CN113151595B - 用于检测hcv 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用 - Google Patents
用于检测hcv 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测HCV6型NS3耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用。所述用于检测HCV6型NS3耐药突变基因的扩增引物组,包括一对外引物和一对内引物。其作为用于检测HCV6型NS3耐药突变基因的扩增引物组进行PCR扩增等检测分析时，可确保低浓度样本中HCV基因6型的各个亚型扩增成功率100％，并获取更长的目的片段，从而有效保证NS3区域耐药相关突变位点的覆盖率。本发明有利于对低HCVRNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。从而可用于辅助分析研究6型HCV基因的耐药突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测HCV 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝病的主要病原体之一，丙型肝炎呈全球流行。我国主要流行的基因型为1b和2a型，而6型虽然相对少见，却在中国南部占主导地位。其中，大部分省份分布以6a亚型为主，而云南主要流行6n亚型，6型NS3片段已确认的耐药相关突变位点主要有：V36、Q41、F43、T54、V55、Y56、L80、S122、R155、A156、V158、D168、I170、M175。检测分析HCV的这些耐药位点可以为丙型病毒肝炎的DAAs治疗方案的制定提供依据，并对关于6型NS3基因区域耐药方面的研究进行补充。但目前针对上述相关耐药基因的研究较为缺乏，而且，要把耐药基因中的多个耐药相关突变位点通过简单的检测方法进行有效检测较难实现，其难点在于难以得到有效的目的片段，或者是得到的目的片段难以囊括待检的多个突变位点。特别是当样本中目的待测物的浓度很低时，更是难以实现多个突变位点得到精准全面的检测效果。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，可在低浓度样本中扩增得到有效覆盖了HCV 6型NS3基因耐药突变位点的目的片段，从而可以实现在低浓度样本中实现耐药突变位点全面检测，为全面分析HCV 6型的耐药情况，丙型病毒肝炎的DAAs治疗方案的制定提供依据。
实现上述目的的具体技术方案如下：
一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对的序列为SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的反向互补序列。
一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列为如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的反向互补序列。
本发明的目的之一还在于提供一种非疾病诊断和治疗目的HCV 6型NS3耐药突变基因的检测方法。
实现上述目的的具体技术方案如下：
(1)获取待测HCV RNA样品；
(2)以待测样本的RNA为模板，采用上述扩增引物组进行两次RT-PCR扩增；
(3)回收步骤(1)的产物，测序后进行耐药性分析。
在其中一些实施例中，上述耐药性分析为测序结果与HCV6型参考株Y12083的序列进行比对，确认耐药相关突变位点是否发生变异。
在其中一些实施例中，上述耐药相关突变位点包括第36位的缬氨酸、第41位的谷氨酰胺、第43位的苯丙氨酸、第54位的苏氨酸、第55位的缬氨酸、第56位的酪氨酸、第80位的亮氨酸、第122位的丝氨酸、第155位的精氨酸、第156位的丙氨酸、第158位的缬氨酸、第168位的天冬氨酸、第170位的异亮氨酸、第175位的甲硫氨酸中的至少一种。
本发明的目的之一还在于提供上述扩增引物组在制备用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因试剂中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的试剂盒。
实现上述目的的具体技术方案如下：
一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的试剂盒，包括上述扩增引物组。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人对6型HCV的NS3区域序列进行深入研究，并针对其巧妙地设计了一系列特异性扩增引物组，使用该扩增引物进行PCR扩增等检测分析时，可确保低浓度样本(病毒RNA浓度高于1.00E+03IU/mL)中HCV基因6型的各个亚型扩增成功率100％，并获取更长的目的片段，从而有效保证NS3区域耐药相关突变位点的覆盖率。本发明有利于对低HCVRNA浓度的样品进行多个耐药突变位点全面检测，灵敏度高。从而可用于辅助分析研究6型HCV基因的耐药突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。
附图说明
图1为实施例2有效性实验时，对40例HCV分型结果为6型的样本进行RT-PCR的电泳结果图；
图2为实施例2有效性实验时，对图1中3例不满足测序要求的样本进行巢式PCR后的电泳结果图。
图3为实施例3重复性实验时，对20例HCV分型结果为6型的样本进行第一批RT-PCR的电泳结果图。
图4为实施例3重复性实验时，对20例HCV分型结果为6型的样本进行第一批RT-PCR的第二批RT-PCR电泳结果图。
图5为实施例3重复性实验时，对图3、图4中不满足测序条件的样本进行巢式PCR的电泳结果图。
图6为实施例4中检出限RT-PCR电泳结果图。
图7为实施例4中检出限巢式PCR电泳结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1检测方法建立
材料和方法
1.1标本收集广州金域医学检验中心有限公司基因分型为6型(6a 36例，6n 4例)的丙肝患者的血浆样本。
1.2仪器和试剂
1.2.1仪器Natch S全自动核酸提取仪(圣湘生物)；ABI7500实时荧光定量PCR仪(Life)；Biorad S1000 PCR仪(BioRad)；Biorad PAC300电泳仪(BioRad)；Biorad凝胶成像系统(BioRad)；ABI3730xl测序仪(Life)。
1.2.2试剂核酸提取或纯化试剂(圣湘生物)；丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)；HiScript II One Step RT-PCR Kit(诺唯赞)；2×Phanta Max MasterMix(诺唯赞)； Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Life)；扩增及测序引物信息见表1，文献(Bernard Besse.et.al,2012)中报道的引物信息见表2。
表1扩增及测序引物信息
注：引物结合位点均以参考株Y12083(EUHK2)为准。上述序列中Y＝C/T，R＝A/G，K＝G/T
表2文献中报道的引物信息
其中Y＝C/T，R＝A/G，I＝N＝A/G/C/T。
1.2.3通过对比分析可知，文献(Bernard Besse.et.al,2012)中的报道的外引物扩增产物片段大小为775bp，本方案的外引物扩增产物片段大小为911bp；文献中的报道的内引物扩增产物片段大小为649bp，本方案的内引物扩增产物片段大小为657bp；相比之下，本方案设计的引物能包括更长的片段，更容易确保扩增的成功率和覆盖率。
1.3实验方法
1.3.1提取核酸和HCV RNA定量:使用圣湘生物的核酸提取或纯化试剂和Natch S全自动核酸提取仪进行核酸提取，并用圣湘生物丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)和Life的ABI7500实时荧光定量PCR仪定量各样本中HCV RNA。
1.3.2扩增HCV6-NS3基因片段：使用诺唯赞的HiScript II One Step RT-PCR Kit和BioRad的Biorad S1000 PCR仪将HCV6-NS3基因片段通过一步法RT-PCR扩增。反应体系如表3，反应程序如表4。
表3第一轮RT-PCR反应体系(30μl)
表4第一轮RT-PCR反应程序
1.3.3琼脂糖凝胶电泳使用BioRad的Biorad PAC300电泳仪对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳，并用Biorad凝胶成像系统进行凝胶成像。
1.3.4巢式PCR没有达到测序要求的样品，则以第一轮扩增产物作为模板用诺唯赞的2×Phanta Max Master Mix和BioRad的Biorad S1000 PCR仪进行巢式PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳。反应体系如表5，反应程序如表6。
表5第二轮巢式PCR反应体系(30μl)
电泳检测结果标准为：在911bp/657bp处有清晰且单一的条带。
表6第二轮巢式PCR反应程序
1.3.5 Sanger测序满足测序要求时，利用Life的 Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit和ABI3730xl测序仪进行Sanger测序，得到的测序图谱用序列分析软件Sequencher与HCV6型参考株序列进行比对，确认氨基酸位点是否发生变异。
测序结果分析标准为：cut off值设置为20％，仅判断大于占比20％碱基信息。
实施例2检测方法的有效性验证
取40例HCV6型阳性样本，HCV RNA含量在1.00E+04IU/mL以上。在同一批次内进行提取、进行NS3靶基因区域扩增并测序，计算检测成功率。100％(40/40)的样本扩增并测序成功，说明所设计的引物能够覆盖本次实验的所有样本，该方法有效性良好。
扩增结果显示第一次RT-PCR扩增后进行电泳，电泳结果见图1。其中，两个阳性质控(编号为T448-POS和T26-POS)扩增出了较为明显的条带，阴性对照(编号为NEG)无扩增，说明本次实验结果有效。有几个样本(编号为T211、T463和T311)无条带或条带不清晰，未满足测序条件，进行巢式PCR后再进行电泳，结果如图2所示，阳性质控(编号为T448-POS和T26-POS，为已知确诊阳性临床样本配制)扩增出了清晰的条带，阴性质控(编号为NEG，为常规无病原体血清)无扩增，本次实验结果有效；样本均扩增出了清晰的条带，满足测序条件。进行了两轮PCR后，100％(40/40)的样本扩增成功。
测序结果显示：将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，结果见表7，100％(40/40)的样本测序成功。经统计，2.5％(1/40)的样本发生了56号位的突变；100％(40/40)的样本发生了80号位的突变，90％(36/40)样本发生了122号位的突变；7.5％(3/40)的样本发生了158号位的突变；2.5％(1/40)的样本发生了168号位的突变；10％(4/40)的样本发生了170号位的突变。从本次实验可看出，80号位和122号位的突变率极高，很有可能导致以这两个位点为靶点的直接抗病毒药物失效。
表7有效性验证测序分析结果
实施例3检测方法的重复性验证
取20例HCV6型阳性样本，HCV RNA含量在1.00E+04IU/mL以上。在两台不同核酸提取仪上分别提取1次核酸，并加入反应体系，分别在两台不同Biorad S1000扩增仪上进行扩增，然后在同一金域测序仪(序列号20141-010)进行测序。
以编号为T36的样本为例，其中T36-1-1表示为重复第一次，36-1-2表示重复第二次。
上述检测结果统计可知，96.25％(77/80)的样本扩增并测序成功，且100％的样本结果一致，说明该检测系统重复性好。
其中，扩增结果显示：第一批RT-PCR电泳结果见图3，有1例样本(T463)未扩增出清晰条带，其余样本扩增结果理想，且两次重复实验结果一致；第二批RT-PCR电泳结果见图4，有1例样本(T463)未扩增出清新条带，其余样本扩增结果理想，且两次重复实验结果一致；两批RT-PCR未扩增出清晰条带的样本，进行巢式PCR，扩增结果见图5，样本均扩增出了清晰的条带，满足测序条件。经过两轮PCR后，100％的样本扩增成功，且100％的样本结果一致。
测序结果显示：将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，结果见表8。其中，两例样本(T124-2-2和T296-2-2)正向测序失败，1例样本(T299-2-2)测序失败，可能是样本纯化不理想所致；两批实验所得测序结果一致。
表8重复性验证测序分析结果
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实施例4最低检出限检测
选择5例HCV6型阳性样本，病毒RNA含量在1.00E+05IU/mL左右。再对5例样本进行10倍梯度稀释，制备系列不同浓度水平的样品，最低浓度样品为1.00E+02IU/mL左右，用荧光PCR仪定量，测出浓度，结果如表9所示；然后对上述样品在同一批次内进行3次重复检测。100％的样本在1.00E+03IU/mL水平以上可以有效扩增出目的条带且测序成功，最低检出限为1.00E+03IU/mL。
表9检出限测量样本浓度
将稀释样本进行RT-PCR，结果如图6所示，条带的清晰度随着样本浓度的减少而下降；除T617的系列稀释样本条带无明显差异，对比T617样本的浓度，可看到定量结果没有呈现预期的规律，可能是稀释过程中的操作错误和点样误差所致；除质控，有10个稀释样本的条带不清晰，不满足测序条件，将这些样本进行巢式PCR，结果如图7所示，仍有5个稀释样本(T9-E2-1、T9-E2-3、T573-E2-1、T573-E2-2、T573-E2-3)不满足测序条件，即两轮PCR后，88.89％的样本扩增成功。经统计，浓度水平在1.00E+03IU/mL以上的样本，扩增成功率为100％(45/45)；浓度水平在1.00E+02IU/mL以上的样本，扩增成功率为88.89％(40/45)。根据本次实验结果，可粗略估计最低检出限在1.00E+03IU/mL到1.00E+02IU/mL之间，初步确定为1.00E+03IU/mL。
将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，测序结果如下表10所示，所有测序样本均测序成功。
表10检出限测量测序分析结果
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以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
<120> 用于检测HCV 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用
<160> 8
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gcnacytgrt angtntgngg 20
Claims (3)
1.一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的扩增引物组，其特征在于，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述扩增引物组在制备用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因试剂中的应用。
3.一种用于检测HCV 6型NS3耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述扩增引物组。
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