CN110423797A

CN110423797A - 一种前列腺癌pca3基因双重实时pcr的引物、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN110423797A
Application number: CN201910622955.3A
Authority: CN
Inventors: 李志鹏; 杨海涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明公开了一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物、方法及试剂盒，通过一个双重实时荧光PCR反应体系同时扩增PCA3和PSA基因，实现PCA3基因表达水平的相对定量。通过合理的引物设计，特异性的扩增前列腺癌特有的PCA3基因选择性剪切产物；通过引物筛选、镁离子浓度优化等，使目标基因PCA3和参照基因PSA的扩增效率均接近100％，符合比较Ct值进行准确定量的要求。本试剂盒适用于病理白片标本和尿液标本的PCA3基因定量检测，单管双探针并行检测，具有明显的低价、快速、简便且定量准确的优点，敏感性为66％、特异性为95％，有助于临床上前列腺癌症病人的早期诊断。

Description

一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物、方法及试剂盒。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，患者主要是老年男性，其发病及死亡率大多是在70～80岁，占全球恶性肿瘤发病率第二位、死亡率第六位。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美，但随着国内社会的老龄化而呈现上升趋势。据有关部门预测，到2035年老年人口将达到4亿，将会成为高发的恶性肿瘤之一，前列腺癌诊治水平的提高将越来越重要。

前列腺癌最有效的治疗方法是根治术，但PCa早期临床无典型表现，一旦突破包膜就会失去根治手术的机会，其患者生存时间大大下降，因此PCa的早期诊断是提高诊治水平和降低死亡率的关键。目前直肠指检联合血清PSA(prostate specific antigen，PSA)检查是应用最广的前列腺癌早期诊断方法。但是PSA蛋白是在前列腺特异表达而不是在前列腺癌特异表达，它不能将前列腺癌与前列腺炎、良性前列腺增生进行区分；特别是PSA值处于4～10ng/ml这个灰区的病人，穿刺活检阳性率只有约20％，这导致许多不必要的穿刺，也给穿刺病人带来经济负担和精神压力；即使是PSA小于4ng/ml的病人，也有超过15％的穿刺活检结果为PCa阳性，因此临床上迫切需要更具特异性和敏感性的PCa早期诊断方法。

PCA3基因是一种PCa高度特异的标记物，在前列腺以外的组织不表达，在正常前列腺组织、良性前列腺增生(BPH)细胞中呈低水平表达，而在PCa细胞和转移坏死灶中表达量升高。大约95％的PCa患者存在PCA3基因的过度表达，与PSA相比PCA3可以有效区分炎症和良性增生。美国FDA于2012年正式批准了首个尿液中PCA3定量检测试剂盒(PROGENSA)用于临床诊断，其用于诊断的敏感性和特异性分别约为78％和69％，因此，PCA3定量检测对前列腺癌早期诊断与治疗具有十分重要的意义。但是该试剂盒价格昂贵、需要额外的全转录组扩增，不利于国内的临床推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种前列腺癌PCA3基因荧光定量PCR的引物。

本发明的目的在于提供一种前列腺癌PCA3基因荧光定量PCR方法。

本发明的目的在于提供一种前列腺癌PCA3基因荧光定量PCR的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物，其核苷酸序列如下所示：

PCA3-F2：5'-GTTTTTGCACATTTCCAGCCC-3'，

PCA3-R1：5'-ATTTCTCCCAGGGATCTCTGTG-3'。

一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的探针，其探针的核苷酸序列如下所示：

PCA3-FAM-P：5'-CCATCCACACACACAGGAAGCACGGATGG-3'。

进一步的，所述的探针5'标记的荧光基团为：FAM、VIC、TEXAS RED中的一种，探针的3'标记的淬灭基团为：BQ1、BQ2中的一种。

一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的试剂盒，该试剂盒包括上述所述的引物。

进一步的，该试剂盒还含有上述所述的探针。

进一步的，该试剂盒还含有荧光定量反应预混液、阳性对照和空白对照。

一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的方法，包括以下步骤：

1)提取样品的RNA；

2)以提取样品的RNA为模板，将RNA逆转录为cDNA；

3)用上述所述的PCA3-F2、PCA3-R1、上述所述的探针、PSA内参基因引物PSA-F1、PSA-R1以及PSA内参基因探针PSA-VIC-P进行定量PCR扩增反应获得扩增产物；

4)对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的Ct值，并代入公式2^{[Ct(PSA)-Ct(PCA3)]}×100得到PCA3分数，若PCA3分数若大于31说明PCA3基因上调表达，若PCA3分数若低于31说明PCA3基因下调表达；若PCA3分数若等于31说明PCA3基因正常表达

进一步的，步骤2)中所述逆转录的具体操作为：

配制以下逆转录体系1和体系2：

体系1：

体系2：

将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min，42℃60min，70℃10min。

进一步的，步骤3)中所述的PSA内参基因引物核苷酸序列为：

PSA-F1：5'-GCGAGAAGCATTCCCAACC-3'；

PSA-R1：5'-GTGCCGACCCAGCAAGAT-3'。

进一步的，步骤3)中所述的PSA内参基因探针PSA-VIC-P核苷酸序列为：5'-CGCCCACTGCATCAGGAACAAGGCG-3'。

进一步的，步骤3)中所述的定量PCR扩增反应体系为：

进一步的，步骤3)中的所述的定量PCR扩增反应程序为：93～95℃预变性1～5min，93～95℃变性10～30sec，64℃～55℃退火25～35sec，70～75℃延伸26～34sec，循环9～13次，其中，第一个循环的退火温度为64～66℃，然后每循环一次温度下降0.7～1.2℃；92～94℃18～22sec，52～60℃28～32sec检测荧光信号，70～74℃28～32sec，循环37～43次。

本发明的有益效果是：

本试剂盒的前列腺癌PCA3基因表达定量检测结果可有效区分前列腺癌与非癌组织。单管双探针并行检测，具有快速、简便且定量准确的特点，而且能减少污染和假阳性，能够在临床PCA3基因检测上得到较好的应用，可实现标本无创性检测。

附图说明

图1以PCA3质粒(100拷贝)作为模板，十对引物扩增PCA3基因的荧光定量扩增曲线。

图2以PCA3质粒(10拷贝)作为模板，十对引物扩增PCA3基因的荧光定量扩增曲线图。

图3以PSA质粒(10拷贝)作为模板，四对引物扩增PSA基因的荧光定量扩增曲线图。

图4为Mg²⁺浓度为4mM的双重qPCR体系扩增PCA3基因的扩增曲线，10倍梯度稀释的PCA3质粒(10⁶拷贝到10拷贝)作为模板的扩增曲线。

图5是PCA3基因的扩增曲线所做的标准曲线。

图6为Mg²⁺浓度为4mM的双重PCR体系扩增PSA基因的扩增曲线，10倍梯度稀释的PSA质粒(10⁶拷贝～10拷贝)作为模板的扩增曲线。

图7是PSA基因的扩增曲线所做的标准曲线。

图8为前列腺癌白片标本的PCA3和PSA定量PCR扩增曲线。

图9为PCA3高表达尿液标本的PCA3和PSA扩增曲线。

图10为PCA3低表达尿液标本的PCA3和PSA扩增曲线。

图11为PCA3基因检测用于诊断前列腺的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例子对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1白片样本的前列腺癌PCA3基因表达定量检测。

方法：(1)白片样品的RNA提取：经病理确认的FFPE(甲醛固定石蜡包埋组织)标本，包括前列腺癌和癌旁组织标本，选取4片未经染色的白片组织切片，采用OMEGA公司的FFPERNA Kit试剂盒提取总RNA，按照操作说明进行提取。用Nanodrop-1000测RNA的浓度和纯度，将RNA冻存于-70℃冰箱备用。

(2)逆转录：逆转录总体系为20μL。首先在RNase-free的Ep管中加入dNTPs(10mM)1μL、Random primer(100mM)1μL、总RNA 1～8μL，用RNA-Free H₂O补足至12μL。在70℃水浴5min后，冰浴2min备用；在RNase-free的PCR小管中加入MMLV(200U/μL)1μL、RT Buffer(5×)4μL、RNasin(40U/uL)0.5μL，用RNA-Free H₂O补足至8μL；将上述两个产物混在一起，进行逆转录，程序为37℃变形15min，42℃退火60min，70℃延伸10min，4℃保存。

(3)实时荧光定量PCR检测：采用本试剂盒提供的双重qPCR反应Mix体系(如表1所示)，同时扩增PCA3基因和PSA基因。每次上机检测标本时，除了待检测标本外，同时扩增一份高浓度和一份低浓度PCA3质粒模板(10⁴拷贝和10²拷贝)、一份高浓度和一份低浓度PSA质粒模板(10⁴拷贝和10²拷贝)、一份空白对照(水)。两种质粒作为阳性质控品，指示体系是否可用、机器是否正常，空白对照指示是否存在模板污染和假阳性可能。

上机之前，先往每份反应Mix体系(20μL)中加入5μL DNA模板(cDNA或质粒或水)。上机的实时PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性20sec，65℃-56℃30sec，72℃延伸30sec，10个循环，其中，第一个循环的退火温度为64～66℃，然后每循环一次温度下降0.7～1.2℃；94℃20sec，56℃，30sec检测荧光信号，72℃，30sec，共40个循环。本方法适用于任何带有FAM通道和VIC通道的实时PCR仪，如ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P等。

表1双重qPCR反应体系

PCA3基因的引物为：

PCA3-F2：5'-GTTTTTGCACATTTCCAGCCC-3'；(SEQ ID NO.1)

PCA3-R1：5'-ATTTCTCCCAGGGATCTCTGTG-3'；(SEQ ID NO.2)

PCA3基因的探针PCA3-FAM-P为：

5'-CCATCCACACACACAGGAAGCACGGATGG-3'(SEQ ID NO.3)。

内参PSA基因的引物为：

PSA-F1：5'-GCGAGAAGCATTCCCAACC-3'；(SEQ ID NO.4)

PSA-R1：5'-GTGCCGACCCAGCAAGAT-3'；(SEQ ID NO.5)

内参PSA基因的探针PSA-VIC-P为：

5'-CGCCCACTGCATCAGGAACAAGGCG-3'(SEQ ID NO.6)。

结果判读：图1～图2是PCA3基因的引物筛选结果，图3为PSA基因的引物筛选结果。根据步骤(3)中待检测标本(cDNA模板)中PCA3基因的扩增曲线(图4)和PCA3基因的扩增曲线(图5)，可分别得到PCA3基因的Ct值和PSA基因的Ct值，然后用以下公式算出PCA3分数：2^{[Ct(PSA)-Ct(PCA3)]}×100。若标本的PCA3分数高于临界值31，则为PCA3高表达；若标本的PCA3分数低于临界值31，则为PCA3低表达。图4的双重实时PCR体系检测PCA3基因的检测限达10拷贝；根据标准曲线的斜率S(S＝-3.30)算出扩增效率为E＝10^(-1/S)-1＝100.9％。图5的双重实时PCR体系检测PCA3基因的检测限达10拷贝；根据标准曲线的斜率S(-3.31)算出扩增效率为E＝10^(-1/S)-1＝100.5％。(由于存在稀释效应，通过梯度稀释标准品算出的扩增效率会略高于实际值，所以有时会大于100％)

图6是待检测标本(cDNA模板)中PSA基因的扩增曲线，图7为PSA基因的扩增曲线。图8为一份前列腺癌白片样品的PCA3和PSA扩增曲线。从图中得到PCA3的Ct值为15.93，PSA的Ct值为16.35，因此标本的PCA3分数为2^{[Ct(PSA)-Ct(PCA3)]}×100＝133.8，133.8高于临界值31，因此标本为PCA3高表达。

实施例2不同尿液样本的前列腺癌PCA3基因表达定量检测。

对于疑似前列腺癌的病人(如血清PSA浓度>10ng/ml或血清PSA浓度在4～10ng/ml灰区)，采集尿液标本进行PCA3定量检测。

方法：(1)尿液样品的收集：首先从前列腺底部按摩至尖部，再分别从两侧叶的外侧至中线按压前列腺，最后按压前列腺中央沟。按压力度以将前列腺表面按压0.5-1.0cm为度。每叶按压3次，重复一次；按压中央沟3次。按摩后收集初段尿30～50mL，立即放4度冰箱保存或低温运输到实验室尽快处理。至少两份尿液标本。

(2)RNA提取：首先用离心力为3500g在4℃离心10min，收集尿沉渣细胞；用PBS洗涤两次后，采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或OMEGA公司的的Blood RNA Kit试剂盒进行总RNA的提取，按照操作说明进行提取。用Nanodrop-1000测RNA的浓度和纯度，将RNA冻存于-70℃冰箱备用。

(3)逆转录：逆转录体系为20μL。首先RNase-free的Ep管中加入dNTPs(10mM)1μL、Random primer(100mM)1μL、总RNA 1～8μL，用RNA-Free H₂O补足至12μL。在70℃水浴5min后，冰浴2min备用；在RNase-free的PCR小管中加入MMLV(200U/μL)1μL、RT Buffer(5×)4μL、RNasin(40U/uL)0.5μL，用RNA-Free H₂O补足至8μL；将上述两个产物混在一起，进行逆转录，程序为37℃变形15min，42℃退火60min，70℃延伸10min，4℃保存。

(4)实时荧光PCR上机检测。采用本试剂盒提供的双重qPCR反应Mix(如表1所示)，同时扩增PCA3基因和PSA基因，。每次上机检测标本时，除了待检测标本外，同时扩增一份高浓度和一份低浓度PCA3质粒模板(10⁴拷贝和10²拷贝)、一份高浓度和一份低浓度PSA质粒模板(10⁴拷贝和10²拷贝)、一份空白对照(水)。两种质粒作为阳性质控品，指示体系是否可用、机器是否正常，空白对照指示是否存在模板污染和假阳性可能。

上机之前，往每份反应Mix体系(20μL)中加入5μL DNA模板(cDNA或质粒或水)。上机的实时PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性20sec，65℃-56℃退火30sec，72℃延伸30sec，10个循环，其中，第一个循环的退火温度为64～66℃，然后每循环一次温度下降0.7～1.2℃；94℃20sec，56℃，30sec(检测荧光信号)，72℃，30sec，共40个循环。本方法适用于任何带有FAM通道和VIC通道的实时PCR仪，如ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P等。

结果判读：根据步骤(3)中待检测标本(cDNA模板)中PCA3基因和PSA基因的扩增曲线，可分别得到PCA3基因和PSA基因的Ct值，然后用以下公式算出PCA3分数：2^{[Ct(PSA)-Ct(PCA3)]}×100。若标本的PCA3分数高于临界值，则为PCA3高表达；若标本的PCA3分数低于临界值，则为PCA3低表达。

图9为PCA3高表达尿液标本的PCA3和PSA扩增曲线和图10为PCA3低表达尿液标本扩增曲线。图9得到PCA3的Ct值为22.13，PSA的Ct值为23.43，因此标本的PCA3分数为2^[Ct ^{(PSA)-Ct(PCA3)]}×100＝246.2，分数高于临界值31，因此这是一份PCA3高表达的尿液标本；图10为从扩增曲线得到PCA3的Ct值为25.24，PSA的Ct值为20.81，因此标本的PCA3分数为2^[Ct ^{(PSA)-Ct(PCA3)]}×100＝4.6，分数低于临界值31，因此这是另一份PCA3低表达的尿液标本。

实施例3临界值的确定

现有61份标本，有已知的病理穿刺活检结果，当中包括41份前列腺癌和20份非癌标本。采用本试剂盒检测这61份标本得到的PCA3分数总结如表2所示。

将PCA3分数与临界值(Cut-off Value)比较，可用于判断某标本为PCA3高表达(高于临界值)或低表达(低于临界值)。因此，临界值大小的确立非常重要，可直接影响结果判读的准确性。以病理检测结果作为金标准，通过调整临界值的大小(即判断高表达或低表达的标准)，可提高检测的准确性。表3为选取的临界值大小与检测敏感性、特异性的关系。以(1-特异性)为横坐标，以敏感性为纵坐标作ROC曲线，如图11示。

表2 61份已知标本的PCA3分数

PCN：Prostate Cancer Number；NPCN：Non-Prostate Cancer Number

标本排除标准：PSA的信号升起晚于25(Ct>25)的标本可认为前列腺细胞不足，予以排除。

PCA3分数：若PSA信号升起的Ct<25，假如PCA3没有信号升起，则PCA3分数记为0。

表3 PCA3检测的临界值与检测敏感性、特异性

根据图8和表3的分析结果可知：当临界值取38时，敏感性为61％，特异性为100％；当临界值取31时，敏感性为66％，特异性为95％；当临界值取19时，敏感性为71％，特异性为85％；当临界值取17时，敏感性为73％，特异性为80％。为了在敏感性和特异性两者之间取平衡，最终选取临界值为31。

在临界值取31的情况下，61份标本的实时PCR检测结果与金标准结果对比如表4所示。从表4算出本方法的准确性为：敏感性为65.9％(27/41)，特异性为95％(19/20)；阳性预测值为96.4％(27/28)，阴性预测值为57.6％(19/33)。可见，当临界值取31时，本方法可对前列腺癌标本和非癌标本进行有效区分，且具有较高的准确性。

表4 61份标本的病理检测结果和实时PCR检测结果对比

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨, 海涛

<120> 一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物、方法及试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

gtttttgcac atttccagcc c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

atttctccca gggatctctg tg 22

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatccacac acacaggaag cacggatgg 29

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

gcgagaagca ttcccaacc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

gtgccgaccc agcaagat 18

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcccactgc atcaggaaca aggcg 25

Claims

1.一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的引物，其特征在于，所述引物核苷酸序列如下所示：

PCA3-F2：5'-GTTTTTGCACATTTCCAGCCC-3'，

PCA3-R1：5'-ATTTCTCCCAGGGATCTCTGTG-3'。

2.一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如下所示：

PCA3-FAM-P：5'-CCATCCACACACACAGGAAGCACGGATGG-3'；

所述的探针5'标记的荧光基团为：FAM、VIC、TEXAS RED中的至少一种，探针的3'标记的淬灭基团为：BQ1、BQ2中的至少一种。

3.一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有权利要求2所述的探针、荧光定量反应预混液、阳性对照和空白对照。

5.一种前列腺癌PCA3基因双重实时PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品的RNA；

2)以提取样品的RNA为模板，将RNA逆转录为cDNA；

3)用权利要求1所述的PCA3-F2、PCA3-R1、权利要求2所述的探针、PSA内参基因引物PSA-F1、PSA-R1以及PSA内参基因探针PSA-VIC-P进行定量PCR扩增反应获得扩增产物；

4)对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的Ct值，并代入公式2^{[Ct(PSA)-Ct(PCA3)]}×100得到PCA3分数，若PCA3分数若大于31说明PCA3基因上调表达，若PCA3分数若低于31说明PCA3基因下调表达；若PCA3分数若等于31说明PCA3基因正常表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述逆转录的具体操作为：

配制以下逆转录体系1和体系2：

体系1：

体系2：

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PSA内参基因引物核苷酸序列为：

PSA-F1：5'-GCGAGAAGCATTCCCAACC-3'；

PSA-R1：5'-GTGCCGACCCAGCAAGAT-3'。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PSA内参基因探针PSA-VIC-P核苷酸序列为：5'-CGCCCACTGCATCAGGAACAAGGCG-3'。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的定量PCR扩增反应体系为：

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中的所述的定量PCR扩增反应程序为：93～95℃预变性1～5min，93～95℃变性10～30sec，64℃～55℃退火25～35sec，70～75℃延伸26～34sec，循环9～13次，其中，第一个循环的退火温度为64～66℃，然后每循环一次温度下降0.7～1.2℃；92～94℃18～22sec，52～60℃28～32sec检测荧光信号，70～74℃28～32sec，循环37～43次。