CN114107019B - 一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途。本发明提供了一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其包括：样品加载腔室；以及样本流动通道，其包括流道检测区，流道检测区用于侧向免疫层析反应；在流道检测区中，沿流体在微流控芯片中的流动方向，依次设置有捕获区、第一检测区和第二检测区；捕获区包括包被有捕获抗体的荧光微粒和包被有与第一修饰物特异性结合的分子的荧光微粒；第一检测区和第二检测区分别包括与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子和/或与第二修饰物特异性结合的分子。本发明提供了用于核酸和蛋白质的同时检测的快速、便携和经济的微流控芯片平台。

Description

一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途
技术领域
本发明属于医疗检测领域，尤其涉及一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途。
背景技术
检测包括核酸和蛋白质的各种生物标记物的能力在临床诊断、药物研发、环境监测和食品分析中起到重要作用[1-3]。目前用于临床和科学实验室的大部分试验方法受限于它们检测单个生物标记物或检测仅一种类型的生物标记物；例如，免疫测定用于蛋白质和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)用于核酸[4]。目前的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)流行病急需用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)的检测的快速、精确、和有效的诊断测试[5]。
存在用于COVID-19的两个主要类型的诊断方法包括：PCR[6-9]和基于等温核酸扩增的方法[10-15]检测SARS-CoV-2病毒RNA，以及基于血清学的免疫测定检测SARS-CoV-2特异性抗体(例如IgG和IgM)[16-21]。然而，这些平台分别地检测蛋白质或核酸，具有临床局限性。研究显示，不是所有的SARS-CoV-2感染的患者对病毒RNA的检测结果呈阳性[6,7,19,22]。检测抗SARS-CoV-2抗体的能力中存在时间过程，具体来说，IgM可在症状发作后5天被检测到，IgG可在症状发作后中值14天被检测到。最近开发了基于微流控侧向层析法的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检验用于SARS-CoV-2 RNA的检测，其具有1拷贝/μL的高灵敏度和30分钟的运行时间。然而，该方法不可同时检测RNA和抗体[10]。本发明人最近开发了用于SARS-CoV-2 IgG、IgM、和抗原的检测的微流控芯片，但不可同时检测核酸[16,23]。
随着检测技术的发展，使用单一平台对蛋白质和核酸生物标记物进行同时分析将极大地有利于临床诊断；该同时分析的能力将改善灵敏度和特异性并允许早期诊断[24,25]。最近，对于多组分(multiplexed)和高通量COVID-19筛选开发了无标签的纳米等离子体生物传感器平台，其能够一起检测核酸、蛋白质、和抗体[26]。然而，通过该平台的核酸的检测是基于核酸杂交并缺乏核酸扩增能力，限制了对于现实应用至关重要的核酸检测的灵敏度。
因此，急需开发用于核酸和蛋白质的快速、简单、灵敏、经济、和可同时检测的集成平台，以实现复杂临床情况中的精确诊断。
发明内容
发明要解决的问题
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种能够同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法以及用途。
用于解决问题的方案
本发明提供了能够由单一反应芯片同时检测核酸和蛋白质的便携式即时(point-of-care)微流控平台。本发明使用该芯片检测SARS-CoV-2核蛋白(N)基因和IgG抗体。
本发明提供的微流控芯片的结构基本如专利公开号为CN110773246A的中国专利申请(发明名称为：一种微流控芯片及用于高敏肌钙蛋白检测的试剂盒；申请号为：201911060541.2)中所公开的。简要地，微流控芯片包括叠置的三层，芯片上层包含加样区，芯片下层设有凹槽和加样孔，芯片中间层为双面胶层，双面胶层上用有胶区和无胶区分隔出样本流动通道，样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，其中加样孔区与芯片上层的加样区相对应，废液槽区至少覆盖芯片下层的凹槽，所述流道检测区为弧形。在本发明提供的微流控芯片中，当将芯片上下层和中间层密合后，加样区、加样孔区以及加样孔构成了样品加载腔室，其用于样品加载和RPA核酸扩增；在芯片下层对应于芯片中间层流道检测区的位置处进行点样，顺着样本流动的方向，依次设置捕获区、第一检测区和第二检测区，用于侧向免疫层析反应。当将芯片上下层和中间层密合后，所述废液槽区的主要作用在于存储废液，即相当于废液池。分别由小鼠抗人IgG抗体和抗地高辛抗体标记荧光微粒(fluorescent microspheres,FMS)，用于SARS-CoV-2特异性IgG和SARS-CoV-2 RNA的同时检测。然后将这些经标记的FMS的混合物点样在微流控芯片的捕获区上，用于IgG和RPA扩增子的特异性捕获。其中，SARS-CoV-2刺突蛋白(抗原)和链霉亲和素分别被点样在第一和第二检测区上。
具体地，本发明的第一方面提供了一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，所述的微流控芯片包括：
样品加载腔室，其用于包含第一生物样品的重组酶聚合酶扩增反应物的加载以及第二生物样品的加载；以及样本流动通道，其包括流道检测区，所述的流道检测区用于侧向免疫层析反应；
其中，所述的重组酶聚合酶扩增反应物中包括用于扩增第一生物样品中待测核酸的正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物分别具有第一修饰物和/或第二修饰物，且所述的正向引物和反向引物所具有的修饰物不同；
在所述的流道检测区中，沿流体在微流控芯片中的流动方向，依次设置有捕获区、第一检测区和第二检测区；
所述的捕获区包括包被有捕获抗体的荧光微粒和包被有与第一修饰物特异性结合的分子的荧光微粒；
所述的第一检测区和第二检测区分别包括与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子和/或与第二修饰物特异性结合的分子。
在一些实施方案中，所述的第一修饰物和与第一修饰物特异性结合的分子选自：地高辛和抗地高辛抗体、生物素和亲和素/链霉亲和素以及荧光素和抗荧光素抗体(例如，但不限于FITC与抗FITC抗体)；所述的第二修饰物和与第二修饰物特异性结合的分子选自：地高辛和抗地高辛抗体、生物素和亲和素/链霉亲和素以及荧光素和抗荧光素抗体(例如，但不限于FITC与抗FITC抗体)；且第一修饰物和与第一修饰物特异性结合的分子，与第二修饰物和与第二修饰物特异性结合的分子不相同。示例性的，正向引物的第一修饰物为生物素，与第一修饰物特异性结合的分子为链霉亲和素；反向引物的第二修饰物为地高辛，与第二修饰物特异性结合的分子为抗地高辛抗体。
在一些具体的实施方案中，正向引物和反向引物的修饰物均位于正向引物和反向引物的5’端。
在一些可选的实施方案中，所述的待测核酸为病原体核酸；所述的待测蛋白质为人抗病原体的特异性抗体或病原体抗原。
在一些具体的实施方案中，当所述的待测蛋白质为人抗病原体的特异性抗体时，所述的捕获抗体为抗人抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为来自病原体的抗原。
在一些更具体的实施方案中，所述的抗人抗体选自抗人IgM抗体、抗人IgD抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体或抗人IgE抗体；优选地，所述的抗人抗体为抗人IgM抗体或抗人IgG抗体；更优选地，所述的抗人抗体为抗人IgG抗体；更进一步优选地，所述的抗人抗体为抗人IgG Fc区抗体。
在一些可选的实施方案中，所述的抗人抗体是来自不同来源的抗体，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、牛、羊、猪、狗、鸡等。优选地，所述的抗人抗体为小鼠抗人抗体。
在另一些具体的实施方案中，当所述的待测蛋白质为病原体抗原时，所述的捕获抗体为抗病原体抗原的第一抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为抗病原体抗原的第二抗体。优选地，所述的第一抗体和所述的第二抗体针对该病原体抗原的不同表位。
在一些具体的实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些优选的实施方案中，所述的病原体为SARS-CoV-2。
在一些更具体的实施方案中，所述的待测核酸为来自SARS-CoV-2的核酸。优选地，所述的待测核酸为来自SARS-CoV-2的ORF1ab基因、S基因、E基因、M基因和N基因的核酸。
在一些优选的实施方案中，所述的待测核酸为来自SARS-CoV-2 N基因的核酸，其序列如SEQ ID NO:3所示；在这个优选的实施方案中，用于重组酶聚合酶扩增如SEQ ID NO:3所示序列的引物包括：序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。进一步地，在这个优选的实施方案中，正向引物具有地高辛作为修饰物，反向引物具有生物素作为修饰物。
在一些更具体的实施方案中，所述的第一生物样品选自鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便和尿液样品；其中，血液选自血清、血浆或全血样品。
在一些具体的实施方案中，所述的待测蛋白质为人抗SARS-CoV-2的特异性抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为来自SARS-CoV-2的抗原。可选地，所述的来自SARS-CoV-2的抗原选自SARS-CoV-2核蛋白(N蛋白)、囊膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和刺突蛋白(S蛋白)。在这些更具体的实施方案中，所述的第二生物样品选自血清、血浆和全血样品。
在另一些具体的实施方案中，所述的待测蛋白质为SARS-CoV-2抗原，所述的捕获抗体为抗SARS-CoV-2抗原的第一抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为抗SARS-CoV-2抗原的第二抗体。在这些具体的实施方案中，所述的第二生物样品选自鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便和尿液样品；其中，血液选自血清、血浆或全血样品。
本发明的第二方面提供了一种同时检测核酸和蛋白质的方法，其基于本发明的第一方面所述的微流控芯片，所述的方法包括以下步骤：
1)将重组酶聚合酶扩增反应缓冲液与第一生物样品添加至样品加载腔室，在样品加载腔室中进行重组酶聚合酶扩增反应；
2)重组酶聚合酶扩增反应结束后，将通过样品缓冲液稀释的第二生物样品添加至样品加载腔室，使样品加载腔室中的流体沿样本流动通道流动，依次经过捕获区、第一检测区和第二检测区；
3)离心后，通过荧光分析仪检测微流控芯片的第一检测区和第二检测区的荧光信号。
在一些具体的实施方案中，重组酶聚合酶扩增反应可根据市售的重组酶聚合酶扩增反应试剂盒进行，例如但不限于TwistAmpTM基础试剂盒等。
在一些具体的实施方案中，步骤2)中，添加通过样品缓冲液稀释的第二生物样品后，在室温下反应2～20分钟，使样品加载腔室中的流体沿样本流动通道流动。
本发明的第三方面提供了一种检测试剂盒，其包括本发明第一方面所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片。
本发明的第四方面提供了如本发明的第一方面所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片在制备用于同时检测病原体的核酸以及抗原或抗体的试剂盒的用途。
在一些具体的实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些优选的实施方案中，所述的病原体为SARS-CoV-2。
本发明的第五方面提供了如本发明的第一方面所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片在制备用于诊断受试者是否感染病原体的试剂盒中的用途。
在一些具体的实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些优选的实施方案中，所述的病原体为SARS-CoV-2。
发明的效果
本发明提供了用于核酸和蛋白质的同时检测的快速、便携、和经济的微流控芯片平台。使用SARS-CoV-2作为标靶，本发明提供的微流控芯片可以被设计成例如检测SARS-CoV-2 RNA(N基因)和特定IgG抗体，检出限分别为1拷贝/μL和1ng/μL。从样品应用至获得结果的整个过程花费小于30分钟。本发明提供的芯片及方法高度稳定并且抗干扰能力强。使用临床样品评价本系统的检测性能，表现出对COVID-19诊断的97.0％灵敏度和100％特异性。这些发现表明了本发明提供的微流控芯片及方法用于病原体的检测和其后的控制的潜力。
附图说明
图1：使用SARS-CoV-2作为概念验证靶标的用于同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片平台的示意图。
图2：微流控芯片上的SARS-CoV-2 IgG和N基因的同时检测的(图2中的A)荧光信号曲线和(图2中的B)荧光强度。RNA(-)表示无SARS-CoV-2 N基因的RPA反应物；RNA(+)表示有SARS-CoV-2 N基因(1,000拷贝/μL)的RPA反应物。IgG(-)表示0ng/mL的IgG；IgG(+)表示1,000ng/mL的IgG。在微流控芯片中在42℃下进行RPA反应15分钟。然后在室温下进行侧向免疫层析反应10分钟。空白表示仅添加样品缓冲液。第一检测区(～150mm)对应于IgG检测，第二检测区(～230mm)对应于RPA扩增子检测。
图3A：基于使用微流控芯片的RPA-侧向免疫层析检验的SARS-CoV-2 N基因(1至10,000拷贝/μL)的系列稀释产生的荧光信号。在42℃下、在微流控芯片上进行各个RPA反应(5μL总体积)15分钟。在室温下进行侧向免疫层析反应10分钟。
图3B：荧光强度(检测强度)和靶浓度的对数值之间的线性关系。
图3C：标准样品的RPA扩增子的电泳图谱。RPA产物的片段长度为120bp。M：DNA标记物，NC：阴性对照，1至5：范围为1至10,000拷贝/μL的标靶的起始浓度。
图4A：使用系列稀释标准IgG样品(1、10、25、100、500、和1,000ng/mL)的微流控芯片的性能。
图4B：IgG浓度和荧光强度之间的相应的校准曲线。图4B中插图显示在1至100ng/mL范围内的IgG浓度和荧光强度的线性关系。在室温下进行侧向免疫层析反应10分钟。
图5：通过使用(图5中的A)高浓度样品(IgG 1,000ng/mL，SARS-CoV-2 N基因10,000拷贝/μL)和(图5中的B)低浓度样品(IgG1ng/mL，SARS-CoV-2 N基因1拷贝/μL)的10个重复实验评价再现性。图5中的C和图5中的D为3mg/mL甘油三酯、0.5mg/mL血红蛋白、和0.05mg/mL胆红素的存在下的微流控芯片的干扰评价。IgG和SARS-CoV-2 N基因的终浓度分别为100ng/mL和1拷贝/μL。在微流控芯片中在42℃下进行RPA反应15分钟；然后在室温下进行侧向免疫层析反应10分钟。第一检测区是对于IgG(～150mm)和第二检测区是对于RPA扩增子(～230mm)。
图6：由包含SARS-CoV-2 IgG和RNA的确证的临床样品评价微流控芯片。其中，图6中的A为来自COVID-19阴性患者的5个血清样品和5个核酸样品。图6中的B为来自COVID-19阳性患者的7个血清样品和来自COVID-19阴性患者的7个核酸样品。图6中的C为来自COVID-19阴性患者的5个血清样品和来自COVID-19阳性患者的5个核酸样品。图6中的D为来自COVID-19阳性患者的7个血清样品和7个核酸样品。在微流控芯片中在42℃下进行RPA反应15分钟，然后将20μL的血清样品与80μL的样品缓冲液混合并添加至芯片。允许在室温下进行侧向免疫层析反应10分钟。第一检测区是对于IgG(～150mm)和第二检测区是对于RPA扩增子(～230mm)。
图7A：COVID-19阳性血清样品(n＝14)对COVID-19阴性血清样品(n＝10)中IgG检测的曼-惠特尼非参数检验结果。
图7B：COVID-19阳性核酸样品(n＝12)对COVID-19阴性核酸样品(n＝12)中SARS-CoV-2 RNA的曼-惠特尼非参数检验结果。
图8：在盲试验中使用临床样品进行验证并与临床诊断结果相比较。在全部中，随机组合38种病例(各自包括血清样品和核酸样品，定义为样品号1-38)。用便携式荧光分析仪检测荧光强度。IgG表示使用我们的方法的IgG的检测；RNA表示使用我们的方法的SARS-CoV-2 RNA的检测；化学发光表示使用化学发光的IgG的临床检测；RT-PCR表示使用RT-PCR的SARS-CoV-2 RNA的临床检测。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
定义
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。
本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
术语“抗体”与“免疫球蛋白(Ig)”可互换使用。基本的4链抗体单位是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白。除非另有说明，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且具体包括抗体的所有同种型、亚类和形式，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体及其片段，优选抗原结合片段。术语“抗体”可以包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、单链分子以及抗体片段(例如Fab、F(ab')和Fv)。术语“抗体”还可以包括天然人和非人IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”是指结合部分与结合靶标的结合，如抗体与靶抗原(例如特定多肽、肽或其他靶标(例如，糖蛋白靶标)上的表位)的结合，且表示不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可为与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)的可测量的结合。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，或脱氧核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、控制区，任何序列、核酸探针和引物的分离RNA。核酸分子可以是线性的或环状的。
如本文所用，术语“引物”及其派生词通常是指可与所关注靶序列杂交的任何核酸。通常，引物用作底物，核苷酸可通过聚合酶聚合到该底物上或核苷酸可连接到该底物；然而，在一些实施方案中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。
如本文所用，术语引物的“修饰物”可以理解为在引物的5'端、3'端或和内部添加的修饰物。修饰物可以是可检测的标记物，一般检测条件下，能够提供检测信号的任何组分，包括直接和间接可检测的标记物，例如包括可通过光谱，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学，化学或其它手段间接或直接检测的任何组分。例如，抗原标记(例如地高辛，荧光素，二硝基苯酚等，用于用标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素，荧光染料(例如荧光素，德士古红，罗丹明，荧光团标记如阿利克斯Fluor标记等)，荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等)，螯合金属的合成聚合物，比色标记等。
如本文所用，术语“扩增子”当用于提及核酸时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可通过使用核酸或其扩增子作为模板的多种扩增方法中的任一种产生，所述扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、连接延伸或连接酶链反应。
如本文所用，“蛋白质”或“蛋白”是一种多肽(即至少两个氨基酸通过肽键相互连接)。蛋白质可以包括氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以其他方式处理或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(有或无信号序列)，或者可以是其功能部分。普通技术人员将进一步认识到，蛋白质有时可以包括多个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接。
如本文所用，术语“样品”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何物质，包括生物样品。如本文所用，“生物样品”是指从活的或病毒性(或朊病毒的)来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括可以从之获得核酸、蛋白质和/或其他大分子的受试者的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或者是被处理的样品。例如，被扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括，但不限于，体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样品、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样品，以及由此衍生出的加工样品。
如本文所用，术语“Ag”是抗原的英文简称。
如本文所用，术语“受试者”是指人或非人生物体，优选受试者是人类，最优选是“患者”。
如本文所用，术语“诊断”是指本领域技术人员通过其可估计和/或确定患者是否患有给定的疾病或病状的可能性的方法。这里的“诊断”是“确定”，但不意味着暗示诊断是100％准确。
如本文所用，术语“病原体”是指能够在受试者中诱导传染性疾病的任何病原体或病原体片段。在一些实施方案中，病原体是传染性微生物(其选自于细菌、真菌，病毒和寄生虫)或其片段。病原体可包括完整的传染性病原体细胞，或病原体细胞的一部分，例如传染性微生物的细胞壁组分。
如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCoV”、“SARS-CoV-2”是指因2019年病毒性肺炎病例而被发现的冠状病毒新毒株，且由国际病毒分类委员会(InternationalCommittee onTaxonomy of Viruses，ICTV)宣布其正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。
如本文所用，术语“S蛋白”、“N蛋白”、“E蛋白”和“M蛋白”是位于新型冠状病毒SARS-CoV-2上的结构蛋白。新型冠状病毒SARS-CoV-2由多种结构蛋白组成，包括刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)、囊膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)、膜蛋白(Membraneprotein，M蛋白)和核蛋白(Nucleocapsid protein，N蛋白)，其中N蛋白是含量最丰富和最保守的蛋白，其主要分布在病毒内部。S蛋白是病毒体外壳上的I类病毒融合蛋白，通过识别宿主细胞受体并介导病毒和细胞膜融合来在病毒感染中发挥关键作用。
如本文所用，SARS-CoV-2的“ORF1ab基因”、“S基因”、“E基因”、“M基因”和“N基因”，其中ORF1ab基因为编码参与病毒RNA转录和复制的多功能蛋白的基因，E基因为编码囊膜蛋白的基因，M基因为编码膜蛋白的基因，N基因为编码核蛋白的基因，S基因为编码刺突蛋白的基因。
如本文所用，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因新型冠状病毒感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
材料和仪器
小鼠抗人IgG抗体购自杭州伊佰新生物技术有限公司(Ebiocore BiologicalTechnology Co.,Ltd.(杭州，中国))。抗地高辛抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司。SARS-CoV-2刺突蛋白(抗原)和标准SARS-CoV-2 IgG获得自菲鹏生物股份有限公司(Fapon Biological Co.,Ltd.(东莞，中国))。样品缓冲液(0.04mM PBS，pH 7.4，0.02％TX-100)购自上海速创诊断产品有限公司(Shanghai Suchuang Diagnostic Products Co.,Ltd.(上海，中国))。Fluoro-MaxTM羧基修饰荧光微粒(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，尺寸为200nm，荧光最佳激发波长为333nm，发射波长为613nm，下文具体的实施例和测试例中简称为FMS)、链霉亲和素、和sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)获得自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(上海，中国)。1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和牛血清白蛋白(BSA)购自西格玛奥德里奇贸易有限公司(Sigma Aldrich Trading Co.,Ltd.(上海，中国))。2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES钠盐)获得自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.(上海，中国))。微流控芯片由上海速创诊断产品有限公司制造。50×TAE缓冲液(B548101)、6×DNA上样缓冲液(B540084)、和琼脂购自上海生工生物工程股份有限公司。DNA标记物(DNA Marker)(BSA30S1 Bio S50)由杭州博日科技有限公司(Hangzhou Bioer Technology Co,.Ltd(杭州，中国))提供。携带SARS-CoV-2 N基因的1,260bp片段的质粒和用于RPA反应的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。逆转录酶(MD301)获得自菲鹏生物股份有限公司。YeaRed核酸凝胶染料(10202ES76)获得自翌圣生物科技股份有限公司(Yeasen Biotechnology(上海，中国))。超纯水用于所有实验。
便携式微流控芯片仪器获得自上海速创诊断产品有限公司并且由三部分组成：具有离心功能的微流控芯片底座支架，激光诱导荧光检测器，和显示器。电泳仪器(Tanon EPS300，上海，中国)用于分析核酸扩增产物。
收集所有的临床血清和咽拭子样品并由青岛出入境检验检疫局(QingdaoAdministration of Entry&Exit Inspection and Quarantine Bureau)进行试验。在项目开始时获得书面的知情同意书。遵照青岛出入境检验检疫局的医学研究伦理委员会进行使用临床样品的实验。按照厂商的说明，用市售试剂盒从咽拭子提取RNA。直接检验所有提取的样品和血清样品，并且在-80℃下贮存所有额外的样品用于进一步的研究。
实施例：微流控芯片的制备及原理
1、荧光微粒与捕获抗体的缀合
通过使用EDC和sulfo-NHS激活的酰胺键形成来实现抗地高辛和抗人IgG抗体与FMS的缀合；过程参考先前的文献[23]。
简要地，通过超声处理2分钟将50μL的FMS分散于1,000μL的MES缓冲液(0.05M，pH6.1)中。通过在25℃下将20μL的新鲜制备的1mg/mL EDC和50μL的1mg/mL sulfo-NHS混合30分钟来激活FMS。通过在15,000rpm下离心35分钟来去除过量的试剂(4℃)。通过超声处理2分钟将羧基激活的FMS重悬浮于1,000μL的MES缓冲液。然后，将53.3μg的抗地高辛抗体或小鼠抗人IgG抗体添加至激活的FMS并在30℃下培养150分钟。通过添加100μL的0.5M甘氨酸和100μL的10％BSA并在30℃下培养30分钟来阻断非特异性结合位点。离心后，纯化由抗地高辛抗体或小鼠抗人IgG抗体标记的FMS并重悬浮于含有3％海藻糖和1％BSA的PBS缓冲液中，并在4℃下贮存用于进一步的研究。
2、微流控芯片的制备
设计微流控芯片(长度×宽度×高度，55mm×35mm×5.2mm)，并通过组装夹着包含样品流动通道的芯片中间层的芯片上层和芯片下层聚碳酸酯板来制造，所述芯片中间层由双面胶带制成[23]。微流控芯片的具体结构及制备方法参照专利公开号为CN110773246A的中国专利申请(发明名称为：一种微流控芯片及用于高敏肌钙蛋白检测的试剂盒；申请号为：201911060541.2)中所公开的。简要地，微流控芯片包含叠置的三层，芯片上层包含加样区，芯片下层设有凹槽，芯片中间层为双面胶层，双面胶层上用有胶区和无胶区分隔出样本流动通道，样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，其中加样孔区与芯片上层的加样区相对应，废液槽区至少覆盖芯片下层的凹槽，所述流道检测区为弧形，芯片下层还设有加样孔。在芯片下层对应于芯片中间层流道检测区的位置处进行点样。与专利公开号为CN110773246A的中国专利申请不同的是，本实施例中，顺着样本流动的方向，依次设置捕获区、第一检测区和第二检测区。其中，将0.5μL试样的1mg/mL SARS-CoV-2刺突蛋白(用于IgG检测的抗原)点样在微流控芯片的芯片下层上的第一检测区；还将0.5μL的0.1mg/mL链霉亲和素(用于SARS-CoV-2 N基因检验)点样在第二检测区。将包被有小鼠抗人IgG捕获抗体的FMS和包被有抗地高辛抗体的FMS的混合物(总体积3μL，各自1.08mg/mL)点样在捕获区。然后在37℃下干燥经点样的芯片下层1小时。使用双面粘合剂层组装免疫测定微流控芯片并在37℃下培养12小时。最终，在4℃下贮存制备的微流控芯片用于进一步的使用。
3、微流控芯片中RPA与免疫测定的整合
靶向SARS-CoV-2 N基因的RPA引物详细描述于先前的文献[27]。基于略微修改的RPA手册、用TwistAmpTM基础试剂盒(TwistDx,Cambridge,UK)进行RPA反应。制备31.9μL试样的RPA反应缓冲液，其包含1.4μL的10μM地高辛修饰的正向引物和10μM生物素修饰的反向引物的混合物、29.5μL的缓冲液、和1μL的逆转录酶。然后，将3.2μL的RPA反应缓冲液添加至微流控芯片并在42℃下预培养1分钟。然后，将1.8μL体积的包含0.25μL的280nM醋酸镁的核酸样品添加至微流控芯片，立即密封样品加载腔室。在42℃下培养芯片15分钟。然后，将临床样品(例如，血清)或标准IgG样品(二者都与样品缓冲液混合)添加至样品加载腔室，并允许在室温下反应10分钟。最后，通过便携式微流控芯片分析仪检测结果。
更具体地，图1中说明了本发明侧向层析微流控系统的主要原理。首先，将3.2μL的RPA反应缓冲液加载至样品加载腔室，然后加载1.8μL的在14mM乙酸镁(终浓度)中的核酸样品；然后密封腔室。在42℃下进行RPA反应15分钟。用于本实施例中的对SARS-CoV-2 N基因进行RPA扩增的引物和扩增子序列见下表1。
表1.靶向SARS-CoV-2 N基因的RPA的引物和扩增子序列
RPA反应后，获得两末端分别具有地高辛修饰末端和生物素修饰末端的RPA扩增子，将以1:4的比在样品缓冲液中稀释的临床血清样品(终体积100μL)添加至样品加载腔室，用防水和透气膜快速密封腔室以防止气溶胶污染同时确保液体流动。随着液体流过捕获区。临床血清样品中的IgG被小鼠抗人IgG(即，图1中的捕获抗体)标记的FMS捕获；类似地，RPA扩增子的地高辛修饰末端被抗地高辛抗体标记的FMS特异性识别并捕获。由于FMS的大的纳米级尺寸(如在本实施例中使用的直径为200nm的FMS)，形成的FMS复合物在毛细血管作用下随着流动不断迁移。当液体流过第一检测区(IgG)时，捕获临床血清样品中的人IgG的标记有小鼠抗人IgG的FMS，通过SARS-CoV-2刺突蛋白和被捕获的临床血清样品中的人IgG之间的抗原-抗体相互作用变得固定化。其后，SARS-CoV-2 N基因的RPA扩增子的生物素修饰末端由链霉亲和素结合并在第二检测区中形成夹心型免疫复合物。在室温下进行侧向免疫层析检验10分钟，由便携式荧光分析仪检测微流控免疫测定芯片。从样品应用至结果的整个过程花费小于30分钟，消除多个洗涤步骤，极大地简化操作，并减少时间和花费。
测试例1
本测试例通过标准样品验证实施例中制备的用于同时检测核酸和蛋白质的侧向层析芯片。如图2所示，应用100μL的无RPA扩增子和IgG(空白)的样品缓冲液，在用于IgG检测的第一检测区(在～150mm)或用于核酸检测的第二检测区(在～230mm)(空白)中不产生信号。在微流控芯片中试验了与具有1,000拷贝/μL N基因模板(RNA阳性)的RPA反应物结合的IgG阳性和IgG阴性样品。在第一检测区中，对于IgG阳性样品检测到强荧光信号(IgG(+)RNA(+))，对于IgG阴性样品未检测到信号(IgG(-)RNA(+))。在第二检测区中产生显著信号。类似地，当在微流控芯片上检测与无SARS-CoV-2 N基因(RNA阴性)的RPA反应物结合的IgG阳性和IgG阴性样品时，在第一检测区中，对于IgG阳性样品获得强荧光信号(IgG(+)RNA(-))，对于IgG阴性样品未观察到信号(IgG(-)RNA(-))。第二检测区未产生显著信号，因为样品为RNA阴性。这些结果表明，本发明实施例提供的芯片/方法可用于同时检测核酸和蛋白质，从而增强诊断的准确性和灵敏度。
测试例2
本测试例检测按照实施例中的方法制备的检测SARS-CoV-2的芯片系统对于单独的RPA反应物的核酸检测灵敏度，略不同于实施例制备的芯片，本测试例中的微流控芯片的第一和第二检测区分别点样有链霉亲和素和SARS-CoV-2刺突蛋白(抗原)。在RPA反应缓冲液中，将SARS-CoV-2 N基因系列稀释至1、10、100、1,000、和10,000拷贝/μL的终浓度。在42℃下使5μL试样的各个标准样品反应15分钟。然后，将100μL的样品缓冲液添加至各个芯片以使RPA扩增子流过检测区；免疫测定反应10分钟。其中，捕获区点样有由抗地高辛标记抗体的FMS和小鼠抗人IgG标记的FMS的混合物。这里，第一和第二检测区分别点样有链霉亲和素和SARS-CoV-2刺突蛋白(抗原)。检测结果示于图3A。从1至10,000拷贝/μL的所有稀释下的标靶在第一检测区(～150mm)中产生增加的荧光信号，而在第二检测区(～230mm)中未检测到信号。当应用阴性对照(无模板的RPA反应物)时，在两个检测区未检测到信号或检测到非常弱的信号。这些结果表明，本发明提供的微流控芯片平台能够以单拷贝灵敏度检测核酸，并且这不干扰第二检测区中的蛋白质的检测。图3B中的结果表明荧光强度和靶浓度(范围1至10,000拷贝/μL，R2＝0.996)的对数值之间的良好的线性关系。在PCR管中在42℃下15分钟产生的RPA扩增子(120bp)的电泳结果(图3C)进一步表明基于微流控芯片的免疫-RPA法的可行性和单拷贝灵敏度。
测试例3
本测试例检测了实施例中制备的微流控芯片用于检测SARS-CoV-2特异性IgG的性能。将标准SARS-CoV-2 IgG抗体在PBS中稀释至1、10、25、100、500、和1,000ng/mL，并使用微流控芯片进行试验(10分钟，室温)。在本测试例中，第一和第二检测区分别点样有SARS-CoV-2刺突蛋白(抗原)和链霉亲和素。捕获区点样有抗地高辛抗体标记的FMS和小鼠抗人IgG抗体标记的FMS的混合物，如前所述。图4A显示不同浓度的IgG的荧光曲线。该微流控芯片的最低检出限为1ng/mL。在用于核酸检测的第二检测区中无信号或有非常低的信号。观察到IgG浓度和荧光强度之间的显著关系–1至1,000ng/mL：y＝2553.22-2448.37/(1+(x/93.172)^1.579)，R2＝0.998；1至100ng/mL：y＝75.15+12.99x，R2＝0.986。这些结果表明该平台在宽范围内的定量检测能力(图4B)。
测试例4：稳定性评价
稳定性对于诊断方法来说是重要的。因此，在本测试例中，通过同时检测高浓度样品(1,000ng/mL标准SARS-CoV-2 IgG和10,000拷贝/μL SARS-CoV-2 N基因)和低浓度样品(1ng/mL标准SARS-CoV-2 IgG和1拷贝/μL SARS-CoV-2 N基因)来评价实施例中制备的微流控芯片的稳定性和再现性。图5中的A和B显示使用高浓度样品和低浓度样品的10个重复实验的结果。高浓度样品的检验内变异系数(CV)为12.99％和10.58％，低浓度样品的CV为25.74％和13.33％，表明本发明实施例制备的芯片/方法的良好稳定性和重复性。
测试例5：抗干扰能力评价
抗干扰能力也是重要的性能参数，因为通常在临床样品中发现的许多干扰物质可影响检验的精度。在本测试例中，以甘油三酯、血红蛋白和胆红素为常见干扰物质，评价实施例中制备的微流控芯片同时检测核酸和蛋白质时的干扰程度。图5中的C和D显示这些物质的干扰是可忽略的，表明本发明实施例提供的微流控芯片具有良好的选择性和强抗干扰能力。
测试例6：临床样本测试
在本测试例中，24个血清样品和24个核酸样品(分别由化学发光法和RT-PCR确证)用于评价实施例中制备的侧向免疫层析芯片(即，微流控芯片)。如图6中的A所示，对于COVID-19阴性个体(n＝5)，IgG或SARA-CoV-2 RNA未观察到信号。试验了7个阳性血清样品和7个阴性核酸样品。在第一检测区中产生对于IgG的荧光信号，而第二检测区中无信号(图6中的B)。类似地，5个阴性血清样品和5个阳性核酸样品仅在第二检测区中产生SARS-CoV-2RNA信号(图6中的C)。此外，对于7个阳性血清样品和7个阳性核酸样品检测来自IgG和SARS-CoV-2 RNA二者的荧光信号，如图6中的D所示。此外，当将健康个体与IgG阳性病例和SARS-CoV-2 RNA阳性病例相比较时，曼-惠特尼非参数检验对于IgG和SARS-CoV-2 RNA二者给出p<0.0001(图7A和图7B)。这些结果表明，本发明实施例提供的芯片的检验结果与临床确证的结果的高度一致，表明本发明提供的基于芯片的侧向免疫层析检验具有同时检测IgG(蛋白质生物标记物)和SARS-CoV-2 RNA的用于COVID-19诊断的巨大潜能。
在本测试例中，进一步用38组样品(定义为样品号1-38)的盲法临床试验评价微流控芯片，并将结果与标准方法(用于SARS-CoV-2 RNA检测的RT-PCR法和用于SARS-CoV-2IgG检测的化学发光法)相比较。如图8所示，本发明实施例提供的芯片/方法通常符合临床试验结果；除了对于样品19中的核酸有弱假阳性信号和对于样品38中的核酸有假阴性信号。本发明实施例提供的芯片/方法对于诊断COVID-19显示97.0％灵敏度和100％特异性(表2)，其中灵敏度＝32/(32+1)×100％＝97.0％,，特异性＝5/(5+0)×100％＝100％。这些值是根据以下标准计算得出的：当RNA或IgG测试呈阳性时，诊断为COVID-19阳性。上述结果表明，本发明提供的芯片及方法极大地增加了COVID-19诊断的精度和灵敏度，并且其有希望用于其它病原体的检测。
表2.采用微流控芯片的方法和临床诊断结果的比较。
综上所述，本发明开发了用于同时检测核酸和蛋白质的侧向免疫层析芯片。使用单个芯片实现了RPA检验和免疫测定。评价了开发的芯片并用于诊断COVID-19。由本方法获得的结果与临床诊断结果高度一致。本发明提供的易于使用的芯片及其方法使得具有高灵敏度和快速(30分钟)的多生物标记物检测变为可能。本发明提供的低成本、即时病原体筛选芯片及方法具有在一系列医学诊断中的潜在应用。
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序列表
<110> 复旦大学
上海速创诊断产品有限公司
上海速芯生物科技有限公司
<120> 一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途
<130> 6595-2183635I-SH
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
agacattttg ctctcaagct g 21
<210> 3
<211> 98
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒
<400> 3
ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 60
tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtct 98

Claims (20)

1.一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的微流控芯片包括：
样品加载腔室，其用于包含第一生物样品的重组酶聚合酶扩增反应物的加载以及第二生物样品的加载；以及
样本流动通道，其包括流道检测区，所述的流道检测区用于侧向免疫层析反应；
其中，所述的重组酶聚合酶扩增反应物中包括用于扩增第一生物样品中待测核酸的正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物分别具有第一修饰物和/或第二修饰物，且所述的正向引物和反向引物所具有的修饰物不同；
在所述的流道检测区中，沿流体在微流控芯片中的流动方向，依次设置有捕获区、第一检测区和第二检测区；
所述的捕获区包括包被有捕获抗体的荧光微粒和包被有与第一修饰物特异性结合的分子的荧光微粒；
所述的第一检测区和第二检测区分别包括与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子和/或与第二修饰物特异性结合的分子。
2.根据权利要求1所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的第一修饰物和与第一修饰物特异性结合的分子选自：地高辛和抗地高辛抗体、生物素和亲和素/链霉亲和素以及荧光素和抗荧光素抗体；所述的第二修饰物和与第二修饰物特异性结合的分子选自：地高辛和抗地高辛抗体、生物素和亲和素/链霉亲和素以及荧光素和抗荧光素抗体；且所述的第一修饰物和与第一修饰物特异性结合的分子，与所述的第二修饰物和与第二修饰物特异性结合的分子不相同。
3.根据权利要求1或2所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的待测核酸为病原体核酸；所述的待测蛋白质为人抗病原体的特异性抗体或病原体抗原。
4.根据权利要求3所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，当所述的待测蛋白质为人抗病原体的特异性抗体时，所述的捕获抗体为抗人抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为来自病原体的抗原。
5.根据权利要求4所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的抗人抗体选自抗人IgM抗体、抗人IgD抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体或抗人IgE抗体。
6.根据权利要求3所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，当所述的待测蛋白质为病原体抗原时，所述的捕获抗体为抗病原体抗原的第一抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为抗病原体抗原的第二抗体。
7.根据权利要求6所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的第一抗体和所述的第二抗体针对该病原体抗原的不同表位。
8.根据权利要求3所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
9.根据权利要求8所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的病原体为SARS-CoV-2。
10.根据权利要求9所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的待测核酸为来自SARS-CoV-2的ORF1ab基因、S基因、E基因、M基因和N基因的核酸。
11.根据权利要求9所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，其特征在于，所述的待测蛋白质为人抗SARS-CoV-2的特异性抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为来自SARS-CoV-2的抗原；或者，
所述的待测蛋白质为SARS-CoV-2抗原，所述的捕获抗体为抗SARS-CoV-2抗原的第一抗体，所述的与第二生物样品中待测蛋白质特异性结合的分子为抗SARS-CoV-2抗原的第二抗体。
12.一种同时检测核酸和蛋白质的方法，其基于权利要求1-11中任一项所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片，所述的方法包括以下步骤：
1)将重组酶聚合酶扩增反应缓冲液与第一生物样品添加至样品加载腔室，在样品加载腔室中进行重组酶聚合酶扩增反应；
2)重组酶聚合酶扩增反应结束后，将通过样品缓冲液稀释的第二生物样品添加至样品加载腔室，使样品加载腔室中的流体沿样本流动通道流动，依次经过捕获区、第一检测区和第二检测区；
3)离心后，通过荧光分析仪检测微流控芯片的第一检测区和第二检测区的荧光信号。
13.根据权利要求12所述的同时检测核酸和蛋白质的方法，其中，在步骤2)中，添加通过样品缓冲液稀释的第二生物样品后，在室温下反应2～20分钟，使样品加载腔室中的流体沿样本流动通道流动。
14.一种检测试剂盒，其包括如权利要求1-11中任一项所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片。
15.如权利要求1-11中任一项所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片在制备用于同时检测病原体的核酸以及抗原或抗体的试剂盒的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的病原体为SARS-CoV-2。
18.如权利要求1-11中任一项所述的同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片在制备用于诊断受试者是否感染病原体的试剂盒中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述的病原体为SARS-CoV-2。
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