CN116179679A - Smn1基因的检测引物对、检测探针以及用于检测脊髓性肌萎缩症的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测脊髓性肌萎缩症的引物对探针组合产品、试剂盒及其应用,检测引物对中,上游引物具有如SEQ ID No.14所示序列,且序列的第15和23位碱基经LNA修饰,下游引物具有如SEQ ID No.16所示的序列,且序列的第13位碱基经LNA修饰;检测探针具有SEQ ID No.21所示的序列,且序列的第12、14位碱基经LNA修饰。本申请具有极高灵敏度和特异性,能在一个荧光定量扩增体系中,对核酸样本中SMN1基因第7号外显子和内参基因进行同时特异扩增,并通过比较目的基因和内参基因CT值差值,从而能够实现对来源于低浓度干血斑核酸的样本中的SMN1基因第7号外显子准确定量检测,且不受SMN2的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,尤其涉及一种SMN1基因的检测引物对、检测探针以及用于检测脊髓性肌萎缩症的试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种较为常见的隐形遗传疾病。根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型:I型(严重型)、II型(中间型)、III型(轻型)和IV型(成人型)。SMA的致病基因定位于五号染色体5q11.2-5q13.2区域,在该区域上的两个高度同源的基因被命名为运动神经元存活基因(survival motor neuron,SMN),其中:靠近端粒的SMN1是SMA的致病性基因;靠近中心体的SMN2不是SMA致病性基因,但其拷贝数与SMA临床表现严重程度相关。SMN基因全长20kb,含有9个外显子(1、2a、2b、3-8)。SMN1和SMN2基因的序列在全部基因区域高度一致,一般认为两者间只有5个碱基的区别,分布于内含子6到外显子8之间的区域内。SMN1和SMN2基因所有外显子序列仅存在两个碱基不同,其一是外显子7中的一个不同碱基(Exon 7+6,第840碱基,C/T),该碱基为同义突变,其二是外显子8中的一个不同碱基(Exon 8+245,G/A),该碱基位于终止密码子后,对蛋白编码无影响。SMN1可以表达稳定、完整的功能的SMN蛋白。虽然SMN2与SMN1基因的序列极为相近,但SMN2在体内转录出的大部分转录产物没有正确剪接,仅有约10%的mRNA拼接正确并翻译出具有正常活性SMN蛋白。SMN1基因转录产物长约1.7kb,编码294个氨基酸的SMN蛋白,参与构成与RNA加工有关的多蛋白复合体。SMN蛋白在人体组织中普遍表达,脊髓前角运动神经元对其需求较高,若SMN蛋白表达水平过低,会使神经元死亡,导致肌肉的萎缩。
已报到的用于SMA检测的技术包括一代测序、单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、荧光定量PCR、双侧双重AS-PCR、ddPCR、高分辨熔解曲线HRM和二代测序等。
Sanger测序、单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)等方法,这些方法都存在定量能力低、稳定性差、操作繁琐、有可能需要其他检测修正结果等问题,不适于大规模临床检测使用。MLPA使用多组特异性探针与SMN1外显子7和其他相关位置杂交,并连接扩增。可定量确定SMN1拷贝数。该方法操作复杂,成本高,对待检测样本要求高,数据分析繁琐。而且每次检测要求同时检测多个对照样本,根据对照样本结果对检测结果进行修正,对照样本选取不当或结果异常也会导致检测错误。
qPCR在较大尺度具备优秀的定量能力,但在区分基因的1个拷贝或2个拷贝上定量能力一般。1拷贝的CT值和2拷贝的CT值差异只有1,要保证有效区分CT差异为1的样本,对检测稳定性和重复性要求很高。
ddPCR定量能力较好,可有效对SMN1拷贝数进行检查。除了操作复杂、成本高外,ddPCR也需要对内参基因进行检测,类似于qPCR,对检测特异性、稳定性和重复性要求很高。
高分辨熔解曲线HRM能定量确定SMN1和SMN2的拷贝数比例,但不能最终确定数值而且对SMN2拷贝数为0的样本也无法检测。为了解决这些问题,还需要引入其他检测,如确定SMN1和SMN2总拷贝数等。由于SMN1和SMN2拷贝数组合较多,区分不同的熔解曲线样式也较为不便及易发生错误。
NGS(Next Generation Sequencing)无法确定拷贝数最终数值,还需要通过其它方法获得SMN1和SMN2的总拷贝数;操作复杂、成本较高、结果计算复杂,且同样需要大量内参基因检测,对反应条件控制要求较高。
有鉴于此,特提出本申请。
发明内容
本申请的目的之一包括提供一种引物对探针组合产品,采用该引物对探针组合产品能够实现SMA的高精度检测。
本申请的目的主要通过以下技术方案实现:
在本申请的第一方面,提供一种SMN1基因的检测引物对,所述检测引物对的扩增产物是由SEQ ID No.14和SEQ ID No.16所示的引物对作为引物扩增得到的SMN1基因的片段。
在本申请的一些实施例中,所述检测引物对具有SEQ ID No.14所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物。
在本申请的一些实施例中,所述上游引物的第15和23位碱基经LNA修饰,所述下游引物的第13位碱基经LNA修饰。
在本申请的第二方面,提供一种SMN1基因的检测探针,所述检测探针能够特异性识别第一方面中定义的片段上的SMN1基因SNP位点。
在本申请的一些实施例中,所述检测探针如SEQ ID No.21所示。
在本申请的一些实施例中,所述检测探针的第12和14位碱基经LNA修饰。
在本申请的第三方面,提供第一方面所述的检测引物对或/和第二方面所述的检测探针在制备脊髓性肌萎缩症检测试剂盒中的应用。
在本申请的第四方面,提供一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包括第一方面所述的检测引物对或/和第二方面所述的检测探针,以及检测内参基因的内参引物对及内参探针。
在本申请的一些实施例中,所述内参基因包括RPP30基因。
在本申请的一些实施例中,所述检测探针和所述内参探针各自独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团,且所述检测探针和所述内参探针标记的荧光报告基团不同。
在本申请的第五方面,提供一种基于非诊断目的的SMN1基因的检测方法,所述检测方法包括如下步骤:
采用第一方面所述的检测引物对、第二方面所述的检测探针或者第四方面所述的检测试剂盒对待测核酸样本进行检测,根据检测结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常。
在本申请的一些实施例中,根据检测结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常,包括:
将SMN1基因、内参基因对应的荧光通道设置相同的阈值,并将阈值设置在0.1-0.12范围内;
将SMN1基因和内参基因对应的Ct值分别记作Ct检测和Ct内参,计算ΔCt=|Ct检测-Ct内参|,
ΔCt满足如下(1)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因正常,
ΔCt满足如下(2)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因异常,
ΔCt满足如下(3)所示的条件,则判断所述待测核酸样本浓度过低无法判断;
(1)Ct内参<30.0,ΔCt≤8.0;
(2)Ct内参≤30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参≤30.0,Ct值显示“undetermined”;或者,Ct内参≤30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线;
(3)Ct内参>30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参>30.0,ΔCt≤8.0;或者,Ct内参>30.0,Ct值显示“undetermined”;或者,Ct内参>30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线。
相对于传统技术,本申请的有益效果包括:
本申请针对SMN1和SMN2之间在7号外显子和7号内含子上的2个SNP位点设计引物对和探针,并用锁核酸(LNA)分别对引物和探针进行修饰,形成特定的引物对探针组合产品,该特定的引物对探针组合产品具有极高的灵敏度和特异性,能够和检测内参基因的引物对和探针组合使用,在一个荧光定量扩增体系中,对待测核酸样本(例如新生儿干血斑DNA样本中提取的核酸)中SMN1基因的第7号外显子和内参基因(例如RPP30基因)进行同时特异扩增,并通过比较目的基因和内参基因CT值差值(ΔCt值),从而能够实现对0、1、2、3拷贝数/基因组的SMN1基因第7号外显子的准确定量检测,且定量结果不受SMN2基因拷贝数的干扰。整体上,本申请能够利用少量的核酸样本(例如由1个3mm直径的干血斑样本抽提得到的核酸样本)作为模板,实现SMA疾病的高精度检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对本领域技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例4中制作的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例,对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式和实施例,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外,在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解,应理解,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本申请中,“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”、“第一类”、“第二类”、“第一段”、“第二段”等中,术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的,应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中,涉及到数值区间,如无特别说明,则包括数值区间的两个端点。
本申请中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中,指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列,当比较和比对以用于最大对应时,如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如,%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。对于序列比较,通常一个序列用作参考序列,测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时,测试序列和参考序列被输入到计算机中,如果需要,指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。然后,序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410;Altschul etal.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括,通过非限制性例子,将一个或多个核苷酸添加到5’端,将一个或多个核苷酸添加到3’端,将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端,添加尾部,缩短序列,延长序列,将序列上下游移动几个碱基,或其任何组合。碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷,和锁核酸(LNA’s),并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基,或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基,以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用,以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响,从而使其能够在较高的温度下进行,在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
如本申请使用的术语“探针”是指可指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如,SYBR Green和其他DNA结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针,例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的,例如Taqman探针、茎环分子信标、MGB探针、ScorpionTM探针、锁核酸(LNA)探针、肽核酸(PNA)探针等。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器),试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
本申请的第一方面
本申请提供一种SMN1基因的检测引物对,所述检测引物对的扩增产物是由SEQ IDNo.14和SEQ IDNo.16所示的引物对作为引物扩增得到的SMN1基因的片段。
本申请的检测引物对可以为SEQ ID No.14和SEQ ID No.16所示的引物对,或者与该引物对的序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%)同一性的且能扩增得到的所述SMN1基因的片段。
可选地,所述检测引物对具有SEQ ID No.14所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物。
可选地,本申请的检测引物对可以是经过修饰的。在其中一个示例中,所述上游引物的第15和23位碱基经LNA修饰,所述下游引物的第13位碱基经LNA修饰。
本申请的第二方面
本申请提供一种SMN1基因的检测探针,所述检测探针能够特异性识别第一方面中定义的片段上的SMN1基因SNP位点。
本申请的检测探针可以是如SEQ ID No.21所示的探针,也可以是与该探针的序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%)的同一性且能够特异性识别第一方面中定义的片段上的SMN1基因SNP位点的其他探针。
可选地,所述检测探针如SEQ ID No.21所示。
可选地,本申请的检测探针可以是经过修饰的探针。在其中一个示例中,所述检测探针的第12和14位碱基经LNA修饰。
本申请的第三方面
本申请的第一方面提供的检测引物对或/和在本申请的第二方面提供的检测探针在制备脊髓性肌萎缩症检测试剂盒中的应用。
本申请的第四方面
本申请提供一种检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括在第一方面提供的检测引物对或/和在第二方面提供的检测探针,以及检测内参基因的内参引物对及内参探针。
本申请对内参基因的选择不做特别限定,可以选择满足如下条件的基因作为内参基因:该基因为单拷贝基因,且无同源的假基因。可选地,所述内参基因包括RPP30基因。
本申请的内参引物对可以选用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对,或者与其序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%)的同一性且能扩增得到的所述RPP30基因的片段的引物对。可选地,检测所述RPP30基因的内参引物对中,上游引物具有如SEQ ID No.2所示的序列,下游引物具有如SEQ IDNo.3所示的序列。
本申请的内参探针可以是如SEQ ID No.4所示的探针,也可以是与该探针的序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%)的同一性且能够特异性识别RPP30基因的片段的其他探针。可选地,检测RPP30基因的内参探针具有SEQ ID No.4所示的序列。
在其中一个示例中,所述检测探针和所述内参探针各自独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团,且所述检测探针和所述内参探针标记的荧光报告基团不同。可选地,各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、AlexaFluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在其中一个示例中,所述检测试剂盒还包括扩增缓冲液、阳性质控品、阴性质控品或者其组合。
可选地,扩增缓冲液可以包括dNTP、Mg2+、UNG酶、DNA聚合酶等。适合于实施本申请的聚合酶是本领域熟知的,可以从多个来源获得。热稳定性DNA聚合酶可以从多种商业途径获得,使用本领域技术人员熟知的方法。优选的热稳定性的DNA聚合酶可以包括但不限于:Taq DNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段。
可选地,试剂盒中的组分,例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照可以以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照以及阴性对照可以以质粒的方式存在。可选地,各组分优选以冻干形式,例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。因此,可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分,特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式,可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地,冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
本申请的第五方面
本申请提供一种基于非诊断目的的SMN1基因的检测方法,所述检测方法包括如下步骤:
采用在第一方面提供的检测引物对、第二方面提供的检测探针或者第三方面提供的检测试剂盒对待测核酸样本进行扩增,根据扩增结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常。
在其中一个示例中,扩增的退火温度为59℃-62℃。
在其中一个示例中,根据扩增结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常,包括:
将SMN1基因、内参基因对应的荧光通道设置相同的阈值,并将阈值设置在0.1-0.12范围内;
将SMN1基因和内参基因对应的Ct值分别记作Ct检测和Ct内参,计算ΔCt=|Ct检测-Ct内参|,
ΔCt满足如下(1)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因正常,
ΔCt满足如下(2)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因异常,
ΔCt满足如下(3)所示的条件,则判断所述待测核酸样本浓度过低无法判断;
(1)Ct内参≤30.0,ΔCt≤8.0;
(2)Ct内参≤30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参≤30.0,Ct值显示“undetermined;或者,Ct内参≤30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线;
(3)Ct内参>30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参>30.0,ΔCt≤8.0;或者,Ct内参>30.0,Ct值显示“undetermined”;或者,Ct内参>30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线。
本申请实施例的检测方法,可以用于诊断/辅助诊断脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscular Atrophy,SMA)。
本申请实施例的中检测引物对、检测探针、检测试剂盒、检测方法适用的样本可以来源于包括但不限于,细胞,例如循环血液、培养的细胞、肿瘤细胞。样本的来源例如咽拭子、鼻拭子、痰液、呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、眼结膜拭子、唾液样品、粪便标本、抗凝血和血清标本中的一种或多种。DNA可以是基因组或者质粒或其他载体中的DNA。本申请用于检测基因组中SMN1基因SNP位点,可以是灵长类动物(尤其是人)以及公知或未知的具有SMN1基因SNP位点的其他任何动物。在一些实施方式中,模板序列或核酸样品可以是gDNA。模板序列或核酸样品的来源可以是任意类型的组织,包括例如福尔马林固定的石蜡包埋组织样品。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1:内参基因的引物、探针设计和内参基因质控质粒的制备
步骤1:内参基因的选择和引物设计
选择基因RPP30作为内参基因,该基因为单拷贝基因,且无同源的假基因。选择其高度保守区的序列,在引物和探针设计软件oligo 7和Primer Premier 5.0软件的辅助下,设计引物和探针,见表2。
基因RPP30的序列如下SEQ ID No.1:
引物的序列如下SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示:
RPP30-F(SEQ ID No.2):TTTGGACCTGCGAGCG,
RPP30-R(SEQ ID No.3):GAGCGGCTGTCTCCACAAGT。
探针的序列如下SEQ ID No.4所示:
RPP30-P(SEQ ID No.4):TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG,5'VIC,3'MGB。
步骤2:内参质控品质粒的制备
在PUC57质粒模板中插入内参基因RPP30片段,得到内参质控品的质粒PUC57-RPP30,全长2703bp,其中插入的内参基因序列如下SEQ ID No.5所示:
TTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTC
根据质粒PUC57-RPP30的大小(2703bp)和碱基的分子量(1.096×10-21g/bp)计算单个质粒分子的质量:mp=(2703bp)×(1.096×10-21g/bp)=2.962×10-18g,根据质粒的分子量计算特定拷贝数的质量,如表1:
表1
根据质粒的质量和每反应管加入的质粒模板的体积(5μl)计算质粒的浓度(g/μl),如表2:
表2
对质粒模板进行梯度稀释至特定的浓度(g/μl),如表3:
表3
步骤3:内参基因的引物、探针在不同退火温度下的扩增效果
利用内参基因的引物、探针配置单重的反应体系(表4),用10倍梯度稀释的PUC57-RPP30为模板,在不同的退火温度下测试单重体系的扩增效果,单重体系的反应条件如表5所示。
表4:RPP30单重体系的反应液配方
组分 | RPP30反应体系 |
2×Taqman Fast Advanced Master Mix | 10μl/reaction |
F(10μM) | 0.4μl/reaction |
R(10μM) | 0.4μl/reaction |
P(10μM) | 0.2μl/reaction |
H2O | 4μl/reaction |
表5:RPP30单重体系的反应条件
结果:使用内参基因引物、探针的单重体系对梯度稀释的PUC57-RPP30质粒模板进行扩增,在退火温度59-62℃时有最佳的扩增效果。
表6:在不同退火温度下RPP30引物探针单重体系的扩增效果
退火温度(T) | 57℃ | 58℃ | 59℃ | 60℃ | 61℃ | 62℃ | 63℃ |
CT值拷贝数/反应 | CtRPP30 | CtRPP30 | CtRPP30 | CtRPP30 | CtRPP30 | CtRPP30 | CtRPP30 |
10^7 | 18.52 | 17.31 | 16.13 | 15.65 | 16.23 | 16.93 | 17.31 |
10^6 | 22.07 | 20.85 | 19.55 | 19.17 | 19.51 | 20.33 | 20.74 |
10^5 | 25.72 | 24.39 | 22.96 | 22.27 | 22.95 | 23.60 | 24.14 |
10^4 | 29.26 | 27.90 | 26.35 | 25.59 | 26.28 | 27.05 | 27.52 |
10^3 | 32.97 | 31.61 | 29.84 | 28.95 | 29.54 | 30.35 | 31.22 |
10^2 | 36.47 | 34.98 | 33.26 | 32.29 | 33.09 | 33.89 | 34.67 |
10^1 | 40.18 | 38.62 | 36.62 | 35.79 | 36.56 | 37.37 | 38.27 |
扩增效率(%) | 89.30% | 91.27% | 96.05% | 97.63% | 97.60% | 96.80% | 93.30% |
Y-int | 43.75 | 42.15 | 40.07 | 39.41 | 39.84 | 40.67 | 41.67 |
R2 | 0.9999 | 0.9999 | 0.9999 | 0.9998 | 0.9999 | 0.9999 | 0.9998 |
实施例2:SMN1引物、探针设计以及阴、质控模板的制备
步骤1:SMN1引物、探针的设计
在NCBI上查找5号染色体上SMN1基因序列,选取包含SMN1 intron 6、exon 7、intron 7的SMN1基因序列作为模板,其中标记下划线的核苷酸序列的即是SMN1基因特异的核苷酸序列,如下SEQ ID No.6所示。ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTCATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAGCTTTAGGATATGATGCCATT
在引物和探针设计软件oligo 7和Primer Premier 5.0软件的辅助下,在选取的SMN1序列设计引物和探针。其中SMN1的上游引物覆盖exon7的SMN1特异性位点;下游引物覆盖intron7上的SMN1特异性位点;SMN1的探针为一段SMN1和SMN2的公共序列。为了提高正、反向引物对SMN1模板识别的特异性以及引物探针在qPCR反应体系中的扩增效率,对引物、探针上的特定核酸进行了LNA(锁核酸)的修饰(见下划线标识),SMN1的引物、探针如表7:
表7:SMN1的引物、探针序列
步骤2:阴、阳性质控模板的制备
在PUC57质粒模板中插入SMN1基因片段,得到质粒PUC57-SMN1,全长2902bp,其中插入的SMN1基因序列如下SEQ ID No.22所示:
ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAA(SEQ ID No.22)
根据质粒PUC57-SMN1的大小(2902bp)和碱基的分子量(1.096×10-21g/bp)计算单个质粒分子的质量:mp=(2902bp)×(1.096×10-21g/bp)=3.18×10-18g,根据质粒的分子量计算特定拷贝数的质量,如表8:
表8
根据质粒的质量和每反应管加入的质粒模板的体积(5μl)计算质粒的浓度(g/μl),如表9:
表9
对质粒模板进行梯度稀释至特定的浓度(g/μl),如表10:
表10
使用PUC57-RPP30-SMN1串联质粒作为引物探针测试的模板和二重体系的阴性质控,该质粒插入序列包含RPP30、SMN1序列和RPP&SMN1引物探针的识别位点。
ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTC(SEQ ID No.23)
使用PUC57-RPP30-SMN2串联质粒作为SMN1引物探针测试的对照,该质粒插入序列包含RPP30、SMN2序列和RPP30引物探针的识别位点。
ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATATCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAGAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTC(SEQ ID No.24)
根据质粒PUC57-RPP30-SMN1/2的大小(3035bp)和碱基的分子量(1.096×10-21g/bp)计算单个质粒分子的质量:mp=(3035bp)×(1.096×10-21g/bp)=3.326×10-18g,根据质粒的分子量计算特定拷贝数的质量,如表11:
表11
根据质粒的质量和每反应管加入的质粒模板的体积(5μl)计算质粒的浓度(g/μl),如表12:
表12
对质粒模板进行梯度稀释至特定的浓度(g/μl),如表13:
表13
步骤3:测试SMN1单重反应体系中引物、探针对质粒模板的扩增
(1)考察6个不同组合的SMN1引物、探针单重体系对PUC57-RPP30-SMN1 DNA(10^4拷贝/反应)模板的扩增,并与RPP30引物、探针单重体系对同一模板扩增的Ct值进行比较。
考察标准:选择扩增效率最高(ΔCt值(CtSMN1-CtRPP30)最小)的SMN1引物、探针组合。
结果:SMN1引物探针组合1-6及其配方如表14和表15所示,单重体系对PUC57-RPP30-SMN1DNA样本的扩增结果如表16所示,其中,组合2在单重体系中扩增有最佳的Ct值,这一组合中SMN1引物、探针均加入了锁核酸的修饰,提高了qPCR反应效果,因此选择这一组合中的SMN1-R2,SMN1-P2,在此基础上对SMN1-F继续进行优化,即后续单重体系7-12的优化。
表14:SMN1单重体系1-6的引物、探针组合
成分 | 组合1 | 组合2 | 组合3 | 组合4 | 组合5 | 组合6 |
引物F | SMN1-F1 | SMN1-F2 | SMN1-F2 | SMN1-F1 | SMN1-F2 | SMN1-F2 |
引物R | SMN1-R1 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R1 | SMN1-R1 | SMN1-R1 |
探针 | SMN1-P1 | SMN1-P2 | SMN1-P1 | SMN1-P2 | SMN1-P1 | SMN1-P2 |
表15:SMN1单重体系1-6和RPP30单重体系的反应液配方
组分 | SMN反应体系 | RPP30反应体系 |
2×Taqman Fast Advanced Master Mix | 10μl/reaction | 10μl/reaction |
F(10μM) | 0.4μl/reaction | 04μl/reaction |
R(10μM) | 0.4μl/reaction | 0.4μl/reaction |
P(10μM) | 0.2μl/reaction | 0.2μl/reaction |
H2O | 4μl/reaction | 4μl/reaction |
表16:单重体系组合1-6对PUC57-RPP30-SMN1(10^4拷贝/反应)样本的扩增结果
(2)考察单重体系组合7-12对PUC57-RPP30-SMN1 DNA(10^4拷贝/反应)模板的扩增,并与对照的RPP30单重扩增体系的Ct值比较,其中引物探针组合如表17所示,单重体系的反应液配方和RPP30反应液的配方如表18所示。
考察标准:根据ΔCt值(CtSMN1-CtRPP)选择ΔCt值最小的SMN1引物、探针组合。
结果:SMN1和RPP30单重体系的扩增结果如表19所示,在引物探针组合7-12中,单重体系8、10、11、12有相对最小且与RPP30体系接近的Ct值,因此选择这四个组合的引物探针在SMN1/RPP30二重qPCR体系中进一步考察。
表17:SMN1单重体系7-12的引物、探针组合
成分 | 组合7 | 组合8 | 组合9 | 组合10 | 组合11 | 组合12 |
引物F | SMN1-F3 | SMN1-F4 | SMN1-F5 | SMN1-F6 | SMN1-F7 | SMN1-F8 |
引物R | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 |
探针 | SMN1-P2 | SMN1-P2 | SMN1-P2 | SMN1-P2 | SMN1-P2 | SMN1-P2 |
表18:SMN1单重体系7-12和RPP30单重体系的反应液配方
组分 | SMN反应体系 | RPP30反应体系 |
2×Taqman Fast Advanced Master Mix | 10μl/reaction | 10μl/reaction |
F(10μM) | 0.4μl/reaction | 0.4μl/reaction |
R(10μM) | 0.4μl/reaction | 0.4μl/reaction |
P(10μM) | 0.2μl/reaction | 0.2μl/reaction |
H2O | 4μl/reaction | 4μl//reaction |
表19:SMN1单重体系7-12和RPP30单重体系对PUC57-RPP30-SMN1 DNA样本的扩增结果
(3)单重体系7-12对梯度稀释的PUC57-RPP30-SMN1和PUC57-RPP30-SMN2质粒扩增的效果。
结果:组合10、11、12对SMN1模板有好的扩增效率,且对SMN2模板无非特异的扩增。
表20:单重体系7-12对梯度稀释的PUC57-RPP30-SMN1质粒扩增的CT值列表
表21:单重体系7-12对PUC57-RPP30-SMN2质粒的扩增的CT值列表
组合7 | 组合8 | 组合9 | 组合10 | 组合11 | 组合12 | |
CtSMN1 | CtSMN1 | CtSMN1 | CtSMN1 | CtSMN1 | CtSMN1 | |
10^7 | 15.66 | 16.96 | 17.77 | 35.75 | NaN | NaN |
10^6 | 18.94 | 20.44 | 21.65 | 37.92 | NaN | NaN |
10^5 | 22.39 | 23.89 | 24.89 | NaN | NaN | NaN |
10^4 | 25.89 | 27.39 | 28.35 | NaN | NaN | NaN |
10^3 | 29.41 | 30.98 | 31.75 | NaN | NaN | NaN |
10^2 | 32.87 | 34.38 | 35.36 | NaN | NaN | NaN |
10^1 | 36.49 | 37.90 | 38.90 | NaN | NaN | NaN |
Eff% | 93.9% | 93.3% | 93.5% | / | / | / |
R2 | 09999 | 0.9999 | 0.9999 | / | / | / |
步骤4:SMN1/RPP30二重扩增体系的优化
根据SMN1单重体系的扩增结果,选用5个组合的SMN1引物、探针建立二重扩增体系,如表22所示,反应体系的组成如表23所示。
结果:通过对阴、阳性质粒模板的扩增(表24、25),以及对干血斑DNA样本的扩增(表26),组合12的二重体系有最佳的扩增效率和扩增特异性。
表22:SMN1/RPP30二重荧光体系的5个引物探针组合
表23:SMN1/RPP30二重体系反应液的配方
组分 | SMN/RPP30反应体系 |
2xTaqman Fast Advanced Master Mix | 10μl/reaction |
SMN1-F(10μM) | 0.4μl/reaction |
SMN1-R(10μM) | 0.4μl/reaction |
SMN1-P(10μM) | 0.2μl/reaction |
RPP3--F(10μM) | 0.2μl/reaction |
RPP3--R(10μM) | 0.2μl/reaction |
RPP3--R(10μM) | 0.1μl/reaction |
H2O | 3.5μl/reaction |
表24:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30-SMN1的扩增结果
表25:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30-SMN2质粒的扩增结果
表26:SMN1/RPP30二重体系对(42ng/反应)干血斑DNA样本(每基因组SMN1:0拷贝,SMN2:3拷贝)的检测结果
SMN1/RPP30二重体系 | 组合2 | 组合8 | 组合10 | 组合11 | 组合12 |
CtSMN1 | NaN | 25.45 | 30.40 | 36.50 | NaN |
CtRPP30 | 25.50 | 25.40 | 25.48 | 25.58 | 25.35 |
SMN1拷贝数/reaction | / | 13081 | 474 | 9 | / |
RPP30拷贝/reaction | 12651 | 13797 | 13331 | 11766 | 13984 |
SMN1检测特异性 | 高 | 低 | 低 | 低 | 高 |
步骤6:在组合12的基础上对SMN1探针进一步筛选,比较了4个不同SMN1探针序列(SMN1 P2/3/4/5)的二重体系(表27)对扩增效果的影响。
选择扩增特异性强(对PUC57-RPP30-SMN2质粒模板无SMN1扩增信号),且能较好地区分不同比例的PUC57-RPP30和PUC57-SMN1混合质粒模板(表28)的SMN1引物探针组合。
结果:比较四条探针在二重体系中对不同比例PUC57-RPP30/PUC57-SMN1混合质粒模板,以及PUC57-RPP30-SMN2模板的扩增效果(表29、表30、表31、表32、表33、表34),结果表明二重体系组合15有最佳的扩增效果(扩增灵敏度&特异性)。
表27:二重体系5-8的引物探针组合
二重体系 | 组合12 | 组合13 | 组合14 | 组合15 |
SMN1-F | SMN1-F8 | SMN1-F8 | SMN1-F8 | SMN1-F8 |
SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 | SMN1-R2 |
SMN1-P | SMN1-P2 | SMN1-P3 | SMN1-P4 | SMN1-P5 |
RPP30-F | RPP30-F | RPP30-F | RPP30-F | RPP30-F |
RPP30-R | RPP30-R | RPP30-R | RPP30-R | RPP30-R |
RPP30-P | RPP30-P | RPP30-P | RPP30-P | RPP30-P |
二重体系对PUC57-RPP30和PUC57-SMN1不同比例的混合质粒模板的扩增:将PUC57-RPP30质粒与PUC57-SMN1质粒以不同比例混合,得到RPP30:SMN1比例为1∶0、1∶1、1∶2、2∶3的质粒模板。
表28:不同比例混合的PUC57-RPP30/PUC57-SMN1的质粒模板的制备
表29:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30/PUC57-SMN1(1∶0)混合质粒的扩增结果
表30:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30/PUC57-SMN1(1:1)混合质粒的扩增结果
表31:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30/PUC57-SMN1(2:1)混合质粒的扩增结果
表32:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30/PUC57-SMN1(1:2)混合质粒的扩增结果
表33:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30/PUC57-SMN1(2:3)混合质粒的扩增结果
表34:SMN1/RPP30二重体系对PUC57-RPP30-SMN2质粒的扩增结果
实施例3:二重体系15(组合15)的扩增效率和各荧光通道线性范围的研究
步骤1:考察退火温度对二重体系扩增效率的影响
实验设计:对已知拷贝数的质粒模板进行10倍梯度稀释,考察在不同退火温度下的二重体系扩增效率。
结果:对梯度稀释的质粒模板在二重体系15中进行qPCR扩增实验,体系在60℃退火温度时有好的扩增效率(表35)。
表35:二重体系15在不同退火温度下对质粒模板PUC57-RPP30-SMN1的扩增效果
步骤2:考察二重体系15中引物、探针的浓度组合对扩增效率的影响。
实验设计:考察了4个不同引物探针浓度组合的二重体系(表36)对梯度稀释质粒模板的扩增效率。
结果:二重体系中的引物探针在浓度组合3的反应体系中有最佳的扩增效果(表37),后续检测采用该最佳的浓度组合3。
表36:4个不同浓度组合的二重体系
表37:二重体系15的不同引物探针浓度组合对梯度稀释的质粒模板的扩增效果
步骤3:利用拷贝数已知的临床DNA样本测试RPP30(VIC通道)的线性范围
对RPP30拷贝数已知的干血斑基因组DNA 2倍梯度稀释,方法如表38所示。
表38
表39:用梯度稀释的DNA样本测试二重体系中VIC通道的线性范围
步骤4:利用SMN1拷贝数已知的临床DNA样本测试SMN1(CY5通道)的线性范围
表40:对已知SMN1拷贝数的干血斑基因组DNA进行梯度稀释
表41:用梯度稀释的干血斑DNA样本测试二重体系中CY5通道的线性范围
实施例4:二重体系对临床样本SMA阳性判断值确定的研究
步骤1:对临床样本的检测
用SMA二重检测体系(荧光PCR法)对已经由二代测序确认突变情况的样本28例(其中包括SMA阳性样本7例,阴性样本21例)进行检测。通过ROC曲线对SMA Ct值和内参RPP30Ct值的差值ΔCt进行分析,以确定二重检测体系对SMN1基因的阳性判断值。检测结果见表43,ROC曲线见图1。
结果表明:1)ROC曲线下的面积为1.0(表44),表明试剂的诊断准确度很好;2)最好的诊断临界值为ΔCt=8.50,此时,灵敏度(Sensitivity)为1.0,即100%;特异度为1.0,即100%,两者相加值最高(表45)。暂拟定ΔCt≥8.0为阳性判断值,检测结果的解释如下表(表42)。
表42:SMA的判定标准
表43:28例临床样本检测结果
步骤2:ROC曲线制作
见图1:ROC曲线。
表44:曲线下的面积
表45:曲线的坐标
步骤3:SMA阳性判断值的验证
根据上述拟定的阳性判断值判定方法,检测20例已经二代测序确认相关基因突变情况样本,结果表明,本试剂盒检测结果与二代测序结论一致,说明试剂盒设置的阳性判断方法合理。
验证结果见表46。
表46
样本编号 | 二代测序结果 | 试剂盒检测结果 | CtCY5 | CtVIC | ΔCt(CtCY5-CtVIC) |
29 | SMN1:0拷贝 | 阳性 | NaN | 29.85 | - |
30 | SMN1:0拷贝 | 阳性 | NaN | 29.15 | - |
31 | SMN1:0拷贝 | 阳性 | NaN | 29.10 | - |
32 | SMN1:0拷贝 | 阳性 | NaN | 29.20 | - |
33 | SMN1:0拷贝 | 阳性 | NaN | 29.90 | - |
34 | SMN1:1拷贝 | 阴性 | 30.96 | 29.86 | 1.1 |
35 | SMN1:1拷贝 | 阴性 | 30.19 | 29.28 | 0.99 |
36 | SMN1:1拷贝 | 阴性 | 30.23 | 29.22 | 1.01 |
37 | SMN1:1拷贝 | 阴性 | 30.59 | 29.69 | 0.9 |
38 | SMN1:1拷贝 | 阴性 | 30.52 | 29.25 | 1.27 |
39 | SMN1:2拷贝 | 阴性 | 29.78 | 29.62 | 0.16 |
40 | SMN1:2拷贝 | 阴性 | 30.08 | 29.90 | 0.18 |
41 | SMN1:2拷贝 | 阴性 | 29.74 | 29.83 | -0.09 |
42 | SMN1:2拷贝 | 阴性 | 29.97 | 29.89 | 0.08 |
43 | SMN1:2拷贝 | 阴性 | 30.03 | 29.92 | 0.11 |
44 | SMN1:3拷贝 | 阴性 | 28.96 | 29.61 | -0.65 |
45 | SMN1:3拷贝 | 阴性 | 28.72 | 29.34 | -0.62 |
46 | SMN1:3拷贝 | 阴性 | 28.38 | 29.14 | -0.66 |
47 | SMN1:3拷贝 | 阴性 | 28.30 | 29.95 | -0.65 |
48 | SMN1:3拷贝 | 阴性 | 29.25 | 29.85 | -0.60 |
实施例5:二重荧光定量体系SMN1拷贝数检出限的研究
按照本申请如下S1-S5操作步骤,对二重荧光定量体系进行SMN1检出限的研究。
S1:干血斑核酸提取。具体为:使用天根的干血斑核酸提取试剂盒(磁珠法,DP344)进行核酸提取,取1-2片直径3mm的干血斑样本加入1.5mL离心管,向离心管中加入400μL裂解液和15μL磁珠。将离心管在恒温金属浴上900rpm,75℃混合45min。用移液器转移上清至新离心管中,加入400μL核酸结合液,10μL磁珠,常温混合10min,用磁力架富集磁珠,弃上清。用去蛋白液PD洗涤磁珠两次,每次加入900μLPD,震荡2min,将离心管在磁力架上静置1min,除去上清。用漂洗液PWB洗涤磁珠两次,每次加入900μLPWB,震荡2min,将离心管在磁力架上静置1min,除去上清。室温晾干磁珠5min,加入50μL洗脱液,75℃孵育10min,将离心管在磁力架上静置1min,吸取上清至新的1.5mL离心管,即为所得DNA,-20℃冷冻保存。
S2:反应液配置。具体为:根据待测标本数量n(需包含阴性对照、阳性对照)分装PCR反应液,按照15μl/管分装至PCR反应管/板中。使用的酶预混液为2×Taqman FastAdvanced Master Mix(Thermofisher,Cat.#4444557),使用的引物探针为在上海生工生物自主合成的序列,PCR反应液的配制如表47,PCR反应液配制用到的引物、探针序列见表48:
表47:PCR反应液的配制
原料 | 24人份试剂盒 |
2×Taqman Fast Advanced Master Mix | 250μl |
RPP30-F(100μM) | 5μl |
RPP30-F(100μM) | 5μl |
RPP30-F(100μM) | 2.5μl |
SMN1-F(100μM) | 10μl |
SMN1-R(100μM) | 10μl |
SMN1-P(100μM) | 5μl |
H2O | 212.5μl |
表48:引物探针核酸标准序列表
S3:加样。具体为:将待测样本提取的核酸、阳性质控品(PUC57-RPP30-SMN2)提取的核酸、阴性质控品(PUC57-RPP30-SMN1)分别加入PCR反应液中,盖紧管盖或封好膜,瞬时离心数秒使液体集中至管底部,转入核酸扩增区。更优选地,单重反应总体系配制如表49:
表49
PCR反应液用量 | 模板用量 | 总体系 |
15μl | 5μl | 20μl |
表50、质控标准
S4:qPCR扩增。所述步骤S4具体为:①将PCR反应管/板置入定量PCR仪的样品槽,按对应名称设置阳性对照、阴性对照和未知样本,并设置样本名称、检测靶标名称;②荧光检测通道选择:选择选择HEX/VIC通道检测内参;淬灭基团选择“MGB”;选择CY5通道检测SMN1;淬灭基团选择“none”;参比染料Passive Reference选择“ROX”;③反应程序设置;④选择反应体系为20μL;⑤设置完毕,保存文件,运行反应程序。使用的定量PCR仪为ABI7500荧光定量PCR仪,反应程序如表51所示:
表51
S5:数据分析。具体为:①结果分析条件设定,调整ABI7500基线(选择自动设置)、阈值线将VIC、CY5二荧光通道手动设置相同的阈值:0.1-0.12;②质控品判定;③检测结果的判断。
表52:SMA结果判断表
具体方案为:
通过标准曲线法定值质粒样本(PUC57-RPP30-SMN1),用1×TE缓冲液稀释质粒DNA至170拷贝/μL、85拷贝/μL、43拷贝/μL、21拷贝/μL、11拷贝/μL、5拷贝/μL、2.5拷贝/μL、1拷贝/μL,取5μL不同拷贝数的质粒模板,使用质检合格的二重荧光定量检测试剂盒(荧光PCR法)检测,初步估计最低检测限(≥95%检出率)的范围(表53)。取低拷贝数的质粒模板进行20次重复检测,计算20次检测结果的检出率。当各浓度20次检测结果中检出率为≥95%(待测荧光通道有检测信号,Ct值≤35.0,且Ct值CV≤5%)时,将符合该条件的最低浓度作为检测限;如果均符合条件,则继续向下稀释并检测至符合该条件的最低浓度作为检测限。在实施此项评估工作时,由一组操作者使用相同的模板及相同批号的试剂,在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行检测。将SMN1的检测限设定为Ct值≤35.0原因在于:在此范围内,反应管SMN1的拷贝数与SMN1的Ct值有良好的线性关系。
结果表明,对浓度低至13拷贝/反应的质粒模板在二重体系中进行检测,对PUC5-RPP30-SMN1质粒模板的估计检测限为52拷贝/反应管,检测结果见表54。
进一步使用纯化的干血斑核酸样本作为模板,在二重检测体系中对SMN1(CY5)进行检出限研究。进行通过利用已知拷贝数的质粒和标准曲线法定值SMA阴性干血斑DNA样本(RPP30:2拷贝/基因组;SMN1:1拷贝/基因组;SMN2:2拷贝/基因组)中的SMN1和RPP30拷贝数。利用TE缓冲液将该核酸样本稀释至检测限附近(表55),并取5μLDNA样本用作模板与二重体系混合,在ABI7500上检测,不同拷贝数的DNA模板对应的Ct值如表56所示。计算对特定模板20次检测结果的检出率。当对样本20次检测结果的检出率为≥95%(待测荧光通道有检测信号,SMN1 Ct值≤35.0,且Ct值CV≤5%)时,将符合该条件的最低浓度作为检测限。如果均符合条件,则继续向下稀释并检测至符合该条件的最低浓度作为检测限。在实施此项评估工作时,由一组操作者使用相同的模板及相同批号的试剂,在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行检测。将SMN1的检测限设定为Ct值≤35.0原因在于:在此范围内,反应管SMN1的拷贝数与SMN1的Ct值有良好的线性关系。结果表明,干血斑DNA样本SMN1的检出限为51拷贝/反应(0.31ng gDNA/反应),检测结果见表57。
步骤1:利用质粒模板在二重体系中进行最低检测限的研究
将拷贝数已知的质粒模板PUC57-RPP30-SMN1进行2倍的梯度稀释至拷贝数(/5μL)<10,并取5μL用作模板与二重体系混合,在ABI7500上检测,不同拷贝数的质粒模板对应的Ct值如表所示。
取5μL 21拷贝/μL,11拷贝/μL,5拷贝/μL,2.5拷贝/μL的质粒DNA作为模板,在二重体系中分别进行20次的重复检测,选取检出率≥95%的最低浓度的模板作为最低检测限,检测结果如表所示。
考察标准:95%的待测样本CY5荧光通道有检测信号,SMN1 Ct值≤35.0,且Ct值CV≤5%。
表53:2倍梯度稀释的质粒DNA在二重体系中的Ct值
质粒模板(拷贝数/反应) | CTRPP30(VIC通道) | CTSMN1(CY5通道) |
840 | 28.85 | 29.05 |
420 | 29.88 | 30.01 |
210 | 30.99 | 31.15 |
105 | 32.07 | 32.20 |
52 | 33.11 | 33.23 |
26 | 34.15 | 34.35 |
13 | 34.97 | 35.50 |
7 | 36.26 | 37.45 |
表54:二重体系对质粒模板PUC57-RPP30-SMN1的最低检测限实验结果
步骤2:二重体系对纯化的干血斑DNA样本进行SMN1检出限的研究
将已知浓度、且SMN1为单拷贝的基因组DNA进行2倍的梯度稀释至SMN1拷贝数(/5μL)<50拷贝(表55),并取5μLDNA样本用作模板与二重体系混合,在ABI7500上检测,不同拷贝数的DNA模板对应的Ct值如表56所示。
取5μL SMN1拷贝数为40拷贝/μL,20拷贝/μL,10拷贝/μL,5拷贝/μL的基因组DNA作为模板,在二重体系中分别进行20次的重复检测,选取检出率≥95%的最低浓度的模板作为最低检测限。
考察标准:95%的待测样本CY5荧光通道有检测信号,SMN1 Ct值≤35.0,且SMN1Ct值CV≤5%
检测结果如表57、表58所示,干血斑DNA样本SMN1的检出限为51拷贝/反应(0.31nggDNA/反应)。
表55:干血斑DNA样本浓度、RPP30&SMN1拷贝数及梯度稀释方法
表56:梯度稀释的干血斑DNA样本在二重体系中检测的Ct值
样本 | CtRPP30(VIC通道) | CtSMN1(CY5通道) | ΔCtSMN1(=CtCY5-CtVIC) |
浓度1(19.8) | 26.59 | 27.64 | 1.05 |
浓度2(9.9) | 27.75 | 28.79 | 1.04 |
浓度3(5.0) | 28.75 | 29.84 | 1.09 |
浓度4(2.5) | 29.87 | 30.93 | 1.06 |
浓度5(1.25) | 30.78 | 32.05 | 1.27 |
浓度6(0.62) | 31.88 | 33.14 | 1.26 |
浓度7(0.31) | 33.06 | 34.35 | 1.29 |
浓度8(0.16) | 33.94 | 36.98 | 3.04 |
表57:干血斑DNA样本SMN1最低检测限检测结果
表58:干血斑DNA样本SMN1最低检测限检测结果
实施例6:分析精密度的研究
具体方案为:由同1组操作者(P1),使用同批号的试剂,每天在同一台仪器上(A)分别检测同样的SMA阴性样本(中、低浓度)和SMA阳性样本(中、低浓度),连续进行为期10天的检测,每次重复检测10次。
可接受标准:阴性样本的重复10天的结果应均为阴性;从每次检测同一样本的10个Ct值计算出检测精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合精密度要求;阳性样本的重复10天的结果应均为阳性,从每次检测同一样本的内参基因Ct值计算出批内精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合批内精密度要求。
结果表明,对中、低浓度的SMA阴性样本10天连续检测的结果,阴性符合率均为100%(表59),Ct值的变异系数CV≤5%;对于中、低浓度的SMA阳性样本,10天连续检测的结果,阳性符合率为100%,内参RPP30的变异系数CV≤5%(表60)。说明二重检测试剂有良好的精密性。
表59:分析精密度-SMA阴性符合率统计结果
表60:分析精密度-SMA阳性符合率统计结果
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合,为使描述简洁,未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1.SMN1基因的检测引物对,其特征在于,所述检测引物对的扩增产物是由SEQ IDNo.14和SEQ ID No.16所示的引物对作为引物扩增得到的SMN1基因的片段。
2.根据权利要求1所述的SMN1基因的检测引物对,其特征在于,所述检测引物对具有SEQ ID No.14所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物。
3.根据权利要求2所述的SMN1基因的检测引物对,其特征在于,所述上游引物的第15和23位碱基经LNA修饰,所述下游引物的第13位碱基经LNA修饰。
4.SMN1基因的检测探针,其特征在于,所述检测探针能够特异性识别权利要求1至3中定义的片段上的SMN1基因SNP位点。
5.根据权利要求4所述的SMN1基因的检测探针,其特征在于,所述检测探针如SEQ IDNo.21所示。
6.根据权利要求5所述的SMN1基因的检测探针,其特征在于,所述检测探针的第12和14位碱基经LNA修饰。
7.权利要求1至3任一项所述的检测引物对或/和权利要求4至6任一项所述的检测探针在制备脊髓性肌萎缩症检测试剂盒中的应用。
8.检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括权利要求1至3任一项所述的检测引物对或/和权利要求4至6任一项所述的检测探针,以及检测内参基因的内参引物对及内参探针。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒,其特征在于,所述内参基因包括RPP30基因。
10.根据权利要求8或者9所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测探针和所述内参探针各自独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团,且所述检测探针和所述内参探针标记的荧光报告基团不同。
11.基于非诊断目的的SMN1基因的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:
采用权利要求1至3任一项所述的检测引物对、权利要求4至6任一项所述的检测探针或者权利要求8至10任一项所述的检测试剂盒对待测核酸样本进行检测,根据检测结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常。
12.根据权利要求11所述的基于非诊断目的的SMN1基因的检测方法,其特征在于,根据检测结果判断所述待测核酸样本中SMN1基因是否异常,包括:
将SMN1基因、内参基因对应的荧光通道设置相同的阈值,并将阈值设置在0.1-0.12范围内;
将SMN1基因和内参基因对应的Ct值分别记作Ct检测和Ct内参,计算ΔCt=|Ct检测-Ct内参|,
ΔCt满足如下(1)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因正常,
ΔCt满足如下(2)所示的条件,则判断所述待测核酸样本中SMN1基因异常,
ΔCt满足如下(3)所示的条件,则判断所述待测核酸样本浓度过低无法判断;
(1)Ct内参≤30.0,ΔCt≤8.0;
(2)Ct内参≤30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参≤30.0,Ct值显示“undetermined”;或者,Ct内参≤30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线;
(3)Ct内参>30.0,ΔCt>8.0;或者,Ct内参>30.0,ΔCt≤8.0;或者,Ct内参>30.0,Ct值显示“undetermined”;或者,Ct内参>30.0,虽有显示Ct值,但无明显的扩增曲线。
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