CN115418394A - 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115418394A CN115418394A CN202210920865.4A CN202210920865A CN115418394A CN 115418394 A CN115418394 A CN 115418394A CN 202210920865 A CN202210920865 A CN 202210920865A CN 115418394 A CN115418394 A CN 115418394A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- primer
- seq
- sequence
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提出了用于检测CHO细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法,该组合物包括引物和探针,所述引物包括:上游引物序列:5’‑CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA‑3’(SEQ ID NO:2),下游引物序列:5’‑CCAGCACTCGGGAGGCA‑3’(SEQ ID NO:3);所述探针包括如下序列:5’‑ACTCACAGAGATCCGCCTGCC‑3’(SEQ ID NO:4)。利用本发明提出的组合物可以排除Vero细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、大肠杆菌细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰,能够有效检测生物制品中残留CHO细胞基因组DNA,稳定检测灵敏度可达1fg。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及用于检测CHO细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法,更具体地,设计一种组合物、试剂盒、检测CHO细胞基因组DNA的方法。
背景技术
CHO细胞,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary),由于具有无限增殖能力,可稳定传代百代以上,而成为目前生物工程上广泛使用的哺乳动物细胞系。现阶段,CHO细胞与大肠杆菌细胞被广泛用于人类疾病治疗和预防基因工程产品的生产,在已经批准的产品中,使用这两种细胞表达的产品占比达90%以上。CHO细胞与大肠杆菌细胞相比,其最大的优势在于CHO细胞是真核哺乳动物细胞,具有形成复杂高级结构蛋白的能力和糖基化修饰能力,从而使得CHO细胞成为表达复杂生物大分子的理想宿主,是一种重要的,应用广泛的生物工程表达细胞株。
重组生物制品绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产,细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源,直接影响生物制品的安全性。其中,残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染,因此,对它的检测是重要的质量控制环节。
在重组生物蛋白制品中,残余DNA多来源于培养的宿主细胞,这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上,存在于生物制品中的微量DNA杂质,都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因,并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后,含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生;如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA,则这种DNA通过表达后具备感染性,从而导致一系列的不良后果。
CHO细胞属于传代细胞系,易于培养,适合大规模工业生产,是常用的人用蛋白药物制备的细胞基质之一。因此,以CHO细胞为基质生产的蛋白药物的主要风险在于蛋白药物中残留的宿主基因组DNA具有潜在的肿瘤致病性。所以,建立准确的生物制品中CHO细胞残留基因组DNA的定量方法对于蛋白药物的安全性和质量控制至关重要。
现阶段,世界卫生组织推荐的标准是每剂量制品中的终DNA含量必须小于10ng;美国FDA建议使用检测灵敏度达到100pg的检测方法检测制品中的DNA水平;且规定每剂量疫苗中的CHO细胞基因组DNA的残留量必须小于100pg。而随着科技的发展和人们对健康要求越来越高这个大趋势来看,上述对CHO细胞基因组DNA残留的安全量标准也会变得越来越高。因此,这就需要高效的,高灵敏度的引物、探针以及检测试剂来检测生物制品中残留的CHO细胞基因组DNA。
迄今为止,常用的技术一般是针对CHO细胞基因组中的高拷贝序列设计引物和探针,经过一段时间的发展,应用此方法设计的引物和探针以及检测方法已经达到了较高的检测灵敏度,最高可达1fg,但低浓度样品定量结果不稳定,误差较大。因此,现有方法已经不能满足人们对检测灵敏度和检测稳定性要求越来越高的标准。另外,由于CHO基因组与人源细胞,小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的同源性很高,一些方法设计的引物并不能很好的排除来自于人源细胞,小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的干扰,使得检测结果不准确的风险增高。
综上所述,本领域急需能够检测生物制品中残留的CHO细胞基因组DNA的新引物、探针和检测方法。所述引物、探针和检测方法应具备高特异性,高灵敏度,高稳定性,操作简便,定量准确等优点,从而为生物制品,特别是蛋白药物的质量控制提供有利的支持。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的:
目前,常用的技术一般是针对CHO细胞基因组中的高拷贝序列设计引物和探针,经过一段时间的发展,应用此方法设计的引物和探针以及检测方法已经达到了较高的检测灵敏度,最高可达1fg,但低浓度样品定量结果不稳定,误差较大。因此,现有方法已经不能满足人们对检测灵敏度和检测稳定性要求越来越高的标准。另外,由于CHO基因组与人源细胞,小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的同源性很高,一些方法设计的引物并不能很好的排除来自于人源细胞,小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的干扰,使得检测结果不准确。由此,发明人研发了新的检测CHO细胞基因组的引物、探针以及方法,利用本申请所述的引物、探针及方法可以有效排除来自于人源细胞,小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的干扰,对CHO细胞基因组具有非常高的特异性和灵敏度。
因此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例,所述组合物包括引物和探针,所述引物包括:上游引物序列:5’-CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA-3’(SEQ ID NO:2),下游引物序列:5’-CCAGCACTCGGGAGGCA-3’(SEQ ID NO:3);所述探针包括如下序列:5’-ACTCACAGAGATCCGCCTGCC-3’(SEQ ID NO:4)。根据本发明的实施例,所述组合物为发明人经过创造性设计并筛选优化获得的,其中,上游引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第22-43位;下游引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第103-135位,并且所述引物扩增产物的长度为98-114bp。根据本发明实施例的组合物能够稳定准确检测生物制品中残留CHO细胞基因组DNA,检测灵敏度达1fg,且可以排除Vero细胞、大肠杆菌细胞、小鼠源细胞、大鼠源细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰,检测结果更加准确。
根据本发明的实施例,上述组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述探针携带荧光基团。
根据本发明的实施例,所述荧光基团选自下列中的至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
根据本发明的实施例,所述探针的5’端标记荧光基团,3’端标记淬灭基团。
根据本发明的实施例,所述探针5’端标记FAM荧光报告基团,3’端标记BHQ1淬灭基团。
根据本发明的实施例,所述上游引物序列、下游引物序列和探针的摩尔比为(4-10):(4-10):(3-6)。引物用量与扩增的目的片段长度有着正比内在关系,一般而言,扩增片段越长,所需引物相对越多,当所述上游引物、下游引物和探针的摩尔比为(4-10):(4-10):(3-6)时,可以有效对所述CHO细胞基因组进行检测,减少二聚体的产生,提高扩增效率。
根据本发明的实施例,所述上游引物序列、下游引物序列和探针的摩尔比为5:5:4。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包含前面所述的组合物。如前所述,所述组合物为发明人经过创造性设计并筛选优化获得的,利用上述组合物可以有效排除Vero细胞、大肠杆菌细胞、小鼠源细胞、大鼠源细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰,能够稳定准确检测生物制品中残留CHO细胞基因组DNA,检测灵敏度达1fg;因此,包含所述组合物的试剂盒同样能够稳定、准确的检测生物制品中残留CHO细胞基因组DNA,检测灵敏度可达1fg。
根据本发明的实施例,上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,进一步包括下列中的至少一种:PCR缓冲液、盐离子、dNTPs、DNA聚合酶或者靶标核酸。
根据本发明的实施例,进一步包括PCR增强剂。
根据本发明的实施例,所述DNA聚合酶为Taq酶。
根据本发明的实施例,所述盐离子为Mg2+。
根据本发明的实施例,进一步包括下列试剂中的至少一种:DNA提取试剂和核酸纯化试剂。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种检测CHO细胞基因组DNA的方法。根据本发明的实施例,包括以下步骤:将待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应,所述PCR扩增体系中包括前面所述的组合物或利用前面所述的试剂盒配制的,其中,所述待测样品包括CHO细胞基因组DNA。根据本发明实施例的方法可以排除Vero细胞、大肠杆菌细胞、小鼠源细胞、大鼠源细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰,能够稳定准确检测生物制品中残留CHO细胞基因组DNA,检测灵敏度达1fg。
根据本发明的实施例,上述检测CHO细胞基因组DNA的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品是以CHO细胞的形式提供的。
根据本发明的实施例,所述待测样品预先经过CHO细胞基因组DNA提取处理。
根据本发明的实施例,在PCR扩增体系中进行扩增反应,以便获得靶标核酸的CT值;以及基于所述靶标核酸的CT值,确定待测样品中CHO细胞基因组DNA的水平。
根据本发明的实施例,所述靶标核酸包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述靶标核酸为发明人经过一系列创造性思维及大量实验验证获得的,基于所述靶标核酸设计的引物对CHO细胞基因组具有更强的特异性和灵敏度。
根据本发明的实施例,所述的PCR扩增体系包括前面所述的组合物,其中,所述组合物中的上游引物、下游引物和探针的摩尔比为(4-10):(4-10):(3-6)。
根据本发明的实施例,所述上游引物、下游引物和探针的摩尔比为5:5:4。
根据本发明的实施例,所述PCR扩增反应的条件依次为:90℃-97℃、0.8-1.5min,进行1个循环;90℃-97℃、3-10s,55-65℃、10-20s,进行38-42个循环。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是根据实施例2的引物探针和定量方法获得的扩增曲线图,其中,Amplification Plot表示扩增曲线,横坐标(Cycle)表示循环数,纵坐标(△Rn)表示相对荧光值;
图2是根据实施例2的引物探针和定量方法获得的标准曲线图,其中,StandardCurve表示标准曲线,横坐标(Quantity)表示模板DNA的数量(单位为皮克),纵坐标(CT)表示模板DNA数量对应的循环数,Slope表示斜率,Y-Inter表示Y轴截距,R2值表示标准曲线的拟合度,Eff%表示PCR扩增效率;
图3是根据实施例3的所述引物探针和国家药典推荐的引物探针获得的扩增曲线图,其中,横坐标(Cycle)表示循环数,纵坐标(△Rn)表示相对荧光值;
图4是根据本发明实施例5的所述引物探针和检测方法以单一浓度模板重复96次情况下获得的扩增曲线(Amplification Plot)图,其中,横坐标(Cycles)表示循环数,纵坐标(RFU)表示荧光值;
图5是根据本发明实施例7的所述引物探针和检测方法在ABI 7500qPCR仪上获得的扩增曲线(Amplification Plot)结果图,其中,横坐标(Cycle)表示循环数,纵坐标(△Rn)表示相对荧光值;
图6是根据本发明实施例7的所述引物探针和检测方法在Roche 480qPCR仪上获得的扩增曲线(Amplification Plot)结果图,其中,横坐标(Cycle)表示循环数,纵坐标(Fluorescence)表示荧光值;
图7是根据本发明实施例7的所述引物探针和检测方法在BioRad CFX96 qPCR仪上获得的扩增曲线(Amplification Plot)结果图,其中,横坐标(Cycle)表示循环数,纵坐标(RFU)表示荧光值;
图8是根据本发明实施例7的所述引物探针和检测方法在宏石96P qPCR仪上获得的扩增曲线(Amplification Plot)结果图,其中,纵坐标(Rn)表示相对荧光值。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
为方便理解,发明人对本发明进行以下介绍:
获得用于设计检测CHO细胞基因组DNA的引物、探针的多核苷酸序列包括以下步骤:
(1)从NCBI中获得中国仓鼠(Cricetulus griseus)基因组的基因组序列GCF_003668045.3_CriGri-PICRH-1.0_genomic.fna.gz,repeat区注释文件GCF_003668045.3_CriGri-PICRH-1.0_rm.out.gz。其中repeat区的注释文件是通过使用RepeatMasker程序(version:open-4.0.8),RepBse数据库(20181026)和Dfam_Consensus(20181026)数据库得到的。
(2)根据所述repeat注释文件信息以及不同重复序列的自身特点和其在基因组中的分布特点,在对应基因组上,提取SINE/Alu家族的AluSz,AluY重复序列,提取卫星序列ALR类型的重复序列,并过滤去除长度低于100bp的序列。
(3)对上述步骤(2)提取的不同类型重复序列分别进行序列相似性聚类,将序列identity值达到80%及以上的序列聚为一个Cluster,并查找聚类序列数量最多的一个Cluster,在该Cluster中,提取identity值前100位的序列,做多序列比对,并确定多序列比对共同区域中每个位置最大可能的碱基。最终确定的碱基序列作为候选序列。
(4)将上述获得的各个不同类型的候选序列使用blast比对到基因组序列上,-evalue为1e-5,过滤掉identity值小于90,比对长度低于候选序列长度90%的比对结果。得到不同类型重复序列在基因组上的比对位置数,数值最大的为最终选择的序列。
(5)对候选序列进行探针法qPCR扩增验证。经过多轮引物、探针设计及探针法qPCR扩增验证,发明人出乎意料地发现根据SEQ ID NO:1所示序列设计的引物、探针不仅能够高度灵敏地检测CHO细胞基因组DNA,还能区分Vero细胞,大肠杆菌细胞,小鼠源细胞,大鼠源细胞和人源细胞的干扰性DNA,从而获得稳定性的,灵敏度的和特异的检测CHO细胞基因组DNA的引物、探针以及检测方法。
组合物
因此,在一些实施方案中,本发明提出了一种组合物,所述组合物包括引物和探针。
(1)引物
本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的CHO细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计,而是针对CHO细胞基因组DNA序列的SEQ ID NO:1所示序列设计的。换言之,本发明的引物可以特异性结合于CHO细胞基因组DNA上的SEQ ID NO:1所示序列。
鉴于本发明的说明和本领域的公知常识,本领域技术人员应该理解,针对SEQ IDNO:1所示序列可以设计多种引物。因此,本发明的引物不限于实施例中具体得到的引物。
在具体的实施方案中,本发明的上游引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第11-43位;下游引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第103-135位,并且所述引物扩增产物的长度为98-114bp。在一些具体的实施方案中,所述上游引物和下游引物的长度为17-22bp;优选所述上游引物和下游引物的长度分别为22和17bp。
在一些优选的实施方案中,所述上游引物和下游引物的Tm温度为56℃-61℃,并且上游引物的Tm与下游引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
在最优选的实施方案中,本发明的上游引物如SEQ ID NO:2所示,下游引物如SEQID NO:3所示。
(2)探针
本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义,即,一小段单链DNA或者单链RNA片段或者单链DNA/RNA杂合片段,用于检测与其互补的核酸序列。
鉴于本发明的说明和本领域的公知常识,本领域技术人员应该理解,在知晓引物对的前提下,本领域技术人员可以根据上游引物和下游引物结合位点之间的模板序列自主设计探针,并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方案中,本领域普通技术人员可根据需要具体引物序列设计探针,所述探针可以处于液相中,也可以固定于固相上;可以在扩增前结合,也可以在扩增后结合。因此,本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。
在具体的实施方式中,本发明的探针如SEQ ID NO:4所示。
试剂盒
在一些实施方案中,本发明提出了一种试剂盒,所述试剂盒包含本发明的引物、检测探针以及实施探针法qPCR所需的其它成分,例如Taq酶、dNTP、Mg2+等。
在具体的实施方式中,本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示上游引物,SEQ IDNO:3所示下游引物,SEQ ID NO:4所示探针。
在具体的实施方式中,本发明试剂盒检测灵敏度可以稳定达到1fg。
在本发明的引物、检测探针或试剂盒的基础上,本发明进一步提供一种检测CHO细胞基因组DNA的方法,所述方法包括:利用本发明的引物、检测探针或试剂盒,对待测样品进行探针法qPCR,并检测qPCR扩增产物。
检测方法
在本发明的引物、检测探针的基础上,本发明还提供了利用本发明的引物、探针扩增目标产物的探针法qPCR方法。
经过筛选优化后,下述引物序列、反应体系、反应条件可以有效检测CHO细胞基因组DNA。
(1)DNA检测相关序列试剂及序列:
试剂:2×Probe qPCR MasterMix(含有热启动型Taq酶、dNTP、Mg2+、ROX ReferenceDye、本发明所述检测引物及探针等成分)。
序列:本发明涉及的相关序列及扩增出的片段如表1所示,所用引物探针由上海生工合成。
表1:
本发明中用到的标准品DNA(CHO细胞基因组DNA标准品)采购自中国检定研究院。阴性标准品为RNase-Free ddH2O,CHO细胞基因组DNA标准品稀释液为由天根生化科技(北京)有限公司提供。
本发明用到的检测仪器包括:ABI 7500,BioRad CFX96,Roche480,宏石96P。
(2)标准品DNA的制备
将采购自中国检定研究院的CHO细胞基因组DNA用核酸标准品稀释液(天根生化产品,目录号RT504)进行梯度稀释,稀释后的浓度如表2所示,其中,超纯水为非模板对照(NTC)。
表2:
梯度编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
浓度 | 300pg/μL | 30pg/μL | 3pg/μL | 300fg/μL | 30fg/μL | 3fg/μL |
(3)探针法qPCR反应体系
反应体系如表3所示:
表3:
组分 | 单个反应所需体积(μL) |
标准品DNA或超纯水 | 10 |
2×qPCR反应试剂 | 15 |
上游引物(10μM) | 0.75 |
下游引物(10μM) | 0.75 |
检测探针(10μM) | 0.6 |
超纯水 | 2.9 |
总体积 | 30 |
(4)探针法qPCR反应程序
反应程序如表4所示:
表4:
本发明的有益效果包括:
(1)本发明中设计的引物、检测探针或检测试剂在检测CHO细胞基因组DNA时具有更高的稳定性和准确性;
(2)本发明中设计的引物,检测探针或检测试剂能够有效排除Vero细胞,大肠杆菌细胞,小鼠源细胞,大鼠源细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰;
(3)本发明所述的检测方法,具有操作简便,定量准确,稳定性好,特异性强和灵敏性高且适应于的特点。
下面参考具体实施例,对本发明进行描述,需要说明的是,这些实施例仅仅是描述性的,而不以任何方式限制本发明。
实施例1引物、探针设计及筛选
1.1用于设计检测CHO细胞基因组DNA的引物、探针的多核苷酸序列的获得:
(1)从NCBI中获得中国仓鼠(Cricetulus griseus)基因组的基因组序列GCF_003668045.3_CriGri-PICRH-1.0_genomic.fna.gz,repeat区注释文件GCF_003668045.3_CriGri-PICRH-1.0_rm.out.gz。其中repeat区的注释文件是通过使用RepeatMasker程序(version:open-4.0.8),RepBse数据库(20181026)和Dfam_Consensus(20181026)数据库得到的。
(2)根据所述repeat注释文件信息以及不同重复序列的自身特点和其在基因组中的分布特点,在对应基因组上,提取SINE/Alu家族的AluSz,AluY重复序列,提取卫星序列ALR类型的重复序列,并过滤去除长度低于100bp的序列。
(3)对上述步骤(2)提取的不同类型重复序列分别进行序列相似性聚类,将序列identity值达到80%及以上的序列聚为一个Cluster,并查找聚类序列数量最多的一个Cluster,在该Cluster中,提取identity值前100位的序列,做多序列比对,并确定多序列比对共同区域中每个位置最大可能的碱基。最终确定的碱基序列作为候选序列。
(4)将上述获得的各个不同类型的候选序列使用blast比对到基因组序列上,-evalue为1e-5,过滤掉identity值小于90,比对长度低于候选序列长度90%的比对结果。得到不同类型重复序列在基因组上的比对位置数,数值最大的为最终选择的序列。
(5)对候选序列进行探针法qPCR扩增验证。经过多轮引物、探针设计及探针法qPCR扩增验证,发明人出乎意料地发现根据SEQ ID NO:1所示序列设计的引物、探针不仅能够高度灵敏地检测CHO细胞基因组DNA,还能区分Vero细胞,大肠杆菌细胞,小鼠源细胞,大鼠源细胞和人源细胞的干扰性DNA,从而获得稳定性的,灵敏度的和特异的检测CHO细胞基因组DNA的引物、探针以及检测方法。
TTGTTTTTTTAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCATGCGCCACCAACGCC(SEQ ID NO:1)。
1.2引物和探针序列的设计
发明人根据1.1中获得的SEQ ID NO:1所示的序列以及Oligo7软件,设计了以下引物对和探针:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
下游引物R2:GCGCATGCCTTTAATCCCAG(SEQ ID NO:5);
上游引物F2:CTGTGTAGCTTTGGAGCC(SEQ ID NO:6);
下游引物R3:ATGCCTTTAATCCCAGCAC(SEQ ID NO:7);
检测探针P2:ACTCACAGAGATCCGCCTGC(SEQ ID NO:8);
其中,设计引物探针的DNA模板如下:
TTGTTTTTTTAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCATGCGCCACCAACGCC(SEQ ID NO:1);
F1/R1扩增产物:
CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
F1/R2扩增产物:
CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCATGCGC(SEQ ID NO:10)。
F2/R3扩增产物:
CTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCAT(SEQ ID NO:11)。
发明人通过探针法qPCR实验检验了上述引物对、探针的性能,其中,qPCR体系如表5所示:
表5:
qPCR标准曲线所使用标准品DNA的浓度设置如表6所示:
表6:
梯度 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
浓度 | 300pg/μL | 30pg/μL | 3pg/μL | 300fg/μL | 30fg/μL | 3fg/μL |
qPCR反应程序如表7所示:
表7:
所用qPCR仪为ABI 7500。
具体的实验结果如表8所示:
表8:
从上表结果可知,在对比的三组引物探针中,F1/R1/P1组的表现最好,检测灵敏度最高,因此在本发明方法中,优选的引物探针组合为:上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4)。
实施例2本发明优选方法扩增效果
本实施例所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
上述引物、探针经标准品DNA扩增的产物为:
CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
qPCR体系同实施例1表5所示:
qPCR标准曲线所使用标准品的DNA浓度如实施例表6所示:
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为ABI 7500。
本实施例对应检测方法的扩增曲线如图1所示,标准曲线如图2所示,CT值数据及扩增参数如表9所示,经实施例1筛选获得的所述引物、探针组合具有较高的扩增效率,且检测的准确度高。
表9:
实施例3本发明所述的引物探针与国家药典推荐引物探针的检测效果对比
本实施例将实施例1筛选获得的引物、探针组合与国家药典推荐引物探针的检测效果进行对比,其中,所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
扩增产物:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
国家药典推荐上游引物:TGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCT(SEQ ID NO:12);
国家药典推荐下游引物:CAGCACTCGGGAGGCAGA(SEQ ID NO:13);
国家药典推荐检测探针:ACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGC(SEQ ID NO:14);
qPCR体系同实施例1中表5所示:
qPCR标准曲线所使用标准品的DNA浓度如实施例1中表6所示:
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为ABI 7500。
表10:
两组引物探针检测效果对比的扩增曲线如图3所示,其中,荧光信号高的曲线对应本发明引物探针,荧光信号低的曲线对应国家药典推荐引物探针。从图中结果可以看出,本申请设计的引物探针对应的PCR反应具有更低的CT值,更高的荧光信号,且指数扩增时间更长;两组检测引物探针对应PCR反应的具体参数如表10所示。由图3和表10所示的实验结果可知,本发明所述引物探针比国家药典推荐的引物探针具有更好的检测效果。
实施例4引物探针特异性评测
本实施例对本发明实施例1设计、筛选的引物探针的特异性进行检测,所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
扩增产物:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
干扰DNA的制备过程如下:将大肠杆菌、Vero、Human 293T、小鼠肝脏细胞和大鼠肝脏细胞五种干扰DNA稀释成浓度为5ng/μL;其中,大肠杆菌DNA来源于天根生化保存的DH5α菌株,CHO细胞和Human 293T细胞采购自鼎国生物,小鼠和大鼠肝脏细胞为天根生化自己保存,用天根生化的基因提取试剂盒提取基因组DNA,未添加干扰DNA组采用等量的超纯水替代所述干扰基因组。
qPCR体系如表11所示:
表11:
qPCR标准曲线所使用标准品的DNA浓度如实施例1中表6所示:
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为ABI 7500。
表12:
表13:
分组 | R<sup>2</sup> | 扩增效率 |
不加干扰基因组DNA | 1 | 99.358% |
加入Human 293T细胞DNA干扰 | 0.999 | 97.612% |
加入E.Coli DNA干扰 | 1 | 99.013% |
加入Vero细胞DNA干扰 | 1 | 97.680% |
加入小鼠基因组DNA干扰 | 1 | 99.305% |
加入大鼠基因组DNA干扰 | 1 | 100.026% |
此外,五组干扰实验对应PCR反应的标准曲线参数如表12、13所示,从表12及表13的实验结果可知,与无干扰组相比,加入干扰DNA的五组检测数据在CT值变化量,扩增效率和标准曲线线性关系方面均无明显变化,说明本发明所述引物探针可有效抵抗Vero、大肠杆菌、人源、小鼠源和大鼠源细胞基因组DNA的干扰,具有很好的物种特异性。
实施例5检测方法重复稳定性检测
本实施例对实施例1设计并筛选获得的引物、探针及方法进行稳定性检测,其中,所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
扩增产物:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
本实施例使用的检测试剂包含本发明的引物以及检测探针等实施探针法qPCR所需的其它成分,例如Taq酶、dNTP、Mg2+等。
重复稳定性检测方案为:重复96次检测3pg/μL的CHO DNA标注品,记录CT值数据变化量和扩增曲线变化程度。
qPCR体系同实施例1表5所示;
qPCR所使用标准品的DNA浓度为3pg/μL;
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为BioRad CFX96。
96次重复下的CT值数据变化量如表14所示。
表14:
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | 21.85 | 21.81 | 21.85 | 22.04 | 21.77 | 21.83 | 22.10 | 21.95 | 21.84 | 22.18 | 21.78 | 22.00 |
B | 21.84 | 21.65 | 21.70 | 21.73 | 21.71 | 21.72 | 21.77 | 22.86 | 21.72 | 22.20 | 22.13 | 21.82 |
C | 21.72 | 21.69 | 21.71 | 21.59 | 21.62 | 21.70 | 21.67 | 21.67 | 21.65 | 21.60 | 21.79 | 21.81 |
D | 21.82 | 21.72 | 21.59 | 21.65 | 21.66 | 21.75 | 21.62 | 21.74 | 21.64 | 21.83 | 21.81 | 21.84 |
E | 21.65 | 21.65 | 21.71 | 21.61 | 21.66 | 21.55 | 21.69 | 22.36 | 21.75 | 21.70 | 21.69 | 21.77 |
F | 21.66 | 21.80 | 21.71 | 21.62 | 21.71 | 21.61 | 21.66 | 21.83 | 21.64 | 21.83 | 21.76 | 21.83 |
G | 21.83 | 21.71 | 21.72 | 21.66 | 21.76 | 21.55 | 21.79 | 21.65 | 22.31 | 21.75 | 21.76 | 21.92 |
H | 21.75 | 21.66 | 21.82 | 21.75 | 21.72 | 21.73 | 21.81 | 21.79 | 21.79 | 21.80 | 21.78 | 21.74 |
注:表中各个数据按96孔板顺序排布。
96次重复下的扩增曲线变化程度如图4所示。
通过表14和图4的结果可知,本发明方法重复96次检测浓度为3pg/μL的标准品时,CT值的CV%值小于1%,扩增曲线最高信号和线型稳定,说明本发明方法的重复稳定性效果良好。
实施例6检测方法的定量稳定性和准确性评测
本实施例对于实施例1设计、筛选的所述引物、探针进行定量稳定性和准确性评测,其中,所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
扩增产物:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
本实施例使用的检测试剂包含本发明的引物以及检测探针等实施探针法qPCR所需的其它成分,例如Taq酶、dNTP、Mg2+等。
定量准确性的测定步骤如下:选取表15所示的4个浓度的模拟样品(CHO基因组DNA),利用本发明实施例2所述的检测引物探针、反应体系、检测方法重复检测10次。
表15:
梯度 | 1 | 2 | 3 | 4 |
浓度 | 1fg/μL | 0.5fg/μL | 0.3fg/μL | 0.1fg/μL |
qPCR体系同实施例1表5所示:
qPCR标准曲线所使用标准品的DNA浓度如实施例1中表6所示:
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为ABI 7500。
本次实验的定量数据如表16所示,其中,本发明所述的检测引物探针和定量方法对4个浓度的模拟样品的定量CV值均小于20%,说明本发明的定量准确度和重复性表现良好,且可稳定检测的最低样品量为1fg。
表16:
实施例7引物探针和检测方法对qPCR仪的普适性检测
本实施例对实施例1设计、筛选的引物、探针以及方法进行仪器普适性检测,其中,所用引物探针如下所示:
上游引物F1:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:CCAGCACTCGGGAGGCA(SEQ ID NO:3);
检测探针P1:ACTCACAGAGATCCGCCTGCC(SEQ ID NO:4);
扩增产物:CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGG(SEQ ID NO:9)。
本实施例使用的检测试剂包含本发明的引物以及检测探针等实施探针法qPCR所需的其它成分,例如Taq酶、dNTP、Mg2+等。
qPCR体系同实施例1表5所示:
qPCR标准曲线所使用标准品的DNA浓度如实施例1中表6所示:
qPCR反应程序同实施例1中表7所示。
所用qPCR仪为ABI 7500、Roche480、BioRad CFX96、宏石96P。
表17:
具体的实验结果如图5-8和表17所示,其中图5显示的是ABI 7500仪器上利用本发明引物、探针及方法对上述浓度DNA进行1次或多次重复获得的扩增曲线,图6显示的是Roche480仪器上利用本发明的引物、探针及方法的扩增曲线,图7显示的是BioRad CFX96仪器上利用本发明引物、探针及方法对上述浓度DNA进行1次或多次重复获得的扩增曲线,图8显示的是宏石96P仪器上本发明引物、探针及方法的扩增曲线;表17中展示的是在各个不同qPCR仪平台下本发明方法对应的CT值和标准曲线的扩增效率及R2数据。在CT值方面,由于不同仪器下对应的阈值线自动设置算法不同,因此CT值变化范围较大,但都在合理范围之内,所以,由本实施例的检测结果可知,本发明所述的检测引物探针和检测方法具有很好的仪器普适性,在主流qPCR仪上的检测效果均稳定良好。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种组合物,其特征在于,包括引物和探针,
所述引物包括:
上游引物序列:5’-CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA-3’(SEQ ID NO:2),
下游引物序列:5’-CCAGCACTCGGGAGGCA-3’(SEQ ID NO:3);
所述探针包括如下序列:5’-ACTCACAGAGATCCGCCTGCC-3’(SEQ ID NO:4)。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述探针进一步携带荧光基团;
任选地,所述荧光基团选自下列中的至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述探针的5’端标记荧光基团,3’端标记淬灭基团,
任选地,所述探针5’端标记FAM荧光报告基团,3’端标记BHQ1淬灭基团。
4.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1-3任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括下列中的至少一种:PCR缓冲液、盐离子、dNTPs、DNA聚合酶或者靶标核酸;
任选地,进一步包括PCR增强剂;
任选地,所述DNA聚合酶为Taq酶;
任选地,所述盐离子为Mg2+。
6.根据权利要求4或所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括下列试剂中的至少一种:DNA提取试剂和核酸纯化试剂。
7.一种检测CHO细胞基因组DNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应,所述PCR扩增体系中包括权利要求1-3任一项所述的组合物或利用权利要求4-6任一项所述的试剂盒配制的,
其中,所述待测样品包括CHO细胞基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述待测样品是以CHO细胞的形式提供的;
任选地,所述待测样品预先经过CHO细胞基因组DNA提取处理;
任选地,在PCR扩增体系中进行扩增反应,以便获得靶标核酸的CT值;以及基于所述靶标核酸的CT值,确定待测样品中CHO细胞基因组DNA的水平;
任选地,所述靶标核酸包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的PCR扩增体系包括权利要求1-3任一项所述的组合物,其中,所述组合物中的上游引物序列、下游引物序列和探针的摩尔比为(4-10):(4-10):(3-6);
优选地,所述上游引物序列、下游引物序列和探针的摩尔比为5:5:4。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增反应的条件依次为:90℃-97℃、0.8-1.5min,1个循环;90℃-97℃、3-10s,55-65℃、10-20s,38-42个循环。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210920865.4A CN115418394A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210920865.4A CN115418394A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115418394A true CN115418394A (zh) | 2022-12-02 |
Family
ID=84195954
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210920865.4A Pending CN115418394A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115418394A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115976232A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-18 | 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 | 利用分子信标检测cho核酸残留的方法及引物和试剂盒 |
-
2022
- 2022-08-02 CN CN202210920865.4A patent/CN115418394A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115976232A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-18 | 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 | 利用分子信标检测cho核酸残留的方法及引物和试剂盒 |
CN115976232B (zh) * | 2023-01-05 | 2023-08-15 | 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 | 利用分子信标检测cho核酸残留的方法及引物和试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
CN110577987A (zh) | 一种fmr1基因cgg重复序列的检测方法及其应用 | |
CN109593847B (zh) | 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
CN111518959A (zh) | 新型冠状病毒的数字pcr检测方法及试剂盒 | |
CN106566874B (zh) | 检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组及检测试剂盒 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
CN115418394A (zh) | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 | |
CN114807318A (zh) | 用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法 | |
CN109735645B (zh) | 一种检测球形孢子丝菌的实时荧光pcr引物、探针及试剂盒 | |
CN107022620A (zh) | N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
CN111676316A (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法 | |
CN105803050B (zh) | 检测cho细胞dna的引物及方法 | |
CN116219040A (zh) | 用于检测植物乳杆菌s58的分子标记、引物探针组和检测方法 | |
EP4141129A1 (en) | Method for detecting hbv genotype, oligonucleotide and kit | |
CN108330213B (zh) | 一种同时进行hbv dna定量、基因分型及rt区突变检测方法 | |
CN102943109A (zh) | 一种基于串联多内对照的检测拷贝数变异的方法 | |
CN110684862B (zh) | 用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字pcr试剂盒及检测方法 | |
CN111534634A (zh) | 一种ⅱ型犬腺病毒的可视化等温扩增检测试剂及其应用 | |
CN106868177B (zh) | 一种新型核酸荧光定量检测方法 | |
CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒(gcrv-i)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN116555452A (zh) | 一种组合物、试剂盒及检测大肠杆菌细胞基因组dna的方法和应用 | |
Al-Turkmani et al. | Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory | |
CN116179679A (zh) | Smn1基因的检测引物对、检测探针以及用于检测脊髓性肌萎缩症的试剂盒 | |
CN115927761A (zh) | 一种检测呼肠孤病毒3型的引物和探针及其应用 | |
Malewski et al. | RT-PCR technique and its applications. State-of the-art |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |