CN110577987A - 一种fmr1基因cgg重复序列的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用。FMR1基因PCR扩增反应检测方法包含至少四种引物，至少一种以上增强剂，对FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列进行扩增。同时此FMR1基因PCR扩增方法应用于脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒，通过PCR扩增、毛细管电泳分析PCR产物，该试剂盒能对高CGG重复序列进行精确定量分析，方法简单、快速、准确的检测方法，只需要一次PCR实验即可检测出CGG重复数的变异情况，从DNA样本开始，6小时内可以出结果，检测技术流程简单，容易实现标准化。

Description

一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因PCR扩增方法与脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒及其应用。
背景技术
脆性X综合症是仅次于唐氏症，造成智能障碍的第二原因，然而大部分的唐氏症不会遗传，但脆性X综合症是一种性联遗传性疾病。脆性X综合症具有范围广泛的病征，从轻微的学习障碍到严重智能障碍都有可能发生。除了智能障碍外，其他可能的现象包括:情绪问题、语言迟缓、注意力不集中、过动、自闭、不善与人接触等。根据统计，此症男性发生率约1/4,000，女性的发生率约 1/5,000-1/8,000。
致病的原因是FMR1基因内5’端非转录区发生CGG重复次数异常增加，导致FMRP基因产物的缺失或减少，FMRP是一种重要的脑部物质，为RNA结合蛋白，可调节许多突触蛋白的合成，缺乏时会会影响大脑发育和功能异常。美国医学遗传学会(ACMG)依据FMR1 CGG重复次数，定义出CGG重复次数小于45为“正常型”、CGG重复次数45-54为“中间型”、CGG重复次55-200为“前突变型”及CGG重复次数大于200为“全突变型”等，“正常型”和“中间型”不会有临床症状，“前突变型”称之为携带者，“全突变型”就会成为患者。当CGG重复中出现AGG能帮助预测对于CGG重复次数遗传至下一代时，CGG重复是否有扩展的风险。80% 脆性X综合症病人有家族病史，家族成员是此症的高风险族群，遗传机率高达二分之一。在脆性症的患者中，20%并没有家族史，是由为没有症状的“前突变型”的母亲所生下。当带因者的CGG重复次数越多，下一代的就有越高的风险生下患者。一旦超过200次就会发病，因此女性带因者最多会有50%的机会生下脆性症宝宝；男性带因者的FMR1基因变异会遗传给女儿，而不会传给儿子。带因父亲所生的女儿也是携带者，她的智力虽然正常，但她所生的小孩却有生下脆性症宝宝的风险。
目前脆性X综合症常见的分子检测方法为印迹杂交法（Southern Blot）、聚合酶链式反应扩增法（Polymerase Chain Reaction, PCR）。印迹杂交法能确定较大CGG重复序列的数目，并能评估FMR1基因的甲基化程度，但DNA需要量大，且对CGG重复较少的前突变型或者嵌合型样本，可能漏检或误诊，无法准确定值CGG重复数，同时因为操作繁琐，费时费力，对实验设备和人员培训要求较高，一般实验室难于实现。基于PCR扩增FMR1基因，毛细管电泳检测扩增片段比传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率更高，但由于扩增片段CG比例太高，难度随着重复数次数的增加，通常大部分的PCR引物的设计，因为PCR反应体系未能调整至最佳条件，当遇到前突变型和全突变型，或者正常型和全突变型，这类嵌合型的样本，通常未能检测出全突变型的片段，可能导致检测结果误判。
较新的检测方法是重复引物 PCR 技术，又称为三引物 PCR 法 (Tripletrepeat-primed PCR, TP-PCR)。1996 年Warner等发明此种方法用以诊断 DM1 超大片段(CAG重复异常)动态突变患者。TP-PCR法有别于传统 PCR扩增，其反应中加入 3 个引物。FMR1基因的TP-PCR法在一般的PCR扩增基础下，新增了CGG序列引物，可以作为全突变型的辅助诊断，确认是否含有全突变的片段，解决了一般PCR在大片段扩增效率较差而误判的问题，但CGG的扩增效率太高，会抑制大片段的反应，同时定量的校准品跨度不够宽，对于较大重复数不能进行精确定量分析，可能还是有误判的风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种FMR1基因PCR扩增方法与脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒及其应用，对于高CGG重复数样本的检测更为灵敏，同时能准确定量，更快速的完成检测，有效地减少操作人员的工作量，降低检测成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物位于FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列外的上游与下游，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列。
一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物为包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列组成的上游与下游引物，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列。
第三引物在PCR扩增反应中的终浓度低于第一引物、第二引物与第四引物在PCR扩增反应中的终浓度至少1000倍。
第三引物的CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列，包含4到7个CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列。
所述四种引物中至少一种引物包含荧光修饰。
所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P1：5’- CGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P2：5’- GTAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACT-3’;
所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P3：
5’- CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTCCGGCGGCGGCGGCGG -3’;
第四引物P4：5’- CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTC -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。
所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P5：
5’- TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT CGGCGGCGGCGGCGG -3’;
第四引物P6：5’- TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT-3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。
所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P7：5’- GCACGCTCCTGCACAGCCTCCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P8：5’- GCACGCTCCTGCACAGCCTCAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列。
所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P9：
5’- ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P10：
5’-ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列。
所述PCR扩增反应所使用的PCR反应液包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；PCR反应液中甜菜碱的浓度为1.5~2M、二甲基亚砜的浓度为0.5~6.0% v/v、甘油的浓度为2.5~8.0% v/v、乙二醇的浓度为0.3~1.2M。
将上述检测方法应用于制备脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒中，所述脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒，组成成分包括FMR1反应液、DNA聚合酶、FMR1阳性对照、FMR1阴性对照；
所述FMR1反应液中包含引物组合物，所述的引物组合物为权利要求6、7、8 、9或10中的引物组合中的一种或多种；
所述FMR1反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；
所述FMR1阳性对照包含FMR1基因中的10、29、36、54、85、120、142与大于200 个CGG重复数的质粒。
本发明的优点在于：
（1）本发明第一引物与第二引物可以特异性的扩增FMR1基因5’端非转录区中包含CGG重复序列的片段。第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列与非人源性基因组序列，第四引物为第三引物的非人源性基因组序列，第二引物、第三引物与第四引物可以特异性的黏合CGG区域，扩增CGG区域的序列，形成影子峰(stutter peaks)，若影子峰(stutterpeaks)延伸超过第一引物与第二引物所扩增的特异性片段，代表有更大片段的FMR1基因扩增产物。透过第四引物，能增强影子峰(stutter peaks)高度，明显扩增出高重复数CGG序列片段，同时依据扩增的产物大小及影子峰(Stutter peaks)的分布，区分CGG区域里是否有AGG或其他可能中断序列。。
（2）本发明试剂盒中第三引物与第一引物、第二引物、第四引物在反应液的终浓度有明显的差异，通过四种引物浓度的差异调整，降低扩增时的竞争抑制，增加扩增效率，能同时产生具有较高强度的CGG 重复片段的影子峰(stutter peaks)以及高强度的FMR1基因5端非转录区的特异性序列片段，更能明显区分全突变型的长片段样本。
（3）本发明在脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒的应用上，因FMR1基因高CGG重复的片段(CG比例可达80%以上)，在进行毛细管电泳时，实际片段会与预测片段大小有很大的落差，若以片段大小计算CGG重复数，此结果会与实际CGG重复有误差，导致结果误判。本试剂盒中设计包含10、29、36、54、85、120、142与大于200重复数的FMR1阳性对照，除了确定试剂性能对照外，利用10、29、36、54、85、120、142重复数的FMR1阳性对照建立标准曲线，计算出检测样本CGG重复数，因为高跨度重复数的对照，及均匀分布的重复数点位，显着提高脆性X综合症基因检测的准确度，使脆性X综合症的检测方法更为完善且准确。
（4）本发明试剂的灵敏度高，DNA样本需求量低，DNA样本浓度低至2.5ng/uL，依旧能准确检出。
（5）本发明所示脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒的应用能对高CGG重复序列进行精确定量分析，是FMR1分子诊断中目前较简单、快速、准确的检测方法，只需要一次PCR实验即可检测出CGG重复数的变异情况，从DNA样本开始，6小时内可以出结果，检测技术流程简单，容易实现标准化。
附图说明
图1为引物设计示意图。
图2为引物设计示意图。
图3为FMR1阳性对照样本结果图。
图4为FMR1阳性对照标准曲线。
图5为FMR1基因正常型(29/30)样本结果图。
图6为FMR1基因中间型(51/53)样本结果图。
图7为FMR1基因前突变型(36/142)样本结果图。
图8为FMR1基因全突变型(>200/Y)样本结果图。
图9为FMR1基因全突变型(29/>200)样本结果图。
具体实施方式
实施例1
1、引物有以下组合设计：
（1）第一引物序列为P1、第二引物序列为P2、第三引物序列为P3、第四引物序列为P4，引物序列见表1，引物设计图见图1。第一引物与第二引物可以特异性的扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段，其中第二引物含有荧光基团。第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列，第二引物、第三引物与第四引物可以特异性的黏合CGG区域，放大CGG区域的序列，形成影子峰(stutter peaks)。若影子峰(stutter peaks)延伸超过第一引物与第二引物所扩增的特异性片段，代表有更大片段的FMR1基因扩增产物。
表1 引物序列表。
（2）第一引物序列为P1、第二引物序列为P2、第三引物序列为P5、第四引物序列为P6，引物序列见表2，引物设计图见图1。第一引物与第二引物可以特异性的扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段，其中第二引物含有荧光基团。第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列，第二引物、第三引物与第四引物可以特异性的黏合CGG区域，放大CGG区域的序列，形成影子峰(stutter peaks)。若影子峰(stutter peaks)延伸超过第一引物与第二引物所扩增的特异性片段，代表有更大片段的FMR1基因扩增产物。
表2 引物序列表
（3）第一引物序列为P7、第二引物序列为P8、第三引物序列为P3、第四引物序列为P4，引物序列见表3，引物设计图见图2。第一引物与第二引物包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列，可以特异性的扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段，其中第二引物含有荧光基团。第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列，第二引物、第三引物与第四引物可以特异性的黏合CGG区域，放大CGG区域的序列，形成影子峰(stutter peaks)，同时又能特异性扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段。
表3 引物序列表
（4）第一引物序列为P9、第二引物序列为P10、第三引物序列为P5、第四引物序列为P6，引物序列见表4，引物设计图见图2。第一引物与第二引物包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列，可以特异性的扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段，其中第二引物含有荧光基团。第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列，第二引物、第三引物与第四引物可以特异性的黏合CGG区域，放大CGG区域的序列，形成影子峰(stutter peaks)，同时又能特异性扩增FMR1基因5端非转录区的序列片段。
表4 引物序列表
2、配制FMR1反应液
FMR1反应液组份如下：
实施例2 PCR扩增与结果分析
1、样本处理：核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNAWholeBlood Kit) 提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应，DNA浓度为2.5ng/uL~50ng/uL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2、扩增试剂配制：
（1）从试剂盒取出FMR1反应液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。
（2）扩增试剂配制：按下表5配制扩增试剂
表5 扩增试剂配制表
* 为了减少分液误差，建议在配制扩增试剂时根据样本数量（n）分别取（n+1）人份的反应液和混合酶。n=待测样本数+ FMR1阴性对照1份 + FMR1阳性1份。
（3）将配制好的试剂用震荡器震荡均匀，用微量离心机短暂离心，使液体沉降于管底。
（4）在PCR反应管中分别加入13μL配制好的扩增试剂，转移到样本处理区加样。
3、加样：在对应的含有13μL 的扩增试剂的PCR反应管中分别加入2μL待测样本基因组DNA、FMR1阴性对照及FMR1阳性对照，盖上PCR反应管盖后，短暂离心。
4、PCR扩增：
（1）将PCR反应管放入PCR仪按表6方法设定反应程序，反应体积设定：15μL；
表6 扩增反应程序
（2）毛细管电泳分析PCR扩增产物：采用ABI3130、ABI3730、ABI3500Dx、或ABISeqStudio Genetic Analyzer毛细管基因分析仪进行检测，取0.5uL PCR扩增产物、0.5uL1200 LIZ Size Standard、9uL Hi-Di Formamide，混匀后95℃变性 5min，立即放冰上2min，上机检测。
5、检测结果分析：
（1）使用GeneMapper软件进行结果分析，根据已知FMR1阳性对照CGG重复数10、29、36、54、85、120、142和所得检测片段长度结果建立标准曲线，可得公式为y=ax+b，其中y代表检测得到的片段长度，x代表CGG重复数，相关系数R2应大于0.98。
（2）FMR1阳性对照应有>200重复的片段长度。
（3）FMR1阴性对照，应无任何长度片段。
（4）同一实验应同时满足以上三个要求，此次实验视为有效，才能进行待测样本的CGG重复数计算。
6、结果判读：
（1）FMR1基因波峰的选择：若毛细管电泳片段小于350bp，选择最高的波峰，进行计算；若毛细管电泳片段于350~800bp，于一丛波峰中，选择中间最高的波峰，进行计算；若毛细管电泳片段大于800bp，选择最高的波峰，进行计算。
（2）CGG重复数计算：使用GeneMapper软件进行结果分析，根据已知FMR1阳性对照CGG重复数10、29、36、54、85、120、142和检测片段长度结果建立标准曲线，可得公式为y=ax+b，其中y代表检测得到的片段长度，x代表CGG重复数，取得a值与b值。将待测样本经GeneMapper软件所得片段大小，与a值、b值，套入公式可得CGG重复数。如图3，计算公式为y= 2.9238x + 232.4（图4），将待测样本所得片段大小为y，带入公式，即得CGG重复数x。
（3）若计算结果，重复数≤200，以计算结果判定重复数。
（4）若计算结果，重复数大于200，结果判为>200。
（5）CGG重复扩增产物形成stutter peaks，若延伸超过第一个FMR1基因波峰，代表有更大片段的FMR1基因扩增产物，可作为FMR1基因大片段的辅助确认。
实施例3 试剂性能验证
1、FMR1阳性对照制备
（1）质粒建构：以CGG重复数为10/32、29/29、36/142、54/Y、29/85、118/Y、与＞200的临床样本，进行FMR1基因引物进行特异性扩增，胶回收需要的片段大小，进行TA clone，所得质粒进行定序，确认重复数。
（2）FMR1阳性对照制备，将10、29、36、54、85、120、142、＞200的CGG重复质粒混合配制，阳性对照中各重复数质粒的终浓度分别为0.025pg/uL、0.025pg/uL、0.025pg/uL、0.04pg/uL、0.04pg/uL、0.05pg/uL、0.05pg/uL、0.07pg/uL。
2、阳性参考品符合率
检测12份参考品，包括脆性X综合症FMR1基因中间型样本CGG重复数为46/Y、54/Y，脆性X综合症FMR1基因前突变型样本CGG重复数为29/85、36/142、57/Y、118/Y，脆性X综合症FMR1基因全突变型样本CGG重复数为30/>200、29/>200、>200/Y、>200/Y，脆性X综合症FMR1基因前突变和全突变嵌合型样本CGG重复数为86,>200/Y，脆性X综合症FMR1基因野生型和全突变嵌合型样本CGG重复数为10，>200/Y，分别检测高、中、低浓度，浓度分别为50 ng/uL、25ng/uL、5 ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果阳性符合率为100%。
3、阴性参考品符合率
检测7份参考品，包括脆性X综合症FMR1基因正常型样本CGG重复数分别为29/29、30/36、29/30、19/30、30/Y、36/Y，与非人源性基因组DNA样本，分别检测高、中、低浓度浓度分别为50 ng/uL、25ng/uL、5 ng/uL，，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果阴性符合率为100%。
4、重复性
以3份阳性参考品，包含脆性X综合症FMR1基因中间型样本CGG重复数为54/Y、脆性X综合症FMR1基因前突变型样本CGG重复数为29/85、脆性X综合症FMR1基因全突变型样本CGG重复数为30/>200，分别检测高、中、低浓度，浓度分别为50 ng/uL、25ng/uL、5 ng/uL，各浓度进行十重复检测，检测三批试剂，重复数判断皆正确，检测结果皆符合。
5、最低检测限
将阳性参考品稀释至10ng/µL、5ng/µL、2.5ng/µL，各进行20重复测试，检测三批试剂，检测结果重复数皆符合要求。
6、嵌合型测试
（1）以50ng投入量，分别以不同比例的正常型与前突变样本进行混合测试，在1%前突变型与39%正常型混合样本，依旧能准确判读前突变型。
（2）以50ng投入量，分别以不同比例的正常型与全突变样本进行混合测试，在1%全突变型与39%正常型混合样本，依旧能准确判读前突变型。
（3）以50ng投入量，分别以不同比例的正常型、前突变型与全突变样本进行混合测试，在1%前突变型、1%全突变型与38%正常型混合样本，依旧能准确判读前突变型。
7、WHO国际标准品测试
测试WHO International Standard , Fragile X Syndrome, Human gDNA , 1stInternational Genetic Reference Panel ，NIBSC code: 08/158，进行三批试剂测试，检测结果皆符合，见表7。
表7 WHO国际标准品测试结果
实施例4
1.收集120例脆性X综合症产前筛查的EDTA抗凝全血样本，采用核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNA WholeBlood Kit)提取人类基因组DNA，用微量分光亮度计检测DNA的浓度与纯度，120例样本浓度为2.5ng/uL-50ng/uL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2.按照实施例2的步骤，进行DNA加样，以PCR仪进行反应，
3.按实施例2的步骤，进行结果分析，结果如下表，皆符合重复数要求，其中正常型检测56例样本、中间型检测14例样本、前突变型检测41例样本、全突变型检测9例样本，共检测120例样本（表8）。其中，FMR1基因正常型(29/30)、FMR1基因中间型(51/53)、FMR1基因前突变型(36/142)、FMR1基因全突变型(>200/Y)、FMR1基因全突变型(29/>200)样本结果图见（图5-9）。
表8 120例样本检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 胜亚生物科技(厦门)有限公司
<120> 一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgctcagctc cgtttcggtt tcacttcc 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtagaaagcg ccattggagc cccgcact 28
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcgacgcac gctcctgcac agcctccggc ggcggcggcg g 41
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcgacgcac gctcctgcac agcctc 26
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaccgtctg cgcctcgttc cggctcggcg gcggcggcgg 40
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgaccgtctg cgcctcgttc cggct 25
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcacgctcct gcacagcctc ctcagctccg tttcggtttc acttcc 46
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcacgctcct gcacagcctc agcgccattg gagccccgca cttcca 46
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
accgtctgcg cctcgttccg gctcagctcc gtttcggttt cacttcc 47
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
accgtctgcg cctcgttccg gctagcgcca ttggagcccc gcacttcc 48

Claims (12)

1.一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，其特征在于：利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物位于FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列外的上游与下游，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列。
2.一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，其特征在于：利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物为包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列组成的上游与下游引物，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，第三引物在PCR扩增反应中的终浓度低于第一引物、第二引物与第四引物在PCR扩增反应中的终浓度至少1000倍。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，第三引物的CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列，包含4到7个CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述四种引物中至少一种引物包含荧光修饰。
6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P1：5’- CGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P2：5’- GTAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACT-3’。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P3：
5’- CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTCCGGCGGCGGCGGCGG -3’;
第四引物P4：5’- CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTC -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。
8.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P5：
5’- TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT CGGCGGCGGCGGCGG -3’;
第四引物P6：5’- TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT-3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。
9.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P7：5’- GCACGCTCCTGCACAGCCTCCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P8：5’- GCACGCTCCTGCACAGCCTCAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列。
10.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P9：
5’- ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC -3’;
第二引物P10：
5’-ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC -3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列。
11.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应所使用的PCR反应液包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；PCR反应液中甜菜碱的浓度为1.5~2M、二甲基亚砜的浓度为0.5~6.0% v/v、甘油的浓度为2.5~8.0% v/v、乙二醇的浓度为0.3~1.2M。
12.一种FMR1基因CGG重复数的检测方法在制备脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒，组成成分包括FMR1反应液、DNA聚合酶、FMR1阳性对照、FMR1阴性对照；
所述FMR1反应液中包含引物组合物，所述的引物组合物为权利要求6、7、8 、9或10中的引物组合中的一种或多种；
所述FMR1反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；
所述FMR1阳性对照包含FMR1基因中的10、29、36、54、85、120、142与大于200 个CGG重复数的质粒。
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