CN106939360B - HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106939360B
CN106939360B CN201710373709.XA CN201710373709A CN106939360B CN 106939360 B CN106939360 B CN 106939360B CN 201710373709 A CN201710373709 A CN 201710373709A CN 106939360 B CN106939360 B CN 106939360B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer pair
pcr amplification
primer
hcv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710373709.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106939360A (zh
Inventor
冯宇鹏
郭晓磊
曾征宇
徐艳艳
刘声碧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Jinyu Medical Inspection Center Co Ltd
Original Assignee
Guizhou Jinyu Medical Inspection Center Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Jinyu Medical Inspection Center Co Ltd filed Critical Guizhou Jinyu Medical Inspection Center Co Ltd
Priority to CN201710373709.XA priority Critical patent/CN106939360B/zh
Publication of CN106939360A publication Critical patent/CN106939360A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106939360B publication Critical patent/CN106939360B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法。本发明通过特别设计的PCR扩增引物，包括第一引物对和第二引物对，将较难扩增和测序的长片段的NS5B区分成两个较小的片段进行独立扩增，再进行测序分析，可以很容易就发现NS5B区域的突变情况，从而在用药前或用药过程中可以及时提供指导和支持。进一步，对于使用第一引物对和第二引物对的第一轮PCR扩增的产物不太理想，如产物片段存在非特异性条带或浓度不高，再使用第三引物对和第四引物对等对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增，再进行鉴定或测序分析，可进一步保证测序结果的可靠性，进而可以提高突变检测的准确性。

Description

HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为 0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症。
HCV病毒体呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36～62nm)，为有包膜、单股正链RNA病毒。单链HCV RNA基因组是正极性的，包含一个约9600个核苷酸长的开放读框(ORF)，编码约3010个氨基酸的线性多蛋白。在被感染的细胞中，该多蛋白被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多个位点切割，产生结构和非结构(NS)蛋白。结构蛋白(C、E1、E2和E2-p7) 包括构成病毒颗粒的多肽。非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B)编码催化和调节HCV RNA基因组复制的酶或辅助因子。
发明内容
本发明提供了一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物及试剂盒。
一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物，包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增引物还包括第三引物对和第四引物对，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增引物还包括第五引物对和第六引物对，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:2所示，所述第六引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增引物还包括第七引物对和第八引物对，所述第七引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5所示，所述第八引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。
一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的试剂盒，含有引物试剂，所述引物试剂中的引物为上述任一实施例所述的PCR扩增引物。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR 扩增试剂及电泳鉴定试剂中的至少一种试剂。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括含有HCV 2a亚型的HCV阳性对照试剂。
上述HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物或试剂盒可用于HCV NS5B突变检测，在其中一实施例中，在突变检测时，可按照如下方法进行：
对含有HCV 2a亚型RNA的待测样本进行逆转录处理，合成HCV cDNA；
对合成的HCV cDNA使用第一引物对和第二引物对进行第一轮PCR扩增，其中，所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 所示；
对所述第一轮PCR扩增的产物进行测序分析。
在其中一个实施例中，还包括对第一轮PCR扩增的产物进行鉴定的步骤，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则使用第三引物对和第四引物对对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增(为半巢式扩增)，再对第二轮PCR扩增的产物进行所述测序分析，其中，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示。
在其中一个实施例中，还包括对第二轮PCR扩增的产物进行鉴定的步骤，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则对合成HCV cDNA 使用第五引物对和第六引物对重新进行第一轮PCR扩增，其中，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:2所示，所述第六引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:8所示；
并对使用所述第五引物对和所述第六引物对进行第一轮PCR扩增的产物进行鉴定，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则使用第七引物对和第八引物对对该第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增(为半巢式扩增)，再对扩增的产物进行鉴定和分析，其中，所述第七引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5所示，所述第八引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。
在进行鉴定的时候，主要是看PCR扩增的结果，如果PCR扩增的条带清楚，则进行测序分析，如果条带不清晰等，还会用上述的引物进行调整更换后再进行PCR扩增，直到扩出的条带清楚。
在其中一个实施例中，所述预设值为1×104IU/ml。
在其中一个实施例中，所述鉴定是使用琼脂糖凝胶电泳法检测所述产物片段的长度。
在其中一个实施例中，所述产物片段的长度满足预设要求是指产物片段的长度在1000bp左右(如1000bp± 50bp)。
整个HCV 2a亚型的NS5B区片段较长(1782bp)，但全扩增出来不利于测序。本发明通过特别设计的PCR扩增引物，包括第一引物对和第二引物对，将较难扩增和测序的长片段的NS5B区分成两个较小的片段进行独立扩增，如果样本本身较好，第一对引物扩增出来的产物应该有1027bp，第二对引物扩增出来1126bp，中间有重叠，再进行测序分析，可以很容易就发现NS5B区域的突变情况。
进一步，对于使用第一引物对和第二引物对的第一轮PCR扩增的产物不太理想，如产物片段存在非特异性条带或浓度不高，再使用第三引物对和第四引物对对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮半巢式PCR扩增，如果第二轮PCR 扩增的产物还不太理想，还可以继续使用第五引物对和第六引物对再对cDNA 重新进行第一轮PCR扩增，之后再进行鉴定或测序分析，如果结果还不理想，还可以使用第七引物对和第八引物对对该第一轮PCR扩增产物进行第二轮半巢式PCR扩增，因而，可进一步保证测序结果的可靠性，进而可以提高突变检测的准确性。
本发明在测序分析时，主要使用一代测序技术，如ABI3730或ABI3500测序仪等，其中，ABI3730只能读大约800bp，读到后面准确性受限，ABI3500能读大约500bp。因此，本发明采用多对引物进行PCR扩增。这样扩增出来，中间是会有重叠的，因为一代测序只能单向测序，测序时，因为仪器本身的测序长度的限制，采用二对引物就能够在保证前面的测序是准确的前提下，而后面的部分因为是有重叠部分，所以测出的也是准确的，因而，采用本发明的多对 PCR扩增引物或试剂盒进行扩增，可以保证测序的精度，提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为各引物对应的位点示意图。
图2为有效性验证时第一轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，图2a使用LF1/LR1引物对；图2b使用RF1/RR1引物对。
图3为有效性验证时第二轮半巢式PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，使用LF1/LR2、RF2/RR1引物对。
图4为有效性验证时扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，使用 LF2/LR1、RF1/RR2引物对对模板进行第一轮PCR扩增，再使用LF2/LR2、 RF2/RR2引物对该第一轮PCR扩增产物对应进行第二轮半巢式PCR扩增。
图5为重复性验证时第一轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，图5a使用LF1/LR1引物对；图5b使用RF1/RR1引物对。
图6为重复性验证时第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，使用LF1/LR2、RF2/RR1引物对。
图7为最低下限验证时第一轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，图7a为使用LF1/LR1引物对；图7b使用RF1/RR1引物对。
图8为最低下限验证时对第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，使用LF1/LR2、RF2/RR1引物对。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下为具体检测实施例部分。
一、样本采集、稳定性及处理
1、样本的采集
1.1血清：用负压采血管采集2ml静脉血于不含有抗凝剂无菌管中，室温放置不超过2小时，分离血清转入无菌管中备用。
1.2血浆：用负压采血管采集2ml静脉血于含有EDTA抗凝剂无菌管中，室温放置不超过2小时，分离血浆转入无菌管中备用。
2、样本的稳定性
2.1样本的稳定性：室温：2小时；冷藏：3天；冷冻：3个月。
2.2样本的保存条件：原管冷藏(2℃～8℃)保存，分离后的血清或血浆冷冻(-15℃～-25℃)保存。
3、样本的处理
3.1检测完的样本，原管冷藏(2℃～8℃)保存10天，分离后的血清或血浆冷冻(-15℃～-25℃)保存1个月。
二、试剂
1、贮存与稳定性
1.1RNA提取试剂：除Proteinase K保存于-20℃，MagBind Particles保存于 2℃～8℃外，其它试剂组份均贮存于常温(15℃～25℃)，有效期均为1年。
1.2核酸扩增试剂、引物及质控品：均贮存于-20℃，有效期均为1年。
1.3电泳试剂：除D2000Marker储存于4℃(经常使用时)外，其它试剂均储存于常温(15℃～25℃)；除1×TAE溶液和1.5％琼脂糖凝胶现配现用外，其它试剂有效期均为1年。
2、试剂盒组成
2.1RNA提取试剂(MagPure Viral Nucleic Acid KF Kit，Magen公司)：
注意：上述试剂在Thermo KingFisher Flex仪器上运行。
2.2核酸扩增试剂
2.2.1第一链cDNA合成试剂为Vazyme公司产品(HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit)：
2.2.2PCR扩增试剂为Vazyme产品(2×Phanta Max Master Mix)：
2×Phanta Max Master Mix(1×1ml)
2.3引物(Life Technologies公司，在广州合成)，见下表1。
表1
引物序列 引物名称 SEQ ID NO:
ACCGGGCCTCTAATCACTGC 2a5B-LF1(对应图2～8中F) 1
GGGCTGAGAACGTGGTGAT 2a5B-LR1(对应图2～8中R3) 2
CTGCTCCACGTCATAGTCAT 2a5B-LF2(对应图2～8中F2) 7
TCGTCTCCGGATATCAGCTT 2a5B-LR2(对应图2～8中R4) 5
CGTATCATACGCGATGATT 2a5B-RF1(对应图2～8中F3) 3
CTCTAGCGAGCGTGGAGCA 2a5B-RR1(对应图2～8中R2) 4
ACTGTGGACTCCAGATATC 2a5B-RF2(对应图2～8中F4) 6
TACGAATAGTAGCAGTACGC 2a5B-RR2(对应图2～8中R) 8
注：1、引物结合位点以参考株AB047639为准，各引物序列的对应位置见图1；人工序列
2、由于整个NS5B区片段较长，不利于测序，因此引物设计为两个较小的片段，可以先分别由2a5B-LF1/LR1、2a5B-RF1/RR1进行第一轮PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序分析，未达到要求者以2a5B-LF1/LR2、 2a5B-RF2/RR1进行第二轮半巢式PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序分析，未达到要求者可以更换第一轮及第二轮的引物序列，如可以以整个NS5B模板先以2a5B-LF2/LR1、2a5B-RF1/RR2进行第一轮PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序分析，未达到要求者再以2a5B-LF2/LR2、 2a5B-RF1/RR2进行第二轮半巢式PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序分析。
2.4质控品
阴性对照：为不含HCV RNA的临床样本。与实验样本平行操作，每批次1 个。
阳性对照：为HCV 2a亚型的HCV阳性临床样本，与实验样本平行操作，每批次1个。
2.5电泳鉴定试剂
2.5.1 50×TAE溶液：称取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，然后加入800ml去离子水，充分搅拌溶解；再加入57.1ml冰醋酸，充分混匀；最后加去离子水定容至1L，室温保存。
2.5.2 1×TAE溶液：量取20ml 50×TAE溶液于试剂瓶中，加入去离子水定容至1L，室温保存。
2.5.3 1％溴酚蓝母液：称取1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
2.5.4 0.05％溴酚蓝上样缓冲液：取0.75ml 1％溴酚蓝母液于15ml塑料管中，加水定容至15ml。
2.5.5 1.5％琼脂糖凝胶：称取1.35g琼脂粉于200ml锥形瓶中，加入90ml 1×TAE溶液，摇匀；置于微波炉中火加热2分钟，取出后冷却至60℃，加入3μl 核酸染料，并摇匀，注意不要有气泡；将溶解的琼脂糖倒入胶槽，然后插入梳子，室温冷却凝固。
2.5.6核酸染料：吖啶橙(深圳亚能公司)；Marker：D2000Marker(天根生化公司)。
三、仪器设备/耗材，见下表2
表2
四、操作步骤
1、样本处理(标本制备区)
1.1准备洗板和洗脱板
按下表3把相应的洗涤液(Buffer MW1和Buffer MW2)和洗脱液(Nuclease FreeWater)加到96孔板中，并标记好名称。把磁力外套放到洗板1中。
表3
1.2准备样品板，见下表4。
表4
1.3上机运行(RNA提取)
a)打开Thermo KingFisher Flex，选择MagPure Viral-5412-KF程序。
b)启动程序，按仪器提示把装好样品和试剂的96孔板放到仪器中。
c)程序开始运行，约30分钟后程序结束。
d)取出洗脱板贴上封口膜，保存于-20℃(非立即检测时)。
e)按照实验室标准流程，丢去废液和耗材。
2、反转录试剂配制(试剂准备区)
2.1从试剂盒中取出HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂，室温融化后，2000rpm离心10秒。
2.2在96孔PCR反应板分别加入1μl Random hexamers(50ng/μl)，通过样品传递窗转移至样本处理区。
2.3设所需要的管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，另外由于分装的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1计算)。每个测试反应体系配制如下表5，配好后通过样品传递窗转移至样本处理区。
表5
试剂名称 用量/单个测试
2×RT Mix 10μl
HiScript Enzyme Mix 2μl
3、反转录PCR加样(标本制备区)
3.1根据预先确定顺序的96孔板加样表，使用八通道移液器分别向96孔PCR 板中加入RNA模板、阴性对照及阳性对照各7μl，使用一次性封口膜密封。
3.2使用酶标板式离心机3000rpm离心1分钟，转移至扩增区。
4、反转录PCR扩增(扩增区/样品处理区)
4.1将96孔板放入PCR仪，并旋紧PCR盖，选择热盖模式。按下表6条件进行变性，完成后转移至样本处理区。
表6
变性阶段 温度(℃) 时间(Time) 循环(Cycles)
Stage 1 65 5分钟 1
Stage 2 4 2分钟 1
注：反应体积8μl。
4.2将配置好的反转录试剂加入到变性后的96孔板中(12μl/孔)，用移液器轻轻吹打混匀，使用一次性封口膜密封。
4.3使用酶标板式离心机3000rpm离心1分钟，转移至扩增区。
4.4将96孔板放入PCR仪，并旋紧PCR盖，选择热盖模式。按下表7条件进行扩增，完成后转移至样本处理区。
表7
扩增阶段 温度(℃) 时间(Time) 循环(Cycles)
Stage 1 25 5分钟 1
Stage 2 50 45分钟 1
Stage 3 85 5分钟 1
注：反应体系20μl。
5、第一轮PCR扩增试剂配制(试剂准备区)
5.1从试剂盒中取出2×Phanta Max Master Mix及引物，室温融化后，2,000 rpm离心10秒。
5.2设所需要的管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，另外由于分装的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1计算)。每个测试反应体系配制如下表8。
表8
试剂名称 用量/单个测试
ddH20 5.8μl
2×Phanta Max Master Mix 15.0μl
2a5B-LF1/2a5B-RF1(20μM) 0.6μl
2a5B-LR1/2a5B-RR1(20μM) 0.6μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混匀，向设定的n 个PCR反应管中分别加入22μl，通过样品传递窗转移至产物分析区。
6、第一轮PCR扩增加样(试剂准备区)
6.1根据预先确定顺序的96孔板加样表，使用八通道移液器分别向96孔PCR 板中加入反转录PCR产物、阴性对照及阳性对照各8μl，使用一次性封口膜密封。
6.2使用酶标板式离心机3000rpm离心1分钟，转移至扩增区。
7、第一轮PCR扩增(扩增区)
将PCR管放入PCR仪，并旋紧PCR盖，选择热盖模式。按下表9条件进行扩增：
表9
注：反应体积30μl。
8、第一轮PCR扩增产物电泳鉴定(产物分析区)
8.1制备1.5％琼脂糖凝胶，取2μl扩增产物加入3μl溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样，120V电压电泳约20分钟，然后于凝胶成像系统观察。
8.2首先观察对照品是否符合(HCV阴性对照管无条带，HCV阳性对照管条带清晰，且条带大小为1000bp左右)。
8.3如果临床样本条带清晰且单一，且条带大小为1000bp左右，进入测序步骤。测序结果分析标准为：cut off值设置为20％，仅判断大于占比20％碱基信息。
8.4如果临床样本条带较暗或无条带，无法满足测序要求，进入第二轮PCR 扩增步骤。
9、第二轮PCR扩增试剂配制(试剂准备区)
9.1从试剂盒中取出2×Phanta Max Master Mix及引物，室温融化后，2,000 rpm离心10秒。
9.2设所需要的管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，另外由于分装的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1计算)。每个测试反应体系配制如下表10。
表10
试剂名称 用量/单个测试
ddH20 11.8μl
2×Phanta Max Master Mix 15.0μl
2a5B-LF1/2a5B-RF2(20μM) 0.6μl
2a5B-LR2/2a5B-RR1(20μM) 0.6μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混匀，向设定的n 个PCR反应管中分别加入28μl，通过样品传递窗转移至产物分析区。
10、第二轮PCR扩增加样(产物分析区)
在该区通风橱内，使用单通道移液器分别向PCR反应管中加入临床样本、阴性对照及阳性对照的第一轮PCR产物各2μl，盖紧PCR管管盖，短暂离心后转移至扩增区。
11、第二轮PCR扩增(扩增区)
将PCR管放入PCR仪，并旋紧PCR盖，选择热盖模式。按下表11条件进行扩增。
表11
注：反应体积30μl。
12、第二轮PCR扩增产物电泳鉴定(产物分析区)
12.1制备1.5％琼脂糖凝胶，取2μl扩增产物加入3μl溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样，120V电压电泳约20分钟，然后于凝胶成像系统观察。
12.2首先观察对照品是否符合(HCV阴性对照管无条带，HCV阳性对照管条带清晰，且条带大小为1000bp左右)。
12.3如果临床样本条带清晰，且条带大小为1000bp左右，进入测序步骤。
12.4如果临床样本无条带，需进行HCV RNA定量确认。如果HCV RNA 定量结果≥1×104IU/ml，则需重新进入RNA提取及PCR扩增步骤；如果HCV RNA 定量结果<1×104IU/ml，该说明病毒含量低于检测下限。
此外，如果第二轮PCR扩增的条带不清晰，还可以对第一轮PCR扩增的产物进行第三轮PCR扩增，第三轮PCR扩增的两个引物对分别是 2a5B-LF2/2a5B-LR1、2a5B-RR1/2a5B-RR2。扩增体系及扩增条件同第二轮PCR 扩增。
13、Sanger测序
13.1测序地点：广州金域实验室。
13.2测序试剂：Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。
13.3DNA模版处理：
a)ExoSAP-IT和H2O以2.0μl:3.0μl混合，震荡混匀后，分装5.0μl至新的8 连管中；
b)每孔加入PCR产物2.0μl，混匀微离心；
c)在PCR仪中进行酶切反应，程序：37℃，15min→80℃，15min→4℃，保温。
13.4测序PCR体系配置：按照试剂盒要求进行体系配置。
13.5测序PCR反应：
a)向每管中加入经ExoSAP-IT处理的DNA测序模板1.0μl；
b)盖好上盖后，振荡混匀后，微离，使混合物沉入管底；
c)在PCR仪中进行测序反应，反应程序：
96℃，1min→(96℃，10sec→50℃，5sec→60℃，4min)，25个循环→4℃保温。
13.6测序PCR产物纯化：
a)每管加入1.0μl 125mM EDTA到管底，每管加入1.0μl 3M NaAc到管底；
b)每管加入35.0μl 100％酒精，铝箔或胶盖封严密，震荡混匀4次，室温放置15min；
c)3700rpm离心30min，马上倒置96孔板，离心至850rpm停止离心；
d)每管加入50.0μl的-20℃预冷70％酒精，3700rpm离心15min；马上倒置 96孔板，离心至850rpm停止离心；
e)重复用预冷70％酒精洗涤1次；
f)室温挥发净酒精，加入10.0μl Hi-Di Formamide溶解DNA；
g)溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后(取出后置于-20℃冰箱)，上样电泳。
13.7结果分析方法：
打开软件sequencing analysis 5.2，载入测序结果，察看LOR值、raw data、 BCstatus、PP status。
原则上应该尽量使质控品的结果达到最佳，详细的软件操作说明参考《AppliedBiosystems DNA Sequencing Analysis Software v5.1》。
14、结果分析
14.1以AJ238799序列为参考，使用Sequencher软件标记出各个分析位点并建立2a-NS5B.SPF工程文件。
14.2将测序结果与工程文件同时导入sequencher软件，通过Assembleautomatically功能进行装配；
14.3打开装配好的文件，以工程文件中的标记为参考对样本中各个位点进行分析。
15、结果判断(Judgment of results)
15.1根据目标位点的序列判定，若为野生型，报告为“野生型(野生型氨基酸+位置)”，如“野生型(L159)”；若为突变型，报告为“突变型(野生型氨基酸+位置+突变型氨基酸)”，如“突变型(L159F)”；当目标位点确定为突变型与野生型共存时(两者占比均在20％以上)，报告为野生型与突变型共存(野生型氨基酸+位置+野生型氨基酸/突变型氨基酸)，如野生型与突变型共存 (L159L/F)。下表12为HCV 2a亚型NS5B区域目标分析位点主要突变类型。
表12
注：*代表A/T/C/G任一个核苷酸；若遇特殊少见情况，根据氨基酸密码子表及文献报道推断。
五、实验结果及验证
1.有效性(Validity)
有效性在本次验证实验中是指该反应体系对阳性样本的检测成功率。
本次验证共对94例HCV分型结果为2a亚型的样本进行检测，对结果进行统计分析显示，有3例样本(T691、T280、T53)两个片段都未扩增出，结果见图2、图3、图4和下表13。
表13
通过对电泳结果分析可以看出，对于全部96例样本，有3例样本(T691、T280、T53)两个片段都未扩增出，对原始样本定量后病毒载量均在1000IU/mL 左右，相对较低；另有一例样本(T763)有一个片段未扩增出，可能是引物结合不良的原因。整体扩增成功率为95.7％(90/94)。
2.测序验证结果
对90例样本进行了测序验证，其中1例测序失败，其余89例测序结果分析如下表14。
表14
注：数据以AB047639.1(JFH-1)基因序列为参考序列进行分析。
3.再现重复性(Reproducibility)
再现重复性是指对相同样本在不同时间、不同人员或不同仪器条件下进行重复检测时得到相同结果的能力。在本次验证过程中主要研究不同PCR仪及测序仪对实验的影响。
对47例HCV 2a亚型样本进行重复扩增并进行电泳检测，通过对电泳图5 和图6分析可以看出，该检测的重复性为100％(48/48)；但由于引物结合性的问题造成第二片段有两例样本未扩增出来，后续会考虑更换其它引物对这两例样本进行扩增。
4.最低检测下限(Limit of Detection)
最低检测下限是指该项目可以成功检测的样本的最低病毒载量。
本次验证实验共对14例样本进行梯度稀释后进行检测，结果见图7、图8 和表15。
表15
通过上表15可以看出，对于第一片段，病毒载量在1.00E+03IU/mL以上的样本都能扩增成功，部分低于1.00E+03IU/mL的样本也可以扩增成功；对于第二片段，病毒载量在1.00E+04IU/mL以上的样本基本可以扩增成功，部分低于 1.00E+04IU/mL的样本也可以扩增成功。在病毒载量达到1.00E+04IU/mL以上的样本，两个片段基本都可以扩增成功，对于载量低于1.00E+04IU/mL的样本受限于第二片段扩增效率而使部分样本无法成功扩增完整片段而造成实验失败，因此目前暂定该项目的检测下限为1.00E+04IU/mL。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州金域医学检验中心有限公司
<120> HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgggcctc taatcactgc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggctgagaa cgtggtgat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtatcatac gcgatgatt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctctagcgag cgtggagca 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgtctccgg atatcagctt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actgtggact ccagatatc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgctccacg tcatagtcat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacgaatagt agcagtacgc 20

Claims (5)

1.一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对及第八引物对；所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:2所示，所述第六引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示，所述第七引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5所示，所述第八引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。
2.一种HCV 2a亚型NS5B突变检测的试剂盒，其特征在于，含有引物试剂，所述引物试剂中的引物包括权利要求1所述的PCR扩增引物。
3.如权利要求2所述的HCV 2a亚型NS5B突变检测的试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR扩增试剂及电泳鉴定试剂中的至少一种试剂。
4.如权利要求2或3所述的HCV 2a亚型NS5B突变检测的试剂盒，其特征在于，还包括含有HCV 2a亚型的HCV阳性对照试剂。
5.一种HCV 2a亚型NS5B突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
对含有HCV 2a亚型RNA的待测样本进行逆转录处理，合成HCV cDNA；
对合成的HCV cDNA使用第一引物对和第二引物对进行第一轮PCR扩增，其中，所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
对所述第一轮PCR扩增的产物进行测序分析；
所述HCV 2a亚型NS5B突变检测方法还包括对第一轮PCR扩增的产物进行鉴定的步骤，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则使用第三引物对和第四引物对对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增，再对第二轮PCR扩增的产物进行所述测序分析，其中，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示；
所述HCV 2a亚型NS5B突变检测方法还包括对第二轮PCR扩增的产物进行鉴定的步骤，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则对合成HCV cDNA使用第五引物对和第六引物对重新进行第一轮PCR扩增，其中，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:2所示，所述第六引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所示，并对使用所述第五引物对和所述第六引物对进行第一轮PCR扩增的产物进行鉴定，若产物片段的长度满足预设要求，则进行所述测序分析，否则使用第七引物对和第八引物对对该第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增，再对扩增的产物进行鉴定和分析，其中，所述第七引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5所示，所述第八引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。
CN201710373709.XA 2017-05-24 2017-05-24 HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法 Active CN106939360B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710373709.XA CN106939360B (zh) 2017-05-24 2017-05-24 HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710373709.XA CN106939360B (zh) 2017-05-24 2017-05-24 HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106939360A CN106939360A (zh) 2017-07-11
CN106939360B true CN106939360B (zh) 2018-04-20

Family

ID=59465075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710373709.XA Active CN106939360B (zh) 2017-05-24 2017-05-24 HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106939360B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107699636B (zh) * 2017-11-10 2019-03-15 黑龙江金域医学检验所有限公司 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法
CN112961942B (zh) * 2021-03-31 2024-02-02 广州金域医学检验中心有限公司 用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用
CN113025756B (zh) * 2021-03-31 2024-02-06 广州金域医学检验中心有限公司 一种用于检测hcv 1型耐药突变基因的检测方法及应用
CN113151595B (zh) * 2021-03-31 2024-02-06 广州金域医学检验中心有限公司 用于检测hcv 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1385540A (zh) * 2001-05-15 2002-12-18 李卫云 一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法,和载体以及用其转化的细胞株及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010040756A1 (en) * 2008-10-06 2010-04-15 Virco Bvba Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6
WO2013173774A2 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Pathogenica, Inc. Molecular inversion probes
US20160177407A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-23 Virco Bvba Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1385540A (zh) * 2001-05-15 2002-12-18 李卫云 一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法,和载体以及用其转化的细胞株及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于丙型肝炎病毒NS5B区的巢式RT-PCR和基因分型的比较研究;尹琦等;《中国病原生物学杂志》;20160831;第11卷(第8期);第685-695页 *
湖北地区丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点分析;卢恩昌等;《微循环杂志》;20151231;第25卷(第1期);摘要、第1.2.2节、第1.3节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106939360A (zh) 2017-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106939360B (zh) HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法
US20220176370A1 (en) Method for purifying and testing biomolecules from biological samples
Erensoy Diagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection and laboratory monitoring of its therapy
Read Recovery efficiencies of nucleic acid extraction kits as measured by quantitative LightCyclerTM PCR
Gretch Use and interpretation of HCV diagnostic tests in the clinical setting
CN1313622C (zh) 高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒
Leary et al. Consensus oligonucleotide primers for the detection of GB virus C in human cryptogenic hepatitis
Ismail et al. Laboratory evaluation of a fully automated chemiluminescence immunoassay for rapid detection of HBsAg, antibodies to HBsAg, and antibodies to hepatitis C virus
CN105420416B (zh) 一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光pcr方法
Majid et al. Current and future hepatitis C virus diagnostic testing: problems and advancements
Tejada-Strop et al. Disparate detection outcomes for anti-HCV IgG and HCV RNA in dried blood spots
CN111349719A (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法
CN110982936A (zh) 一种用于检测pedv的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物和试剂盒
CN104830996B (zh) 一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法
Romeo et al. Analysis of hepatitis C virus RNA prevalence and surrogate markers of infection among seropositive voluntary blood donors
Yang et al. Targeted sequencing of respiratory viruses in clinical specimens for pathogen identification and genome-wide analysis
Sun et al. Rapid and sensitive detection of hepatitis C virus in clinical blood samples using reverse transcriptase polymerase spiral reaction
Pichl et al. Magnetic bead technology in viral RNA and DNA extraction from plasma minipools
CN107699636A (zh) 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法
CN102212621B (zh) 一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法
CN111808852A (zh) 用于2019新型冠状病毒核酸提取的组合物、试剂盒、用途及其方法
EP1590671A1 (en) Improved method of detection of hcv antibodies in combination assay or sole antibody assay
CN1464071A (zh) 镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒
CN112195272A (zh) 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒
CN103602753A (zh) 一种检测lbp基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant