CN112522404B - 一种用于检测前列腺癌的多重荧光pcr试剂盒 - Google Patents

一种用于检测前列腺癌的多重荧光pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，包括用于扩增TMPRSS2‑ERG，TMPRSS2‑ETV1和TMPRSS2‑ETV4三种融合基因的引物组以及与三种融合基因分别对应的荧光探针；引物组包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的五条引物；探针组包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的三条荧光探针。使用本发明的试剂盒进行前列腺癌的检测，简单高效，准确性、灵敏度和特异性均较高，成本低廉。

Description

一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒。
背景技术
前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)的患者主要是老年男性，占全球恶性肿瘤发病率第二位、死亡率第六位。随着我国人口老龄化，PCa的发病率正逐年升高，成为威胁我国男性健康的公共问题。前列腺癌最有效的治疗方法是根治术，但PCa早期临床无典型表现，一旦突破包膜就会失去根治手术的机会，其患者生存时间大大下降，因此PCa的早期诊断是提高诊治水平和降低死亡率的关键。
目前直肠指检联合血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)检查是应用最广的前列腺癌早期辅助诊断方法。但是，PSA蛋白升高不仅存在于前列腺癌，也存在于前列腺炎、良性前列腺增生，因此用于前列腺癌检测的特异性不足。例如，PSA值处于4～10ng/ml的灰区病人，穿刺活检阳性率只有约20％，这导致许多不必要的穿刺，也给穿刺病人带来经济负担和巨大精神压力。因此临床上迫切需要更具特异性和敏感性的PCa早期诊断方法。
基因融合是染色体重排导致的两个基因的融合，常见于血液肿瘤和实体瘤中。研究表明，TMPRSS2-ERG是PCa中最常见的基因融合类型，国内前列腺癌的发生率为20～50％。TMPRSS2与其他基因融合产生的TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4发生率约为8％和1％。这三种融合基因是在PCa中高度特异存在的，在血浆、前列腺液和尿液中检测这些融合基因可用来筛查PCa。
目前检测融合基因的方法包括荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR和测序。FISH方法耗时繁琐，而且对人员和技术要求高；测序技术因价格昂贵尚未普及；RT-PCR需要电泳容易发生污染和假阳性。此外，由于癌症的异质性，采用单个标志物进行检测可能存在灵敏度不足的问题。因此有必要开发一种操作容易、检测灵敏度高、价格适中的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、灵敏度高、特异性强的检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供了一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，包括用于扩增TMPRSS2-ERG，TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的引物组以及与三种融合基因分别对应的荧光探针，所述引物组包括TMPRSS2-F1、TMPRSS2-F2、ERG-R、ETV1-R和ETV4-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的上游引物均为TMPRSS2-F1和/或TMPRSS2-F2，下游引物分别为ERG-R、ETV1-R和ETV4-R；所述TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因对应的荧光探针分别为ERG-P、ETV1-P和ETV4-P，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
进一步，所述荧光探针ERG-P、ETV1-P和ETV4-P的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
进一步，荧光探针ERG-P的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ1，荧光探针ETV1-P的5’端标记的荧光报告基团为TXR，3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ2，荧光探针ETV4-P的5’端标记的荧光探针为VIC，3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ1。
进一步，所述试剂盒还包括用于检测内参基因PSA的引物对和荧光探针，所述检测内参基因PSA的引物对为IC-PSA-F和IC-PSA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示，所述检测内参基因PSA的荧光探针为IC-PSA-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
进一步，所述荧光探针IC-PSA-P的5’端标记有荧光报告基团为Cy5，3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ2。
进一步，所述试剂盒还包括多重荧光PCR检测试剂和/或样本提取试剂。
进一步，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照为分别含有TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4的质粒，所述阴性对照为ddH2O。
使用本专利的试剂盒进行前列腺癌的检测，可以同时进行TMPRSS2-ERG，TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的检测，有效区分前列腺癌样本、前列腺增生样本和非癌样本，且简单高效，准确性、灵敏度和特异性均较高，成本低廉。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1检测前列腺癌的多重荧光PCR引物组和探针组
TMPRSS2-ERG，TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4是三种前列腺癌高度特异且常见的融合基因，可以作为检测前列腺癌的标志物组合。对于该标志组组合，发明人设计了可以快速检测该标志物组合的多重荧光PCR引物组和探针组，引物组包括TMPRSS2-F1、TMPRSS2-F2、ERG-R、ETV1-R和ETV4-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的上游引物均为TMPRSS2-F1和/或TMPRSS2-F2，下游引物分别为ERG-R、ETV1-R和ETV4-R，具体序列如下表1所示：
表1检测前列腺癌的多重荧光PCR引物组和探针组
Figure BDA0002828148320000041
Figure BDA0002828148320000051
实施例2用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒
用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒包括实施例1提供的用于检测前列腺癌的多重荧光PCR引物组和探针组。
在一个优选的实施方案中，还包括检测内参基因PSA的引物对和荧光探针，所述检测内参基因PSA的引物对为IC-PSA-F和IC-PSA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示，所述检测内参基因PSA的荧光探针为IC-PSA-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
SEQ ID NO:9cgagaagcattcccaaccc
SEQ ID NO:10tgccgacccagcaagat
SEQ ID NO:11gcccactgcatcaggaacaa
在一个优选的实施方案中，荧光探针IC-PSA-P的5’端标记有荧光报告基团为Cy5，3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ2。
在一个优选的实施方案中，该试剂盒还包括多重荧光PCR检测试剂和/或样本提取试剂。
其中，多重荧光PCR检测试剂包括qPCR Buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶，样本提取试剂为RNA提取试剂。
在一个优选的实施方案中，该试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照为分别含有TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4的质粒，所述阴性对照为ddH2O。
实施例3实施例2中的试剂盒的使用方法
(1)尿液样本的采集及处理：采用传统的前列腺按摩法，从患者的排尿中收集50ml初段尿，于4℃，3000rpm/分钟离心15分钟，收集沉淀并用PBS溶液洗涤3次，转移至1.5ml离心管并加入适量含10％DMSO的保存液，置于-80℃冰箱保存；
(2)总RNA提取及逆转录：采用市售的总RNA提取试剂盒(Omega Total RNA KitII)从沉淀中提取RNA。通过Nanodrop测定RNA的浓度和纯度，然后计算RNA含量，取10μg至2ng总RNA，剩余样品置于-80℃冰箱保存。以提取样品的RNA为模板，使用市售的逆转录试剂盒(Omega M-MLV transcriptase)，将RNA逆转录为cDNA，逆转录总体系为25μl。
(3)多重荧光PCR扩增检测
用三种融合基因的引物组合、内参基因的引物及对应的探针组合，同时扩增PSA，TMPRSS2-ERG，TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4基因。除了待测样本以外，同时扩增一份PSA质粒模板，一份TMPRSS2-ERG质粒模板，一份TMPRSS2-ETV1质粒模板，一份TMPRSS2-ETV4质粒模板，一份以ddH2O为模板。四种质粒作为阳性对照组指示体系是否工作；ddH2O作为阴性对照组以指示该实验是否受到模板污染
在进行多重荧光PCR扩增检测前，先加入5μl的样本cDNA或者质粒、ddH2O，再加入20μl预混液，设定PCR的扩增程序为95℃预变性2-5min，95℃变性20-30sec，65℃-56℃退火30-35sec，72℃延伸15-25sec，其中，第一个循环的退火温度为65℃，然后每经过一个循环，退火温度下降1℃，循环10次；95℃变性20-30sec，56℃退火30-35sec并采集检测荧光信号，72℃延伸15-25sec，循环40次，4℃保存PCR产物；每个通道设置同时采集FAM、VIC、ROX和CY5四种荧光信号。多重荧光PCR反应体系如下表2所示。
表2：多重荧光PCR反应体系
Figure BDA0002828148320000071
(4)结果判读
A、对照结果判断：4种阳性对照质粒都有对应的荧光信号升起，且Ct值不大于25；阴性对照没有任何荧光信号升起，则表明检测体系可用。
B、若对照结果均正常，则质控通过，可进行待检标本结果判断：
1)其中PSA作为内参基因，若PSA的信号晚于25个循环升起，即Ct>25，则认为该样本中前列腺细胞不足；若PSA无信号升起，则此次样品无效，两者均需重新采样并进行检测或对该样本予以排除。
2)若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ERG信号升起的Ct<40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ERG阳性；若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ERG无信号升起或信号升起的Ct>40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ERG阴性。
3)若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ETV1信号升起的Ct<40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ETV1阳性；若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ETV1无信号升起或信号升起的Ct>40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ETV1阴性。
4)若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ETV4信号升起的Ct<40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ETV4阳性；若PSA的信号小于25个循环升起，即Ct<25，且同时TMPRSS2-ETV4无信号升起或信号升起的Ct>40，则判定该待测样本为TMPRSS2-ETV4阴性。
实施例4使用该发明的试剂盒进行前列腺癌检测
本实施例共取得108例待测样本，根据病理穿刺活检结果，其中包括43例确诊前列腺癌患者，15例前列腺增生患者，50例非癌正常人。使用实施例2中的试剂盒以及实施例3中的方法对每个样本进行检测，结果如下表3所示，使用本专利的试剂盒检测前列腺癌的灵敏度为69.7％(30/40)，特异性为96.9％(63/65)，阳性预测值为93.8％(30/32)，阴性预测值为72.4％(63/87)。
表3 108例样本的病理穿刺活检结果与多重荧光PCR检测结果对比
Figure BDA0002828148320000081
Figure BDA0002828148320000091
使用本专利检测阳性的32个样本中，其融合基因的类型如下表4所示，43例穿刺活检阳性样本中检测出TMPRSS2-ERG融合基因阳性24例，灵敏度为55.8％(29/43)，，特异性为96％(24/25)；TMPRSS2-ETV1融合基因阳性5例，灵敏度为11.6％(5/43)，特异性为83.3％(5/6)；TMPRSS2-ETV4融合基因阳性1例，灵敏度为2.3％(1/43)，特异性为100％(1/1)。
表4本专利检测阳性的样本类型
Figure BDA0002828148320000092
使用本专利的试剂盒进行前列腺癌的检测，可以有效区分前列腺癌样本、前列腺增生样本和非癌样本，且该方法简单高效，灵敏度和特异性均较高，成本低廉。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测前列腺癌的多重荧光PCR引物组、探针组和试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggggaggg gaacct 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggggaggg gaacctg 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatgtcggc gttgtagc 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgaatcatg agccagatct ctgt 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgaatggaa atcaggaaca aactg 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcagtggc tggagtgggc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcagtggc tggagtgggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcaggtacc agacagtgat gagcagt 27
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
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cgagaagcat tcccaaccc 19
<210> 10
<211> 17
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tgccgaccca gcaagat 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccactgca tcaggaacaa 20

Claims (6)

1.一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括用于扩增TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的引物组以及与TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因分别对应的荧光探针；
所述引物组包括TMPRSS2-F1、TMPRSS2-F2、ERG-R、ETV1-R和ETV4-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因的上游引物均为TMPRSS2-F1和/或TMPRSS2-F2，下游引物分别为ERG-R、ETV1-R和ETV4-R；
所述与TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4三种融合基因对应的荧光探针分别为ERG-P、ETV1-P和ETV4-P，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示；
还包括用于检测内参基因PSA的引物对和荧光探针，所述检测内参基因PSA的引物对为IC-PSA-F和IC-PSA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述检测内参基因PSA的荧光探针为IC-PSA-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光探针ERG-P、ETV1-P和ETV4-P的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，荧光探针ERG-P的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1，荧光探针ETV1-P的5’端标记的荧光报告基团为TXR，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ2，荧光探针ETV4-P的5’端标记的荧光探针为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光探针IC-PSA-P的5’端标记有荧光报告基团为Cy5，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，还包括多重荧光PCR检测试剂和/或样本提取试剂。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测前列腺癌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照为分别含有TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1和TMPRSS2-ETV4的质粒，所述阴性对照为ddH2O。
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