０　１．　３ １ニア２９　２．　９　０．　３ １：２１８７　２．０　０．２ 実施例６： 本発明のアッセイと、ファルマ／ア社ＨＩＶ−Ｉ　ＥＬＩＳＡアッセイとを比較 した（実施例５参照）。この実験の目的は、ＨＩＶに対する抗体に陽性のさまざ まな試料を研究し、そして抗体が検出されつる、もっとも高い希釈液を測定する ことである。各試料の検出可能なもっとも高い希釈液をを表６に示す。このデー タから、本発明のアッセイが市販のアッセイ法よりも、より希釈度の高い抗体を 検出できることが示された。

表６ ＨＩ　Ｖ抗体の希釈液の検出 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）二次抗原、および一次抗原に対する抗体がコートされた固形支持体に 試料を接触させることにより、上記一次抗原、および上記二次抗原に対する抗体 が試料中に存在する場合は、それらを固形支持体上にコートされたそれぞれの免 疫反応相手と結合させ（複合体を作らせる）；（ｂ）固形支持体上にコートされ た二次抗原により結合した抗体の検出用試薬の形で二次抗原を添加するが、その 際、上記の添加した二次抗原と、工程（ａ）の固形支持体に結合した上記二次抗 原に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成するような条件下で添加を実施し； （ｃ）固形支持体上にコートされた抗体により結合した一次抗原の検出用試薬の 形で上記一次抗原に対する抗体を添加するが、その際、上記の添加した一次抗体 と、工程（ａ）の固形支持体に結合した一次抗原との間で免疫複合体を形成する ような条件下で添加を実施し；（ｄ）試料中の一次抗原および／または二次抗原 に対する抗体の存在、不在、または量を測定するために、工程（ｂ）および（ｃ ）で形成された免疫複合体の存在、不在、または量を測定する工程よりなるが、 その際、固形支持体上にコートされた二次抗原が、第一の起源に由来する抗原を 含み、そして検出用試薬として使用された二次抗原が、第二の起源に由来する抗 原を含み、第一の抗原と第二の抗原が異なる、試料中の一次抗原、および／また は二次抗原に対する抗体の存在、不在、または量を測定するための、併用イムノ アッセイ。
2. ２．起源が、二次抗原を発現する２つの異なるセルラインである、請求項１記載 のイムノアッセイ。
3. ３．二次抗原がウイルス抗原であり、そしてセルラインが（ｉ）ウイルスに感染 したセルラインおよび（ｉｉ）抗原を発現する組換え体宿主セルラインである、 請求項２記載のイムノアッセイ。
4. ４．セルラインの一方が、決められた宿主の組換え体セルラインであり、他方の セルラインが、異なる宿主の組換え体セルラインである、請求項３記載のイムノ アッセイ。
5. ５．セルラインの一方が昆虫の宿主のセルラインであり、他方のセルラインが大 腸菌宿主のセルラインである、請求項４記載のイムノアッセイ。
6. ６．二次抗原がＨＩＶ抗原であり、一次抗原が肝炎ウイルス抗原である、請求項 １記載のイムノアッセイ。
7. ７．一次抗原がＨＢｓＡｇである、請求項６記載のイムノアッセイ。
8. ８．工程（ｂ）および（ｃ）それぞれにおいて添加される二次抗原、および一次 抗原に対する抗体がビオチン化されており、ビオチン結合基質を工程（ｄ）にお いて添加することにより、工程（ｂ）および（ｃ）において固形支持体に結合し ているビオチン化試薬と複合体を形成させ、そしてビオチンと固形支持体上のビ オチン結合基質との間の複合体の存在、不在、または量を検出することにより、 一次抗原および／または二次抗原に対する抗体の存在、不在、または量を測定す ることを特徴とする、請求項１記載のイムノアッセイ。
9. ９．添加されるビオチン結合基質が、マーカーで標識された抗一ビオチン抗体で ある、請求項８記載のイムノアッセイ。
10. １０．（ａ）二次抗原、および一次抗原に対する抗体がコートされた固形支持体 に試料を接触させることにより、上記一次抗原、および上記二次抗原に対する抗 体が試料中に存在する場合は、それらを固形支持体上にコートされたそれぞれの 免疫反応相手と結合させ（複合体を作らせる）；（ｂ）検出用試薬としてビオチ ン化二次抗原を添加するが、上記ビオチン化二次抗原と工程（ａ）において固形 支持体に結合した上記二次抗原に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成するよ うな条件下で行い：（ｃ）検出用試薬として上記一次抗原に対するビオチン化抗 体を添加するが、上記ビオチン化抗体と工程（ａ）において固形支持体に結合し た上記一次抗原との間で免疫複合体を形成するような条件下で行い；（ｄ）工程 （ｂ）および（ｃ）において形成された免疫複合体の存在、不在、または量を測 定するが、 （ｄ１）マーカー標識されたビオチン結合基質を、工程（ｂ）および（ｃ）の支 持体に結合したビオチン化試薬との複合体に添加し、そして（ｄ２）一次抗原、 および／または二次抗原に対する抗体の存在、不在、または量を測定するために 、ビオチンと固形支持体上のビオチン結合基質の複合体の存在、不在、または量 を検出することにより行う工程からなる、 試料中の一次抗原、および／または二次抗原に対する抗体の存在、不在、または 量を測定するための、併用イムノアッセイ。
11. １１．固形支持体上にコートされる二次抗原が、第一の起源由来の抗原を含み、 そして検出用試薬として使用される二次抗原が、第二の起源に由来の抗原を含み 、第一の起源と第二の起源が異なる、請求項１０記載のイムノアッセイ。
12. １２．起源が、二次抗原を発現する２つの異なるセルラインである、請求項１１ 記載のイムノアッセイ。
13. １３．二次抗原がウイルス抗原であり、そしてセルラインが（ｉ）ウイルスに感 染したセルラインおよび（ｉｉ）抗原を発現する組換え体宿主セルラインである 、請求項１２記載のイムノアッセイ。
14. １４．セルラインの一方が、決められた宿主の組換え体セルラインであり、他方 のセルラインが、異なる宿主の組換え体セルラインである、請求項１３記載のイ ムノアッセイ。
15. １５．セルラインの一方が昆虫の宿主のセルラインであり、他方のセルラインが 大腸菌宿主のセルラインである、請求項１４記載のイムノアッセイ。
16. １６．二次抗原がＨＩＶ抗原であり、一次抗原が肝炎ウイルス抗原である、請求 項１０記載のイムノアッセイ。
17. １７．一次抗原がＨＢｓＡｇである、請求項１６記載のイムノアッセイ。
18. １８．工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１０記載 のイムノアッセイ。
19. １９．工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１記載の イムノアッセイ。
20. ２０．二次抗原がＨＩＶ抗原であり、そしてセルラインが、ＨＩＶに感染した、 それぞれＨ９およびＭＯＬＴ−３である、請求項１２記載のイムノアッセイ。
21. ２１．二次抗原がＨＩＶ抗原であり、そしてセルラインが、ＨＩＶに感染した、 それぞれＨ９およびＭＯＬＴ−３である、請求項３記載のイムノアッセイ。
22. ２２．支持体上にコートされるか、または検出用試薬として使用されるＨＩＶ抗 原がｇｐ１６０である、請求項６記載のイムノアッセイ。
23. ２３．二次抗原がＨＩＶ抗原であり、そして組換え体セルラインの一方がｇｐ１ ６０を発現する、請求項４記載のイムノアッセイ。
24. ２４．二次抗原が、２つまたはそれ以上の起源に由来するＨＩＶ抗原の混合物で あり、そして一次抗原がＨＢｓＡｇである、請求項１記載のイムノアッセイ。
25. ２５．二次抗原が、２つまたはそれ以上の起源に由来するＨＩＶ抗原の混合物で あり、そして一次抗原がＨＢｓＡｇである、請求項１０記載のイムノアッセイ。