CN101576562A - 检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法。该检测卡构成包括A、B两张试纸条、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，实现对HIV抗体与HIV p24抗原的同时检测，本发明以二氧化硅与荧光物质复合的核壳双结构发光纳米粒子为标记，采用免疫层析技术实现艾滋病病毒定量的免疫分析。检测过程中，采用荧光微球激发光源进行激发，发射出的荧光经过滤光片装置后，用CCD扫描技术或光纤技术，把所有的发射光谱收集、聚集和倍增后，转换成数值信号，利用荧光分析仪中的内置分析软件，自动计算出待测物的浓度。本发明的优点是灵敏度高、定量准确、检测快速、操作方便、经济实用。

Description

检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体地说是涉及一种利用荧光微球免疫层析技术定量检测艾滋病病毒的检测卡及其制备方法。

背景技术

艾滋病是获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，简称AIDS)的英文音译。它是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，简称HIV，俗称艾滋病病毒)引起的一种病死率极高的恶性传染病。HIV属于逆转录病毒，目前已发现HIV-1、HIV-2二型。AIDS主要传播途径为血液传播、异性和同性间的性行为传播和母婴间垂直传播。

自1981年在美国洛杉矶首次发现艾滋病病例后，艾滋病正在全世界迅速流行。至今，全球已有六千多万人感染了HIV，已造成2500万人死亡。我国在1985年发现第一例AIDS患者，历经了传入期、扩散期，在上世纪90年代进入了快速增长期。截止到2007年10月，我国累计报告HIV感染者223501例，其中AIDS患者62838例，已死亡22205例。专家估计，我国现已有约70万HIV感染者，如不及时采取严格的控制措施，到2010年有可能迅速达到1000万例。艾滋病的流行已引起各国政府的重视，但迄今为止，仍无特效的治疗药物及安全有效的抗HIV疫苗，因而早期诊断并及时发现感染病人，控制其进一步传播仍是艾滋病防治的重要手段之一。

近年来，分子生物学技术飞速发展，HIV抗体检测方法也随之不断更新。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(Western-Blotting)相结合是HIV抗体检测的“金标准”方法。但这两种方法需要借助昂贵而复杂的仪器设备，成本高，需由专业人员进行操作，操作复杂，耗时长，不利于在基层推广和在现场进行快速筛查。近几年，HIV抗体快速检测方法发展迅速，常用的快速检测方法有免疫斑点、免疫层析以及凝集试验，其中利用胶体金免疫层析技术检测HIV抗体已有很多文献和专利报道，但胶体金法一般情况下对艾滋病病毒只能进行定性分析。目前国内使用的快速检测试剂，其灵敏性和特异性都不是很理想，导致实际样品检测过程中会产生漏检现象。

HIV感染后抗体的出现需要2-8周的时间，这一阶段为不能检出抗体的“窗口期”，是可能发生传播的危险期。而患者血液中只要有HIV病毒，即存在p24抗原，其通常在感染2-3周后可以检出，通过检测HIV p24抗原可以发现早期的HIV感染，缩短了HIV抗体检测的窗口期。HIVp24抗原的变化情况几乎与HIV感染后的临床急性表现同步，在血液中的浓度不断变化着，p24抗原的检测可以作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断。目前，研制出的第四代HIV抗体酶免检测试剂可以同时检测HIV 1/2抗体和HIVp24抗原，使窗口期缩短了一周多，但由于把抗原和抗体同时包被在酶标板上，存在着相互干扰，影响了免疫反应的特异性，另外，该试剂是采用ELISA方法，检测时操作复杂，比较耗时。

AIDS之所以被称为“超级癌症”和“世纪杀手”，主要是因为HIV病毒复制具有失保真性，病毒很容易发生变异而产生耐药性，使原本有效的药物活性变低甚至失去作用。因此如何有效预防与控制AIDS的传播是一项刻不容缓、复杂而长期的艰巨任务。目前，国内外已研制出很多种HIV检测试剂，但能同时兼顾敏感性、特异性和操作简便快速的试剂很少。

发明内容

本发明的一个目的是针对上述现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、操作简便检测快速、价格低廉的检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡。

本发明的另一个目的是提供上述检测卡的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采取的一个技术方案是：

提供一种能同时检测HIV抗体与HIV p24抗原的荧光微球免疫层析检测卡，该检测卡为双卡型，由两张免疫层析试纸条、底卡以及面卡构成，一张试纸条A检测HIV抗体，另一张试纸条B检测HIV p24抗原；免疫层析试纸条是在底板上依次搭接地粘贴滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、NC膜和吸水纸而制成的，所述的玻璃纤维膜上喷涂有荧光微球垫，所述的硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；所述试纸条A的玻璃纤维膜上喷涂的荧光微球垫为荧光微球标记gp41，gp36重组抗原和荧光微球标记的兔多抗，硝酸纤维素膜上检测区喷涂gp41，gp36重组抗原；所述试纸条B的玻璃纤维膜上喷涂的荧光微球垫为荧光微球标记的抗HIV p24抗体和荧光微球标记的兔多抗，硝酸纤维素膜上的检测区喷涂有配对的抗HIV p24抗体；所述试纸条A和试纸条B的质控区都固定有抗兔抗体。

所述荧光微球是通过采用一种有机硅掺杂，无机硅包覆相结合的方法而制备的二氧化硅与荧光物质复合的核壳双结构发光纳米粒子，直径为30-150nm，其表面有修饰的活性基团。

所述活性基团为-CHO、-COOH、-OH、-NH₂或-SH；所述的荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、1，8-萘二酰亚胺、7-羟基香豆素有机荧光染料或其掺杂物以及量子点。

本发明采取的另一个技术方案是提供一种上述检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，具体包括以下步骤：

1.免疫层析试纸条的制备

(1)荧光微球垫的制备

荧光微球的制备：将60ml无水乙醇、2～15ml氨水、1～6ml正硅酸乙酯、1～4ml超纯水、0.1～5mg荧光物质混合在一起，恒温水浴反应6～24小时后，加入Na₂SiO₃封闭微球，Na₂SiO₃的终浓度为2％～10％，通过加入盐酸调节溶液pH值来控制微球大小，最后用活性基团修饰微球表面。

用制备的荧光微球标记抗原或抗体，并将其喷涂在玻璃纤维膜上：

取微球在1000×g离心10～15min，收集沉淀，用0.01M pH 4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD₄₅₀＝0.2，然后分别加入20～100mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)100μl，2～20mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)100μl，再加入0.01M pH 4.8的硼酸盐缓冲液，振荡混匀，室温孵育10～30min后，1000×g离心5～15min，沉淀用0.01M pH 7～8的硼酸盐缓冲液混匀，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.2～1.0。在0.1ml荧光微球中加入1～10μg的gp41，gp36重组抗原和兔多抗或抗HIV p24抗体和兔多抗，充分混匀后，室温搅拌反应1～4h，超纯水离心洗涤2～5次，用0.01M pH 7.2PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，用BIODOTDispensing System(BIODOT操作平台)喷涂至玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥环境备用。

(2)检测区和质控区的制备

分别将gp41，gp36重组抗原，配对的抗HIV p24抗体和抗兔抗体喷涂到硝酸纤维素膜上，制成检测区和质控区。

用0.01M pH 7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)分别调节包被物的浓度为0.5～8.0mg/mL，喷膜量为0.74μL/cm，检测区喷涂gp41，gp36重组抗原或配对的抗HIV p24抗体，质控区喷涂抗兔抗体，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。

(3)组装和剪切

在粘性底板上依次搭接地粘贴：滤纸、样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，并剪切成适当宽度即成为免疫层析试纸条。按照上述步骤分别制得试纸条A和试纸条B。

2.免疫层析试纸条的组装

将按上述方法制备的检测HIV抗体的试纸条A和检测HIV p24抗原的试纸条B并排固定在底卡上，然后在试纸条表面用面卡压紧，即成为免疫层析检测卡。底卡和面卡一般都为塑料卡，底卡能使试纸条上的样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水纸紧密结合，面卡可保护试纸条，使其不受损坏。面卡上预留加样孔和观察窗各两个，加样孔的位置与每张试纸条的样本垫对应，观察窗的位置与每张试纸条的NC膜对应。

用上述的荧光微球免疫层析检测卡定量检测艾滋病病毒，包括以下步骤：

(1)免疫层析检测卡的两个加样孔中分别加入待检样本，反应3～20min后，将检测卡放入检测窗口；样本包括全血、血清、血浆、体液等；

(2)截留在检测区和质控区的荧光微球在最佳激发灯源下，发出强烈的荧光条带；

(3)发射的荧光经滤除杂光后，通过聚焦系统将采集的光学信号，送入光电倍增管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，获得检测线与质控线的荧光强度；

(4)通过荧光分析仪中内置分析软件对检测线的荧光数值进行校正，并把校正值代入内置标准曲线，自动计算出待检样本中HIV抗体与HIV p24抗原的浓度。

本发明中所述的免疫层析试纸条上的免疫反应方式为夹心模式，其中检测HIV抗体的试纸条上为双抗原夹心模式，检测HIV p24抗原的试纸条上为双抗体夹心模式。

本发明的优点如下：

1.荧光物质被入射光激发后，返回基态时发射出荧光，可以在与激发光源垂直的方向进行检测，因此荧光不受来自激发光本底的干扰，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物质检测方法的10～1000倍。另外，荧光标记检测方法还具有操作简便，检测快速，定量准确，价格低廉等优点；

2.荧光微球是核壳双结构，克服了常规荧光微球的染料泄露，抗溶液干扰能力差等缺点，增加了荧光微球的稳定性和荧光寿命；

3.荧光微球表面修饰活性基团，采用化学偶联方法来标记抗体和抗原，形成抗体和抗原与微球的稳定结合；

4.通过CCD扫描技术或光纤技术把过滤后的发射光谱收集后，再发送到荧光分析检测仪以及经过软件处理，把荧光信号数值化，从而实现定量检测；

5.采用双卡型免疫层析检测卡，实现同时检测HIV抗体与HIV p24抗原，缩短了窗口期，与现有的第四代HIV抗体诊断试剂相比，避免了HIV抗体与HIV p24抗原之间的相互干扰。

用上述方法制备的荧光微球免疫层析检测卡来分别测试20例AIDS患者和20例正常人血清，准确率均达到100％。用第四代HIV抗体酶免检测试剂对这40个样品进行检测，所得数据与本发明提供的荧光微球免疫层析法相比，相关系数为r＝0.9578，表明这两种方法的检测结果显著相关。本发明提供的荧光微球免疫层析法定量准确，检测快速，操作简便，灵敏度高。

附图说明

图1是免疫层析试纸条的结构示意图；

图2是免疫层析检测卡的结构示意图；

图3是荧光微球免疫层析检测卡检测原理图；

图4是一种简易荧光检测仪的检测原理及其结构示意图。

如图1所示，该免疫层析试纸条的构成为：在粘性底板18上，依次搭接地粘贴滤纸11、样本垫12、喷涂有荧光微球标记的兔多抗和gp41，gp36重组抗原或荧光微球标记的兔多抗抗HIV p24抗体的玻璃纤维膜13、包被有gp41，gp36重组抗原或配对的抗HIV p24抗体的检测区15和包被有抗兔抗体的质控区16的硝酸纤维素膜14和吸水纸17。如图2所示，该免疫层析检测卡是双卡型的，由分别检测HIV抗体和HIV p24抗原的两张免疫层析试纸条固定在底卡上而形成，具体构造包括底卡21、面卡22、加样孔23、观察窗24、NC膜25、质控区26、检测区27。

如图1、2和3所示，检测原理如下：在检测卡的两个加样孔23中加入待检样本，样本溶解玻璃纤维膜13上喷涂的荧光微球标记的兔多抗和gp41，gp36重组抗原以及荧光微球标记的抗HIV p24抗体，通过毛细作用在纤维膜上向前泳动，同时样本中HIV抗体、HIV p24抗原与相应的荧光微球标记物反应；反应液经过检测区15时，与检测区的包被物反应，并富集在检测区；而兔多抗则继续向前泳动，在质控区16被抗兔抗体截留。将检测卡放入检测窗口31，荧光微球33在光源32激发下，发射的荧光34通过单色滤光片35过滤后，通过观察窗口36在检测区15能够观察到一条清晰的荧光条带，质控区不管样本是阴性还是阳性都会出现荧光条带。检测区15无荧光条带，样本是阳性，检测区15有荧光条带，样本是阴性。

如图4所示，荧光微球免疫层析定量检测艾滋病病毒的检测步骤如下：

(1)在检测卡的两个加样孔中滴加待检样本，反应3～20min后，将其放入检测窗口41；

(2)检测区和质控区被截留的荧光微球43在最佳激发光源42激发下，发出强烈的荧光条带；

(3)发射的荧光44经CCD扫描系统或光纤系统45汇聚后，经过光电聚集管46，送入光电倍增管47，光信号得到增强，再经过信号转换元件48以及软件分析49后，样本中HIV抗体与HIV p24抗原的浓度在数据输出410的显示器上显示出来。

具体实施方式

实施例一

1、异硫氰酸荧光素-二氧化硅壳核双结构荧光微球的制备

将1mg FITC与APS按摩尔比1∶10加入4ml无水乙醇，避光常温200rpm搅拌8小时后加入60ml无水乙醇，2ml氨水，3ml正硅酸乙酯和1ml超纯水混合搅拌8小时，再加入Na₂SiO₃封闭微球，Na₂SiO₃的终浓度为3％，封闭8小时，离心洗涤微球三遍，然后用10ml无水乙醇将微球超声分散。在三口烧瓶中加入60ml无水乙醇、1ml氨水、1ml超纯水，50ulMPS，加入超声处理后的微球，25℃，300rpm搅拌8小时。将0.07g SDBS，0.05g NaHCO₃，溶解于100ml超纯水中，加入微球，通氮，70℃，300rpm搅拌，然后向三口烧瓶中加500uL苯乙烯和100uL丙烯酸，0.03g过硫酸钾，1ml超纯水，300rpm搅拌7小时，即为制备好的表面修饰活性基团(-COOH)的异硫氰酸荧光素-二氧化硅壳核双结构荧光微球。

2、荧光微球标记物的制备(EDC法)

荧光微球标记的市售的gp36，gp41重组抗原的制备：取1mg包裹异硫氰酸荧光素的荧光微球在1000×g离心10min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD₄₅₀＝0.2，然后加入90μL 50mg/mL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，150μL 5mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育20min后，1000×g离心5min，沉淀用0.01M pH4.8的硼酸盐缓冲液溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.5。在0.1mL荧光微球中加入1μg gp36，gp41重组抗原，充分混匀后，室温搅拌反应3h，用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶至起始体积后，即为制备好的荧光微球标记的gp36，gp41重组抗原。

荧光微球标记的抗HIV p24抗体的制备：取1mg包裹异硫氰酸荧光素的荧光微球在1000×g离心10min，收集沉淀，用0.01MpH4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD₄₅₀＝0.2，然后加入80μl 50mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，100μl10mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育30min后，1000×g离心5min，沉淀用0.01MpH4.8的硼酸盐缓冲液溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.8。在0.1ml荧光微球中加入2μg抗HIV p24抗体，充分混匀后，室温搅拌反应3h，用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01MpH 7.2的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶至起始体积后，即为制备好的荧光微球标记的抗HIV p24抗体。

荧光微球标记的兔多抗的制备：取1mg包裹异硫氰酸荧光素的荧光微球在1000×g离心10min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD₄₅₀＝0.2，然后加入80μl 50mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，100μl 10mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育30min后，1000×g离心5min，沉淀用0.01MpH4.8的硼酸盐缓冲液溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.8。在0.1ml荧光微球中加入2μg兔多抗，充分混匀后，室温搅拌反应3h，用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的PBS(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶至起始体积后，即为制备好的荧光微球标记的兔多抗。

3、荧光微球垫的制备

用BIODOT Dispensing System，将荧光微球标记的gp36，gp41重组抗原和兔多抗喷涂至玻璃纤维膜(A)上，将荧光微球标记的抗HIV p24抗体和兔多抗喷涂至玻璃纤维膜(B)上，喷膜量均为4μl/cm，玻璃纤维膜大小为30×0.8cm，25℃真空干燥1～2h，放于干燥环境备用。

4、检测区和质控区的制备

gp36，gp41重组抗原和抗兔抗体包被到硝酸纤维素膜A上：用0.01M pH 7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)调节gp36，gp41重组抗原的浓度为1mg/ml，将所得溶液喷涂在NC膜A上形成检测区；用0.01M pH 7.2PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)调节抗兔抗体的浓度为1mg/ml，将所得溶液喷涂在NC膜(A)上形成质控区。两区的喷膜量均为0.74μl/cm，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。

抗HIV p24抗体和抗兔抗体包被到硝酸纤维素膜(B)上：用0.01M pH 7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)调节抗HIV p24抗体的浓度为0.5mg/ml，将所得溶液喷涂在NC膜(B)上形成检测区；用0.01M pH 7.2PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)调节抗兔抗体的浓度为0.5mg/ml，将所得溶液喷涂在NC膜(B)上形成质控区。两区的喷膜量均为0.74μl/cm，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。

5、荧光微球免疫层析检测卡的制备：

组装试纸条A：在PVC底板上依次搭接地粘贴：(1)滤纸和样本垫，样本垫为一种经过5％Tween-20浸泡1小时的玻璃纤维膜；(2)喷涂有荧光微球标记的兔多抗和gp36，gp41重组抗原的玻璃纤维膜A；(3)包被有gp36，gp41重组抗原作为检测区和抗兔抗体作为质控区的硝酸纤维素膜A；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，即成为免疫层析试纸条A。

组装试纸条B：在PVC底板上一次搭接地粘贴：(1)滤纸和样本垫，样本垫为一种经过5％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)喷涂有荧光微球标记的兔多抗和抗HIV p24抗体的玻璃纤维膜B；(3)包被有配对的抗HIV p24抗体作为检测区和抗兔抗体作为质控区的硝酸纤维素膜B；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，即成为免疫层析试纸条B。

把免疫层析试纸条A和免疫层析试纸条B并排固定在塑料底卡上，试纸条表面用面卡压紧，面卡在对应每张试纸条的样本垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗，制成的免疫层析检测卡可用来同时检测HIV抗体与HIV p24抗原。该检测卡组装好后装入铝箔袋中，加入干燥剂后封口保存，于室温干燥环境下至少可以保存一年。

用上述荧光微球免疫层析检测卡定量检测艾滋病病毒包括以下步骤：

(1)平放检测卡，待测样品血样平衡至室温后，两个加样孔中各加入血样50μL，于室温下反应10min，将检测卡放入检测窗口；

(2)截留在检测区和质控区的荧光微球在最佳激发光源的激发下，发出强烈的荧光；

(3)发射的荧光经滤除杂光后，通过聚集系统将采集的光学信号，送入光电倍增管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，自动获得HIV抗体和HIV p24抗原检测卡的检测线与质控线的荧光数值；

(4)荧光分析仪中的内置分析软件通过对检测线的荧光值进行校正，并把校正值代入内置标准曲线，自动计算出待测样品中HIV抗体为82U/ml，HIV p24抗原浓度为235pg/ml。

实施例二

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤1中制备的荧光微球为二氯三(1，10-邻二氮杂菲)钌荧光素-二氧化硅壳核双结构微球，其制备方法如下：

将3mg二氯三(1，10-邻二氮杂菲)钌荧光素，60ml无水乙醇，4ml氨水，2ml正硅酸乙酯和3ml超纯水混合搅拌8小时，再加入Na₂SiO₃封闭微球，Na₂SiO₃的终浓度为3％，封闭8小时，离心洗涤微球三遍，然后用10ml无水乙醇将微球超声分散。在三口烧瓶中加入60ml无水乙醇、1ml氨水、1ml超纯水，50ul MPS以及超声处理后的微球，25℃，300rpm搅拌8小时。将0.07g SDBS，溶解于100ml pH7.0的PB中，加入微球，通氮，70℃，300rpm搅拌，然后向三口烧瓶中加500uL苯乙烯和50uL APS，0.03g过硫酸钾，1ml超纯水，300rpm搅拌8小时，即为制备好的表面修饰活性基团(-NH₃)的二氯三(1，10-邻二氮杂菲)钌荧光素-二氧化硅壳核双结构荧光微球。

用上述荧光微球免疫层析检测卡定量检测艾滋病病毒包括以下步骤：

(1)平放检测卡，待测样品血样平衡至室温后，两个加样孔中各加入血样50μL，于室温下反应10min，将检测卡放入检测窗口；

(2)截留在检测区和质控区的荧光微球在最佳激发光源的激发下，发出强烈的荧光；

(3)发射的荧光经滤除杂光后，通过聚集系统将采集的光学信号，送入光电倍增管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，获得检测线与质控线的荧光数值；

(4)荧光分析仪中的内置分析软件对检测线荧光强度进行校正，并把校正值代入内置标准曲线，自动计算出待测样品中HIV抗体为53U/ml，HIV p24抗原为125pg/ml。

Claims (10)

1.一种检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于：包括用于检测HIV抗体的试纸条A和用于检测HIV p24抗原的试纸条B；所述试纸条A和试纸条B均包括在底板上依次搭接地粘贴的滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的玻璃纤维膜上喷涂有荧光微球垫，所述的硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；所述试纸条A的玻璃纤维膜上喷涂的荧光微球垫为荧光微球标记gp41，gp36重组抗原和荧光微球标记的兔多抗，硝酸纤维素膜上检测区喷涂gp41，gp36重组抗原；所述试纸条B的玻璃纤维膜上喷涂的荧光微球垫为荧光微球标记的抗HIV p24抗体和荧光微球标记的兔多抗，硝酸纤维素膜上的检测区喷涂有配对的抗HIV p24抗体；所述试纸条A和试纸条B的质控区都固定有抗兔抗体。

2.根据权利要求1所述的检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于：所述的荧光微球是采用有机硅掺杂，无机硅包覆相结合的方法制备的双结构二氧化硅复合荧光物质的发光纳米粒子，其直径为30-150nm。

3.根据权利要求2所述的检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于：所述的荧光微球的制备方法为：将60ml无水乙醇、2～15ml氨水、1～6ml正硅酸乙酯、1～4ml超纯水、0.1～5mg荧光物质混合在一起，恒温水浴反应6～24小时后，加入Na₂SiO₃封闭微球，Na₂SiO₃的终浓度为2％～10％，最后用活性基团修饰微球表面。

4.根据权利要求3所述的检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于：所述的活性基团为-CHO、-COOH、-OH、-NH₂或-SH；所述的荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、1，8-萘二酰亚胺、7-羟基香豆素有机荧光染料或其掺杂物以及量子点。

5.根据权利要求1所述的检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，免疫层析试纸条制备步骤包括：

(1)荧光微球垫的制备：首先制备荧光微球，用荧光微球来标记gp41，gp36重组抗原或抗HIV p24抗体，并将其喷涂在玻璃纤维膜上；将荧光微球标记在兔多抗上并同时喷涂在玻璃纤维膜上；

(2)检测区和质控区的制备：将gp41，gp36重组抗原或抗HIV p24配对抗体喷涂到硝酸纤维素膜上制成检测区，将抗兔抗体喷涂到硝酸纤维素膜上制成质控区；

(3)组装和剪切：在粘性底板上依次搭接地粘贴滤纸、样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，并剪切成所需宽度即成为免疫层析试纸条；

按照上述步骤分别制得试纸条A和试纸条B。

6.根据权利要求5所述的定量检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述荧光微球垫的制备方法如下：

取荧光微球在1000×g离心10～15min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD₄₅₀＝0.2，然后分别加入20～100mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺100μl，2～20mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺100μl，再加入0.01M pH4.8的硼酸盐缓冲液，振荡混匀，室温孵育10～30min后，1000×g离心5～15min，沉淀用0.01M pH7～8的硼酸盐缓冲液混匀，并调节微球浓度为OD₄₅₀在0.2～1.0，在0.1ml荧光微球中加入1～10μg gp41，gp36重组抗原、兔多抗或抗HIV p24抗体，充分混匀后，室温搅拌反应1～4h，超纯水离心洗涤2～5次，沉淀用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液复溶沉淀至起始体积后，用BIODOT Dispensing System喷涂至玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥环境备用。

7.根据权利要求5所述的定量检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的制备方法如下：

用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液分别调节包被物的浓度为0.5～8.0mg/mL，喷膜量为0.74μL/cm，检测区喷涂gp41，gp36重组抗原或配对的抗HIV p24抗体，质控区喷涂抗兔抗体，两区相隔5mm，质控区距离硝酸纤维素膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。

8.根据权利要求5所述的定量检测艾滋病病毒的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，免疫层析检测卡的制备方法如下：

将试纸条A和试纸条B两张免疫层析试纸条并排固定在底卡上，试纸条表面用面卡压紧，所述面卡上预留加样孔和观察窗，加样孔的位置与试纸条的样本垫对应，观察窗的位置与试纸条的硝酸纤维素膜对应，所述底卡和面卡为塑料卡。

9.用权利要求1、2、3或4所述的检测卡定性检测艾滋病病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在免疫层析检测卡的两个加样孔中分别加入待检样本，反应3～20min后，将检测卡放入简易荧光分析仪窗口检测；

(2)荧光微球在激发灯源下，发出强烈的荧光条带；

(3)发射的荧光经滤除杂光后，用肉眼观察是否有荧光信号；当样本中不含有被检测物质时，检测区和质控区均出现一条荧光条带，即检测样本为阴性；当样本中含有过量被检测物质时，检测区无荧光条带，质控区有一条荧光条带，检测样本即为阳性。

10.用权利要求1、2、3或4所述的检测卡定量检测艾滋病病毒的方法，其特征在于，定量检测艾滋病病毒时，包括以下步骤：

(1)免疫层析检测卡的两个加样孔中分别加入待检样本，反应3～20min后，将检测卡放入荧光分析仪检测窗口；

(2)截留在检测区和质控区的荧光微球在激发灯源下，发出强烈的荧光条带；

(3)发射的荧光经滤除杂光后，通过聚焦系统将采集的光学信号，送入光电倍增管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，获得检测区与质控区的荧光强度；

(4)通过荧光分析仪中内置分析软件对检测区的荧光数值进行校正，并把校正值代入内置标准曲线，自动计算出待检样本中HIV抗体与HIV p24抗原的浓度。

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