CN114276915A - 检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用，芯片包括从下到上依次设置的功能化基底、流道层和阀门控制层，所述功能化基底上分为GO核酸捕获区域和PLL检测区域；功能化基底上位于进样流道的区域固定有SARS‑CoV‑2病毒E区段的捕获探针E；试剂盒包括如上所述的芯片、封闭液、清洗液、裂解试剂、阴性对照品和阳性对照品。采用本发明的试剂盒进行检测无需核酸的提取和扩增，检测灵敏度高，样本需求量少，检测过程简单，时间短。而且制备材料廉价、装置简单。

Description

检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及一种检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情对世界的公众健康产生巨大威胁，与以往大多数流行性传染疾病相比，SARS-CoV-2的传染性更高。为了更快的检测病毒和抑制病毒的传播，发展一种快速、准确和灵敏的分子筛查技术是亟需解决的关键任务。基于SARS-CoV-2是一种具有单链RNA基因组的β型冠状病毒，并且包含S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白等的特点，核酸和抗体检测方法被用于筛查SARS-CoV-2。基于上述蛋白的抗体检测主要用于检测感染后产生的SARS特异性抗体(如IgG、IgM和IgA等)，此种方法可被用于病毒的感染、康复以及注射疫苗后抗体的追踪和确认，但在防止疾病传播方面存在不足；而核酸检测技术主要基于特异性基因，且与核酸提取和扩增技术相结合，完成SARS-CoV-2的高灵敏检测，有效抑制SARS-CoV-2的传播。

目前，基于核酸检测的qRT-PCR是诊断SARS-CoV-2感染的公认标准，具有优异的选择性和灵敏性，但是存在检测时间长、需要高质量技术人才，以及仅限于包含大型固定设备的实验室的医院使用的缺点。为了克服qRT-PCR自身的不足，发展了许多基于核酸的SARS-CoV-2检测技术，如基于RPA的等温核酸扩增、DNA纳米支架基杂交链反应、环介导等温扩增和核酸序列基扩增等。利用CRISPR-Cas酶介导的CRISPR核酸检测技术的快速发展，为SARS-CoV-2的检测提供了新的方法，此方法易操作，并且具有高的灵敏度，但前处理过程的加入，延长了检测时间。纳米科技和二维材料的发展，产生了许多新型的FET基生物传感，丰富了SARS-CoV-2的检测方法，可以实现分析样本量小、瞬时测量的目的，但其构建过程复杂。将不同试剂和样本之间的化学反应产生的信号转换为电信号完成RNA检测的电化学生物传感，具有灵敏度高、成本低和易于使用等优点，但是不同试剂的添加和相互反应以及检测过程中核酸的提取和扩增延长了整体的检测时间。

微流控技术的出现实现了检测试剂和样本的微量化，以及多样本检测，很大程度上提高了检测通量。微流控技术与CRISPR-Cas、FET等检测技术的结合，不仅体现了原有技术的优势，还提高了整体检测的准确率和效率。但核酸的提取和扩增在检测过程中是必不可少的，因此延长了整体的检测时间。所以，发展一种无需核酸提取和扩增，同时满足高通量筛选、低成本、高灵敏度和易操作等特点的新型冠状病毒检测方法，是亟需解决的任务。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用，以达到无核酸提取和扩增、快速、超灵敏、低成本、多样本以及易操作的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测新型冠状病毒核酸的芯片，包括从下到上依次设置的功能化基底、流道层和阀门控制层，所述功能化基底上分为GO核酸捕获区域和PLL检测区域；所述流道层上设置多个检测单元，每个检测单元包括上下贯穿流道层的微腔一、样品进样口一、样品出样口一，以及开设于流道层背面的进样流道和出样流道，所述进样流道一端连接样品进样口一，另一端连接微腔一，所述出样流道一端连接于进样流道上，另一端连接样品出样口一；所述进样流道位于功能化基底上GO核酸捕获区域的上方，所述微腔一位于功能化基底上PLL检测区域，所述功能化基底上位于进样流道的区域固定有SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E；

所述阀门控制层上开设多个上下贯穿阀门控制层的微腔二、样品进样口二、样品出样口二，所述微腔二和微腔一位置对应，所述样品进样口二和样品进样口一位置对应，所述样品出样口二和样品出样口一位置对应；所述阀门控制层上还开设上下贯穿阀门控制层的阀门进样口一和阀门进样口二，所述阀门控制层背面开设与阀门进样口一连接的控制流道一和与阀门进样口二连接的控制流道二，所述控制流道一上位于各微腔一的入口位置上方设置微腔控制阀，所述控制流道二上位于各出样流道的位置上方设置微流道控制阀。

上述方案中，所述捕获探针E的序列如下：

5'-GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATA-Cy3-3'。

一种上述芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、功能化基底的制备、流道层的制备和阀门控制层的制备；

步骤二、将制备好的阀门控制层放置于流道层的上部，显微镜下对接到一起，并于70℃下烘烤一段时间后，冷却至室温，然后放置在功能化基底上，制得芯片；

步骤三、SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E的固定。

上述方案中，步骤一中，功能化基底的制备包括如下过程：

(1)清洗载玻片：对载玻片进行划线处理，划分出生长GO和PLL的区域；然后将载玻片放入食人鱼溶液中煮沸后，采用去离子水对载玻片进行超声清洗；

(2)Plasma处理载玻片表面：将清洗过的载玻片采用等离子体清洗机进行表面羟基化处理；

(3)载玻片浸泡APTES：将Plasma处理过的载玻片的部分区域浸泡在APTES溶液中，一段时间后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；

(4)生长GO：将载玻片上浸泡过APTES的部分浸泡于GO溶液中，一段时间后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；

(5)生长PLL：将该载玻片中未生长GO的部分浸泡于PLL溶液中，一段时间后取出，采用去离子水清洗载玻片，并吹干，得到包含有PLL检测区域和GO核酸捕获区域的功能化基底。

上述方案中，步骤一中，流道层的制备包括如下过程：将RTV 615A和RTV 615B按照一定比例充分混合后，采用匀胶仪将RTV 615A和RTV 615B均匀铺到流道层模板中，放入烘箱中，70℃下烘烤一段时间后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间制得流道层。

上述方案中，步骤一中，阀门控制层的制备包括如下过程：将RTV 615A和RTV 615B按照一定比例充分混合后，倾倒入到阀门控制层模板中，并放入烘箱中，70℃下烘烤一段时间后，降至室温，将阀门控制层从模板上拆下即可。

上述方案中，步骤三的具体方法如下：将一定体积的含有捕获探针E的溶液加入到样品进样口二，此时微腔控制阀关闭，微流道控制阀开启，并采用真空泵在样品出样口二处将溶液经进样流道和出样流道吸入到样品出样口二中，并保留一部分溶液在进样流道内，孵育一段时间后，采用真空泵在样品出样口二处将进样流道内的溶液经出样流道吸出，并取一定量的100％PBS注入到样品进样口二中，后采用真空泵在样品出样口二将PBS吸出，完成对样品进样口二和进样流道内多余捕获探针E的清洗，至此捕获探针E固定完成。

一种检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括如上所述的芯片、封闭液、清洗液、裂解试剂、阴性对照品和阳性对照品；所述芯片用来对SARS-CoV-2病毒进行检测；所述封闭液在检测过程中用来占据未固定捕获探针E的位点；所述清洗液在检测的最后对已经固定DNA-RNA双链的功能化基底进行清洗；所述裂解试剂用来处理SARS-CoV-2病毒获得RNA；所述阴性对照品用来与待检测样本结果进行定性比较，确认待检测样本中是否存在SARS-CoV-2病毒；所述阳性对照品对待检测样本中SARS-CoV-2病毒中的RNA含量进行定量分析。

上述方案中，所述封闭液由BSA和PBS组成，BSA的质量分数为3％；所述清洗液包括四种试剂，分别为100％的PBS、50％的PBS、以及两份超纯水，所述50％的PBS为等质量的PBS和水混合而成；所述阴性对照品为TE buffer缓冲溶液；所述阳性对照品为不同浓度的SARS-CoV-2假病毒RNA溶液，包括S1，S2，S3，S4，其中S1为浓度10^-18M的假病毒RNA溶液，S2为浓度10^-17M的假病毒RNA溶液，S3为10^-16M的假病毒RNA溶液，S4为10^-15M的假病毒RNA溶液。

一种如上所述的检测新型冠状病毒核酸的试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：将四种不同浓度的阳性对照品分别注入到芯片的四个微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测，分析荧光值，与浓度进行线性拟合，制作标准曲线；

(2)病毒样本的处理获得RNA：将裂解试剂加入到病毒样本中，然后将盛放上述混合溶液的容器整体置于冰水混合物中，采用细胞破碎仪对冰水混合物进行超声，得到样本溶液；

(3)病毒样本中的RNA定性检测：将样本溶液和阴性对照品分别注入到芯片的空白微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测；将样本的荧光值与阴性对照品的荧光值进行比对，确定样本溶液中是否含有新型冠状病毒；

(4)病毒样本中的RNA定量检测：将样本溶液注入到芯片的空白微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测；根据标准曲线得到样本中RNA的含量。

通过上述技术方案，本发明提供的检测新型冠状病毒核酸的芯片、试剂盒及制备方法和应用具有如下有益效果：

(1)本发明的芯片内功能化基底的设计是基于纳米材料氧化石墨烯(GO)单链吸附，荧光猝灭和双链解吸附的特点以及多聚赖氨酸(PLL)分子双链吸附，不猝灭荧光的特点设计而成，同时结合阀门控制层的作用，实现微流道内DNA单链捕获探针E的荧光猝灭与复亮；特异性捕获探针E的设计以及在GO表面的固定可以捕获样本内微量的与其完全互补的RNA分子，并通过对PLL检测区域的荧光进行检测，完成样本的检测，因此无需核酸的提取和扩增。

(2)本发明的芯片以及试剂盒检测灵敏度高，样本需求量少，检测过程简单，时间短。

(3)本发明的芯片以及试剂盒中各试剂的制备材料廉价、装置简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例所公开的一种检测新型冠状病毒核酸的芯片整体示意图；

图2为功能化基底的正面图；

图3为流道层的背面图；

图4为阀门控制层的背面图；

图5为捕获探针E的特异性比较图；

图6为由阳性对照品的荧光值绘制的标准曲线图；

图7为阴性对照品和阳性对照品的荧光值比较图；

图8为本发明的试剂盒与qRT-PCR检测结果的对比图。

图中，1、功能化基底；2、流道层；3、阀门控制层；4、微腔一；5、样品进样口一；6、样品出样口一；7、进样流道；8、出样流道；9、微腔二；10、样品进样口二；11、样品出样口二；12、阀门进样口一；13、阀门进样口二；14、控制流道一；15、控制流道二；16、微腔控制阀；17、微流道控制阀。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提供了一种检测新型冠状病毒核酸的芯片，如图1所示，包括从下到上依次设置的功能化基底1、流道层2和阀门控制层3。

如图2所示，功能化基底1上分为GO核酸捕获区域和PLL检测区域，GO核酸捕获区域占功能化基底1宽度的3/5，PLL检测区域占功能化基底1宽度的2/5。

如图3所示，流道层2上设置多个检测单元，每个检测单元包括上下贯穿流道层2的微腔一4、样品进样口一5、样品出样口一6，以及开设于流道层2背面的进样流道7和出样流道8，进样流道7和出样流道8为开设在流道层2背面的凹槽结构，不贯穿流道层2。进样流道7一端连接样品进样口一5，另一端连接微腔一4，出样流道8一端连接于进样流道7上，另一端连接样品出样口一6；进样流道7位于功能化基底1上GO核酸捕获区域的上方，微腔一4位于功能化基底1上PLL检测区域的上方。功能化基底1上位于进样流道7的区域固定有SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E。根据SARS-CoV-2RNA的基因片段，设计了碱基完全互补的DNA捕获探针E，该捕获探针E会产生荧光，捕获探针E序列如下：5'-GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATA-Cy3-3'。

如图4所示，阀门控制层3上开设多个上下贯穿阀门控制层3的微腔二9、样品进样口二10、样品出样口二11，微腔二9和微腔一4位置一一对应，样品进样口二10和样品进样口一5位置一一对应，样品出样口二11和样品出样口一6位置一一对应；阀门控制层3上还开设上下贯穿阀门控制层3的阀门进样口一12和阀门进样口二13，阀门控制层3背面开设与阀门进样口一12连接的控制流道一14和与阀门进样口二13连接的控制流道二15，控制流道一14上位于各微腔一4的入口位置上方设置微腔控制阀16，控制流道二15上位于各出样流道8的位置上方设置微流道控制阀17。控制流道一14和控制流道二15为开设在阀门控制层3背面的凹槽结构，不管穿阀门控制层3，微腔控制阀16和微流道控制阀17为方形凹槽结构。

阀门控制层3以流道层2的顶为底。在检测之前，首先通过阀门进样口一12和阀门进样口二13将液体加入到内部，使液体充满每个微腔控制阀16和微流道控制阀17，以及控制流道一14和控制流道二15，然后再在阀门进样口一12和阀门进样口二13处通入氮气，通过控制氮气阀门的开启与关闭，对内部的液体施加压力，进而控制阀门进样口一12和阀门进样口二13的关闭与开启。氮气阀门开，液体有压力，微腔控制阀16和微流道控制阀17关闭；氮气阀门关闭，液体无压力，微腔控制阀16和微流道控制阀17开启。

上述芯片的制备方法包括如下步骤：

步骤一、功能化基底1的制备、流道层2的制备和阀门控制层3的制备。

1、功能化基底1的制备包括如下过程：

(1)清洗载玻片：对载玻片进行划线处理，划分出生长GO和PLL的区域；然后将载玻片放入食人鱼溶液中煮沸后，采用去离子水对载玻片进行超声清洗；

(2)Plasma处理载玻片表面：将清洗过的载玻片采用等离子体清洗机进行表面羟基化处理，便于APTES与功能化基底的结合；

(3)载玻片浸泡APTES：将Plasma处理过的载玻片的部分区域(3/5宽度)浸泡在APTES溶液中，20min后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；浸泡APTES有利于GO在功能化基底上生长。

(4)生长GO：将载玻片上浸泡过APTES的部分浸泡于GO溶液中，20min后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；

(5)生长PLL：将该载玻片中未生长GO的部分(2/5宽度)浸泡于PLL溶液中，10min后取出，采用去离子水清洗载玻片，并吹干，得到包含有PLL检测区域和GO核酸捕获区域的功能化基底1。

2、流道层2的制备包括如下过程：

将RTV 615A和RTV 615B按照1：5的质量比充分混合后，采用匀胶仪将RTV 615A和RTV 615B均匀铺到流道层2模板中，放入烘箱中，70℃下烘烤一段时间后，从烘箱中取出，在室温下放置20min以上制得PDMS流道层2。

3、阀门控制层3的制备包括如下过程：

将RTV 615A和RTV 615B按照1：5的质量比充分混合后，倾倒入到阀门控制层3模板中，并放入烘箱中，70℃下烘烤30min后，降至室温，将阀门控制层3从模板上拆下即可得到PDMS阀门流道层2。

步骤二、将制备好的阀门控制层3放置于流道层2的上部，显微镜下对接到一起，并于70℃下烘烤30min后，冷却至室温，然后放置在功能化基底1上，进样流道7对应GO核酸捕获区域，微腔一4和微腔二9对应PLL检测区域，制得芯片。

步骤三、SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E的固定。

具体方法如下：将一定体积的含有捕获探针E的溶液加入到样品进样口二10，此时微腔控制阀16关闭，微流道控制阀17开启，并采用真空泵在样品出样口二11处将溶液经进样流道7和出样流道8吸入到样品出样口二11中，并保留一部分溶液在进样流道7内，孵育一段时间后，采用真空泵在样品出样口二11处将进样流道7内的溶液经出样流道8吸出，并取一定量的100％PBS注入到样品进样口二10中，后采用真空泵在样品出样口二11将PBS吸出，完成对样品进样口二10和进样流道7内多余捕获探针E的清洗，至此捕获探针E固定完成。

捕获探针E的特异性验证：

捕获探针E固定完成后，需要对其进行特异性的验证。选取SARS-CoV-2RNA中与探针E非互补的其他RNA进行验证，总共三种：

RNA-ORF1a/b-3(序列：5'-GUUCCACCUGGUUUAACAUAUAGUGAACCGCCACACAUGACCAUUUCAC-3')

RNA-ORF1a/b-4(序列：5'-AAAUGUUAAAAACACUAUUAGCAUAAGCAGUUGUGGCAUCUCCUGAUGAG-3')，

RNA-E2(序列：5'-AAGAAUACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGUACGCUAUUAACUAUUAACGUACCUGU-3')。

采用移液枪分别将2μL的上述RNA溶液加入到芯片的三个样品进样口二10内，此时微腔控制阀16开启，微流道控制阀17关闭，将与真空泵相连的软管末端的方形盒盖在微腔二9上面，开启真空泵，将RNA溶液吸入到进样流道7内，关闭微腔控制阀16，使进样流道78内的RNA溶液孵育20min后，开启微腔控制阀16，在样品进样口二10处采用氮气将进样流道7内的RNA溶液吹入到微腔一4内，关闭微腔控制阀16，孵育10min，使RNA与DNA探针充分反应，结合成双链，形成DNA-RNA，然后将与真空泵相连的软管末端的方形盒盖在微腔二9上面，开启真空泵，将微腔一4内的RNA溶液吸出。在封闭液中将芯片上层的PDMS(阀门控制层3和流道层2)揭掉，功能化基底1在封闭液中浸泡10分钟，然后将功能化基底1取出，采用清洗液进行清洗，依次经过：100％PBS，50％PBS，两份超纯水清洗，最后将功能化基底1甩干，对微腔一4下方的功能化基底进行荧光检测，检测结果如图5所示。从图5可以看出，与捕获探针E1非互补的RNA具有很低的荧光值，而与捕获探针E1完全互补的RNA-E1表现出高的荧光值，比非互补RNA荧光值高10倍以上，因此说明选取的捕获探针E1表现出优良的特异性。

一种检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括如上的芯片、封闭液、清洗液、裂解试剂、阴性对照品和阳性对照品；芯片用来对SARS-CoV-2病毒进行检测；封闭液在检测过程中用来占据未固定捕获探针E的位点；清洗液在检测的最后对已经固定DNA-RNA双链的功能化基底1进行清洗；裂解试剂用来处理SARS-CoV-2病毒获得RNA；阴性对照品用来与待检测样本结果进行定性比较，确认待检测样本中是否存在SARS-CoV-2病毒；阳性对照品对待检测样本中SARS-CoV-2病毒中的RNA含量进行定量分析。

具体的，封闭液由BSA和PBS组成，BSA的质量分数为3％；采用PBS将BSA按比例进行稀释即可。

清洗液包括四种试剂，分别为100％的PBS、50％的PBS、以及两份超纯水，50％的PBS为等质量的PBS和水混合而成。

裂解试剂由裂解液(25mM Tris·HCl pH 7.6，50mM NaCl，1％NP-40，1％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS)构成。

阴性对照品为TE buffer缓冲溶液。

阳性对照品为人工合成的不同浓度的SARS-CoV-2假病毒RNA溶液，包括S1，S2，S3，S4，其中S1为浓度10^-18M的假病毒RNA溶液，S2为浓度10^-17M的假病毒RNA溶液，S3为10^-16M的假病毒RNA溶液，S4为10^-15M的假病毒RNA溶液。

阳性对照品的制备：取一定体积的假病毒溶液，然后加入等量体积的裂解

试剂，将上述混合溶液置于EP管中，并将EP管置于冰水混合物中，然后采用细胞破碎仪对冰水混合物进行超声处理；采用Qubit对EP管内的溶液进行RNA浓度的测定，获得确定浓度后，采用TE buffer对该溶液进行不同浓度的稀释，最终获得四种不同浓度(S1，S2，S3，S4)的阳性对照品。

上述试剂盒的组成见表1。

表1试剂盒组成

本发明的芯片检测原理如下：

首先，芯片的进样流道区域的功能化基底上已经固定好DNA捕获探针E，当待检测样本加入到进样流道内后，如果样本内含有与捕获探针E碱基完全互补的RNA，那么DNA捕获探针E会通过碱基配对原则，将RNA捕获，两者结合形成双链(DNA-RNA)，形成双链后，由于GO对双链不吸附，因此，结合形成的双链会悬浮于GO表面；然后采用氮气从样品进样口二处将进样流道内的液体吹入到微腔一内(此液体含有形成的DNA-RNA双链)，由于进入到微腔一内(PLL端)的液体含有DNA-RNA双链，液体内的DNA-RNA双链会被PLL吸附，由于PLL不会使荧光猝灭，从而捕获探针E上面带有的荧光基团的荧光复亮，从而可以进行荧光检测。

一种如上的检测新型冠状病毒核酸的试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：将四种不同浓度的阳性对照品50μL分别采用微注射泵按照速率1μL/min注入到芯片的样品进样口二10中，此时微腔控制阀16处于开启状态，微流道控制阀17处于关闭状态；将与真空泵相连的软管末端的方形盒盖在微腔二9上方，开启真空泵，将样品进样口二10中的液体通过样品进样口一5流经进样流道7，进入微腔一4中，液体在微腔一4中孵育10min，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层2和阀门控制层3揭掉，将功能化基底1浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底1进行清洗；按照下面顺序依次进行清洗：100％PBS浸泡；50％PBS浸泡；第一瓶H₂O浸泡；第二瓶H₂O浸泡；最后将功能化基底1吹干进行荧光检测，分析荧光值；然后对荧光值进行log处理，与浓度进行线性拟合，制作标准曲线；本实施例中为RNA-E1，拟合公式为lgy＝5.08+0.12lgx，见图6。从图6可以看出，随着浓度的升高，试剂盒检测到的荧光值增加，低检测浓度可以达到1aM，因此，试剂盒可以检测SARS-CoV-2RNA含量极低的样本，并且浓度与荧光值之间具有很好的线性拟合关系。

(2)病毒样本的处理获得RNA：将25μL裂解试剂加入到25μL病毒样本中，然后将盛放上述混合溶液的容器整体置于冰水混合物中，采用细胞破碎仪对冰水混合物进行超声，时间为5min，此操作是将裂解后的得到的长链RNA变为短链RNA，得到样本溶液；

(3)病毒样本中的RNA定性检测：将样本溶液和阴性对照品各50μL采用微注射泵按照一定速率注入到芯片剩余的空白样品进样口二10中，操作过程同步骤(1)，最后将功能化基底1吹干进行荧光检测；将样本的荧光值与阴性对照品的荧光值进行比对，确定样本溶液中是否含有新型冠状病毒。

本发明将阴性对照品和阳性对照品同样按照步骤(3)的操作之后，检测到的荧光值进行对比，结果如图7所示，可以发现阴性对照品的荧光值远低于阳性对照品，阴性对照品内无任何SARS-CoV-2RNA，此结果可以被用于定性检测样本内是否含有SARS-CoV-2RNA，若待检测样本溶液的荧光值比阴性对照品高说明样本溶液中含有SARS-CoV-2RNA，反之不含SARS-CoV-2RNA。

(4)病毒样本中的RNA定量检测：将50μL样本溶液采用微注射泵按照一定速率注入到芯片剩余的空白样品进样口二10中，操作过程同步骤(1)，最后将功能化基底1吹干进行荧光检测；根据标准曲线中得到的荧光值与浓度的关系式，将测量的荧光值带入，得到样本溶液中RNA的含量。

本发明将阳性对照品采用qRT-PCR方法以及本发明的试剂盒的方法进行检测，检测结果见图8，可以发现，本发明试剂盒检测到的浓度与通过RT-qPCR检测到的浓度相比，偏差范围很小，在2％～6.1％，因此说明本发明的试剂盒具有优异的检测性能。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种检测新型冠状病毒核酸的芯片，其特征在于，包括从下到上依次设置的功能化基底、流道层和阀门控制层，所述功能化基底上分为GO核酸捕获区域和PLL检测区域；所述流道层上设置多个检测单元，每个检测单元包括上下贯穿流道层的微腔一、样品进样口一、样品出样口一，以及开设于流道层背面的进样流道和出样流道，所述进样流道一端连接样品进样口一，另一端连接微腔一，所述出样流道一端连接于进样流道上，另一端连接样品出样口一；所述进样流道位于功能化基底上GO核酸捕获区域的上方，所述微腔一位于功能化基底上PLL检测区域，所述功能化基底上位于进样流道的区域固定有SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E；

所述阀门控制层上开设多个上下贯穿阀门控制层的微腔二、样品进样口二、样品出样口二，所述微腔二和微腔一位置对应，所述样品进样口二和样品进样口一位置对应，所述样品出样口二和样品出样口一位置对应；所述阀门控制层上还开设上下贯穿阀门控制层的阀门进样口一和阀门进样口二，所述阀门控制层背面开设与阀门进样口一连接的控制流道一和与阀门进样口二连接的控制流道二，所述控制流道一上位于各微腔一的入口位置上方设置微腔控制阀，所述控制流道二上位于各出样流道的位置上方设置微流道控制阀。

2.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒核酸的芯片，其特征在于，所述捕获探针E的序列如下：

5'-GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATA-Cy3-3'。

3.一种如权利要求1所述的芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、功能化基底的制备、流道层的制备和阀门控制层的制备；

步骤二、将制备好的阀门控制层放置于流道层的上部，显微镜下对接到一起，并于70℃下烘烤一段时间后，冷却至室温，然后放置在功能化基底上，制得芯片；

步骤三、SARS-CoV-2病毒E区段的捕获探针E的固定。

4.根据权利要求3所述的芯片的制备方法，其特征在于，步骤一中，功能化基底的制备包括如下过程：

(1)清洗载玻片：对载玻片进行划线处理，划分出生长GO和PLL的区域；然后将载玻片放入食人鱼溶液中煮沸后，采用去离子水对载玻片进行超声清洗；

(2)Plasma处理载玻片表面：将清洗过的载玻片采用等离子体清洗机进行表面羟基化处理；

(3)载玻片浸泡APTES：将Plasma处理过的载玻片的部分区域浸泡在APTES溶液中，一段时间后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；

(4)生长GO：将载玻片上浸泡过APTES的部分浸泡于GO溶液中，一段时间后取出，采用去离子水超声清洗载玻片，并吹干；

(5)生长PLL：将该载玻片中未生长GO的部分浸泡于PLL溶液中，一段时间后取出，采用去离子水清洗载玻片，并吹干，得到包含有PLL检测区域和GO核酸捕获区域的功能化基底。

5.根据权利要求3所述的芯片的制备方法，其特征在于，步骤一中，流道层的制备包括如下过程：将RTV 615 A和RTV 615 B按照一定比例充分混合后，采用匀胶仪将RTV 615 A和RTV 615 B均匀铺到流道层模板中，放入烘箱中，70℃下烘烤一段时间后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间制得流道层。

6.根据权利要求3所述的芯片的制备方法，其特征在于，步骤一中，阀门控制层的制备包括如下过程：将RTV 615 A和RTV 615 B按照一定比例充分混合后，倾倒入到阀门控制层模板中，并放入烘箱中，70℃下烘烤一段时间后，降至室温，将阀门控制层从模板上拆下即可。

7.根据权利要求3所述的芯片的制备方法，其特征在于，步骤三的具体方法如下：将一定体积的含有捕获探针E的溶液加入到样品进样口二，此时微腔控制阀关闭，微流道控制阀开启，并采用真空泵在样品出样口二处将溶液经进样流道和出样流道吸入到样品出样口二中，并保留一部分溶液在进样流道内，孵育一段时间后，采用真空泵在样品出样口二处将进样流道内的溶液经出样流道吸出，并取一定量的100％PBS注入到样品进样口二中，后采用真空泵在样品出样口二将PBS吸出，完成对样品进样口二和进样流道内多余捕获探针E的清洗，至此捕获探针E固定完成。

8.一种检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的芯片、封闭液、清洗液、裂解试剂、阴性对照品和阳性对照品；所述芯片用来对SARS-CoV-2病毒核酸进行检测；所述封闭液在检测过程中用来占据未固定捕获探针E的位点；所述清洗液在检测的最后对已经固定DNA-RNA双链的功能化基底进行清洗；所述裂解试剂用来处理SARS-CoV-2病毒获得RNA；所述阴性对照品用来与待检测样本结果进行定性比较，确认待检测样本中是否存在SARS-CoV-2病毒；所述阳性对照品对待检测样本中SARS-CoV-2病毒中的RNA含量进行定量分析。

9.根据权利要求8所述的一种检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述封闭液由BSA和PBS组成，BSA的质量分数为3％；所述清洗液包括四种试剂，分别为100％的PBS、50％的PBS、以及两份超纯水，所述50％的PBS为等质量的PBS和水混合而成；所述阴性对照品为TE buffer缓冲溶液；所述阳性对照品为不同浓度的SARS-CoV-2假病毒RNA溶液，包括S1，S2，S3，S4，其中S1为浓度10^-18M的假病毒RNA溶液，S2为浓度10^-17M的假病毒RNA溶液，S3为10^-16M的假病毒RNA溶液，S4为10^-15M的假病毒RNA溶液。

10.一种如权利要求9所述的检测新型冠状病毒核酸的试剂盒的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：将四种不同浓度的阳性对照品分别注入到芯片的四个微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测，分析荧光值，与浓度进行线性拟合，制作标准曲线；

(2)病毒样本的处理获得RNA：将裂解试剂加入到病毒样本中，然后将盛放上述混合溶液的容器整体置于冰水混合物中，采用细胞破碎仪对冰水混合物进行超声，得到样本溶液；

(3)病毒样本中的RNA定性检测：将样本溶液和阴性对照品分别注入到芯片的空白微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测；将样本的荧光值与阴性对照品的荧光值进行比对，确定样本溶液中是否含有新型冠状病毒；

(4)病毒样本中的RNA定量检测：将样本溶液注入到芯片的空白微腔一中，孵育一段时间，再将芯片整体浸在3％BSA中，并将流道层和阀门控制层揭掉，将功能化基底浸泡10min，然后采用清洗液对功能化基底进行清洗；最后将功能化基底吹干进行荧光检测；根据标准曲线得到样本中RNA的含量。

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