发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种高效、可靠的用于抗原抗体联合检测的均相免疫检测方法,该方法在至少两个检测区域中判断是否存在含有待测抗原和/或待测抗体的复合物的存在,解决了均相免疫分析方法中抗原抗体联合检测时不能区分阳性结果是抗体阳性或抗原阳性的问题。
为此,本发明在第一方面提供了一种均相免疫检测方法,其包括至少两个检测区域,在一个检测区域判断是否存在由供体-待检抗体-受体所形成的第一复合物,而在另一个检测区域判断是否存在由供体-待检抗原-受体所形成的第二复合物;其中,所述供体能够在激发状态下生成单线态氧,所述受体能与单线态氧反应产生可检测的信号。
根据本发明,当检测区域存在第一复合物和/或第二复合物时,用能量或者活性化合物激发供体产生单线态氧,所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施方式中,所述待检抗体选自与待检抗原特异性结合的完整抗体或基因工程化的抗体片段。
在本发明的另一些实施方式中,所述待检抗原选自多种不同病毒类型的抗原;在本发明的一些具体实施例中,所述待检抗原选自同一被分析物的不同亚型、亚亚型或流行重组型的抗原。
在本发明的一些实施方式中,所述受体和待检抗体通过标记抗原相连接;所述供体和待检抗体通过中间抗原相连接;所述标记抗原和中间抗原能够与待检抗体的不同表位特异性结合。
在本发明的一些具体实施例中,所述供体和中间抗原通过生物素-链霉亲和素的相互作用连接。
在本发明的一些实施方式中,所述受体和待检抗原通过标记抗体相连接;所述供体和待检抗原通过中间抗体相连接;所述标记抗体和中间抗体能够与待检抗原的不同表位特异性结合。
在本发明的一些具体实施例中,所述供体和中间抗体通过生物素-链霉亲和素的相互作用连接。
在本发明的一些实施例中,所述标记抗体为单克隆抗体。
在本发明的另一些实施例中,所述中间抗体为多克隆抗体。
根据本发明,所述方法在一个检测区域准备第一组合物,并判断第一组合物中是否存在由供体-待检抗体-受体所形成的第一复合物;在另一个检测区域准备第二组合物,并判断第二组合物中是否存在由供体-待检抗原-受体所形成的第二复合物;
其中,所述第一组合物包含:待检样本;与标记抗原结合的受体;中间抗原;供体;所述标记抗原和中间抗原能够与待检抗体的不同表位特异性结合;
所述第二组合物包含:待检样本;与标记抗体结合的受体;中间抗体;供体;所述标记抗体和中间抗体能够与待检抗体的不同表位特异性结合。
本发明所述方法中,在两个检测区域分别判断第一复合物和/或第二复合物的顺序是不分先后,可以根据实际需要选择优先判断哪个区域或者同时判断至少两个区域。
在本发明的一些具体实施例中,所述第一组合物包含:待检样本;与标记抗原结合的受体;中间抗原以及与之结合的第一特异性结合配对成员对的一员;供体以及与之结合的第一特异性结合配对成员对的另一员;所述标记抗原和中间抗原能够与待检抗体的不同表位特异性结合。所述第二组合物包含:待检样本;与标记抗体结合的受体;中间抗体以及与之结合的第二特异性结合配对成员对的一员;供体以及与之结合的第二特异性结合配对成员对的另一员,所述标记抗体和中间抗体能够与待检抗体的不同表位特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述方法具体包括以下步骤:
步骤S1,在一个反应区域准备第三组合物,所述第三组合物包含:待检样本、与标记抗原结合的受体以及中间抗原;在另一个反应区域准备第四组合物,所述第四组合物包含:待检样本、与标记抗体结合的受体以及中间抗体;该步骤中在两个反应区域分别准确第三组合物和第四组合物的顺序不分先后;
步骤S2,将供体加入到第三组合物中,获得第一组合物;将供体加入到第四组合物中,获得第二组合物;
步骤S3,将第一组合物和第二组合物分别送到检测区域,然后用能量或者活性化合物接触检测区域,激发供体产生单线态氧;当存在第一复合物和/或第二复合物时,所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号;
步骤S4,检测所述化学发光信号,判断待检样本中是否存在待检抗体和/或待检抗原以及待检抗体和/或待检抗原的含量或浓度。
在本发明的一些具体实施例中,所述方法具体包括以下步骤:
步骤S1,在一个反应区域准备第三组合物,所述第三组合物包含:待检样本、与标记抗原结合的受体、与第一特异性结合配对成员中的一员结合的中间抗原;在另一个反应区域准备第四组合物,所述第四组合物包含:待检样本、与标记抗体结合的受体、与第二特异性结合配对成员中的一员结合的中间抗体;该步骤中在两个反应区域的加样顺序不分先后;
步骤S2,将与第一特异性结合配对成员中的另一员结合的供体加入到第三组合物中,获得第一组合物;将与第二特异性结合配对成员中的另一员结合的供体加入到第四组合物中,获得第二组合物;同样地,该步骤中在两个反应区域的加样顺序也不分先后;
步骤S3,将第一组合物和第二组合物分别送到检测区域,然后用能量或者活性化合物接触检测区域,激发供体产生单线态氧;当存在第一复合物和/或第二复合物时,所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号;
步骤S4,检测所述化学发光信号值,判断待检样本中是否存在待检抗体和/或待检抗原;其中,信号值的存在表明待检样本中存在待检抗原或待检抗体,而信号值的强度与待检抗原或待检抗体的含量和浓度呈正相关。
在本发明的一些优选实施方式中,所述第一组合物中的待检样本在加入第一组合物前预先用稀释液进行稀释,形成稀释的待检样本。本发明的方法通过在两个检测区域内加入不同的样本量来缓解高浓度抗体样本在一步法中的HOOK问题和提高低浓度抗原样本的检测灵敏度问题。
根据本发明,所述稀释的待检样本的体积稀释倍数为1:(4-20),优选为1:(6-16),更优选为1:(8-14)。本发明中对用于稀释待检样本的稀释液没有特别限制,一个非限制性的稀释液的例子可以是pH值为7.35-7.45的PBST缓冲液。
根据本发明,当第一组合物的化学发光信号值≥抗体阳性样本的临界值时,则待检样本为抗体阳性样本;当第一组合物的化学发光信号值<抗体阳性样本的临界时,则待检样本为抗体阴性样本。
根据本发明,当第二组合物的化学发光信号值≥抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为抗原阳性样本;当第二组合物的化学发光信号值<抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为抗原阴性样本。
本发明中,用语“抗体阳性样本的临界值”为标定好的抗体阳性对照品,在相同条件下进行检测时的发光信号值;用语“抗原阳性样本的临界值”为标定好的抗原阳性对照品,在相同条件下进行检测时的发光信号值。
在本发明的一些具体实施例中,所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物,
在本发明的一些具体实施例中,所用试剂均为非粒子化试剂,且可溶于含水介质中。
在本发明的另一些具体实施例中,所述供体和/或受体被包被在基体上形成粒子化的供体微球和/或受体微球。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法在病毒感染的血清诊断中抗原和抗体联合检测中的应用。
进一步地,本发明提供了一种如本发明第一方面所述的方法在HIV抗原和抗体联合检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中,该应用所采用的标记抗原和中间抗原均包括HIVgp41型抗原和HIV gp36型抗原;
所采用的标记抗体为抗HIV p24型抗原的单克隆抗体;
所采用的中间抗体为抗HIV p24型抗原的多克隆抗体;
本发明所述方法在至少两个检测区域中判断是否存在含有待测抗原和/或待测抗体的复合物的存在,解决了均相免疫分析方法中抗原抗体联合检测时不能区分阳性结果是抗体阳性或抗原阳性的问题。此外,通过加入不同的样本量,具体为在高浓度抗体样本的检测区域内加入稀释的待检样本,在低浓度抗原样本的检测区域内加入未稀释的待检样本,又进一步解决了抗原抗体一步法检测中的高浓度样本HOOK效应问题和低浓度样本检测灵敏度偏低问题。本发明所述方法特别适用于HIV抗原和抗体的联合检测中。
具体实施方式
为使本发明容易理解,下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前,应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解,本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式,而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”,其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待检样本”是指可能含有被分析物的一种混合物,被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待检样本包括体液,如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液等。
本发明所述用语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广含义使用,包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白,保留对抗原的特异性结合的抗体片段,包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下,抗体可以进一步与其它部分,诸如特异性结合配对成员,例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“单克隆抗体”是指由单克隆的B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白,其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“多克隆抗体”是指由一个以上的B淋巴细胞克隆产生的免疫球蛋白集合,其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合,发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用,包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子,它们能够相互特异性结合,例如,酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员对的例子是生物素-链霉亲和素系统,其中“生物素”广泛存在于动植物组织中,其分子上有两个环状结构,分别为咪唑酮环和噻吩环,其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等;而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成,其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子,从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。
在任何需要的情况下,本发明中所用的任何试剂,包括抗原、抗体、受体或供体,可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员,例如:所述第一组合物包含生物素标记的中间抗原和链霉亲和素标记的供体;又例如:所述第二组合物包含生物素标记的中间抗体和链霉亲和素标记的供体。
本发明所述用语“检测区域”是指能够提供检测本发明所述复合物以及其他免疫反应的结果的区域,例如可以是化学发光检测仪中提供光学检测的部位。同一个化学发光检测仪中的光学检测部位可以根据实际需要区分为一个或多个检测区域。
本发明所述用语“反应区域”是指化学反应或免疫反应发生的场所。本发明所述“反应区域”同所述“检测区域”可以是同一个位置,也可以是不同的位置。
本发明所述“检测区域”以及“反应区域”的尺寸和形状包括各种大小、各种形状的任何可以实现的几何结构,例如:试管、微孔板。
本发明所述“检测区域”以及“反应区域”的数量也不限于两个,它们均可以根据实际需要设置相应的多个检测区域和/或反应区域以同时对多个待检样本进行检测。
本发明所述用语“供体”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。
在本发明一些具体实施例中,所述供体是光敏剂,所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂,优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物,其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物,以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物,所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用,例如美国专利US6406913中记载的内容,该专利文献并入本文以供参考。
在本发明另一些具体实施例中,所述供体是化学活化的其他敏化剂,其非限定性的例子是某些化合物,它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括:1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等,加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。
本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧,该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获,从而传递能量以激活所述受体。
在本发明的一些具体实施例中,所述受体是这样的物质:其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体,所述亚稳态中间体可以分解,同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于:烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑或光泽精。
在本发明的另一些具体实施例中,所述受体是能够与单线态氧反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷的烯烃类;可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷;可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类;可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类,诸如鲁米诺;和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。可以根据本公开和要求保护的发明利用的受体的具体的、非限制性实例记载于美国专利号US5340716(该专利文献在此全文引为参考)。
在本发明另一些具体实施例中,所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物,其是非粒子化的且可溶于含水介质中,这种受体的制备方法可参见专利PCT/US2010/025433(该专利文献在此全文引为参考)。
在本发明另一些具体实施例中,所述“供体”和/或“受体”可以通过功能基团被包被在基体上形成“供体微球”和/或“受体微球”。本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒,其可以是任何尺寸的,其可以是有机的或是无机的,其可以是可膨胀或不可膨胀的,其可以是多孔的或非多孔的,其具有任何密度,但优选具有和水接近的密度,优选能漂浮于水中,且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷,当带有电荷时,优选是负电荷。所述基体可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。基体通常具有多功能性,或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到供体或受体上。有许多官能团是可用的或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。适用于本发明的基体的一个非限制性的例子是羧基改性的乳胶颗粒。这种基体的详细情况可参见美国专利US5709994与US5780646(这两篇专利文献在此全文引为参考)。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中,表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团,例如但不限于:氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中,表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
Ⅱ.实施例
如前所述目前采用均相免疫检测方法进行抗原抗体联合检测时,由于无法区分阳性信号值是由抗原引起还是由抗体引起,从而不能准确判断病程,无法给临床治疗提供可靠的信息。本申请的发明人通过采用两个检测区域对抗原抗体进行联合检测,在其中一个检测区域进行待测抗体的检测,同时在另一个检测区域进行待测抗原的检测,解决了采用均相免疫检测方法进行抗原抗体联合检测时不能区分阳性结果是抗体阳性或抗原阳性问题。另外,针对现有的抗原抗体一步法检测中存在的高值抗体阳性样本HOOK效应和低值抗原阳性样本检测灵敏度低的问题,本申请的发明人通过在高值抗体样本的检测区域内加入将稀释后的待检样本,进而降低抗体在待检液中的浓度,解决高值抗体样本的HOOK效应问题;另外,在低值抗原样本的检测区域内加入未经稀释的待检样本,不降低抗原在待检液中的浓度,以避免为了降低高值抗体样本的HOOK效应所带来的低值抗原样本检测灵敏度偏低的问题。本发明正是基于上述方法作出的。
因此,本发明第一方面所涉及的均相免疫检测方法进行抗原抗体联合检测时所采用的试剂包括:
(a)样本稀释液;
(b)与标记抗原结合的受体溶液,所述受体能与单线态氧反应生成检测信号,所述标记抗原能够与所述待检样本中的待检抗体特异性结合;
(c)中间抗原溶液,所述中间抗原能够与所述待检样本中的待检抗体特异性结合;
(d)供体溶液,所述供体能在激发状态下能生成单线态氧;
(e)与标记抗体结合的受体溶液,所述受体能与单线态氧反应生成检测信号,所述标记抗体能够与所述待检样本中的待检抗原特异性结合;
(f)中间抗体溶液,所述中间抗体能够与所述待检样本中的待检抗原特异性结合;
(g)供体溶液,所述供体能在激发状态下能生成单线态氧。
上述试剂根据实际需要,供体与受体、中间抗原与中间抗体均可以与生物素或链霉亲和素中的任一种相连,从而通过“特异性结合配对成员”之间的特异性相互作用而实现两个分子间的连接。另外,所述试剂中的供体和受体可以被包被在基体上形成粒子化的供体微球和受体微球,其也可以是非粒子化的试剂,可溶于含水介质中。
在本发明的一些具体实施例中,所涉及的均相免疫检测方法进行抗原抗体联合检测时所采用的试剂包括:
(a)样本稀释液;
(b)与标记抗原结合的受体微球溶液,所述受体微球能与单线态氧反应生成检测信号,所述标记抗原能够与所述待检样本中的待检抗体特异性结合;
(c)生物素标记的中间抗原溶液,所述中间抗原能够与所述待检样本中的待检抗体特异性结合;
(d)链霉亲和素标记的供体微球溶液,所述供体微球能在激发状态下能生成单线态氧;
(e)与标记抗体结合的受体微球溶液,所述受体微球能与单线态氧反应生成检测信号,所述标记抗体能够与所述待检样本中的待检抗原特异性结合;
(f)生物素标记的中间抗体溶液,所述中间抗体能够与所述待检样本中的待检抗原特异性结合;
(g)链霉亲和素标记的供体微球溶液,所述供体微球能在激发状态下能生成单线态氧。
具体地,利用上述试剂采用均相免疫方法对抗原抗体进行联合检测的方法为:在一个检测区域判断是否存在由供体-待检抗体-受体所形成的第一复合物,而在另一个检测区域判断是否存在由供体-待检抗原-受体所形成的第二复合物;其中,所述供体能够在激发状态下生成单线态氧,所述受体能与单线态氧反应产生可检测的信号。
更具体地,利用上述试剂采用均相免疫方法对抗原抗体进行联合检测的方法为:其在一个检测区域准备第一组合物,并判断第一组合物中是否存在由供体-待检抗体-受体所形成的第一复合物;在另一个检测区域准备第二组合物,并判断第二组合物中是否存在由供体-待检抗原-受体所形成的第二复合物;其中,所述第一组合物包含:待检样本;与标记抗原结合的受体;中间抗原;供体;所述标记抗原和中间抗原能够与待检抗体的不同表位特异性结合;所述第二组合物包含:待检样本;与标记抗体结合的受体;中间抗体;供体;所述标记抗体和中间抗体能够与待检抗体的不同表位特异性结合。
再具体地,利用上述试剂采用均相免疫方法对抗原抗体进行联合检测的方法,包括以下步骤:
步骤S1,在一个反应区域准备第三组合物,所述第三组合物包含:待检样本、与标记抗原结合的受体以及中间抗原;在另一个反应区域准备第四组合物,所述第四组合物包含:待检样本、与标记抗体结合的受体以及中间抗体;
步骤S2,将供体加入到第三组合物中,获得第一组合物;将供体加入到第四组合物中,获得第二组合物;
步骤S3,将第一组合物和第二组合物分别送到检测区域,然后用能量或者活性化合物分别接触检测区域,激发供体产生单线态氧;当存在第一复合物和/或第二复合物时,所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号;
步骤S4,检测所述化学发光信号,判断待检样本中是否存在待检抗体和/或待检抗原以及待检抗体和/或待检抗原的含量和浓度。
本发明所述方法中,所有试剂组合后,均可以根据需要进行混匀和/或温育。具体地,所述温育的温度可以是35-45℃,时间可以是10-20min;优选地,所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃;温育的时间可以选自12min、15min、16min或18min。
在本发明的另一些优选的实施方式中,与第一特异性结合配对成员中的一员结合的中间抗原的溶液的浓度可以是(0.3-0.8)μg/mL;优选地,其浓度可以选自0.32、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75或0.78μg/mL;进一步优选地,其浓度为0.5μg/mL。
在本发明的另一些优选的实施方式中,与第二特异性结合配对成员中的一员结合的中间抗体的溶液的浓度可以为(0.3-0.8)μg/mL;优选地,其浓度可以选自0.32、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75或0.78μg/mL;进一步优选地,其浓度为0.5μg/mL。
在本发明的一些具体实施例中,采用波长为680nm的光激发供体生成单线态氧;当存在第一复合物和/或第二复合物时,所述受体能够与单线态氧反应产生615nm波长的化学发光信号;所述化学发光信号的强度与待检抗体或待检抗原的含量和浓度成正相关。
特别地,一个利用上述试剂采用均相免疫方法对抗原抗体进行联合检测的具体实施例,其包括以下步骤:
S0,利用样本稀释液对待检样本进行1:(4-20)的体积稀释,获得稀释后的待检样本;
S1,将稀释后的待检样本、与标记抗原结合的受体微球溶液和浓度为0.3-0.8μg/mL的生物素标记的中间抗原溶液加入到一个反应区域内混匀,在35-40℃下温育10-20min后,获得第三组合物;将未稀释的待检样本、与标记抗体结合的受体微球和浓度为0.3-0.8μg/mL的生物素标记的中间抗体溶液加入到另一个反应区域内混匀,在35-40℃下温育10-20min后,获得第四组合物;
S2,将链霉亲和素标记的供体微球溶液加入到第三组合物内,在35-40℃下继续温育10-20min后,获得第一组合物;将链霉亲和素标记的供体微球溶液加入到第四组合物内,在35-40℃下继续温育10-20min后,获得第二组合物;
S3,在检测区域采用波长为680nm的光分别处理第一组合物和第二组合物,激发其中所述供体微球产生单线态氧;当存在第一复合物和/或第二复合物时,所述受体微球能够与单线态氧反应产生615nm波长的化学发光信号;
S4,分别检测所述第一组合物和第二组合物的化学发光信号值,判断待检样本中是否存在待检抗体和/或待检抗原。其中,信号的存在表明待检样本中存在待检抗原或待检抗体,而信号值的强度与待检抗原或待检抗体的含量和浓度呈正相关。
具体的,所述的判断标准为:
当第一组合物的化学发光信号值≥抗体阳性样本的临界值时,则待检样本为抗体阳性样本;当第一组合物的化学发光信号值<抗体阳性样本的临界时,则待检样本为抗体阴性样本。
当第二组合物的化学发光信号值≥抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为抗原阳性样本;当第二组合物的化学发光信号值<抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为抗原阴性样本。
本发明第二方面涉及一种如本发明第一方面所述的方法在病毒感染的血清诊断中抗原和抗体联合检测中的应用。
进一步地,本发明涉及一种如本发明第一方面所述的方法在的HIV抗原和抗体检测中的应用;该应用中所采用的试剂包括:
样本稀释液;
与HIV gp41型抗原结合的受体微球和HIV gp36型抗原结合的受体微球的混合溶液;
生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIV gp36型抗原的混合溶液;
与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体微球溶液;
生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液;
链霉亲和素标记的供体微球溶液。
上述应用中,对HIV抗原和抗体检测的判断标准为:
当第一组合物的化学发光信号值≥HIV抗体阳性样本的临界值时,则待检样本为HIV抗体阳性样本;当第一组合物的化学发光信号值<HIV抗体阳性样本的临界值时,则待检样本为HIV抗体阴性样本。
当第二组合物的化学发光信号值≥p24抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为p24抗原阳性样本;当第二组合物的化学发光信号值<p24抗原阳性样本的临界值时,则待检样本为p24抗原阴性样本。
为使本发明更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本发明,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
下述实施例中所采用的光激化学发光分析仪为全自动光激化学发光分析仪。
实施例1:采用均相免疫方法对HIV临床待测样本的抗原和抗体进行双孔联合检测
所采用的主要试剂包括:
样本稀释液;
与HIV gp41型抗原结合的受体和HIV gp36型抗原结合的受体的混合溶液;
生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIV gp36型抗原的混合溶液;
与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体溶液;
生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液;
链霉亲和素标记的供体溶液。
其中用作本发明的受体是按照专利PCT/US2010/025433中记载的实施例来制备的,其与HIV抗原/抗体连接后的结构为:HIV抗原/抗体-BSA-(二甲基噻吩)-(BHHCT),从而得到与HIV gp41型抗原结合的受体、与HIV gp36型抗原结合的受体以及与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体,它们在水溶液中能够完全溶解。
供体是按照专利US5780646的实施例所述的方法将200g叶绿素A放入200nm的羧基改性的乳胶颗粒中,并将链霉亲和素包被在表面以形成本发明所述的供体。
检测步骤如下:
将采集的HIV临床待测样本用样本稀释液按体积比为1:11进行稀释,获得稀释后的HIV临床待测样本。
将25μL稀释的HIV临床待测样本、25μL与HIV gp41型抗原结合的受体和HIV gp36型抗原结合的受体的混合溶液及25μL生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIVgp36型抗原的混合溶液(浓度为0.5μg/mL)加入到第一反应孔混匀,置于37℃下温育15min后,获得第三组合物;将25μL HIV临床待测样本、25μL与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体溶液和25μL生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液(浓度为0.5μg/mL)加入到第二反应孔内混匀,置于37℃下温育15min后,获得第四组合物。
继续将175μL链霉亲和素标记的供体溶液分别加入到第三组合物和第四组合物内,置于37℃下继续温育15min后,获得第一组合物和第二组合物;
分别将第一组合物和第二组合物置于光激化学发光分析仪(激发波长680nm,检测波长615nm)的检测区域中进行光激发,读取第一组合物和第二组合物的化学发光信号值。
同时利用上述方法对已标定好的HIV抗体阳性对照品和p24抗原阳性对照品进行检测,获得HIV抗体阳性样本的临界值和p24抗原阳性对照样本的临界值。
根据检测结果计算待测样本化学发光信号值/对照样本临界值(S/CO),结果如表1所示。
表1:HIV临床待测样品的检测结果。
注:S/CO值≥1为阳性
实施例2:采用均相免疫方法对HIV临床待测样本的抗原和抗体进行双孔联合检测
下述实施例中所采用的主要试剂包括:
样本稀释液;
与HIV gp41型抗原结合的受体微球和HIV gp36型抗原结合的受体微球的混合溶液;
生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIV gp36型抗原的混合溶液;
与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体微球溶液;
生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液;
链霉亲和素标记的供体微球溶液。
其中用作本发明的受体微球的制备方法、组成结构及其含量可以参见中国专利CN100429197C的实施例1,然后将HIV抗原/抗体包被在受体微球的表面,以形成与HIV gp41型抗原结合的受体微球、HIV gp36型抗原结合的受体微球以及与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体微球。
供体微球是按照专利US5780646的实施例所述的方法将200g叶绿素A放入200nm的羧基改性的乳胶颗粒中,并将链霉亲和素包被在表面以形成本发明所述的供体微球。
检测步骤如下:
将采集的HIV临床待测样本用样本稀释液按体积比为1:11进行稀释,获得稀释后的HIV临床待测样本。
将25μL稀释的HIV临床待测样本、25μL与HIV gp41型抗原结合的受体微球和HIVgp36型抗原结合的受体微球的混合溶液及25μL生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIV gp36型抗原的混合溶液(浓度为0.5μg/mL)加入到第一反应孔混匀,置于37℃下温育15min后,获得第三组合物;将25μL HIV临床待测样本、25μL与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体微球溶液和25μL生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液(浓度为0.5μg/mL)加入到第二反应孔内混匀,置于37℃下温育15min后,获得第四组合物。
继续将175μL链霉亲和素标记的供体微球溶液分别加入到第三组合物和第四组合物内,置于37℃下继续温育15min后,获得第一组合物和第二组合物;
分别将第一组合物和第二组合物置于光激化学发光分析仪(激发波长680nm,检测波长615nm)的检测区域中进行光激发,读取第一组合物和第二组合物的信号值。
同时利用上述方法对已标定好的HIV抗体阳性对照品和p24抗原阳性对照品进行检测,获得HIV抗体阳性样本的临界值和p24抗原阳性对照样本的临界值。
根据检测结果计算待测样本信号值/对照样本临界值(S/CO),结果如表2所示。
对比例:采用均相免疫方法对HIV临床待测样本的抗原和抗体进行单孔联合检测
采用的试剂如实施例2。
具体的检测步骤为:检测时,将25μL稀释后的HIV临床待测样本、25μL与HIV gp41型抗原结合的受体微球和HIV gp36型抗原结合的受体微球的混合溶液、25μL生物素标记的HIV gp41型抗原和生物素标记的HIV gp36型抗原的混合溶液(浓度为0.5μg/mL)、25μL与抗HIV p24型抗原的单克隆抗体结合的受体微球溶液和25μL生物素标记的抗HIV p24型抗原的多克隆抗体溶液(浓度为0.5μg/mL)加入到同一个反应区域内混匀,其余步骤同实施例2。检测结果如表2所示。
表2:HIV临床待测样品的检测结果。
注:S/CO值≥1为阳性
从表2的检测结果可见:
1.单孔模式不能区分抗原阳性还是抗体阳性,双孔模式既能报告抗原阳性也能报告抗体阳性。
2.从感染第14天的结果可以看出,双孔模式的S/CO值明显高于单孔模式,在第20天抗体开始出现而抗原被抗体中和掉开始下降,此时单孔模式出现了漏检。
3.在感染42天后抗体大量出现时,单孔模式的检测值开始变小,HOOK效应非常明显,而双孔模式下抗体的S/CO值还是上升。双孔模式抗HOOK能力明显好于单孔模式。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。