CN116144769B - 一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用 - Google Patents

一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及基因检测技术领域，公开了一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用，其检测试剂包括：恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas9试剂和免疫试纸条；恒温扩增体系试剂包括：含有标记分子1的PCA3基因扩增引物和含有标记分子2的PSA基因扩增引物，且标记分子1和标记分子2不同；免疫试纸条含有显色物质、基因探针以及两条检测线；显色物质选自胶体金、四氧化三铁、碳点、纳米硒、量子点、荧光分子中的任一种；两条检测线分别固定有与标记分子1和标记分子2结合的物质；CRISPR/Cas9试剂含有PCA3和PSA基因的sgRNA引物和cas9蛋白。解决了现有的基于PCA3、PSA双基因的检测方法具有临床操作不方便的缺陷。

Description

一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用
技术领域
本申请涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用。
背景技术
前列腺癌是男性第二大常见癌症，基于PCA3、PSA双基因检测为前列腺癌的主要检测方法之一。PSA是前列腺抗原而非前列腺癌抗原，有着高灵敏性、低特异性的特点，因此其既不能区分恶性肿瘤与非恶性肿瘤，也不能区分低级别和高级别的恶性癌症，往往导致不必要的活检与广泛的过度治疗。前列腺癌抗原3(PCA3)是一种非编码长链RNA，在前列腺癌中高度过表达。且已经有研究对PCA3在前列腺癌检测概率方面的表现进行了探索。由于其高灵敏度(52％到58％)和特异度(72％到87％)，美国食品和药物管理局(US Food AndDrug Administration)于2012年2月将PCA3确定为前列腺癌早期诊断的肿瘤标志物，用于促进既往前列腺活检阴性男性的活检决策。
目前不管是在临床还是科研中，针对PCA3与PSA的研究都是检测其在病人血液、尿液中的表达。而这些研究的操作方法均需要专业的人员对大型仪器进行长时间的专业操作，给临床上的应用带来了很多不便，这也是PCA3一直未能广泛应用于临床的主要原因之一。
针对上述相关技术，现有的基于PCA3、PSA双基因的检测方法具有需要专业的人员对大型仪器进行长时间的专业操作，临床操作不方便的缺陷。
发明内容
为了解决现有的基于PCA3、PSA双基因的检测方法具有需要专业的人员对大型仪器进行长时间的专业操作，临床操作不方便的缺陷，本申请提供了一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用。
第一方面，本申请提供一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒。
本申请是通过以下技术方案得以实现的：一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒，包括：
恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas9试剂和免疫试纸条；
所述恒温扩增体系试剂包括：含有标记分子1的PCA3基因扩增引物和含有标记分子2的PSA基因扩增引物，且所述标记分子1和所述标记分子2不同；所述恒温扩增的产物包含所述CRISPR/Cas9试剂识别所需的PAM位点；
所述恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自重组酶介导恒温核酸扩增(RT-RAA)、环介导恒温扩增(RT-LAMP)和超分支滚环扩增(HRCA)恒温扩增方法中任一种；
所述免疫试纸条含有显色物质、基因探针以及两条检测线；所述显色物质选自胶体金、四氧化三铁、碳点、纳米硒、量子点和荧光分子中的任一种；两条所述检测线分别固定有与所述标记分子1和所述标记分子2结合的特异性识别物质
所述CRISPR/Cas9试剂含有PCA3和PSA基因的sgRNA引物和cas9蛋白；所述CRISPR/Cas9试剂合成的sgRNA含有与所述基因探针结合的序列。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述PCA3恒温基因扩增引物和所述PSA恒温基因扩增引物选自以下：
PCA3-F CATACTGGTCACTTATCTCAAC(SEQ ID No.1)
PCA3-R GCTCTTAACAACTGGTCCT(SEQ ID No.2)
PSA-F AGCATTGAACCAGAGGAGTT(SEQ ID No.3)
PSA-R GAAGCACACCATTACAGACA(SEQ ID No.4)。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述标记分子1和所述标记分子2独立地选自：cy3、cy5、cy7、FITC、FAM、Alexa Fluor、Bio、Dig、Methylene Blue中的任一种。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：PCA3和PSA基因的sgRNA引物优选自以下：
PCA3-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTGTGAGCCACT
TTGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.5)
PCA3-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)
PSA-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTTCATGCTGTGT
GCGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.7)
PSA-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：优选地，所述CRISPR/Cas9试剂还含有DNA和/或RNA纯化试剂，T7聚合酶。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述基因探针选自金纳米颗粒基因探针、链霉亲和素修饰纳米基因探针、羧基修饰纳米基因探针中的任一种。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述基因探针选自金纳米颗粒基因探针。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述免疫试纸条含有：样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；
所述样品垫用于接收待检测样品；
所述结合垫含有所述基因探针；
所述NC膜上含有两条所述检测线以及质控线；
所述质控线含有捕获探针，所述捕获探针为与所述基因探针互补的核酸探针。
第二方面，本申请还提供一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒的使用方法。
本申请是通过以下技术方案得以实现的：一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒的使用方法，包括：
采用恒温扩增体系试剂对PCA3和PSA基因进行扩增，获得带标记分子的PCA3和PSA扩增产物；
采用PCA3和PSA基因的sgRNA引物进行桥式PCR扩增得到sgRNA转录模板DNA，sgRNA转录模板DNA经纯化后，用于T7RNA聚合酶介导的转录反应，转录出sgRNA并纯化；
将Cas蛋白和带标记分子的PCA3和PSA扩增产物以及sgRNA混合制备得到Cas9-sgRNA-目的基因复合物；
将Cas9-sgRNA-目的基因复合物与免疫试纸条进行反应，通过试纸的显色反应获得待测基因的PCA3和PSA阳性或者阴性情况。
第三方面，本申请还提供一种检测试剂/试剂盒在前列腺癌诊断和/或预后中的应用，所述检测试剂/试剂盒为上述基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒。
第四方面，本申请还提供一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物。
本申请是通过以下技术方案得以实现的：一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物，包括：
PCA3-sgRNA-F引物，序列如下：
5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTGTGAGCCACT
TTGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.5)；
PSA-sgRNA-F引物，序列如下：
5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTTCATGCTGTGT
GCGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.7)；
通用下游引物，序列如下：
5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)。
第五方面，本申请还提供一种sgRNA引物在制备前列腺癌诊断和/或预后的试剂中应用，所述sgRNA引物为上述基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物。
本申请至少包括以下有益技术效果：
本申请基于PCA3、PSA双基因设计了特异性sgRNA引物，通过体外转录纯化得到对应的sgRNA产物，对PCA3、PSA双基进行扩增并标记后，构建了对应的免疫试纸条和sgRNA产物配合作为检测平台，可以将检测结果直观的表示出来。通过简化检测方法，降低对大型仪器与专业平台的依赖，缩短检测的时间，以及更直观的表示检测结果，操作简单。
附图说明
图1是本申请一个示例性实施例提供的金纳米颗粒的表征结果以及PCA3与PSA的sgDNA、sgRNA合成产物电泳图；
图2是本申请一个示例性实施例提供的免疫试纸条的原理示意图；
图3是本申请一个示例性实施例提供的PCA3、PSA双基因的扩增结果以及RAA扩增原理图；
图4是本申请一个示例性实施例提供的CRISPR对PCA3、PSA双基因的特异性识别结果示意图；
图5是本申请一个示例性实施例提供的免疫试纸条结果判定图；
图6是本申请一个示例性实施例提供的免疫试纸条检测PCA3检测下限的结果示意图；
图7是本申请一个示例性实施例提供的免疫试纸条检测PSA检测下限的结果示意图；
图8是本申请一个示例性实施例提供的qPCR检测PCA3、PSA双基因定量分析示意图；
图9是本申请一个示例性实施例提供的免疫试纸条检测PCA3、PSA双基因下限的示意图；
图10是本申请一个示例性实施例提供的临床样本检测示意图。
具体实施方式
以下结合附图1-10对本申请作进一步详细说明。
实施例一
本申请实施例公开一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒，包括：恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas9试剂和免疫试纸条；
恒温扩增体系试剂包括：含有标记分子1的PCA3恒温基因扩增引物和含有标记分子2的PSA恒温基因扩增引物，且标记分子1和标记分子2不同；恒温扩增的产物包含所述CRISPR/Cas9试剂识别所需的PAM位点；
恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自RT-RAA、RT-LAMP和HRCA恒温扩增方法中任一种；
本实施例中，采用RT-RAA恒温扩增方法作为恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法。
免疫试纸条含有显色物质、基因探针以及两条检测线；显色物质选自胶体金、四氧化三铁、碳点、纳米硒、量子点和荧光分子中的任一种；两条检测线分别固定有与标记分子1和标记分子2结合的物质；
CRISPR/Cas9试剂含有PCA3和PSA基因的sgRNA引物和cas9蛋白；CRISPR/Cas9试剂合成的sgRNA含有与基因探针结合的序列。
标记分子1和标记分子2独立地选自cy3、cy5、cy7、FITC、FAM、Alexa Fluor、Bio、Dig、Methylene Blue中的任一种。
本实施例中，显色分子为胶体金；两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，第一检测线固定有标记分子1，标记分子1为生物素(Bio)，第二检测线固定有标记分子2，标记分子2为地高辛(Dig)。
本实施例中，与标记分子1结合的特异性识别物质选自链霉亲和素，与标记分子2结合的特异性识别物质选自抗地高辛抗体。
PCA3恒温基因扩增引物和PSA恒温基因扩增引物选自以下：
PCA3-F CATACTGGTCACTTATCTCAAC(SEQ ID No.1)
PCA3-R GCTCTTAACAACTGGTCCT(SEQ ID No.2)
PSA-F AGCATTGAACCAGAGGAGTT(SEQ ID No.3)
PSA-R GAAGCACACCATTACAGACA(SEQ ID No.4)。
PCA3和PSA基因的sgRNA引物选自以下：
PCA3-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTGTGAGCCACT
TTGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.5)
PCA3-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)
PSA-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTTCATGCTGTGT
GCGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.7)
PSA-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)。
CRISPR/Cas9试剂还含有DNA和/或RNA纯化试剂，T7聚合酶。
免疫试纸条含有：样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；
样品垫用于接收待检测样品；
结合垫含有基因探针；
NC膜上含有两条检测线以及质控线；
质控线含有捕获探针，捕获探针为与基因探针互补的核酸探针。
基因探针选自金纳米颗粒基因探针、链霉亲和素修饰纳米基因探针、羧基修饰纳米基因探针中的任一种。
在一个示范性的实施例中基因探针为金纳米颗粒基因探针，捕获探针为金纳米颗粒基因探针互补的核酸探针。
金纳米颗粒基因探针序列如下：
SH-AAAAAAAAAATTTTTCATTGCTAGAGCAGGGGTATTCCACTTGCA(SEQ ID No.8)；
捕获探针序列如下：
Biotin-CCTGCTCTAGCAATG(SEQ ID No.9)。
金纳米颗粒基因探针通过如下步骤制备：
金纳米颗粒采用柠檬酸盐还原法进行制备，金纳米颗粒基因探针通过采用TCEP法将DNA探针修饰至金纳米颗粒上得到。
采用柠檬酸盐还原法制备金纳米颗粒，具体如下：
将100mL 1mM的HAuCl4溶液加热至沸腾，搅拌状态下向HAuCl4溶液中加入10mL38.8mM的柠檬酸钠溶液并持续搅拌20min，冷却至室温得到金纳米颗粒胶体溶液。用紫外吸收光谱测得其吸收峰在520nm左右处，即得到13nm的纳米颗粒金胶体溶液。
采用TCEP法标记纳米金探针，具体如下：
向PCR管中加入66μL 200μM的5’端修饰有巯基的多聚T探针，T数量为16，然后向PCR管中加入2μL 500μM的pH为5.2的醋酸缓冲液和3.3μL 10μM的磷酸三氯乙酯(TCEP)以活化巯基，并在室温下避光孵育1小时；
向离心管中加入3mL 13nm的金纳米颗粒胶体溶液，在摇动状态下再向离心管中加入TCEP处理过的多聚T探针溶液，盖上管盖后用振荡器以600rpm转速振荡离心管，并在室温下避光孵育16小时；
缓慢震荡下向离心管中逐滴加入66μL 500mM的pH为8.2的Tris醋酸缓冲液，使Tris醋酸缓冲液的终浓度为5mM,再向离心管中逐滴加入660μL 1M的NaCl溶液，并在室温下避光孵育一天；
使用离心机于12000rpm转速，4℃离心离心管30分钟，取出离心管后吸掉上清液，用2mL包埋缓冲液重悬，包埋缓冲液包括20mM的Na3PO4溶液、质量百分比为5％的BSA溶液、体积百分比为0.25％的Tween X-100和质量百分比8％的蔗糖(sucrose)。
参照图1，微观与宏观图均表示13nm胶体金在被DNA探针修饰前后，结构没有改变。
免疫试纸条通过如下步骤制备：
使用样品垫处理液对样品垫进行饱和浸润处理，样品垫处理液包括体积百分比为0.25％的Triton X-100、0.05M的Tris-HCl和0.15M的NaCl溶液，且样品垫处理液的pH＝8.0，处理后的样本垫于37℃下干燥2h，置于干燥器中室温保存；
用300l金纳米颗粒探针溶液喷于结合垫上，试问过夜后并于4℃干燥保存；
用喷膜仪将60l的1mg/mL链霉亲和素溶液喷到NC膜的第一检测线位置，用喷膜仪将60l 1mg/mL的抗地高辛抗体溶液喷到NC膜的第二检测线位置，将60l的1000M的质控线捕获探针混合液喷到NC膜的质控线位置，室温下干燥1h并于4℃干燥保存；
对样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫进行组装，得到免疫试纸条；
参照图2，按所示结构组装，每部分之间重叠2mm，最后切成4mm宽的免疫试纸条。
实施例二
本申请实施例公开一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂/试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤S1：采用恒温扩增体系试剂对PCA3和PSA基因进行扩增，获得带标记分子的PCA3和PSA扩增产物；
本实施例中，采用RT-RAA扩增体系试剂对PCA3和PSA基因进行扩增；
根据PCA3与PSA基因序列在Primer Premier 6软件上分别设计PCA3上游引物、PCA3下游引物、PSA上游引物和PSA下游引物；
在PCA3上游引物的5’端加入生物素，在PSA上游引物的5‘端加入地高辛；
提取正常前列腺细胞(RWPE-1)与前列腺癌细胞(LNCAP、22RV1)总RNA，分别用PCA3、PSA特异性扩增引物进行RT-RAA扩增反应。
根据PCA3与PSA基因序列在Primer Premier 6软件上分别设计PCA3上游引物(PCA3-F)、PCA3下游引物(PCA3-R)、PSA上游引物(PSA-F)和PSA下游引物(PSA-R)，如表1所述：
表1
引物名称 引物序列
PCA3-F Bio-CATACTGGTCACTTATCTCAAC(SEQ ID No.1)
PCA3-R GCTCTTAACAACTGGTCCT(SEQ ID No.2)
PSA-F DIG-AGCATTGAACCAGAGGAGTT(SEQ ID No.3)
PSA-R GAAGCACACCATTACAGACA(SEQ ID No.4)
参照图3，本实施例对扩增产物即目的基因进行PAGE实验验证。
图3a是PCA3与PSA基因的qPCR扩增曲线，PSA基因表达高于PCA3基因；图3b是重组酶介导恒温指数扩增(RT-RAA)的示意图：目的基因引物与重组酶结合形成复合体，在单链结合蛋白作用下与目的基因进行结合，并在聚合酶的作用下往两端延伸，最终形成双链；图3c中，lane1-2与lane3-4分别是PCA3基因与PSA基因RT-RAA扩增产物电泳图，lane5-6分别是PCA3基因与PSA基因qPCR扩增产物电泳图，lane1-2与lane5的条带位置一致，lane3-4与lane6条带位置一致，说明两种方法均可以对目的基因进行扩增。图3d中，lane1-2与lane3-4分别是PCA3基因引物与PSA基因引物在正常前列腺细胞RNA中扩增的产物电泳图，lane5-6分别是PCA3基因引物与PSA基因引物在前列腺癌细胞RNA中扩增的产物电泳图，由于PCA3基因在健康人群中是低表达或不表达，因此并没有出现条带，而PSA基因在健康人群与肿瘤患者人群中均有表达，因此在正常前列腺细胞与前列腺癌细胞RNA中均有扩增。
从PAGE实验结果可以看出PCA3与PSA基因在RT-RAA以及RT-qPCR两种方法中得到的扩增产物一致，电泳条带单一明亮，均可以用于下后续步骤。
步骤S2：采用PCA3和PSA基因的sgRNA引物进行桥式PCR扩增得到sgRNA转录模板DNA，sgRNA转录模板DNA经纯化后，用于T7 RNA聚合酶介导的转录反应，转录出sgRNA并纯化；
设计sgRNA产物转录所需的转录模板DNA的sgRNA引物，其中上游引物包含有T7启动子区和20-nt的与靶DNA相关序列，下游引物主要用于编码sgRNA的3’末端序列；
通过桥式PCR扩增反应得到所述转录模板DNA；
桥式PCR扩增反应的步骤依次为：将样品于95℃下变性5分钟，于95℃下变性20秒，于63℃退火10秒，于72℃延伸45秒，并循环35次；循环后于72℃延伸15分钟。
对得到的转录模板DNA使用PCR纯化试剂盒纯化，再使用T7RNA聚合酶介导进行转录反应，从而转录得到sgRNA产物；
对得到的sgRNA产物用RNA纯化试剂盒纯化，对纯化后的sgRNA冻存备用。
步骤S3：将Cas蛋白和带标记分子的PCA3和PSA扩增产物以及sgRNA混合制备得到Cas9-sgRNA-目的基因复合物；
将Cas蛋白和sgRNA产物以1:1的浓度比在缓冲液中于室温下混合静止孵育10min，形成Cas-sgRNA复合物；
将Cas-sgRNA复合物与目的基因混合并于37℃进行孵育1h得到Cas9-sgRNA-目的基因复合物。
步骤S4：将Cas9-sgRNA-目的基因复合物与免疫试纸条进行反应，通过试纸的显色反应获得待测基因的PCA3和PSA阳性或者阴性情况。
将Cas9-sgRNA-目的基因复合物配置成溶液滴于免疫试纸条上，通过第一检测线、第二检测线和质控线的变色情况读取检测结果。当第一检测线和质控线变色时，证明被测样本中含有PCA3的基因扩增产物；当第二检测线和质控线变色时，证明被测样本中含有PSA的基因扩增产物；当第一检测线、第二检测线和质控线同时变色时，证明被测样本中同时含有PCA3的基因扩增产物和PSA的基因扩增产物；当质控线不变色时，则表明免疫试纸条已失效；当质控线变色，第一检测线、第二检测线均不变色时，证明被测样本中不含有PCA3的基因扩增产物和PSA的基因扩增产物。
实施例三
本申请实施例还提供一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物，包括：
PCA3-sgRNA-F引物，序列如下：
5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTGTGAGCCACT
TTGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.5)；
PSA-sgRNA-F引物，序列如下：
5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTTCATGCTGTGT
GCGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’(SEQ IDNo.7)；
通用下游引物，序列如下：
5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT
AACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’(SEQ IDNo.6)。
实验例一cas9-sgRNA复合体与目的基因结合验证
参照图4，PCA3基因扩增产物、cas9蛋白与浓度分别为0、0.3、0.6、1.5μg/μl的sgRNAPCA3溶液反应，产物的电泳图如图4所示，当sgRNAPCA3浓度为0时，只有一条明亮的电泳条带，证明PCA3基因扩增产物与cas9蛋白不发生反应不会被剪切；当sgRNAPCA3浓度逐渐升高时，PCA3基因扩增产物，属于PCA3基因扩增产物的条带亮度逐渐减低，剪切片段逐渐增多，在sgRNAPCA3浓度达到1.5μg/μl时出现了剪切产物条带，证明sgRNAPCA3对PCA3识别并剪切。
PSA基因扩增产物、cas9蛋白与浓度分别为0、0.3、0.6、1.5μg/μl的sgRNAPSA反应，产物的电泳图如图4所述，结果与上述实验一致，并且在低浓度sgRNAPSA作用下即可出现剪切条带，证明sgRNAPSA对PSA识别并剪切。
实验例二免疫试纸条功能验证
a.在EP管中加入ddH2O、MgCl2、sgRNA产物，室温反应5min后加入PCA3与PSA基因扩增产物；
b.在EP管中加入ddH2O、MgCl2、cas9，室温反应5min后加入PCA3与PSA基因扩增产物；
c.在EP管中加入ddH2O、MgCl2、cas9、sgRNA产物，室温反应5min后加入PSA基因扩增产物；
d.在EP管中加入ddH2O、MgCl2、cas9、sgRNA产物，室温反应5min后加入PCA3基因扩增产物；
e.在EP管中加入ddH2O、MgCl2、cas9、sgRNA产物，室温反应5min后加入PCA3与PSA基因扩增产物；
参照图5，分别使用1-5号免疫试纸条对a-e号实验例进行测试，结果如下：
1号免疫试纸条只出现了一条C线条带，证明带有生物素\地高辛标记的扩增产物与sgRNA产物结合依赖cas9蛋白的剪切能力；
2号免疫试纸条只出现了一条C线条带，证明带有生物素\地高辛标记的扩增产物与cas9蛋白结合依赖sgRNA的靶向能力；
3、4号免疫试纸条分别出现了T-PSA与C线条带、T-PCA3与C线条带，PCA3与PSA基因扩增产物和对应的sgRNA不会发生交叉反应；
5号免疫试纸条出现了T-PCA3、T-PSA以及C线三条条带，证明当反应体系中同时含有PCA3、PSA基因的扩增产物及对应的sgRNA，cas9蛋白时，免疫试纸条才会同时出现两条测试带与一条控制带；
根据实验结果可以得出以下结论：cas9蛋白、sgRNA与目的基因在组成三元复合物中均起到不可缺少的作用，并且PCA3与PSA基因在与sgRNA识别结合时不会发生交叉反应，证明免疫试纸条可以对PCA3与PSA双基因进行检测。
实验例三免疫试纸条基因检测下限实验
提取LNCAP细胞内全血RNA，利用酶标仪测出浓度并梯度稀释，逆转成cDNA备用；
对上一步得到的cDNA进行恒温扩增；
取4μlddH2O、MgCl2、cas9蛋白和sgRNA置于EP管中，振荡混匀室温静置5分钟；
再取4μl基因扩增产物加入EP管中，振荡混匀后于37℃下反应25分钟；
往EP管中滴加20μl上样缓冲液，上样缓冲液包括4份SSC溶液、0.05％的Tween-20、1份PBS和1％的BSA，混匀后将混合后的溶液滴加至样品垫，1分钟后再滴加120μl上样缓冲液至样品垫并读取结果。
参照图6，对不同浓度PCA3基因的RT-RAA扩增产物进行cas9-sgRNA识别，实验结果可以从免疫试纸条上直观的观察，本组实验设置了从5×106fg/μl到50fg/μl的6个浓度与一个对照组，经过重复实验与定量分析发现PCA3基因检测下限为500fg/μl；对不同浓度PCA3基因进行qPCR扩增，PCA3的基因的检测下限均在500fg/μl。
参照图7-8，对不同浓度PSA基因的RT-RAA扩增产物进行cas9-sgRNA识别，本组实验设置了从5×106fg/μl到5fg/μl的7个浓度与一个对照组，重复实验与定量分析发现PSA基因检测下限为50fg/μl；对不同浓度PSA基因进行qPCR扩增，PSA的基因的检测下限均在50fg/μl。
参照图9，对不同浓度PCA3、PSA基因同时检测，本组实验设置了从5×106fg/μl到50fg/μl的6个浓度与一个对照组，重复实验与定量分析发现同时检测PCA3与PSA基因时，PCA3基因的检测下限为500fg/μl。在单独检测PCA3基因或PSA基因时，免疫试纸条与qPCR检测下限一致，分别为500fg/μl以及50fg/μl。
实验例四临床样本免疫试纸条测定
收集病人血液样本，并记录样本对应的病人信息；
对所有血样样本分别提取全血RNA并进行RT-RAA与qPCR扩增；
对RT-RAA扩增的产物与cas9-sgRNA共孵育并通过免疫试纸条检测；
分析qPCR扩增的ct值，计算PCA3 score＝{(PCA3 mRNA/PSA mRNA)*1000}；
参照图10，选取25份外周血临床样本验证本免疫试纸条检测系统的实用性，25份样本由16份RT-qPCR和临床确认的阴性样本及9份阳性样本。在以上样本中，免疫试纸条的检测结果出现了一例与qPCR的结果不一致的假阳性结果，即阳性预测值为81％，而免疫试纸条的阴性结果与qPCR验证的结果一致，及阴性预测值为100％。接收者操作特征曲线为0.9861，体现了免疫试纸条检测的优秀的特异性与灵敏度。
在免疫试纸条检测的结果中，编号7和编号18两例阴性样本的检测结果为阳性。RT-qPCR定量分析显示，编号7和编号18样本的PCA3表达量分别为683.7682与737.5672fg/ul，而实验例三中结果显示免疫试纸条的PCA3基因检测下限是500fg/ul,说明CRISPR介导的免疫试纸条检测较高表达PCA3基因的阴性样本的特异性较差。尽管如此，这种特异性水平足以用于PCA3、PSA双基因检测。在临床上对PCA3的应用是构建PCA3评分{(PCA3mRNA/PSAmRNA)*1000},而不是单独应用PCA3基因表达量。尽管编号7和编号18样本的PCA3表达量较高，但是其PCA3评分仍在临界值以下。因此基于CRISPR核酸检测免疫试纸条可以用于PCA3、PSA双基因快速检测。
实施例的实施原理为：根据PCA3与PSA基因序列，设计特异性扩增引物,可以对PCA3、PSA双基因扩充并在PCA3上游引物的5’端加入生物素，在PSA上游引物的5‘端加入地高辛，得到目的基因；基于PCA3、PSA双基因设计sgRNA引物并对sgRNA引物进行转录与纯化得到sgRNA产物；基于sgRNA引物和目的基因制备Cas9-sgRNA-目的基因复合物。制备金纳米颗粒和金纳米颗粒基因探针作为PCA3、PSA双基因的检测探针，将金纳米颗粒基因探针的溶液喷于结合垫上，将链霉亲和素溶液喷到NC膜的第一检测线位置，将抗地高辛抗体溶液喷到NC膜的第二检测线位置，将质控线捕获探针混合液喷到NC膜的质控线位置，对样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫进行组装，得到免疫试纸条，免疫试纸条可用于PCA3、PSA双基因检测。当第一检测线和质控线变色时，证明被测样本中含有PCA3的基因扩增产物；当第二检测线和质控线变色时，证明被测样本中含有PSA的基因扩增产物；当第一检测线、第二检测线和质控线同时变色时，证明被测样本中同时含有PCA3的基因扩增产物和PSA的基因扩增产物；当质控线不变色时，则表明免疫试纸条已失效；当质控线变色，第一检测线、第二检测线均不变色时，证明被测样本中不含有PCA3的基因扩增产物和PSA的基因扩增产物。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于PCA3、PSA双基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于，包括：恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas9试剂和免疫试纸条；
所述恒温扩增体系试剂包括：含有标记分子1的PCA3基因恒温扩增引物和含有标记分子2的PSA基因恒温扩增引物，且所述标记分子1和所述标记分子2不同；恒温扩增的产物包含所述CRISPR/Cas9试剂识别所需的PAM位点；
所述免疫试纸条含有显色物质、基因探针以及两条检测线；所述显色物质为胶体金；两条所述检测线分别固定有与所述标记分子1和所述标记分子2结合的特异性识别物质;
所述CRISPR/Cas9试剂含有PCA3和PSA基因的sgRNA引物和cas9蛋白；所述CRISPR/Cas9试剂合成的sgRNA引物含有与所述基因探针结合的序列；
所述PCA3基因恒温扩增引物和所述PSA基因恒温扩增引物如下所示：
PCA3-F CATACTGGTCACTTATCTCAAC，
PCA3-R GCTCTTAACAACTGGTCCT，
PSA-F AGCATTGAACCAGAGGAGTT，
PSA-R GAAGCACACCATTACAGACA；
PCA3和PSA基因的sgRNA引物如下所示：
PCA3-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTGTGAGCCACTTTGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’，
PCA3-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’，
PSA-sgRNA-F 5’-CCTCTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTTCATGCTGTGTGCGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3’，
PSA-sgRNA-R 5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC-3’。
2.根据权利要求1所述的基于PCA3、PSA双基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于：所述标记分子1和所述标记分子2独立地选自：cy3、cy5、cy7、FITC、FAM、Alexa Fluor、Bio、Dig、Methylene Blue中的任一种。
3.根据权利要求1所述的基于PCA3、PSA双基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于：所述CRISPR/Cas9试剂还含有DNA和/或RNA纯化试剂、T7聚合酶。
4.根据权利要求1所述的基于PCA3、PSA双基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于：
所述基因探针为金纳米颗粒基因探针。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于PCA3、PSA双基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于：所述免疫试纸条含有：样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；
所述样品垫用于接收待检测样品；
所述结合垫含有所述基因探针；
所述NC膜上含有两条所述检测线以及质控线；
所述质控线含有捕获探针，所述捕获探针为与所述基因探针互补的核酸探针。
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