CN116162538B - 一种同时检测蛋白和rna的微流控芯片及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明提供了同时检测蛋白和RNA的微流控芯片，包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具；固定流道层上有若干组“I”型固定流道组，“I”型固定流道组中的每个“I”型固定流道与载玻片共同形成固定捕获探针或捕获蛋白的“I”型空腔；通用流道层上有至少一个“Y”型通用流道，每个“Y”型通用流道与载玻片共同形成检测待检样本的“Y”型空腔。将“I”型固定流道和“Y”型通用流道结合可以同时检测蛋白和RNA，还可以将多种捕获探针和捕获蛋白分区，使不同靶标蛋白和靶标RNA在不同区域进行反应，以实现对靶标的定性和定量检测。

Description

一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
抗原检测和核酸检测是疾病诊断的两种主要方法，在疾病发生发展过程中，两者可以相互补充，在诊断中充分展现疾病的全貌。例如，在SARS-CoV-2的检测中，在患者感染的急性期可在唾液或鼻咽拭子等临床样本中检测到病毒RNA，在康复后的唾液、血清等临床样本中可检测到IgG抗体等血清学生物标志物。然而大部分研究都只对蛋白或核酸的某一类进行检测，从而判断相关疾病进程，很少有研究同时关注二者。根据文献报道，对同一疾病的多种标志物联合使用可提高敏感性，可随着疾病进展为临床疾病监测和管理提供更有价值的结果。
但是目前结合血清学和核酸检测的诊断流程存在很多难点，因为这些检测需要移液器、离心机和加热模块等仪器设备，以及专业的操作。以ELISA和RT-qPCR两种血清学检测和核酸检测的金标准检测方法为例，两者有很多区别。1)样品处理：ELISA样品不需要纯化，qPCR检测需要核酸提取纯化。2)反应温度：ELISA反应温度多为37℃，qPCR反应温度约为60-95℃。3)操作程序：ELISA实验需要多次孵育、清洗和换液等操作，而qPCR是所有试剂混合在一起后，在PCR仪中进行变性-退火-延伸等步骤。
已经有一些同时检测蛋白质和核酸的方法，但都存在一些不足。包括对样品的预处理不适合实际样品的检测，或是需进行复杂的预处理。Devora Najjar等人利用电化学生物传感器设计了一个LOC诊断平台，能够同时检测唾液样本中的SARS-CoV-2核酸和宿主抗体，但该方法需要将样品分成两份分别进行核酸和蛋白质检测；同一样品同时发生蛋白质和核酸反应的问题并没有得到解决。因此，蛋白和核酸同时检测的方法仍需要进一步探索，以便更快且更准确的用于疾病的早期诊断。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片，所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具；所述上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置；所述上层夹具开设有贯穿上层夹具的第一加样或离样口和第二加样或离样口；所述通用流道层与载玻片相贴的一面为“Y”型通用流道面，与上层夹具相贴的一面为进样或出样孔面；所述“Y”型通用流道面上设有至少一个“Y”型通用流道，“Y”型通用流道与载玻片共同形成供待检样本流动的“Y”型空腔；所述“Y”型通用流道包括第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道，所述第二通用流道和第三通用流道的末端连通且连通处与第一通用流道相连通；所述第一通用流道远离连通处的一端设有第一进样或出样孔，第二通用流道远离连通处的一端设有第二进样或出样孔，第三通用流道远离连通处的一端设有第三进样或出样孔；所述第一进样或出样孔、第二进样或出样孔和第三进样或出样孔贯穿通用流道层；所述上层夹具的第一加样或离样口与通用流道层上的第一进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第一进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第二加样或离样口与通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔加样或离样；所述载玻片对应第二通用流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白；所述载玻片对应第三通用流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针；所述下层夹具上开设有用于检测荧光强度的检测孔；
或者，所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具；所述上层夹具、固定流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置；所述上层夹具开设有贯穿上层夹具的第一加样或离样口、第二加样或离样口、第三加样或离样口和第四加样或离样口；所述通用流道层与载玻片相贴的一面为“I”型固定流道面，与上层夹具相贴的一面为进样或出样孔面；所述“I”型固定流道面上设有若干组“I”型固定流道组，每组“I”型固定流道组包含两个“I”型固定流道，分别为第一“I”型固定流道和第二“I”型固定流道；所述第一“I”型固定流道的两端分别设有第四进样或出样孔和第五进样或出样孔，所述第二“I”型固定流道的两端分别设有第六进样或出样孔和第七进样或出样孔；所述第四进样或出样孔、第五进样或出样孔、第六进样或出样孔和第七进样或出样孔贯穿固定流道层；所述上层夹具的第三加样或离样口与固定流道层上的第四进样或出样孔和第六进样或出样孔对应设置，用于对固定流道层上的第四进样或出样孔和第六进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第四加样或离样口与固定流道层上的第五进样或出样孔和第七进样或出样孔对应设置，用于对固定流道层上的第五进样或出样孔和第七进样或出样孔加样或离样；所述载玻片对应第一“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白；所述载玻片对应第二“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针；所述通用流道层的一面为“Y”型通用流道面，另一面为进样或出样孔面；所述“Y”型通用流道面上设有至少一个“Y”型通用流道；所述“Y”型通用流道包括第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道，所述第二通用流道和第三通用流道的末端连通且连通处与第一通用流道相连通；所述第一通用流道远离连通处的一端设有第一进样或出样孔，第二通用流道远离连通处的一端设有第二进样或出样孔，第三通用流道远离连通处的一端设有第三进样或出样孔；所述第一进样或出样孔、第二进样或出样孔和第三进样或出样孔贯穿通用流道层；所述上层夹具的第一加样或离样口与通用流道层上的第一进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第一进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第二加样或离样口与通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔加样或离样；所述下层夹具上开设有用于检测荧光强度的检测孔。
在本发明的一种实施方式中，所述通用流道层为PDMS通用流道层。
在本发明的一种实施方式中，所述固定流道层为PDMS固定流道层。
在本发明的一种实施方式中，所述通用流道层的厚度为2-5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述固定流道层的厚度为2-5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“Y”型通用流道的高度为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“I”型固定流道的高度为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“Y”型通用流道的宽度为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“I”型固定流道的宽度为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“Y”型通用流道的第一进样或出样孔、第二进样或出样孔和第三进样或出样孔的直径为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述“I”型固定流道的第四进样或出样孔和第五进样或出样孔的直径为0.1-1.5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述载玻片使用化学试剂改变载玻片表面基团，使其更亲水。
在本发明的一种实施方式中，所述上层夹具的厚度为5-10mm。
在本发明的一种实施方式中，所述上层夹具的材料为铝、有机玻璃(PMMA)或石英玻璃。
在本发明的一种实施方式中，所述下层夹具的厚度为5-10mm。
在本发明的一种实施方式中，所述下层夹具的材料为铝、有机玻璃(PMMA)或石英玻璃。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法为：使通用流道层的“Y”型通用流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定通用流道层和载玻片，通过第二加样或离样口将捕获蛋白加入第二进样或出样孔，使得捕获蛋白流入第二通用流道和载玻片形成的空腔中；通过第二加样或离样口将捕获探针加入第三进样或出样孔，使得捕获探针流入第三通用流道和载玻片形成的空腔中；孵育至载玻片对应第二通用流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白，并且载玻片对应第三通用流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法中，所述通用流道层和载玻片的修饰面贴合。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法中，还包括在所述通用流道层的“Y”型通用流道面和载玻片一面贴合后，紧压以赶走气泡。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法为：使固定流道层的“I”型固定流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定载玻片和固定流道层，通过第三加样或离样口将捕获蛋白加入第四进样或出样孔，使得捕获蛋白流入第一“I”型固定流道和载玻片形成的空腔中；通过第三加样或离样口将捕获探针加入第六进样或出样孔，使得捕获探针流入第二“I”型固定流道和载玻片形成的空腔中；孵育至载玻片对应第一“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白，并且载玻片对应第二“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法中，所述通固定流道层和载玻片的修饰面贴合。
在本发明的一种实施方式中，当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法中，还包括在所述固定流道层的“I”型固定流道面和载玻片一面贴合后，紧压以赶走气泡。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述捕获蛋白和捕获探针使用1×PBS缓冲液稀释。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述捕获蛋白和捕获探针的加入量各为5μL。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述捕获探针的浓度为10μM。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述捕获蛋白的浓度为10mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述将捕获蛋白和捕获探针固定在载玻片上的方式为生物反应连接，物理吸附，化学吸附或化学反应连接。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述捕获探针和捕获蛋白与载玻片的化学反应连接的结合条件为：25～37℃下孵育3～12h。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，捕获探针和捕获蛋白和载玻片化学反应连接的结合条件为：37℃孵育8-12h。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，还包括将所述捕获蛋白和捕获探针固定在载玻片上后，加入封闭液并孵育。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述封闭液的加入方法为：通过第一加样或离样口封闭第一进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将待检样本加入第三进样或出样孔。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，蠕动泵以20μL/min的流速加入封闭液。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述封闭液包括50mM的Tris和质量分数为1％的BSA水溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述封闭液的孵育条件为37℃，孵育30min。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，还包括在加入所述封闭液前后，分别用清洗液清洗。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述清洗液用量为2-5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，使用所述清洗液清洗时，重复三遍。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述清洗液为纯水。
在本发明的一种实施方式中，所述固定捕获蛋白和捕获探针的方法中，所述清洗液为1×PBS缓冲液。
本发明还提供了一种同时检测蛋白和RNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述微流控芯片、蛋白检测试剂、RNA检测试剂和荧光反应试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白检测试剂包括捕获蛋白和HRP标记的标记蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述RNA检测试剂包括捕获探针、DNA聚合酶、RNaseH、dNTPs(Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP)和HRP标记的链霉亲和素。
在本发明的一种实施方式中，所述所述捕获探针的3′端为氨基修饰，中间是RNA，两端是DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶是Klenow exo-，Bsu大片段，phi29或Bst大片段。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光反应试剂包括荧光素、花青、罗丹明、AlexaFluor或iFluorTM染料。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光反应试剂为PSA反应试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述PSA反应试剂包括双氧水、Tris-Hcl、iFluorTM染料和PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述PSA反应试剂包括3％(v/v)双氧水，20mM的Tris-Hcl，100×iFluorTM染料和1×PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述iFluorTM染料为iFluorTM 350，iFluorTM 405，iFluorTM 430，iFluorTM 440，iFluorTM 450，iFluorTM 460，iFluorTM 488，iFluorTM 514，iFluorTM 532，iFluorTM 546，iFluorTM 555，iFluorTM 560，iFluorTM 568，iFluorTM 594，iFluorTM 597，iFluorTM 610，iFluorTM 633，iFluorTM 647或iFluorTM 660。
本发明还提供了一种同时检测蛋白和RNA的方法，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，所述方法包括如下步骤：
步骤一：使用上述微流控芯片，通过第一加样或离样口封闭第一进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将待检样本加入第三进样或出样孔，使得待检样本依次流入第三通用流道和第二通用流道，经孵育，若待检样本中含有靶标蛋白，则靶标蛋白与载玻片对应于第二通用流道的位置上固定的捕获蛋白特异性结合，若待检样本中含有靶标RNA，则靶标RNA与载玻片对应于第三通用流道的位置上固定的捕获探针特异性结合；
步骤二：步骤一结束后，通过第一加样或离样口放开第一进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔；使用蠕动泵通过第二加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液依次流入第三通用流道和第一通用流道，以清洗第一通用流道及第三通用流道；
步骤三：步骤二结束后，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将DNA聚合酶、RNaseH、Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP加入第三进样或出样孔，使其流入第三通用流道，经孵育，若靶标RNA已与捕获探针特异性结合，则靶标RNA能够以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段；
步骤四：步骤三结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤五：步骤四结束后，通过第二加样或离样口封闭第三进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的标记蛋白加入第二进样或出样孔，经孵育，若靶标蛋白已与捕获蛋白特异性结合，则HRP标记的标记蛋白能够与靶标蛋白结合；
步骤六：步骤五结束后，通过第二加样或离样口放开第三进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔，经孵育，若靶标RNA已经以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段，则HRP标记的链霉亲和素能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上与靶标RNA上的生物素结合；
步骤七：步骤六结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤八：步骤七结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将荧光反应试剂加入第一进样或出样孔，使得荧光反应试剂流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与HRP标记的标记蛋白结合和/或靶标RNA已与HRP标记的链霉亲和素结合，则荧光反应剂能够与靶标蛋白和/或靶标RNA上的HRP结合；
步骤九：步骤八结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤十：步骤九结束后，吹干清洗过的第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道并检测第二通用流道和第三通用流道的荧光强度；
当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，所述方法包括如下步骤：
步骤一：使用上述的微流控芯片，将上层夹具、固定流道层、载玻片和下层夹具分离，将上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置并组装：通用流道层的“Y”型通用流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定通用流道层和载玻片，“Y”型通用流道与载玻片共同形成供试剂流动的“Y”型空腔；
步骤二：步骤一结束后，通过第一加样或离样口封闭第一进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将待检样本加入第三进样或出样孔，使得待检样本依次流入第三通用流道和第二通用流道，经孵育，若待检样本中含有靶标蛋白，则靶标蛋白与载玻片对应于第二通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置以及第三通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置上固定的捕获蛋白特异性结合，若待检样本中含有靶标RNA，则靶标RNA与载玻片对应于第二通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置以及第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上固定的捕获探针特异性结合；
步骤三：步骤二结束后，通过第一加样或离样口放开第一进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔；使用蠕动泵通过第二加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液依次流入第三通用流道和第一通用流道，以清洗第一通用流道及第三通用流道；
步骤四：步骤三结束后，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将DNA聚合酶、RNaseH、Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP加入第三进样或出样孔，使其流入第三通用流道，经孵育，若靶标RNA已与捕获探针特异性结合，则靶标RNA能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上，以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段；
步骤五：步骤四结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤六：步骤五结束后，通过第二加样或离样口封闭第三进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的标记蛋白加入第二进样或出样孔，使其流入第二通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与捕获蛋白特异性结合，则HRP标记的标记蛋白能够在载玻片对应于第二通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置上与靶标蛋白结合；
步骤七：步骤六结束后，通过第二加样或离样口放开第三进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔，经孵育，若靶标RNA已经以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段，则HRP标记的链霉亲和素能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上与靶标RNA上的生物素结合；
步骤八：步骤七结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤九：步骤八结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将荧光反应试剂加入第一进样或出样孔，使得荧光反应试剂流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与HRP标记的标记蛋白结合和/或靶标RNA已与HRP标记的链霉亲和素结合，则荧光反应剂能够与靶标蛋白和/或靶标RNA上的HRP结合；
步骤十：步骤九结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤十一：步骤十结束后，吹干清洗过的第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道并检测第二通用流道和第三通用流道的荧光强度。
在本发明的一种实施方式中，使用堵头封闭所述加样或离样口或进样或出样孔。
在本发明的一种实施方式中，使用胶带封闭所述加样或离样口或进样或出样孔。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本为稀释后样本。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本为用质量分数为1％的BSA水溶液稀释的样本。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本为用质量分数为1％的BSA水溶液稀释5-10倍的血清或血浆样本。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本的加入量为120μL。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本、HRP标记的标记蛋白以及HRP标记的链霉亲和素皆使用蠕动泵以20μL/min的流速加入通用流道。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为1×PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液的用量为2-5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述使用清洗液清洗通用流道为：使用2mL的1×PBS缓冲液冲洗通用流道。
在本发明的一种实施方式中，所述使用清洗液清洗通用流道的具体方法为：使用蠕动泵以200μL/min的流速冲洗通用流道。
在本发明的一种实施方式中，所述使用清洗液清洗通用流道的具体方法为：使用清洗液冲洗通用流道约5min。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本的孵育条件为25～37℃下孵育5～60min。
在本发明的一种实施方式中，所述待检样本的孵育条件为37℃孵育30min。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶、RNase H和dNTPs混合液的加入量为20μL。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶的加入量为0.3μL。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶为Klenow fragement(3’-5’exo-)DNA聚合酶。
在本发明的一种实施方式中，所述RNase H包括RNase H缓冲液和1U的RNase H。
在本发明的一种实施方式中，所述RNase H包括1μL的RNase H缓冲液和0.6μL 1U的RNase H。
在本发明的一种实施方式中，所述dNTPs的加入量为1μL。
在本发明的一种实施方式中，所述dNTPs包括Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP各250μM。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶、RNase H和dNTPs混合液中，还包括7.4μL的无酶水。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶、RNase H和dNTPs混合液的孵育条件为25～37℃下孵育5～60min。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶、RNase H和dNTPs混合液的孵育条件为37℃孵育10min。
在本发明的一种实施方式中，使用20μL的1×PBS稀释所述HRP标记的标记蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述HRP标记的标记蛋白浓度为：1000-2400ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，将所述HRP标记的标记蛋白加入通用流道后，孵育条件为25～37℃下孵育30～60min。
在本发明的一种实施方式中，将所述HRP标记的标记蛋白加入通用流道后，孵育条件为25～37℃下孵育30～60min。
在本发明的一种实施方式中，使用20μL的1×PBS稀释所述HRP标记的链霉亲和素。
在本发明的一种实施方式中，所述HRP标记的链霉亲和素浓度为：500-2000ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，将所述HRP标记的链霉亲和素加入通用流道后，孵育条件为25～37℃下孵育5～60min。
在本发明的一种实施方式中，将所述HRP标记的链霉亲和素加入通用流道后，孵育条件为25℃孵育20min。
在本发明的一种实施方式中，还包括在所述捕获蛋白和捕获探针皆被HRP标记后，使用氮气吹干通用流道。
在本发明的一种实施方式中，蠕动泵以20μL/min的流速将所述荧光反应试剂加入通用流道。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光反应试剂的加入量为60μL。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育条件为25～37℃孵育5～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育条件为25℃孵育10min。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为1×PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液的用量为2-5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为2mL的1×PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗通用流道时，蠕动泵以200μL/min的流速冲洗。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗通用流道时，用PBS缓冲液冲洗通用流道约5min。
在本发明的一种实施方式中，所述吹干通用流道为使用氮气吹干通用流道。
在本发明的一种实施方式中，通过使用荧光显微镜进行观察以检测所述荧光强度。
在本发明的一种实施方式中，使用所述荧光显微镜的FITC通道进行观察。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述蛋白是抗原或抗体；所述RNA是microRNA，mRNA，siRNA，tRNA，rRNA或病毒单链RNA。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述蛋白是抗原；所述RNA是microRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述抗原是有免疫活性的，且存在2个及以上不同的抗体结合位点的同一物种的抗原。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述抗原是有免疫活性，且存在2个及以上不同的抗体结合位点的不同物种的抗原。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述microRNA是具有可延伸的自由3’端的一条链上的不同序列区域。
在本发明的一种实施方式中，所述同时检测蛋白和RNA中，所述microRNA是具有可延伸的自由3’端的不同链上的不同序列区域。
本发明还提供了一种将上述微流控芯片上述试剂盒或上述方法在针对已离体的组织、体液或排泄物检测中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片，所述微流控芯片利用了表面修饰方法以及微流道的灵活性，通过化学修饰将RNA捕获探针及捕获蛋白同时绑定在载玻片上，利用微流道通入多个样本，经清洗后利用HRP和酪胺反应对信号进行放大，在荧光显微镜下观察；将“I”型固定流道和“Y”型通用流道结合，不仅可以同时检测蛋白和RNA，还可以将多种捕获探针和捕获蛋白分区分别检测，对待检靶标定性和定量检测；利用“Y”型微流道的灵活性，加上双检测通道的设计，使同一样品可以同时发生蛋白质和核酸反应的同时，还规避了同时检测的串扰问题。并且本发明检测精度与金标准检测方法(RT-qPCR和ELISA)相当，检测时间更短，检测成本更低，检测通量可以根据需要灵活调整。
本发明针对蛋白和RNA同时进行检测，待检测的蛋白包括但不限于抗原和抗体；待检测的RNA包括但不限于microRNA，mRNA，siRNA，tRNA，rRNA，病毒单链RNA；通过抗原与单克隆抗体(捕获蛋白)通过位点特异结合，加入HRP标记的标记蛋白，形成抗体-抗原-抗体复合结构，靶标抗原被HRP标记；RNA和3′端为氨基修饰的探针通过碱基互补配对杂交，所述探针中间是RNA，两端是DNA，在反应时探针与RNA通过碱基互补配对杂交，RNA两端和DNA区域互补部分RNA被RNase H消化，未消化的RNA区域在大片段DNA聚合酶的作用下以探针为模板进行延伸，合成带有生物素标记的片段，通过和HRP标记的链霉亲和素特异结合，使靶标RNA被HRP标记。通过将iFluorTM染料的卓越亮度和光稳定性与HRP介导的苯乙烯酰胺扩增相结合对RNA和抗原检测信号同时进行放大，可以对待检测靶标同时定性和定量检测。使用所述微流控芯片同时检测蛋白和RNA，具有快速、高效、特异性强、检测灵敏度及检测准确度较高的优势，极具应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片的整体结构示意图(微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具)。
图2：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片中通用流道层的结构示意图。
图3：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片中固定流道层的结构示意图。
图4：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片的检测原理图。
图5：使用同时检测蛋白和RNA的微流控芯片按浓度梯度检测miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原的标准曲线图。
图6：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片的准确性测试图。
图7：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片的特异性测试图。
图8：一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片的灵敏度测试图。
附图标记说明：
1、上层夹具；11、第一加样或离样口；12、第二加样或离样口；13、第三加样或离样口；14、第四加样或离样口；2、PDMS通用流道层；211、第一进样或出样孔；212、第二进样或出样孔；213、第三进样或出样孔；221、第一通用流道；222、第二通用流道；223、第三通用流道；3、载玻片；4、下层夹具；5、PDMS固定流道层；5101、第四进样或出样孔；5102、第五进样或出样孔；5103、第六进样或出样孔；5104、第七进样或出样孔；5105、第八进样或出样孔；5106、第九进样或出样孔；5107、第十进样或出样孔；5108、第十一进样或出样孔；5109、第十二进样或出样孔；5110、第十三进样或出样孔；521、第一“I”型固定流道；522、第二“I”型固定流道；523、第三“I”型固定流道；524、第四“I”型固定流道；525、第五“I”型固定流道。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的AFP单克隆抗体购自南京金斯瑞生物科技有限公司，型号为V06301：PIVKA II单克隆抗体购自南京金斯瑞生物科技有限，型号为V06701；HRP标记的AFP单克隆抗体购自南京金斯瑞生物科技有限公司，型号为V06302；HRP标记的PIVKAII单克隆抗体购自南京金斯瑞生物科技有限公司，型号为V06702；AFP抗原购自北京沫之东生物技术有限公司，型号为mzdnct25011；PIVKA II抗原购自南京金斯瑞生物科技有限公司，型号为V06703；人epcam抗体购自赛默飞世尔科技公司，型号为EpCAM PE；纤维蛋白原购自赛默飞世尔科技公司，型号为F35200；白蛋白购自赛默飞世尔科技公司，型号为EHALB；CD13抗体购自赛默飞世尔科技公司，型号为MA1-19359；精密蠕动泵购自保定迪创电子科技有限公司，型号为BT100-2J+DG-2A；RNase H缓冲液购自赛默飞世尔科技公司，型号为EN0202；RNase H购自赛默飞世尔科技公司，型号为EN0202；Klenow fragement(3’-5’exo-)DNA聚合酶购自赛默飞世尔科技公司，型号为EP0421；Biotin-dUTP购自赛默飞世尔科技公司，型号为R0081；dATP购自上海生工生物工程股份有限公司，型号为B600007；dGTP购自上海生工生物工程股份有限公司，型号为B600007；dCTP购自上海生工生物工程股份有限公司，型号为B600007；无酶水购自赛默飞世尔科技公司，型号为AM9938；1×PBS缓冲液购自上海生工生物工程股份有限公司，型号为B540627；HRP标记的链霉亲和素购自赛默飞世尔科技公司，型号为N100；30％(v/v)双氧水购自国药集团上海有限公司，型号为10011218；iFluorTM 488酪胺购自北京中昊新生科技有限责任公司公司，型号为45020；Tris-Hcl缓冲液购自上海生工生物工程股份有限公司，型号为B548124。
下述实施例中涉及的RNA待检样本为上海生工生物合成的RNA序列，具体为：
miR-21：5’-GGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUU-3’(SEQ ID NO：1)；
miR-122：5’-CUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCU-3’(SEQ ID NO：2)；
miR-223：5’-CACGCUCCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGGACAC-3’(SEQ ID NO：3)；
miR-26a：5’-GCUGUGGCUGGAUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’(SEQ ID NO：4)；
miR-27a：5’-GCUGCUUGUGAGCAGGGUCCACACCAAGUCGUGUU-3’(SEQ ID NO：5)；
miR-192：5’-GCUCUGACCUAUGAAUUGACAGCCAGUGCUCUCGU-3’(SEQ ID NO：6)。
miR-801：5’-GAUUGCUCUGCGUGCGGAAUCGAC-3’(SEQ ID NO：7)
下述实施例中涉及的RNA捕获探针为上海生工生物合成的DNA-RNA-DNA序列，具体为：
miR-21探针：5’-AACAGTC/rA//rA//rC//rA//rU//rC//rA//rG//rU//rC//rU//rG//rA//rU//rA/AACATCAGTCTGATAAGCTACCC-3’(SEQ ID NO：8)；
miR-122探针：5’-AGACACA/rA//rA//rC//rA//rC//rC//rA//rU//rU//rG//rU//rC//rA//rC//rA/AACACCATTGTCACACTCCACAG-3’(SEQ ID NO：9)；
miR-223探针：5’-GTGTCCAA/rC//rU//rC//rA//rG//rC//rU//rU//rG//rU//rC//rA//rA//rA//rU/ACACGGAGCGTG-3’(SEQ ID NO：10)。
实施例1-1：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA生物标志物的微流控芯片
本实施例提供了一种如图1所示的同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA生物标志物的微流控芯片，微流控芯片由上层夹具1、PDMS通用流道层(图2)、NHS基团修饰的载玻片3以及下层夹具4组成，上层夹具1、PDMS通用流道层(图2)、NHS基团修饰的载玻片3以及下层夹具4从上到下依次设置；其中，PDMS通用流道层通过购自道康宁公司的PDMS原料制成；
其中，上层夹具1开设有贯穿上层夹具1的第一加样或离样口11和第二加样或离样口12；PDMS通用流道层2与上层夹具1相贴的一面为进样或出样孔面，与NHS基团修饰的载玻片3相贴的一面为“Y”型通用流道面；“Y”型通用流道面上设有“Y”型通用流道，“Y”型通用流道与NHS基团修饰的载玻片3共同形成供待检样本流动的“Y”型空腔；“Y”型通用流道包括第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223，第二通用流道222和第三通用流道223的末端连通且连通之处与第一通用流道221相连通；第一通用流道221远离连通处一端设有第一进样或出样孔211，第二通用流道222远离连通处一端设有第二进样或出样孔212，第三通用流道223远离连通处一端设有第三进样或出样孔213；第一进样或出样孔211、第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213贯穿PDMS通用流道层2；上层夹具1的第一加样或离样口11与PDMS通用流道层2上的第一进样或出样孔211对应设置，用于对PDMS通用流道层2上的第一进样或出样孔211加样或离样；上层夹具1的第二加样或离样口12与PDMS通用流道层2上的第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213对应设置，用于对PDMS通用流道层2上的第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213加样或离样；“Y”型通用流道面上设有六个“Y”型通用流道，其中，每两个“Y”型通用流道对称设置，“Y”型通用流道面上共有三组对称设置的“Y”型通用流道；下层夹具4上开设有用于检测荧光信号的检测孔41。
在NHS基团修饰的载玻片3对应于第二通用流道222的位置上固定有捕获蛋白，在NHS基团修饰的载玻片3对应于第三通用流道223的位置上固定有捕获探针，具体方法为：将PDMS通用流道层2和NHS基团修饰的载玻片3的修饰面贴合，使用上层夹具1和下层夹具4固定贴合后的PDMS通用流道层2和NHS基团修饰的载玻片3，紧压后赶走气泡，通过第二加样或离样口12，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10mg/mL捕获蛋白(捕获蛋白由浓度比为1∶1的AFP单克隆抗体和PIVKAII单克隆抗体组成)加入第二进样或出样孔212，使得捕获蛋白流入第二通用流道222；通过第二加样或离样口12，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10μM的捕获探针(浓度比为1∶1∶1的miR-21探针、miR-122探针和miR-223探针)加入第三进样或出样孔213，使得捕获探针流入第三通用流道223中，37℃孵育12h；使用1×PBS缓冲液将第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223清洗3遍，加入封闭液1(50mM的Tris和质量分数为1％的BSA水溶液)，于37℃孵育30min；使用1×PBS缓冲液将第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223清洗3遍后使用氮气吹干，得到固定有捕获蛋白和捕获探针的微流控芯片。
实施例1-2：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA生物标志物的微流控芯片
本实施例提供了一种如图1所示的同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA生物标志物的微流控芯片，微流控芯片由上层夹具1、PDMS通用流道层2(图2)、NHS基团修饰的载玻片3、下层夹具4以及PDMS固定流道层5(图3)组成，上层夹具1、PDMS固定流道层5(图3)、NHS基团修饰的载玻片3以及下层夹具4从上到下依次设置；其中，PDMS通用流道层通过购自道康宁公司的PDMS原料制成；
其中，上层夹具1开设有贯穿上层夹具1的第一加样或离样口11、第二加样或离样口12、第三加样或离样口13和第四加样或离样口14；PDMS固定流道层5与NHS基团修饰的载玻片3相贴的一面为“I”型通用流道面，与上层夹具1相贴的一面为进样或出样孔面；“I”型固定流道面上设有二十个“I”型固定流道，“I”型固定流道面的左右分别设置十个“I”型固定流道；第一“I”型固定流道521的两端分别设有第四进样或出样孔5101和第五进样或出样孔5102，第二“I”型固定流道522的两端分别设有第六进样或出样孔5103和第七进样或出样孔5104，第三“I”型固定流道523的两端分别设有第八进样或出样孔5105和第九进样或出样孔5106，第四“I”型固定流道524的两端分别设有第十进样或出样孔5107和第十一进样或出样孔5108，第五“I”型固定流道525的两端分别设有第十二进样或出样孔5109和第十三进样或出样孔5110；第四进样或出样孔5101、第五进样或出样孔5102、第六进样或出样孔5103、第七进样或出样孔5104、第八进样或出样孔5105、第九进样或出样孔5106、第十进样或出样孔5107、第十一进样或出样孔5108、第十二进样或出样孔5109和第十三进样或出样孔5110贯穿PDMS固定流道层5；上层夹具的第三加样或离样口13与PDMS固定流道层5上的第四进样或出样孔5101、第六进样或出样孔5103、第八进样或出样孔5106、第十进样或出样孔5108和第十二进样或出样孔5110对应设置，用于对PDMS固定流道层5上的第四进样或出样孔5101、第六进样或出样孔5103、第八进样或出样孔5106、第十进样或出样孔5108和第十二进样或出样孔5110加样或离样；上层夹具1的第四加样或离样口14与PDMS通用流道层上的第五进样或出样孔5102、第七进样或出样孔5104、第九进样或出样孔5106、第十一进样或出样孔5108和第十三进样或出样孔5110对应设置，用于对PDMS固定流道层5上的第五进样或出样孔5102、第七进样或出样孔5104、第九进样或出样孔5106、第十一进样或出样孔5108和第十三进样或出样孔5110加样或离样；NHS基团修饰的载玻片3对应第一“I”型固定流道521的位置上固定有AFP单克隆抗体；NHS基团修饰的载玻片3对应第二“I”型固定流道522的位置上固定有PIVKAII单克隆抗体；NHS基团修饰的载玻片3对应第三“I”型固定流道523的位置上固定有miR-21探针；NHS基团修饰的载玻片3对应第四“I”型固定流道524的位置上固定有miR-122探针；NHS基团修饰的载玻片3对应第五“I”型固定流道525的位置上固定有miR-223探针；PDMS通用流道层2的一面为进样或出样孔面，另一面为“Y”型通用流道面；“Y”型通用流道面上设有“Y”型通用流道，“Y”型通用流道包括第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223，第二通用流道222和第三通用流道223的末端连通且连通之处与第一通用流道221相连通；第一通用流道221远离连通处一端设有第一进样或出样孔211，第二通用流道222远离连通处一端设有第二进样或出样孔212，第三通用流道223远离连通处一端设有第三进样或出样孔213；第一进样或出样孔211、第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213贯穿PDMS通用流道层2；上层夹具1的第一加样或离样口11与PDMS通用流道层2上的第一进样或出样孔211对应设置，用于对PDMS通用流道层2上的第一进样或出样孔211加样或离样；上层夹具1的第二加样或离样口12与PDMS通用流道层2上的第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213对应设置，用于对PDMS通用流道层2上的第二进样或出样孔212和第三进样或出样孔213加样或离样；“Y”型通用流道面上设有六个“Y”型通用流道，其中，每两个“Y”型通用流道对称设置，“Y”型通用流道面上共有三组对称设置的“Y”型通用流道；下层夹具4上开设有用于检测荧光信号的检测孔41。
NHS基团修饰的载玻片3对应第一“I”型固定流道521的位置上固定有AFP单克隆抗体，NHS基团修饰的载玻片3对应第二“I”型固定流道522的位置上固定有PIVKAII单克隆抗体，NHS基团修饰的载玻片3对应第三“I”型固定流道523的位置上固定有miR-21探针，NHS基团修饰的载玻片3对应第四“I”型固定流道524的位置上固定有miR-122探针，NHS基团修饰的载玻片3对应第五“I”型固定流道525的位置上固定有miR-223探针，具体方法为：将PDMS固定流道层5和NHS基团修饰的载玻片3的修饰面贴合，使用上层夹具1和下层夹具4固定贴合后的PDMS固定流道层5和NHS基团修饰的载玻片3，紧压后赶走气泡，通过第三加样或离样口13，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10mg/mLAFP单克隆抗体加入第四进样或出样孔5101，使得AFP单克隆抗体流入第一“I”型固定流道521；通过第三加样或离样口13，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10mg/mLPIVKA II单克隆抗体加入第六进样或出样孔5103，使得PIVKAII单克隆抗体流入第二“I”型固定流道522；通过第三加样或离样口13，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10μM miR-21探针加入第八进样或出样孔5105，使得miR-21探针流入第三“I”型固定流道523；通过第三加样或离样口13，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10μM miR-122探针加入第十进样或出样孔5107，使得捕获蛋白流入第四“I”型固定流道524；通过第三加样或离样口13，使用移液器将5μL使用1×PBS缓冲液稀释的10μMmiR-122探针加入第十二进样或出样孔5109，使得捕获蛋白流入第五“I”型固定流道525；于37℃孵育12h；使用1×PBS缓冲液将第一“I”型固定流道521、第二“I”型固定流道522、第三“I”型固定流道523、第四“I”型固定流道524和第五“I”型固定流道525清洗3遍，加入封闭液1(50mM的Tris和质量分数为1％的BSA水溶液)，于37℃孵育30min；使用1×PBS缓冲液将第一“I”型固定流道521、第二“I”型固定流道522、第三“I”型固定流道523、第四“I”型固定流道524和第五“I”型固定流道525清洗3遍后使用氮气吹干，得到固定有捕获蛋白和捕获探针的微流控芯片。
实施例2-1：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的试剂盒
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的相关蛋白和RNA的试剂盒，试剂盒包括实施例1-1的微流控芯片、蛋白检测试剂、RNA检测试剂和PSA反应试剂。
上述蛋白检测试剂、RNA检测试剂和PSA反应试剂包括如下成分：
(1)蛋白检测试剂
10μL使用1×PBS稀释的1000ng/mL的HRP标记的AFP单克隆抗体和10μL使用1×PBS稀释的1000ng/mL的HRP标记的PIVKA II单克隆抗体。
(2)RNA检测试剂
1μL的RNase H缓冲液，0.6μL 1U的RNase H，0.3μL Klenow fragement(3’-5’exo-)DNA聚合酶，1μL的dNTPs(Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP各250μM)，7.4μL的无酶水和20μL 1×PBS稀释的500ng/mL HRP标记的链霉亲和素。
(3)PSA反应试剂
60μL的PSA反应液(含0.3％(v/v)的双氧水和1×iFluorTM 488酪胺的20mM Tris-Hcl缓冲液)
实施例2-2：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的试剂盒
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的相关蛋白和RNA的试剂盒，试剂盒包括实施例1-2的微流控芯片、蛋白检测试剂、RNA检测试剂和PSA反应试剂，蛋白检测试剂、RNA检测试剂和PSA反应试剂与实施例2-1相同。
实施例3-1：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的方法
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的方法，检测原理如图4所示，检测方法使用实施例2-1的检测试剂盒在精密蠕动泵上进行，包括如下步骤：
步骤一：取血浆样本用质量分数为1％的BSA水溶液稀释5倍后作为待检样本；
步骤二：取实施例1-1的微流控芯片，使用胶带通过第一加样或离样口11封闭第一进样或出样孔211，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将120μL的待检样本加入第三进样或出样孔213，使得待检样本依次流入第三通用流道223和第二通用流道222，于37℃孵育30min；
步骤三：步骤二结束后，通过第一加样或离样口11将第一进样或出样孔211的胶带除去，并使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第二进样或出样孔212；使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第二加样或离样口12将2mL的1×PBS缓冲液加入第三进样或出样孔213，使得PBS缓冲液依次流入第三通用流道223和第一通用流道221，以清洗第一通用流道221及第三通用流道223；
步骤四：步骤三结束后，使用蠕动泵以20μL/min通过第二加样或离样口12将1μL的RNase H缓冲液、0.6μL 1U的RNase H，0.3μL Klenow fragement(3’-5’exo-)DNA聚合酶、1μL的dNTPs(Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP各250μM)和7.4μL的无酶水加入第三进样或出样孔213，于37℃孵育10min；
步骤五：步骤四结束后，通过第二加样或离样口12使第二进样或出样孔212的胶带除去，使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第一加样或离样口11将2mL的1×PBS缓冲液加入第三进样或出样孔213，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤六：步骤五结束后，使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第三进样或出样孔213，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将20μL使用1×PBS缓冲液稀释的1000ng/mL的HRP标记的标记蛋白(浓度比为1∶1的HRP标记的AFP单克隆抗体和HRP标记的PIVKA II单克隆抗体)加入第二进样或出样孔212，于25℃孵育30min；
步骤七：步骤六结束后，通过第二加样或离样口12将第三进样或出样孔213的胶带除去，并使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第二进样或出样孔212，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将20μL使用1×PBS稀释的500ng/mL HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔213，于25℃孵育20min；
步骤八：步骤七结束后，通过第二加样或离样口12将第二进样或出样孔212的胶带除去，使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第一加样或离样口11将2rnL的1×PBS缓冲液加入第一进样或出样孔211，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤九：步骤八结束后，使用氮气吹干冲洗后的第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第一加样或离样口11将60μL的PSA反应液(含0.3％(v/v)双氧水和1×iFluorTM 488酪胺的20rnM Tris-Hcl缓冲液)加入第一进样或出样孔211，使得荧光反应试剂流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，于25℃孵育10min；
步骤十：步骤九结束后，使用蠕动泵以200μL/rnin的流速通过第一加样或离样口11将2mL的1×PBS缓冲液加入第一进样或出样孔211，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤十一：步骤十结束后，使用氮气吹干第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223后，将反应完成的微流控芯片翻转，使下层夹具4朝上并使用荧光显微镜的FITC通道通过下层夹具4的检测孔41对第二通用流道222及第三通用流道223拍摄荧光图像；
步骤十二：步骤十一结束后，使用image J软件计算荧光图像的荧光强度，当待检样本的荧光强度/背景荧光强度或无模板对照荧光强度≥3时，计为阳性样本，当待检样本的荧光强度/背景荧光强度或无模板对照荧光强度＜3时，计为阴性样本。
实施例3-2：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的方法
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的方法，检测原理如图4所示，检测方法使用实施例2-2的检测试剂盒在精密蠕动泵上进行，包括如下步骤：
步骤一：取血浆样本用质量分数为1％的BSA水溶液稀释5倍后作为待检样本；
步骤二：取实施例1-2的微流控芯片，将上层夹具1、PDMS固定流道层5、NHS基团修饰的载玻片3和下层夹具4分离，将上层夹具1、PDMS通用流道层2、NHS基团修饰的载玻片3以及下层夹具4从上到下依次设置并组装：PDMS通用流道层2的“Y”型通用流道面和NHS基团修饰的载玻片3一面贴合，使用上层夹具1和下层夹具4固定PDMS通用流道层2和NHS基团修饰的载玻片3，“Y”型通用流道与NHS基团修饰的载玻片3共同形成供试剂流动的“Y”型空腔；
步骤三：步骤二结束后，使用胶带通过第一加样或离样口11封闭第一进样或出样孔211，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将120μL的待检样本加入第三进样或出样孔213，使得待检样本依次流入第三通用流道223和第二通用流道222，于37℃孵育30min；
步骤四：步骤三结束后，通过第一加样或离样口11将第一进样或出样孔211的胶带除去，并使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第二进样或出样孔212；使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第二加样或离样口12将2mL的1×PBS缓冲液加入第三进样或出样孔213，使得PBS缓冲液依次流入第三通用流道223和第一通用流道221，以清洗第一通用流道221及第三通用流道223；
步骤五：步骤四结束后，使用蠕动泵以20μL/min通过第二加样或离样口12将1μL的RNase H缓冲液、0.6μL 1U的RNase H，0.3μL Klenow fragement(3’-5’exo-)DNA聚合酶、1μL的dNTPs(Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP各250μM)和7.4μL的无酶水加入第三进样或出样孔213，于37℃孵育10min；
步骤六：步骤五结束后，通过第二加样或离样口12使第二进样或出样孔212的胶带除去，使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第一加样或离样口11将2mL的1×PBS缓冲液加入第三进样或出样孔213，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤七：步骤六结束后，使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第三进样或出样孔213，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将20μL使用1×PBS缓冲液稀释的1000ng/mL的HRP标记的标记蛋白(浓度比为1∶1的HRP标记的AFP单克隆抗体和HRP标记的PIVKA II单克隆抗体)加入第二进样或出样孔212，于25℃孵育30min；
步骤八：步骤七结束后，通过第二加样或离样口12将第三进样或出样孔213的胶带除去，并使用胶带通过第二加样或离样口12封闭第二进样或出样孔212，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第二加样或离样口12将20μL使用1×PBS稀释的500ng/mL HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔213，于25℃孵育20min；
步骤九：步骤八结束后，通过第二加样或离样口12将第二进样或出样孔212的胶带除去，使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第一加样或离样口11将2mL的1×PBS缓冲液加入第一进样或出样孔211，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤十：步骤九结束后，使用氮气吹干冲洗后的第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223，使用蠕动泵以20μL/min的流速通过第一加样或离样口11将60μL的PSA反应液(含0.3％(v/v)双氧水和1×iFluorTM 488酪胺的20mM Tris-Hcl缓冲液)加入第一进样或出样孔211，使得荧光反应试剂流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，于25℃孵育10min；
步骤十一：步骤十结束后，使用蠕动泵以200μL/min的流速通过第一加样或离样口11将2mL的1×PBS缓冲液加入第一进样或出样孔211，使得PBS缓冲液流入第一通用流道221后，同时流入第二通用流道222和第三通用流道223，以清洗第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223；
步骤十二：步骤十一结束后，使用氮气吹干第一通用流道221、第二通用流道222和第三通用流道223后，将反应完成的微流控芯片翻转，使下层夹具4朝上并使用荧光显微镜的FITC通道通过下层夹具4的检测孔41对第二通用流道222及第三通用流道223拍摄荧光图像；
步骤十三：步骤十二结束后，使用image J计算待检样本单个靶标的荧光图像的荧光强度，当待检样本某个靶标的荧光强度/背景荧光强度或无模板对照荧光强度≥3时，计为该样本的对应靶标阳性，当待检样本某个靶标的荧光强度/背景荧光强度或无模板对照荧光强度＜3时，计为该样本的对应靶标阴性。
实验例1：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的准确性评估
本实验例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的准确性评估，实验过程如下：
收集10例血浆样本(来自苏州科技城医院和上海华山医院)，蛋白和RNA均通过金标准检测方法进行检测：miR-21、miR-122和miR-223通过RT-qPCR方法检测，得到Ct值，带入RT-qPCR的标准曲线中计算后得到原始样本中的拷贝数；AFP抗原和PIVKA II抗原通过ELISA方法检测，得到OD值，带入ELISA的标准曲线中计算后得到原始样本中的浓度。
将含有miR-21、miR-122和miR-223的1×SSC缓冲液作为待检样本，使用质量分数为1％的BSA水溶液阶段稀释为0、101、102、103、104、105、106copies/μL；将含有AFP抗原和PIVKAII抗原的1×PBS缓冲液作为待检样本，使用质量分数为1％的BSA水溶液阶段稀释为0、0.315、1.25、5、10、15、20ng/mL；根据其不同浓度与荧光强度的关系，分别制成标准曲线，其线性相关度评估如图5所示。
采用实施例3-2的方法，10例血浆样本均使用质量分数为1％的BSA水溶液稀释5倍后作为待检样本，将得到的图像的荧光强度带入图5的标准曲线，计算后得到原始样本中的拷贝数或浓度，通过与金标准方法得到的拷贝数或浓度进行比较，从而评估微流控芯片的准确性，准确性结果见图6。
由图5可知，miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原的标准曲线相关性R2分别为0.999、0.998、0.998、0.992和0.995，说明检测体系有较高的线性相关度；图6分别以样本的ELISA检测结果和RT-qPCR检测结果为Y轴，样本的微流控芯片检测结果为X轴，金标准方法与微流控芯片检测结果对比，miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原的相关性R2分别为0.978、0.999、0.997、0.971和0.978，均大于0.95，说明微流控芯片检测临床样本和金标准方法检测结果一致性较好，检测准确度较高。
实验例2：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的特异性评估
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的特异性评估，实验过程如下：
本实验例以miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原作为实验组，以miR-26a、miR-27a、miR-192、miR-801、人epcam抗体、纤维蛋白原、白蛋白和CD13抗体作为对照组；RNA样本分别用1×SSC缓冲液配制成104copies/μL的溶液，蛋白样本分别用1×PBS缓冲液配制成10ng/mL的溶液；使用NTC溶液作为RNA样本的空白对照，使用BSA溶液作为蛋白样本的空白对照。
采用实施例3-2的方法，将步骤一中的待检样本分别替换为上述五个实验组、八个对照组和两个空白对照；八种RNA待检样本在三种捕获探针上的荧光强度见图7A，七种蛋白待检样本在两种捕获蛋白上的荧光强度见图7B。
由图7可知，仅miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原在对应捕获探针和捕获蛋白上的荧光强度显示阳性，说明微流控芯片的特异性好，无交叉反应。
实验例3：一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的灵敏度评估
本实施例提供了一种同时检测肝细胞肝癌(HCC)相关的蛋白和RNA的微流控芯片的灵敏度评估，实验过程如下：
待检样本1：将miR-21、miR-122和miR-223以浓度比为1∶1∶1混合，使用质量分数为1％的BSA水溶液稀释为10copies/μL的miR混合液；将AFP抗原和PIVKA II抗原以浓度比为1∶1混合，使用质量分数为1％的BSA水溶液稀释为1ng/mL的蛋白混合液；将60μL的miR混合液和60μL的蛋白混合液混合作为待检样本1。
待检样本2：以120μL质量分数为1％的BSA水溶液作为待检样本2。
采用实施例3-2的方法，将步骤一中的待检样本分别替换为上述待检样本1和待检样本2，两种待检样本在三种捕获探针上的荧光强度见图8A，两种待检样本在两种捕获蛋白上的荧光强度见图8B。
由图8可知，待检样本1和待检样本2的荧光强度有明显差异，说明在微流控的基础上对待检样本中的miR-21、miR-122、miR-223、AFP抗原和PIVKA II抗原同时进行检测，检测灵敏度高，至少能对10copies/μL的miR-21、miR-122和miR-223以及1ng/mL AFP抗原和PIVKA II抗原同时定性和定量检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种同时检测蛋白和RNA的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具；所述上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置；所述上层夹具开设有贯穿上层夹具的第一加样或离样口和第二加样或离样口；所述通用流道层与载玻片相贴的一面为“Y”型通用流道面，与上层夹具相贴的一面为进样或出样孔面；所述“Y”型通用流道面上设有至少一个“Y”型通用流道，“Y”型通用流道与载玻片共同形成供待检样本流动的“Y”型空腔；所述“Y”型通用流道包括第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道，所述第二通用流道和第三通用流道的末端连通且连通处与第一通用流道相连通；所述第一通用流道远离连通处的一端设有第一进样或出样孔，第二通用流道远离连通处的一端设有第二进样或出样孔，第三通用流道远离连通处的一端设有第三进样或出样孔；所述第一进样或出样孔、第二进样或出样孔和第三进样或出样孔贯穿通用流道层；所述上层夹具的第一加样或离样口与通用流道层上的第一进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第一进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第二加样或离样口与通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔加样或离样；所述载玻片对应第二通用流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白；所述载玻片对应第三通用流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针；所述下层夹具上开设有用于检测荧光强度的检测孔；
或者，所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具；所述上层夹具、固定流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置；所述上层夹具开设有贯穿上层夹具的第一加样或离样口、第二加样或离样口、第三加样或离样口和第四加样或离样口；所述固定流道层与载玻片相贴的一面为“I”型固定流道面，与上层夹具相贴的一面为进样或出样孔面；所述“I”型固定流道面上设有若干组“I”型固定流道组，每组“I”型固定流道组包含两个“I”型固定流道，分别为第一“I”型固定流道和第二“I”型固定流道；所述第一“I”型固定流道的两端分别设有第四进样或出样孔和第五进样或出样孔，所述第二“I”型固定流道的两端分别设有第六进样或出样孔和第七进样或出样孔；所述第四进样或出样孔、第五进样或出样孔、第六进样或出样孔和第七进样或出样孔贯穿固定流道层；所述上层夹具的第三加样或离样口与固定流道层上的第四进样或出样孔和第六进样或出样孔对应设置，用于对固定流道层上的第四进样或出样孔和第六进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第四加样或离样口与固定流道层上的第五进样或出样孔和第七进样或出样孔对应设置，用于对固定流道层上的第五进样或出样孔和第七进样或出样孔加样或离样；所述载玻片对应第一“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白；所述载玻片对应第二“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针；所述通用流道层的一面为“Y”型通用流道面，另一面为进样或出样孔面；所述“Y”型通用流道面上设有至少一个“Y”型通用流道；所述“Y”型通用流道包括第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道，所述第二通用流道和第三通用流道的末端连通且连通处与第一通用流道相连通；所述第一通用流道远离连通处的一端设有第一进样或出样孔，第二通用流道远离连通处的一端设有第二进样或出样孔，第三通用流道远离连通处的一端设有第三进样或出样孔；所述第一进样或出样孔、第二进样或出样孔和第三进样或出样孔贯穿通用流道层；所述上层夹具的第一加样或离样口与通用流道层上的第一进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第一进样或出样孔加样或离样；所述上层夹具的第二加样或离样口与通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔对应设置，用于对通用流道层上的第二进样或出样孔和第三进样或出样孔加样或离样；所述下层夹具上开设有用于检测荧光强度的检测孔。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法为：
使通用流道层的“Y”型通用流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定通用流道层和载玻片，通过第二加样或离样口将捕获蛋白加入第二进样或出样孔，使得捕获蛋白流入第二通用流道和载玻片形成的空腔中；通过第二加样或离样口将捕获探针加入第三进样或出样孔，使得捕获探针流入第三通用流道和载玻片形成的空腔中；孵育至载玻片对应第二通用流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白，并且载玻片对应第三通用流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针；
当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，在载玻片上固定能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白和能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针的方法为：
使固定流道层的“I”型固定流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定载玻片和固定流道层，通过第三加样或离样口将捕获蛋白加入第四进样或出样孔，使得捕获蛋白流入第一“I”型固定流道和载玻片形成的空腔中；通过第三加样或离样口将捕获探针加入第六进样或出样孔，使得捕获探针流入第二“I”型固定流道和载玻片形成的空腔中；孵育至载玻片对应第一“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标蛋白特异性结合的捕获蛋白，并且载玻片对应第二“I”型固定流道的位置上固定有能够与靶标RNA特异性结合的捕获探针。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述固定流道层和通用流道层是PDMS流道层。
4.如权利要求1～3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述载玻片使用化学试剂改变其表面基团。
5.如权利要求1～3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述捕获探针3'端为氨基修饰，中间是RNA，两端是DNA。
6.一种同时检测蛋白和RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的微流控芯片、蛋白检测试剂、RNA检测试剂和荧光反应试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA检测试剂包括DNA聚合酶、RNaseH、Biotin-dUTP、dATP、dGTP、dCTP和HRP标记的链霉亲和素。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白检测试剂包括HRP标记的标记蛋白；所述标记蛋白能够与靶标蛋白特异性结合。
9.一种同时检测蛋白和RNA的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，当所述微流控芯片包括上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，所述方法包括如下步骤：
步骤一：使用权利要求1～5任一项所述的微流控芯片，通过第一加样或离样口封闭第一进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将待检样本加入第三进样或出样孔，使得待检样本依次流入第三通用流道和第二通用流道，经孵育，若待检样本中含有靶标蛋白，则靶标蛋白与载玻片对应于第二通用流道的位置上固定的捕获蛋白特异性结合，若待检样本中含有靶标RNA，则靶标RNA与载玻片对应于第三通用流道的位置上固定的捕获探针特异性结合；
步骤二：步骤一结束后，通过第一加样或离样口放开第一进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔；使用蠕动泵通过第二加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液依次流入第三通用流道和第一通用流道，以清洗第一通用流道及第三通用流道；
步骤三：步骤二结束后，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将DNA聚合酶、RNase H、Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP加入第三进样或出样孔，使其流入第三通用流道，经孵育，若靶标RNA已与捕获探针特异性结合，则靶标RNA能够以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段；
步骤四：步骤三结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤五：步骤四结束后，通过第二加样或离样口封闭第三进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的标记蛋白加入第二进样或出样孔，经孵育，若靶标蛋白已与捕获蛋白特异性结合，则HRP标记的标记蛋白能够与靶标蛋白结合；
步骤六：步骤五结束后，通过第二加样或离样口放开第三进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔，经孵育，若靶标RNA已经以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段，则HRP标记的链霉亲和素能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上与靶标RNA上的生物素结合；
步骤七：步骤六结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤八：步骤七结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将荧光反应试剂加入第一进样或出样孔，使得荧光反应试剂流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与HRP标记的标记蛋白结合和/或靶标RNA已与HRP标记的链霉亲和素结合，则荧光反应剂能够与靶标蛋白和/或靶标RNA上的HRP结合；
步骤九：步骤八结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤十：步骤九结束后，吹干清洗过的第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道并检测第二通用流道和第三通用流道的荧光强度；
当所述微流控芯片包括上层夹具、固定流道层、通用流道层、载玻片以及下层夹具时，所述方法包括如下步骤：
步骤一：使用权利要求1～5任一项所述的微流控芯片，将上层夹具、固定流道层、载玻片和下层夹具分离，将上层夹具、通用流道层、载玻片以及下层夹具从上到下依次设置并组装：通用流道层的“Y”型通用流道面和载玻片一面贴合，使用上层夹具和下层夹具固定通用流道层和载玻片，“Y”型通用流道与载玻片共同形成供试剂流动的“Y”型空腔；
步骤二：步骤一结束后，通过第一加样或离样口封闭第一进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将待检样本加入第三进样或出样孔，使得待检样本依次流入第三通用流道和第二通用流道，经孵育，若待检样本中含有靶标蛋白，则靶标蛋白与载玻片对应于第二通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置以及第三通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置上固定的捕获蛋白特异性结合，若待检样本中含有靶标RNA，则靶标RNA与载玻片对应于第二通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置以及第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上固定的捕获探针特异性结合；
步骤三：步骤二结束后，通过第一加样或离样口放开第一进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔；使用蠕动泵通过第二加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液依次流入第三通用流道和第一通用流道，以清洗第一通用流道及第三通用流道；
步骤四：步骤三结束后，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将DNA聚合酶、RNase H、Biotin-dUTP、dATP、dGTP和dCTP加入第三进样或出样孔，使其流入第三通用流道，经孵育，若靶标RNA已与捕获探针特异性结合，则靶标RNA能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上，以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段；
步骤五：步骤四结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第三进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤六：步骤五结束后，通过第二加样或离样口封闭第三进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的标记蛋白加入第二进样或出样孔，使其流入第二通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与捕获蛋白特异性结合，则HRP标记的标记蛋白能够在载玻片对应于第二通用流道和第一“I”型固定流道交叉的位置上与靶标蛋白结合；
步骤七：步骤六结束后，通过第二加样或离样口放开第三进样或出样孔，并通过第二加样或离样口封闭第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第二加样或离样口将HRP标记的链霉亲和素加入第三进样或出样孔，经孵育，若靶标RNA已经以捕获探针为模板进行延伸并合成带有生物素标记的片段，则HRP标记的链霉亲和素能够在载玻片对应于第三通用流道和第二“I”型固定流道交叉的位置上与靶标RNA上的生物素结合；
步骤八：步骤七结束后，通过第二加样或离样口放开第二进样或出样孔，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤九：步骤八结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将荧光反应试剂加入第一进样或出样孔，使得荧光反应试剂流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，经孵育，若靶标蛋白已与HRP标记的标记蛋白结合和/或靶标RNA已与HRP标记的链霉亲和素结合，则荧光反应剂能够与靶标蛋白和/或靶标RNA上的HRP结合；
步骤十：步骤九结束后，使用蠕动泵通过第一加样或离样口将清洗液加入第一进样或出样孔，使得清洗液流入第一通用流道后，同时流入第二通用流道和第三通用流道，以清洗第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道；
步骤十一：步骤十结束后，吹干清洗过的第一通用流道、第二通用流道和第三通用流道并检测第二通用流道和第三通用流道的荧光强度。
10.权利要求1～5任一项所述的微流控芯片或权利要求6～8任一项所述的试剂盒或权利要求9所述的方法在针对已离体的组织、体液或排泄物检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
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