CN104232781A - 一种检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合：上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’探针probe：5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’；同时使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因与内参基因加入一管中进行双通道荧光定量PCR反应，通过扩增曲线分析结果。本发明具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、分辨率高等特点，适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA-B*5801等位基因的检测。

Description

一种检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因诊断领域，具体涉及一种检测HLA‐B*5801等位基因的方法。

背景技术

别嘌醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体，是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂，可阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成的药物。临床主要用于高尿酸血症和痛风的治疗。然而，随着药品的大量应用，其不良反应也日益凸显，是最易引起严重药疹的药物之一。别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害，最常见的是剥脱性皮炎，比较严重的有Stevens‐Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、系统性疾病(嗜酸性粒细胞增多症、脉管炎、以及主要器官的疾病)。有文献报道别嘌呤醇皮肤变态反应致死率达20‐40％。

目前，已有报道别嘌呤醇、卡马西平等多种药物都与HLA上的等位基因密切相关。HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。其中已有大量研究证明别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA‐B*5801密切相关，在服用别嘌呤醇后出现严重不良反应的患者中100％存在，而在未出现不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中，其携带率仅为15％和20％；中国汉族、泰国人中HLA‐B*5801阳性者比白人高(6‐8％vs2％)，发生超敏反应的风险更大。台湾卫生署已更新了别嘌呤醇的药品说明书，添加了别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA‐B*5801的关系，并建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA‐B*5801基因型检测，结果阳性患者应禁止使用该药物。此外，美国临床药理学联盟也提出了类似的建议。临床医师推荐在服用别嘌呤醇之前进行HLA‐B*5801等位基因检测，以判断是否属高危人群；从而有效降低由别嘌呤醇引起的严重不良反应。同时，美国风湿病协会发布指南建议对具有高风险的别嘌呤醇过敏综合征的亚群体进行HLA‐B*5801检测。因此，研究一种快速PCR法对HLA‐B*5801等位基因进行检测是非常必要的。

目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要包括PCR‐SBT(PCR Sequence‐based Typing,基于测序分型的聚合酶链反应)、PCR‐SSOP(SequenceSpecific Oligonucleotide Probes)法和PCR‐SSP(Sequence‐specificprimers)法。其中，PCR‐SBT直接测序法更是国际上公认的HLA基因分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高，特异性强，样本需求量少等优点。但是，拥有众多优点的同时，此类方法也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得PCR‐SBT法存在着模棱两可的结果等缺点。尤其，操作繁琐，耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要，不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。此外，PCR‐SSOP即序列特异性寡核苷酸探针，首先是对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对产物进行标记，然后针对扩增产物设计系列寡核苷酸探针固定在膜上，最后将产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断实验结果。该技术为传统的分型技术，灵敏度高、特异型较强，且需要样本量少；但是由于其所用的载体大多为膜或微滴定板，对于复杂的HLA等位基因来说，它不具有集成化的优点，而且洗脱条件比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化。PCR‐SSP即序列特异性引物PCR技术，适用于广泛临床监测。其原理是根据已知HLA基因序列设计特异性引物，直接PCR扩增基因组DNA后通过凝胶电泳检测产物，根据产物有无和片段大小来判断HLA基因型。该技术简便、技术条件容易掌握，需要样本量少、对血液条件要求不高，适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势；然而由于PCR‐SSP技术需要进行凝胶电泳实验，因此该技术在操作过程中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果。

针对于传统的HLA检测方法，实时定量PCR法是在普通PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用信号积累检测整个PCR反应的进程，它是将荧光值的积累与PCR产物扩增的过程相结合，最后通过标准曲线或测量指数扩增期的荧光值来进行定量或者定性的方法；实时定量PCR法的优点主要有灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短、高通量、无污染等特点。因此，将实时定量PCR结合ARMS(Amplification refractory mutation system)法应用于HLA等位基因的分型检测是PCR分子诊断技术领域的一项创新。

但是，由于HLA基因家族的的序列多态性，经过一系列的序列比对，发现多个HLA‐B基因与HLA‐B*5801有很高的序列同源性，其中以HLA‐B*570101基因与HLA‐B*5801的基因序列同源性最高，它们之间的序列同源性达到99％，相对于HLA基因家族序列多态性集中的区域，尤其是exon1、exon2、exon3及intron1、intron2序列中，只存在15个特异性碱基。因此，设计一种适宜于荧光定量PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801基因的引物探针组合非常困难。

目前，国内针对HLA‐B*5801的检测技术以PCR‐SSP和荧光PCR这两种方法为主，其中目前可查的荧光PCR法专利及相关试剂盒基本上是采用多个探针、多管同时进行检测的方法，由于这些方法都是多管反应，因此与本发明技术相比，它们普遍具有检测通量较低、操作繁琐、成本高等不足之处。

发明内容

本申请研发出一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801等位基因的引物探针组合；在现已有的实时定量PCR检测HLA分型的基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA‐B*5801等位基因分型的方法，以改善现有技术上所存在的缺陷。此检测方法更易于在临床的推广和应用，从而更加有利于HLA‐B*5801基因型指导下的别嘌呤醇安全用药。

本发明提供的定性HLA‐B*5801基因的TaqMan探针检测方法，首先通过与HLA‐B中3000个其它等位基因序列的对比，进行HLA‐B*5801特异性位点和引物设计区域的确定，它们主要位于HLA‐B等位基因第2和第3外显子，然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计TaqMan探针检测的特异性引物以及探针，值得注意的是探针和引物设计的位置能够排除其它HLA‐B等位基因的结合、识别，尤其是HLA‐B*570101等位基因。采用TaqMan探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

为实现以上发明目的，本发明的技术方案如下。

本发明提出的用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的特异性引物探针组合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’

探针probe：5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

一种检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，主要包括以下环节：

(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；

(5)分析判断待测样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

基于上述方案，本发明还进一步作如下优化设计：

环节(1)中设计内参基因β‐actin引物和探针为：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’

下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’

探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein。

使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM，下游引物Rp250nM‐500nM，HLA‐B*5801特异性探针100nM‐250nM，以及ACTB基因特异性上游引物100nM‐250nM，下游引物100nM‐250nM，探针50nM‐250nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。

本发明的优点主要有：

1、节省耗材和时间、简单易行、高通量

基于本实验设计及PCR反应特点，使得该发明可以很大程度上节省实验时间和耗材，检测过程只需要50min‐1h，操作也简单易行，整个实验可以在2小时内全部完成。采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR‐SBT测序进行方法学对比，50例样本结果完全吻合；与PCR‐SSP进行方法学对比，104例样本结果完全吻合。同时，使用本发明方法，可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测，因此，可完全使用本发明进行HLA‐B*5801等位基因检测，适用于临床分子诊断。

2、结果可靠、灵敏度高

本发明中，只需10ng‐20ng基因组DNA便可进行准确的HLA‐B*5801基因分型检测，相比与传统的PCR‐SSP技术，大大提高了检测的灵敏度。其中，最低检测样本量可达到0.15ng。

3、检测方法灵活、无污染

本发明方法较传统的HLA等位基因分型方法，未涉及多重扩增、重复开盖等二次污染的可能。本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，操作简便、耗时短、安全、无污染。

4、成本低、经济适用

由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术适用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，较经济适用。

附图说明

图1为利用内参基因(Target2)的引物与探针对人基因组DNA实时扩增结果。曲线1为纯合阳性样本(2条DNA链均携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝23.20；曲线2为杂合阳性样本(1条DNA链携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝23.97；曲线3为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝23.45；NTC扩增曲线表明此实验无污染。

图2为利用目的基因(Target1)的引物与探针对人基因组DNA实时荧光定量扩增结果曲线1为纯合阳性样本(2条DNA链均携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝24.63；曲线2为杂合阳性样本(1条DNA链携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝25.42；曲线3为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA‐B*5801等位基因)，Ct＝36.46(>35.0)；NTC扩增曲线表明此实验及引物和探针无污染。

图3为利用FAM通道和HEX/VIC通道进行双通道荧光采集的实时定量扩增结果。

图4和图5为HLA‐B*5801标准阳性样本DNA系列稀释后实时扩增曲线，样本系列稀释倍数分别为1:5，1:25，1:125，1:625；其Ct值分别为26.968，29.372，31.731，34.201。其中图4为目的基因稀释后的实时扩增曲线；图5为目的基因和内参基因整体稀释后实时扩增曲线。

图6为SBT测序结果示意图。

具体实施方式

实施例1 TaqMan探针法检测HLA‐B*5801等位基因

1、DNA样本的提取及稀释

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A_260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H₂O将样本稀释至10ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA‐B*5801的特异性引物，上游引物F：5’‐GGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’，下游引物R：5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’；另外在β‐actin基因上设计内参引物，上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’，下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’。

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHole Quencher‐2；

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和HEX/VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM，下游引物Rp 250nM‐500nM，HLA‐B*5801特异性探针100nM‐250nM，以及ACTB基因特异性上游引物100nM‐250nM，下游引物100nM‐250nM，探针50nM‐250nM,然后加入被测样本基因组DNA约10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA‐B*5801基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。

4、结果分析

内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到曲线，则判断待测样本携带HLA‐B*5801等位基因。本发明中，有荧光扩增曲线达到阈值以上，则代表该目的片段的特异性引物及探针与DNA模板结合，并且引物能够顺利延伸，引物覆盖区域碱基序列与模板序列一致，且探针覆盖范围内碱基也与模板序列一致。

实施例2 HLA—B*5801基因型特异引物灵敏度检测

1、DNA样本的稀释

取HLA‐B*5801标准品DNA作为试验样品，其浓度为10ng/μL。用PCR等级的H₂O 5倍连续稀释样品，即1:5，1:25，1:125，1:625；其DNA浓度分别为：10ng/μL，2ng/μL，0.4ng/μL，0.08ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA‐B*5801的特异性引物，上游引物F：5’‐GGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’，下游引物R：5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’；另外在β‐actin基因上设计内参引物，上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’，下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’，以及配套的荧光探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’。

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHole Quencher‐2；

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM，下游引物Rp 250nM‐500nM，HLA‐B*5801特异性探针100nM‐250nM，以及ACTB基因特异性上游引物100nM‐250nM，下游引物100nM‐250nM，探针50nM‐250nM,然后加入被稀释的标准样品基因组DNA约2μL，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA‐B*5801基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。

4、实验结果

HLA‐B*5801标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图4、图5。由图4、图5可见，标准样品系列稀释倍数1:5(10ng/μL)，1:25(2ng/μL)，1:125(0.4ng/μL)，1:625(0.08ng/μL)的Ct值分别为26.968，29.372，31.731，34.201。本发明由此可检测低至0.15ng DNA左右的样本。

验证实验：50例样本进行SBT测序与HLA‐B*5801基因检测方法比较

从104例布依族样本中随机选取50例样本，将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序，测序结果用峰图和Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1

本发明在前期还准备了已知为HLA‐B*5801等位基因纯合型和杂合型的血样标准品，作为检测体系的阳性对照。此外，标准品的存在，使完成HLA‐B*5801等位基因检测方法建立的同时，进一步提高了待检样本HLA‐B*5801等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。我们利用全基因组扩增技术将标准品样本进行了富集，以便多次使用。

Claims (4)

1.用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的特异性引物探针组合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’

探针probe：5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

2.一种检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，主要包括以下环节：

(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；

(5)分析判断待测样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

3.根据权利要求2所述的检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于，环节(1)中设计内参基因β‐actin引物和探针为：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’

下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’

探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein。

4.根据权利要求3所述的检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM，下游引物Rp 250nM‐500nM，HLA‐B*5801特异性探针100nM‐250nM，以及ACTB基因特异性上游引物Actin‐F 100nM‐250nM，下游引物Actin‐R 100nM‐250nM，探针50nM‐250nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。