CN113201581A - 基于熵驱动的可视miRNA生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于熵驱动的可视miRNA生物传感器及其应用,属于生物检测技术领域。本发明提供了基于熵驱动的可视miRNA生物传感器,此生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物1,燃料链,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5,及修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6,或者,包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物,燃料链,DNA探针链,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1,修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3,及修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4;此生物传感器具有灵敏度高,选择性和区分度良好,及适用于复杂的生物样品等优势。
Description
技术领域
本发明涉及基于熵驱动的可视miRNA生物传感器及其应用,属于生物检测技术领域。
背景技术
MicroRNA(miRNAs)是一系列长度为18~25个核苷酸的短小非编码RNA,是基因表达的关键调控因子。到目前为止,已经发现了2500多种人类miRNAs。越来越多的证据表明,miRNAs与各种疾病,特别是癌症的发生和发展有关。目前,miRNAs被认为是一类有价值的生物标志物,可用于疾病诊断、病情监测以及作为药物靶点。
Let-7a是第一个被人们发现的miRNA,其在肿瘤抑制基因发挥重要作用。最近的报道显示,在乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种癌症组织中,let-7a水平明显下降,因此let-7a作为极具参考价值的肿瘤标志物,可用于肿瘤的早期检测及药物开发。此外,在疾病发展的任何阶段我们都可通过无创的方法获取体内的miRNA。因此,准确有效地分析miRNA的表达在早期临床诊断和生物学研究中发挥着重要作用。然而,由于miRNA体积小、丰度低、序列相似度高等特点,很难开发出高灵敏、高特异性的miRNA定量检测方法。
目前,常规定量检测miRNA的方法主要为定量逆转录PCR(RT-qPCR)、Northern印迹(northern blotting)和miRNA微阵列。然而,这些方法都有其内在的局限性。其中,定量逆转录PCR被认为是miRNA分析的金标准,这种方法虽然可靠、灵敏,但是需要聚合酶、复杂的热循环反应以及昂贵的设备,具有成本高的缺陷。Northern印迹和miRNA微阵列则具有低灵敏度且耗时的缺陷。
为了克服上述方法的缺陷,人们还开发了电化学、比色和荧光生物等用于定量检测miRNA的新型生物传感器及其相应的定量检测方法。在这些生物传感器中,由金纳米颗粒(AuNPs)构建的比色传感器因其操作简单和实用性强等优点引起了人们的广泛关注。并且,金纳米颗粒制备简单,易于化学修饰,为可视化检测提供了一条新的思路。然而,由于裸的金纳米颗粒容易发生非特异性聚集等原因,现阶段的比色传感器存在灵敏度较低的缺陷。因此,开发灵敏度高的用于定量检测miRNA的生物传感器及其相应的定量检测方法仍迫在眉睫。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种生物传感器,所述生物传感器用于检测样本中的靶标物,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物1,燃料链,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5,以及,修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述ssDNA5和ssDNA6分别与DNA2的不同区域互补,使得DNA2被释放后,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5和修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6能够通过ssDNA5和ssDNA6与DNA2互补序列间的杂交诱导发生聚集;
或者,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物,燃料链,DNA探针链,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1,修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3,以及,修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有内切酶识别区域的双链DNA,在内切酶的作用下,双链DNA至少能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2;所述ssDNA1和ssDNA2分别与游离DNA片段1的不同区域互补,使得游离DNA片段1被释放后,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1和修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2能够通过ssDNA1和ssDNA2与游离DNA片段1互补序列间的杂交诱导发生聚集;所述ssDNA3和ssDNA4分别与游离DNA片段2的不同区域互补,使得游离DNA片段2被释放后,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3和修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4能够通过ssDNA3和ssDNA4与游离DNA片段2互补序列间的杂交诱导发生聚集。
在本发明的一种实施方式中,所述粘性区域位于靶标物和DNA2之间。
在本发明的一种实施方式中,所述DNA探针链为发夹型DNA探针链;所述内切酶为切刻内切酶;所述发夹型DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有切刻内切酶识别区域的双链DNA,在切刻内切酶的作用下,双链DNA能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2。
在本发明的一种实施方式中,所述靶标RNA包括靶标miRNA;所述靶标miRNA包括let-7a、miRNA-141、miRNA-145、miRNA-21或miRNA-25。
在本发明的一种实施方式中,当靶标miRNA为let-7a时,所述DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述DNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述燃料链的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述发夹型DNA探针链的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,所述ssDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,所述ssDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,所述ssDNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在本发明的一种实施方式中,所述let-7a的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一种实施方式中,所述检测为定量检测。
本发明还提供了一种定量检测样本中靶标物的方法,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,所述方法使用上述生物传感器,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5和金纳米颗粒6进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3和金纳米颗粒4进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
在本发明的一种实施方式中,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5、金纳米颗粒6和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3、金纳米颗粒4和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
在本发明的一种实施方式中,所述吸光度与靶标物浓度之间的线性关系的获得方法为:配置不同浓度的靶标物溶液;检测不同浓度的靶标物溶液的吸光度;根据靶标物溶液的浓度和测得的不同浓度的靶标物溶液的吸光度绘制标准曲线,得到吸光度与靶标物浓度之间的线性关系。
在本发明的一种实施方式中,所述反应的温度为25~37℃、时间为40~80min。
在本发明的一种实施方式中,所述反应的温度为37℃、时间为60min。
在本发明的一种实施方式中,所述酶切的温度为25~37℃、时间为20~40min。
在本发明的一种实施方式中,所述酶切的温度为37℃、时间为30min。
在本发明的一种实施方式中,所述孵育的温度为20~40℃、时间为20~40min。
在本发明的一种实施方式中,所述孵育的温度为25℃、时间为30min。
在本发明的一种实施方式中,所述DNA探针链为发夹型DNA探针链。
在本发明的一种实施方式中,所述内切酶为切刻内切酶。
在本发明的一种实施方式中,所述缓冲液1为Tris缓冲液。
在本发明的一种实施方式中,所述缓冲液2为NEBuffer溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述吸光度通过紫外-可见光谱检测而得,检测波长为350~700nm。
本发明还提供了上述生物传感器或上述方法在定量检测靶标物中的应用,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明提供了基于熵驱动的可视miRNA生物传感器,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物1,燃料链,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5,以及,修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6,DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标miRNA结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标miRNA、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域,燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放,ssDNA5和ssDNA6分别与DNA2的不同区域互补,使得DNA2被释放后,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5和修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6能够通过ssDNA5和ssDNA6与DNA2互补序列间的杂交诱导发生聚集;本发明的生物传感器具有以下优势:
(1)使用本发明的生物传感器定量检测miRNA时,仅需将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,在反应液中加入内切酶进行酶切,在酶切液中加入金纳米颗粒5、金纳米颗粒6和缓冲液2进行孵育,以及,检测孵育液的吸光度四个步骤,具有操作简单、实用性强的优势;
(2)EDA是一种无酶、等温的DNA扩增方法,其反应由催化链引发,由体系中熵值的增加来驱动整个扩增反应,最终形成稳定的双链DNA产物,熵驱动催化反应主要运用一系列的单链DNA在整个反应体系扮演多种角色,基于DNA链锚定点所介导的链位移反应,由于避免使用DNA中的吻合环等复杂的第二结构,EDA可大大降低由DNA二级结构相互作用所造成的高背景信号,从而获得可靠灵敏的检测结果,并且,EDA的模块化的设计使其适应多种目标物的检测,因此,EDA具有扩增效率高、特异性强、序列设计灵活等优势;金纳米颗粒则具有可视化的优势;本发明的生物传感器结合了EDA优越的信号扩增效率和金纳米颗粒可视化的优势,使用本发明的生物传感器定量检测miRNA时,当体系中miRNA存在的时候即可启动熵驱动扩增反应,输出链可以进一步触发切刻内切酶辅助的DNA扩增循环,经过切刻内切酶切割后,产物DNA片段最终作为连接链诱导单链DNA修饰的金纳米颗粒聚集,基于这种多重信号扩增策略,可对miRNA进行超灵敏定量分析;经验证,使用本发明的生物传感器定量检测miRNA的检测限达到3.13fM,并且,本发明的生物传感器对于同族的高度同源性的序列表现有良好的选择性和区分度,此外,本发明的生物传感器对在复杂的生物样品(人血清)中也表现出良好的检测性能。
2、本发明提供了基于熵驱动的可视miRNA生物传感器,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物,燃料链,DNA探针链,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1,修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3,以及,修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4,DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标miRNA结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标miRNA、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域,燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放,DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有内切酶识别区域的双链DNA,在内切酶的作用下,双链DNA至少能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2,ssDNA1和ssDNA2分别与游离DNA片段1的不同区域互补,使得游离DNA片段1被释放后,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1和修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2能够通过ssDNA1和ssDNA2与游离DNA片段1互补序列间的杂交诱导发生聚集,ssDNA3和ssDNA4分别与游离DNA片段2的不同区域互补,使得游离DNA片段2被释放后,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3和修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4能够通过ssDNA3和ssDNA4与游离DNA片段2互补序列间的杂交诱导发生聚集;本发明的生物传感器具有以下优势:
(1)使用本发明的生物传感器定量检测miRNA时,仅需将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,在反应液中加入内切酶进行酶切,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3、金纳米颗粒4和缓冲液2进行孵育,以及,检测孵育液的吸光度四个步骤,具有操作简单、实用性强的优势;
(2)EDA是一种无酶、等温的DNA扩增方法,其反应由催化链引发,由体系中熵值的增加来驱动整个扩增反应,最终形成稳定的双链DNA产物,熵驱动催化反应主要运用一系列的单链DNA在整个反应体系扮演多种角色,基于DNA链锚定点所介导的链位移反应,由于避免使用DNA中的吻合环等复杂的第二结构,EDA可大大降低由DNA二级结构相互作用所造成的高背景信号,从而获得可靠灵敏的检测结果,并且,EDA的模块化的设计使其适应多种目标物的检测,因此,EDA具有扩增效率高、特异性强、序列设计灵活等优势;金纳米颗粒则具有可视化的优势;本发明的生物传感器结合了EDA优越的信号扩增效率和金纳米颗粒可视化的优势,使用本发明的生物传感器定量检测miRNA时,当体系中miRNA存在的时候即可启动熵驱动扩增反应,输出链可以进一步触发切刻内切酶辅助的DNA扩增循环,经过切刻内切酶切割后,产物DNA片段最终作为连接链诱导单链DNA修饰的金纳米颗粒聚集,基于这种多重信号扩增策略,可对miRNA进行定量分析;经验证,使用本发明的生物传感器定量检测miRNA的检测限达到3.13fM,并且,本发明的生物传感器对于同族的高度同源性的序列表现有良好的选择性和区分度,此外,本发明的生物传感器对在复杂的生物样品(人血清)中也表现出良好的检测性能。
3、本发明提供了一种定量检测样本中靶标miRNA的方法,所述方法使用基于熵驱动的可视miRNA生物传感器,使用本发明的方法定量检测miRNA,具有操作简单,实用性强,灵敏度高,选择性和区分度良好,以及,适用于复杂的生物样品等优势。
附图说明
图1:生物传感器的工作原理示意图。
图2:探针-1的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3:探针-1的紫外可见光谱UV-vis表征结果。
图4:let-7a启动的熵驱动扩增凝胶电泳结果。图4中,泳道1:DNA1;泳道2,DNA2;泳道3,DNA3;泳道4:DNA1/DNA2/DNA3三链复合物;泳道5:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物;泳道6:let-7a/DNA2/DNA3三链复合物;泳道7:燃料链;泳道8:燃料链/DNA3双链DNA;泳道9:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物+燃料链;泳道10:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物+燃料链+发夹型DNA探针链(DNA H);泳道11:DNA2/H双链DNA;泳道12:发夹型DNA探针链(DNA H),每个样品的浓度为1μM。
图5:在let-7a(100pM)和缓冲液(阴性对照)存在情况下孵育液在400~700nm范围内的UV-vis吸收光谱。
图6:在let-7a(100pM)和缓冲液(阴性对照)存在情况下孵育液的颜色响应。
图7:在缓冲液的存在下AuNPs聚集的TEM图像。
图8:在let-7a的存在下AuNPs聚集的TEM图像。
图9:孵育液的颜色改变与let-7a浓度的关系。
图10:孵育液的紫外-可见吸收光谱与let-7a浓度的关系。
图11:吸光峰比值(A530/A650)与let-7a浓度的线性关系图。
图12:生物传感器对let-7家族和空白组的区分度。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1:一种生物传感器
本实施例提供了一种生物传感器(生物传感器的工作原理如图1所示),所述生物传感器用于检测样本中的靶标物,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物1,燃料链,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5,以及,修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述ssDNA5和ssDNA6分别与DNA2的不同区域互补,使得DNA2被释放后,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5和修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6能够通过ssDNA5和ssDNA6与DNA2互补序列间的杂交诱导发生聚集;
或者,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物,燃料链,DNA探针链,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1,修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3,以及,修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有内切酶识别区域的双链DNA,在内切酶的作用下,双链DNA至少能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2;所述ssDNA1和ssDNA2分别与游离DNA片段1的不同区域互补,使得游离DNA片段1被释放后,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1和修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2能够通过ssDNA1和ssDNA2与游离DNA片段1互补序列间的杂交诱导发生聚集;所述ssDNA3和ssDNA4分别与游离DNA片段2的不同区域互补,使得游离DNA片段2被释放后,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3和修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4能够通过ssDNA3和ssDNA4与游离DNA片段2互补序列间的杂交诱导发生聚集。
作为优选,所述粘性区域位于靶标物和DNA2之间。
作为优选,所述DNA探针链为发夹型DNA探针链;所述内切酶为切刻内切酶;所述发夹型DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有切刻内切酶识别区域的双链DNA,在切刻内切酶的作用下,双链DNA能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2。
作为优选,所述靶标RNA包括靶标miRNA;所述靶标miRNA包括let-7a、miRNA-141、miRNA-145、miRNA-21或miRNA-25。
作为优选,当靶标miRNA为let-7a时,所述DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述DNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述燃料链的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述发夹型DNA探针链的核苷酸序列如SEQID NO:5所示,所述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,所述ssDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,所述ssDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,所述ssDNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
作为优选,所述let-7a的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
作为优选,所述检测为定量检测。
实施例2:一种定量检测样本中靶标物的方法
本实施例提供了一种定量检测样本中靶标物的方法,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,所述方法使用上述生物传感器,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5和金纳米颗粒6进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3和金纳米颗粒4进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
作为优选,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5、金纳米颗粒6和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3、金纳米颗粒4和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
作为优选,所述吸光度与靶标物浓度之间的线性关系的获得方法为:配置不同浓度的靶标物溶液;检测不同浓度的靶标物溶液的吸光度;根据靶标物溶液的浓度和测得的不同浓度的靶标物溶液的吸光度绘制标准曲线,得到吸光度与靶标物浓度之间的线性关系。
作为优选,所述反应的温度为25~37℃、时间为40~80min。
作为优选,所述反应的温度为37℃、时间为60min。
作为优选,所述酶切的温度为25~37℃、时间为20~40min。
作为优选,所述酶切的温度为37℃、时间为30min。
作为优选,所述孵育的温度为20~40℃、时间为20~40min。
作为优选,所述孵育的温度为25℃、时间为30min。
作为优选,所述DNA探针链为发夹型DNA探针链。
作为优选,所述内切酶为切刻内切酶。
作为优选,所述缓冲液1为Tris缓冲液。
作为优选,所述缓冲液2为NEBuffer溶液。
作为优选,所述吸光度通过紫外-可见光谱检测而得,检测波长为350~700nm。
作为优选,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将浓度为500nM的DNA1、DNA2、DNA3的混合物(混合物中,DNA1、DNA2、DNA3的摩尔比为1:1:1)加热至90℃5min(退火),然后缓慢冷却至室温,得到DNA1/DNA2/DNA3(500nM);将浓度为1μM的发夹型DNA探针链(DNA H)加热至90℃5min(退火),然后缓慢冷却至室温,得到稳定的DNA H(1μM);将10μL待测样本与10μL DNA1/DNA2/DNA3(500nM)、10μL燃料链(500nM)、10μL DNA H(1μM)在1×Tris缓冲液(20mM tris-HCL,100mMNaCl,5mM MgCl2,1U/μL RNase抑制剂,pH 7.4)中混合后,在37℃下反应60min,得到反应液;将6U切刻内切酶Nb.BbvCI和2μL 10×NEBuffer溶液以加入到反应液中,在37℃下酶切30min,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的混合物在80℃下加热20min以使酶失活后,在酶切液中加入40μL浓度为4.5nM的探针-1(即金纳米颗粒1)、40μL浓度为4.5nM的探针-2(即金纳米颗粒2)、40μL浓度为4.5nM的探针-3(即金纳米颗粒3)以及40μL浓度为4.5nM的探针-4(即金纳米颗粒4),在室温(25℃)下反应30min,得到孵育液;使用紫外-可见光检测孵育液的吸光度,检测波长为350~700nm;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标miRNA浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标miRNA的绝对含量。
实验例1:生物传感器构建成功的验证(以let-7a为靶标miRNA,let-7a的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)
1.1实验材料
1.1.1 DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物:化学合成而得,DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,DNA3的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
1.1.2燃料链:化学合成而得,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
1.1.3发夹型DNA探针链(DNA H):化学合成而得,核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
1.1.4修饰有不同ssDNA的金纳米颗粒
1.1.4.1金纳米颗粒的制备
金纳米颗粒的制备采用柠檬酸钠还原法,即在加热煮沸条件下以柠檬酸钠为还原剂和稳定剂将氯金酸还原为金纳米颗粒。具体方法是,将50mL浓度为1mM的HAuCl4加热至沸腾并搅拌,此时一次性在HAuCl4中加入5mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠,得到混合液;待混合液的颜色由最初的淡黄色经过一系列反应最终变为酒红色,保持沸腾并搅拌30分钟以确保反应完全进行后停止加热,再继续搅拌至混合液冷却到室温(25℃),得到金纳米溶液。制得的金纳米溶液中的金纳米颗粒直径约为13nm。
1.1.4.2修饰有不同ssDNA的金纳米颗粒的制备
合成核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的ssDNA1,得到巯基修饰的ssDNA1。用TCEP(终浓度10mM)与巯基修饰的ssDNA1混合孵育1h打断DNA链间的二硫键,得到硫醇化ssDNA1。将10μL浓度为100μM的硫醇化ssDNA1加到1mL 1.1.1部分制备的金纳米溶液中进行混合,得到混合物;将混合物在室温下(25℃)摇动12h,得到反应液;在反应液中逐步加入20μL含2M氯化钠的PBS溶液,得到稳定的金纳米颗粒1,作为探针-1。将制得的探针-1以14000转/分的速度离心20min进行纯化并重新溶解于1mL PBS(pH7.4,0.1M)中,储存在4℃中备用。对制得的探针-1进行琼脂糖凝胶电泳(电泳结果见图2)及紫外可见光谱UV-vis表征(表征结果见图3)。如图2~3所示,裸AuNPs的最大紫外-可见光吸收峰出现在520nm处,修饰上ssDNA后吸收峰发生了红移,峰值出现在525nm,由于AuNPs的最大紫外-可见光吸收峰位置与其直径有直接关联,以上结果说明ssDNA已经成功修饰到AuNPs表面,探针-1制备成功。
合成核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的ssDNA2;合成核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的ssDNA3;合成核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的ssDNA4;按照与制备探针-1同样的方法,制备金纳米颗粒2、金纳米颗粒3、金纳米颗粒4,分别作为探针-2、探针-3、探针-4。将制得的探针-2、探针-3、探针-4分别以14000转/分的速度离心20min进行纯化并分别重新溶解于1mL PBS(pH7.4,0.1M)中,储存在4℃中备用。
1.1.5 let-7a、let-7b、let-7c、let-7e、let-7i:化学合成而得,let-7a的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,let-7b的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,let-7c的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,let-7e的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,let-7i的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
1.2实验方法
1.2.1生物传感器构建成功的验证方法
实验一:为了证实靶标miRNA let-7a引发EDA反应的可行性,进行20%聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。泳道1:DNA1;泳道2,DNA2;泳道3,DNA3;泳道4:DNA1/DNA2/DNA3三链复合物;泳道5:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物反应产物;泳道6:let-7a/DNA2/DNA3三链复合物;泳道7:燃料链;泳道8:燃料链/DNA3双链DNA;泳道9:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物+燃料链反应产物;泳道10:let-7a+DNA1/DNA2/DNA3三链复合物+燃料链+发夹型DNA探针链(DNA H)反应产物;泳道11:DNA2/H双链DNA;泳道12:发夹型DNA探针链(DNA H),每个样品的浓度为1μM。以上反应均在1×Tris缓冲液(20mM tris-HCL,100mM NaCl,5mM MgCl2,1U/μL RNase抑制剂,pH 7.4)中进行,反应条件为:在37℃下反应60min。将以上产物在1×TBE的缓冲液(89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA,pH值8.0)中,在110V的恒定电压条件下,室温(25℃),进行90min 20%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),电泳结束后,使用GelGreen染色10min,在紫外光条件下拍摄,每个泳道的样品浓度为1μM,总体积为10μL(实验结果见图4)。
实验二:为了证实所提出的可视策略对let-7a检测的可行性,进行紫外-可见光吸收峰和照片的检测。实验过程为:实验组:将浓度为500nM的DNA1、DNA2、DNA3的混合物(混合物中,DNA1、DNA2、DNA3的摩尔比为1:1:1)加热至90℃5min(退火),然后缓慢冷却至室温,得到DNA1/DNA2/DNA3(500nM);将浓度为1μM的发夹型DNA探针链(DNA H)加热至90℃5min(退火),然后缓慢冷却至室温,得到稳定的DNA H(1μM);将10μL let-7a(100pM)与10μL DNA1/DNA2/DNA3(500nM)、10μL燃料链(500nM)、10μL DNA H(1μM)在1×Tris缓冲液(20mM tris-HCL,100mM NaCl,5mM MgCl2,1U/μL RNase抑制剂,pH 7.4)中混合后,在37℃下反应60min,得到反应液;将6U切刻内切酶Nb.BbvCI和2μL 10×NEBuffer溶液以加入到反应液中,在37℃下酶切30min,得到酶切液;将熵驱动扩增步骤获得的混合物在80℃下加热20min以使酶失活后,在酶切液中加入40μL浓度为4.5nM的探针-1(即金纳米颗粒1)、40μL浓度为4.5nM的探针-2(即金纳米颗粒2)、40μL浓度为4.5nM的探针-3(即金纳米颗粒3)以及40μL浓度为4.5nM的探针-4(即金纳米颗粒4),在室温(25℃)下反应30min,得到孵育液。以1×Tris缓冲液(20mM tris-HCL、100mM NaCl、5mM MgCl2,pH 7.4)作为let-7a的阴性对照。将实验组和对照组获得的孵育液用多功能酶标仪记录波长范围为350~700nm的紫外-可见吸收光谱(实验结果见图5)。图6为实验二的孵育液颜色照片。图7为实验二中阴性对照组加入金纳米探针后溶液的TEM图。图8为实验二实验组加入金纳米探针后溶液的TEM图。
实验三:为了证实所提出的生物传感器的检测性能,进行灵敏度检测。实验过程为:在实验二的基础上,将let-7a(100pM)分别替换为let-7a(0fM)、let-7a(1fM)、let-7a(10fM)、let-7a(100fM)、let-7a(1pM)、let-7a(10pM)、let-7a(100pM),得到孵育液;将孵育液用多功能酶标仪记录波长范围为350~700nm的紫外-可见吸收光谱(实验结果见图10)。图9为实验三孵育液颜色照片。图11为两处波峰的比值(A530/A650)与let-7a(浓度范围在0pM-1000pM)的定量分析曲线。嵌入图提示两处波峰的比值(A530/A650)在0.01pM-100pM浓度范围内具有良好的线性关系。
实验四:为了证实所提出的生物传感器的检测特异性,选择一系列与let-7a仅相差1~4个核苷酸的let-7a家族成员(let-7b、let-7c、let-7e、let-7i)进行对比实验。实验过程为:在实验三的基础上,将let-7a(100pM)分别替换为let-7b、let-7c(200pM)、let-7e(200pM)、let-7i(200pM),得到孵育液;将孵育液用多功能酶标仪记录波长范围为350~700nm的紫外-可见吸收光谱,以及,A530处波峰值除以A650处的波峰值的吸光峰比值(A530/A650)(实验结果见图12)。
1.3实验结果
1.3.1生物传感器构建成功的验证实验结果
实验一:如图4所示,1~4、6、7、8、11、12号泳道分别对应DNA1、DNA2、DNA3、DNA1/DNA2/DNA3三链复合物、let-7a/DNA2/DNA3三链复合物、燃料链、燃料链/DNA3双链DNA、DNA2/H双链DNA和DNA H。在DNA1/DNA2/DNA3三链复合物中加入let-7a后,观察到一条新的条带(泳道5),该条带与let-7a/DNA2/DNA3三链复合物的位置相同(泳道6),说明let-7a可以取代DNA1/DNA2/DNA3三链复合物中的DNA1,形成let-7a/DNA2/DNA3三链复合物。在let-7a、DNA1/DNA2/DNA3三链复合物和燃料链存在的情况下,观察到一条明显的亮带(泳道9),该亮带与燃料链/DNA3双链DNA处于同一位置(泳道8)。同时,在DNA2的同一位置出现了一条弱带(泳道2)。这些结果表明,燃料链/DNA3双链DNA形成,DNA2从DNA1/DNA2/DNA3三链复合物中被释放出来。此外,在let-7a、DNA1/DNA2/DNA3三链复合物和燃料链的混合物中引入DNA H后,在DNA2/H双链DNA的同一位置可以看到一条新的带子(泳道10、泳道11),表明DNAH可以与EDA反应中释放的DNA2杂交,形成DNA2/H双链。
实验二:如图5、7所示,在没有let-7a的情况下,在530nm处有明显的紫外-可见吸收(曲线b),说明探针(AuNPs)分散良好。如图6、8所示,AuNPs溶液的颜色为酒红色,说明在没有miRNA的情况下没有启动EDA,因此没有产生连接链来触发AuNPs探针的聚集,而一旦将100pM let-7a加入到生物传感器中,就能观察到530nm处的微弱紫外光吸收峰(曲线b),AuNPs溶液的颜色也变成紫色,表明AuNPs的聚集是由于通过内切酶产生的连接链(linker)的数量。这些结果证实,所提出的可视化检测let-7a的策略可行。
实验三:如图9所示,在最佳条件下,随着let-7a浓度的增加,检测液的颜色逐渐由红色变为紫色,说明AuNPs的聚集对let-7a浓度呈剂量依赖性反应。如图10所示,UV-vis波峰大小与let-7a浓度也呈剂量依赖性。如图11所示,随着let-7a浓度的增加,波长为530nm的紫外可见光吸光度降低,在从0.01pM到100pM的范围内,可以得到一个良好的线性关系,该线性方程为:Y=-0.46X+2.46,R2为0.9924,其中,Y为吸收峰比值(A530/A650),X为let-7a的浓度,3σ对应的检测限(LOD)为3.13fM。
实验四:如图12所示,由于序列中的错位碱基不能激活EDA过程,因此let-7a表现出比其他let-7miRNA家族成员低得多的吸光比(A530/A650)。这些结果表明,实施例1的生物传感器具有良好的特异性,可以区分let-7a与同类miRNAs成员之间的差异。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 无锡市第二人民医院
<120> 基于熵驱动的可视miRNA生物传感器及其应用
<130> WXHA202100003
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatggtgag gtag 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccctcagcc aatt 14
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aactatacaa cctactacct caccatggaa ttggctgag 39
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccaattcca tggtgaggta gtaggttgta 30
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgattcctg aggttcaaat tggctgaggg gacgtgggta ggaatca 47
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcaggaatc attttttttt tt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttttttttt gccaatttga ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacgtcccct catttttttt tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttttttttt atgattccta cc 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
ugagguagua guuugugcug u 21
Claims (10)
1.一种生物传感器,所述生物传感器用于检测样本中的靶标物,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,其特征在于,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物1,燃料链,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5,以及,修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述ssDNA5和ssDNA6分别与DNA2的不同区域互补,使得DNA2被释放后,修饰有若干ssDNA5的金纳米颗粒5和修饰有若干ssDNA6的金纳米颗粒6能够通过ssDNA5和ssDNA6与DNA2互补序列间的杂交诱导发生聚集;
或者,所述生物传感器包括由DNA1、DNA2和DNA3杂交而成的三链复合物,燃料链,DNA探针链,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1,修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3,以及,修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4;所述DNA3依次含有粘性末端,与DNA1互补的第一互补区域,以及,与DNA2互补的第二互补区域,其中,粘性末端用于与靶标物结合来触发熵驱动扩增反应,使得靶标物、DNA2和DNA3杂交形成三链复合物2,同时,使得DNA3上暴露出一个能够与燃料链结合的粘性区域;所述燃料链与DNA3互补,使得粘性区域与燃料链结合后,三链复合物2的DNA2能够被释放;所述DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有内切酶识别区域的双链DNA,在内切酶的作用下,双链DNA至少能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2;所述ssDNA1和ssDNA2分别与游离DNA片段1的不同区域互补,使得游离DNA片段1被释放后,修饰有若干ssDNA1的金纳米颗粒1和修饰有若干ssDNA2的金纳米颗粒2能够通过ssDNA1和ssDNA2与游离DNA片段1互补序列间的杂交诱导发生聚集;所述ssDNA3和ssDNA4分别与游离DNA片段2的不同区域互补,使得游离DNA片段2被释放后,修饰有若干ssDNA3的金纳米颗粒3和修饰有若干ssDNA4的金纳米颗粒4能够通过ssDNA3和ssDNA4与游离DNA片段2互补序列间的杂交诱导发生聚集。
2.如权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述粘性区域位于靶标物和DNA2之间。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器,其特征在于,所述DNA探针链为发夹型DNA探针链;所述内切酶为切刻内切酶;所述发夹型DNA探针链用于与DNA2杂交形成含有切刻内切酶识别区域的双链DNA,在切刻内切酶的作用下,双链DNA能够释放出游离DNA片段1和游离DNA片段2。
4.如权利要求1~3任一项所述的生物传感器,其特征在于,所述靶标RNA包括靶标miRNA;所述靶标miRNA包括let-7a、miRNA-141、miRNA-145、miRNA-21或miRNA-25。
5.如权利要求4所述的生物传感器,其特征在于,当靶标miRNA为let-7a时,所述DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述DNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述燃料链的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述发夹型DNA探针链的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,所述ssDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,所述ssDNA3的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示,所述ssDNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.一种定量检测样本中靶标物的方法,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA,其特征在于,所述方法使用权利要求1~5任一项所述的生物传感器,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5和金纳米颗粒6进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3和金纳米颗粒4进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;
检测步骤:在熵驱动扩增步骤获得的反应液中加入金纳米颗粒5、金纳米颗粒6和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量;
或者,所述方法包括如下步骤:
熵驱动扩增步骤:将待测样本、三链复合物1、燃料链、DNA探针链和RNase抑制剂在缓冲液1中混合后进行反应,得到反应液;在反应液中加入内切酶进行酶切,得到酶切液;
检测步骤:将熵驱动扩增步骤获得的酶切液灭酶后,在酶切液中加入金纳米颗粒1、金纳米颗粒2、金纳米颗粒3、金纳米颗粒4和缓冲液2进行孵育,得到孵育液;检测孵育液的吸光度;根据孵育液的吸光度,以及,吸光度与靶标物浓度之间的线性关系,计算得到待测样本中靶标物的绝对含量。
8.如权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述吸光度与靶标物浓度之间的线性关系的获得方法为:配置不同浓度的靶标物溶液;检测不同浓度的靶标物溶液的吸光度;根据靶标物溶液的浓度和测得的不同浓度的靶标物溶液的吸光度绘制标准曲线,得到吸光度与靶标物浓度之间的线性关系。
9.如权利要求6~8任一项所述的方法,其特征在于,所述反应的温度为25~37℃、时间为40~80min。
10.权利要求1~5任一项所述的生物传感器或权利要求6~9任一项所述的方法在定量检测靶标物中的应用,所述靶标物包括靶标RNA或靶标DNA。
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CN114085890A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-02-25 | 苏州科技大学 | miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒 |
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-
2021
- 2021-03-24 CN CN202110313844.1A patent/CN113201581A/zh not_active Withdrawn
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CN114085890A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-02-25 | 苏州科技大学 | miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒 |
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CN114934046A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-23 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 熵驱动DNA链置换四面体的microRNA检测方法及其应用 |
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