CN114480615B - 一种用于检测hla-b*5101等位基因的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测HLA‑B*5101等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针,包含三对根据HLA‑B*5101特异性序列设计的引物及相应三条探针，还包含一对用于筛除HLA‑B*5101假阳性的引物及相应一条探针，还包含一对内对照引物及相应一条探针。本发明具有如下技术效果：通过三个反应管确定实验样本HLA‑B*5101基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA‑B*5101基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA‑B*5101基因的假阴性结果。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测HLA-B*5101等位基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(TumourNecrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。
白塞病(Behcet’s thsease，BD)是一种病因未明的多系统受累的慢性炎性疾病，现多倾向为一种自身免疫性疾病，即BD患者首先具有一定的遗传易感性，在病原体感染后继发机体免疫功能失调而引发本病。许多研究认为BD与HLA-B51抗原间存在极强的相关性，这些结果提示，BD患者存在着某种易感基因，这种易感基因可能就是HLA-B51，并可能是BD易感的遗传标志。HLA-B51与BD具有强相关性提示，HLA-B51基因特别是等位基因HLA-B*5101是BD的一种标志，但尚不能证明HLA-B*5101本身直接地导致了BD。基于以上资料，推测HLA-B51分子可能触发了BD的发生，因为某些引起BD的外源性因子的抗原与HLA-B51抗原之间具有高度的亲和性。由此可见，HLA-B*5101的检测在白塞病的诊断中有着重要意义。
由此可见，快速而准确地检测HLA*B5101等位基因对临床诊断、疾病鉴别及医学研究具有重要意义。目前国内市场上常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。PCR-SSOP即多聚酶链反应寡聚核苷酸探针杂交，先采用位点特异性引物对HLA-B位点进行扩增，扩增产物包括HLA-B位点的所有等位基因序列，再根据碱基互补原则，将PCR产物经化学变性解链后，单链与固化在2条尼龙膜上的序列特异寡核苷酸探针在特定条件下杂交，经洗膜，加入标记有碱性磷酸盐的抗生物蛋白链菌素与生物素及底物反应，对扩增片段进行分析鉴定。SSOP反向杂交法操作繁琐，耗时长，需严格控制实验条件，否则会导致错配，影响结果准确性。荧光定量PCR的基本原理是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时检测。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA-B*5101特异性引物及相应探针，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。
中国专利CN 105177152 B，名称为“检测HLA-B*51等位基因的方法和引物”，该试剂盒公开了检测HLA-B*51等位基因的方法和引物，所述引物包括扩增覆盖HLA-B*51等位基因序列的正、反向引物、内参引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述测序引物可用于快速准确地检测HLA-B*51等位基因。在方法学角度，Sanger测序法操作相对繁琐，耗时长，需PCR扩增后再进行一代测序分析DNA序列，整个流程需要1～2天；另外测序仪价格高，且未大量普及，仪器操作和维护复杂。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测HLA-B*5101等位基因的方法和试剂盒。
发明人设计了三类错配引物——弱错配引物、中错配引物和强错配引物。我们首先通过设计弱错配引物提高检测结果的特异性，即在正常引物5’端5个碱基以内引入一个错配碱基，若检测结果完全正确，则引物可用；若仍存在假阳，则使用中错配引物，即在引物中间部分引入一个错配碱基；若假阳严重，则使用强错配引物，在引物3’端5个碱基以内引入一个错配碱基，该方法成本低，准确性好，具有广阔的应用前景。
本发明的第一个目的是提供用于检测HLA-B*5101等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，包含三对根据HLA-B*5101特异性序列设计的引物及相应三条探针，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物1 | 5’-GCCAGGGTCTCACACTTGG-3’ |
| 引物2 | 5’-CGTTCAGGGCGATGTAATCT-3’ |
| 探针1 | 5’-TGCGACGTGGGGCCGGAC-3’ |
| 引物3 | 5’-GGACCGGAACACACAGATCTT-3’ |
| 引物4 | 5’-GGTTGTAGTAGCGGAGCGC-3’ |
| 探针2 | 5’-TCCGCAGGTTCTCTCGGTAAGTCTGT-3’ |
| 引物5 | 5’-GCCCTGAACGAGGACCTGA-3’ |
| 引物6 | 5’-CCTTCCCGTTCTCCAGGTG-3’ |
| 探针3 | 5’-CTCCACGCACAGGCCCTCCA-3’ |
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA-B*5101假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物7 | 5’-GTACGCCTACGACGGCAAA-3’ |
| 引物8 | 5’-CCCTCCAGGTAGGCTCTGTC-3’ |
| 探针4 | 5'-CACACGGGCCGCCTCCCA-3' |
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物9 | 5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’ |
| 引物10 | 5’-ACACATGGAAGACCACA-3’ |
| 探针5 | 5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3' |
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。
本发明的第二个目的是提供上述PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-B*5101等位基因的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
进一步地，所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。
进一步地，所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
本发明具有如下技术效果：
本发明通过三个反应管确定实验样本HLA-B*5101基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA-B*5101基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA-B*5101基因的假阴性结果。
附图说明
图1为样本检测示意图。
图2-1a为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 1VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-1b为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 1FAM(检测5101的报告荧光)的扩增曲线。
图2-2a为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 2VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-2b为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 2FAM(检测5101的报告荧光)的扩增曲线。
图2-3a为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 3VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-3b为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 3FAM(检测5101的报告荧光)的扩增曲线。
图2-4a为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 4VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-4b为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 4FAM(检测5101的报告荧光)的扩增曲线。
图2-5a为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 5VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-5b为HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 5FAM(检测5101的报告荧光)的扩增曲线。
图3-1为Sample 1测序图。
图3-2为Sample 2测序图。
图3-3为Sample 3测序图。
图3-4为Sample 4测序图。
图3-5为Sample 5测序图。
具体实施方式
实施例1
1.原料和设备：
1.1试剂盒内含物：
1)荧光定量PCR反应8连管，每条8连管可进行2个样本检测，每个检测需4管(MIX1～MIX4)：
8连管上按数字1～4和5～8依次为MIX1,MIX2,MIX3,MIX4。
2)4对特异性上下游扩增引物及相应探针，按特定排列干燥于PCR反应8连管底部，每个PCR反应8连管底部还添加有一对内对照引物及相应探针；所有引物和探针均干燥于PCR反应管底部。
3对特异性扩增引物及相应探针在PCR反应8连管中的分布如下：
每个反应管中还添加一对内对照引物及相应探针，内对照引物序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物9 | 5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’ |
| 引物10 | 5’-ACACATGGAAGACCACA-3’ |
| 探针5 | 5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3' |
3)PCR反应试剂
DNA聚合酶：为热启动Taq聚合酶；
PCR反应混合液：包括0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
1.2样本的来源
1)血液样本采集
血液样本可以用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。
2)核酸样本萃取
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
3)核酸样本定量
萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于10-40ng/μl。
4)核酸样本质量规范
核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.0之间。
1.3所需实验设备
荧光定量PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8连管水平头)。
2.基因分型过程
2.1反应体系的配置：以一次进行4个样本的检测为例，反应体系如表1所示：
表1：PCR反应体系
| 组分名称 | 加量μl/管 | 1人份(5孔) |
| PCR反应混合液 | 3 | 15 |
| 灭菌水 | 12.8 | 64 |
| Taq核酸聚合酶 | 0.2 | 1 |
| 核酸样本 | 2 | 10 |
| 总体积 | 18 | 90 |
每个PCR反应8连管中预先冻存有0.6μl 10μM内对照引物和0.4μl 10μM内对照探针，4对特异性引物及相应探针在PCR反应8连管中的分布和用量如下：
取18μl的上述混合液至各反应管中；将反应管盖上盖子，短暂离心后，放入荧光定量PCR仪中。
2.2PCR反应程序：如表2所示：
表2：PCR反应程序
请依各型号的自动循环控温仪操作手册进行程序设定，荧光信号采集点设定在65℃；荧光信号采集波长设定FAM(520nm)和VIC(560nm)，其中VIC为内对照基因报告荧光。
2.3实验结果分析：在上述PCR反应体系中，观察样本中FAM(检测5101的报告荧光)和VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线及Ct值。四管反应的内对照(VIC)Ct值均≤35，提示聚合酶链式反应正常进行；样本具备如下条件，且扩增曲线呈典型S型曲线，判为阳性：
即待测样本中，MIX1、MIX2、MIX3的特异性荧光信号FAM都形成对数扩增S型曲线Ct值均＜35，MIX4无扩增Ct值≥35，则该样本判为HLA-B*5101等位基因阳性。
图2-1a—图2-5b为5个HLA-B*5101等位基因阳性样本——Sample 1、Sample2、Sample 3、Sample 4和Sample 5使用本方法和试剂盒检测图。图中，各样本三管反应的内对照(VIC)Ct值均＜35，提示聚合酶链式反应正常进行；MIX1、MIX2、MIX3的FAM扩增曲线呈典型S型曲线，Ct值＜35；MIX4的FAM无扩增，Ct值≥35。样本判为HLA-B*5101等位基因阳性。
图3-1—图3-5为这5个HLA-B*5101等位基因阳性样本测序图。测序结果显示样本均为HLA-B*5101等位基因阳性。本发明的试剂盒检测结果与测序结果一致。
结论：整个实验流程仅需约1个小时，实验结果准确，通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HLA-B*5101等位基因阴阳性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 泰兴市人民医院
<120> 一种用于检测HLA-B*5101等位基因的引物组及试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccagggtct cacacttgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttcagggc gatgtaatct 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgacgtgg ggccggac 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaccggaac acacagatct t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttgtagta gcggagcgc 19
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccgcaggtt ctctcggtaa gtctgt 26
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccctgaacg aggacctga 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccttcccgtt ctccaggtg 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctccacgcac aggccctcca 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtacgcctac gacggcaaa 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccctccaggt aggctctgtc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacacgggcc gcctccca 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catctggaca tgcttgct 18
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acacatggaa gaccaca 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgttaaagct ctgaataa 18
Claims (6)
1.一种用于检测HLA-B*5101等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含三对根据HLA-B*5101特异性序列设计的引物及相应三条探针，序列如下：
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA-B*5101假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：
。
2.根据权利要求1所述的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。
3.如权利要求1或2所述PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-B*5101等位基因的试剂盒中的应用。
4.含有如权利要求1或2所述用于检测HLA-B*5101等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸dNTP、1.8mM氯化镁MgCl2、60.3mM氯化钾KCl，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、甘油0.6％v/v，二甲基亚砜DMSO 5％v/v和甲酰胺2.5％v/v，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
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