CN114231632B - 一种可刺激性响应的dna水凝胶微针贴片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片及其制备方法与应用,其中,方法包括步骤:提供DNA水凝胶和燃料链;将所述DNA水凝胶、燃料链、甲基丙烯酸化透明质酸(MeHA)和光引发剂苯基‑2,4,6‑三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)溶液混合,得到混合溶液;将所述混合溶液加入到预制的聚二甲基硅氧烷微针阴模中,离心处理后再经过光照固化处理,制得可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片。本发明采用MeHA溶液和DNA水凝胶作为微针材料,利用掩模法,将检测miRNA的DNA水凝胶加载到微针上,在提高微针力学性能和膨胀率的同时,待检测miRNA可以触发粘性末端介导的DNA链置换反应,催化裂解交联点产生放大的荧光信号,从而实现原位灵敏地检测ISF中的生物标志物miRNA。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片及其制备方法与应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是细胞内的一种内源性非编码小分子单链RNA,一般由19-23个碱基组成。作为转录后调节因子,它们参与细胞分化、进展和发育等生物学过程。大量研究表明miRNA的调控过程对于以更少的时间和试剂消耗获得更准确的信息具有特别重要的意义。不幸的是,外周系统中循环的miRNA丰度极低,而成熟的miRNA长度较短,直接阻碍了聚合酶链式反应(PCR)引物的设计,因此对微量循环miRNA的灵敏快速定量检测仍然是一个巨大的挑战。血液是测量系统生物标志物的黄金标准生物基质。然而,现如今间质液体(ISF)分析越来越受欢迎,这是因为这种生物液体无处不在,而且与血液不同,它不会凝固。ISF占总体重的15%到20%,在毛细血管内的细胞和血液之间持续的细胞间交换和生物标志物转移方面起着核心的生理作用。最近的实验证据表明,以前在血液中发现的所有种类的RNA(包括miRNA)以相似的比例存在于间质液体中,这种体液是一种被大大忽视的个性化医学生物标志物来源。皮肤ISF存在于皮肤表面几百微米的范围内,主要存在于结缔组织真皮中,那里只有几个毛细血管床和痛觉感受器。因此,可以在无痛的方式下对其进行采样,而不会有任何血液污染的风险。这些初步结果证实了ISF作为血液替代品用于诊断和监测健康状况的潜力。为了达到这一目标,有必要快速采集少量微升的这种生物流体。
然而,目前的ISF收集技术,如离子导入、透析或通过吸引形成水泡,除了需要昂贵和笨重的仪器以及训练有素的人员外,仍然是有创和耗时的。此外,这些技术可能会造成局部组织损伤,从而潜在地改变ISF的局部生物标记物组成,或者破坏皮肤毛细血管,使得收集的ISF被污染。最近,微针(MNs)被提出作为一种创新的皮肤ISF微创提取方法来评估临床生物标志物的存在。它们通常是由玻璃、金属、硅或其他聚合物材料制成的一系列微米尺度空心、实心或多孔针组成。它们通常排列成阵列,并且可以通过微制造方法精细地裁剪成各种形状。微针由于长度足够短,可以避免接触到位于真皮深层的痛觉感受器。因此,它们的患者依从性很好,并且耐受性好,不会导致皮肤水肿或产生红斑。传统的硅或玻璃空心MNS是一种非常有用的有创采样技术,用于通过真空诱导吸力或毛细管力实现ISF提取路径。然而,它们在使用后可能会对环境造成破坏。利用吸水性良好的水凝胶材料在设计MNS时受到了极大的关注。例如,Chenjie Xu等报道了一种可快速提取皮肤间质液进行及时代谢分析的可膨胀微针贴片,但是提取的ISF代谢物需要通过离心从MN贴片中回收,用于随后的代谢物(如葡萄糖和胆固醇)的离线分析。(A Swellable Microneedle Patch to RapidlyExtract Skin Interstitial Fluid for Timely Metabolic Analysis)Sei Kwang Hahn等设计了一种在内窥镜原位肿瘤诊断中实时电检测一氧化氮的微针生物传感器,但是微针制备过程比较繁琐,并且需要搭配价格高昂的仪器设备使用。(Microneedle Biosensorfor Real-Time Electrical Detection of Nitric Oxide for In Situ CancerDiagnosis During Endomicroscopy)Jilie Kong等报道了一种穿戴式微针贴片用于原位采集和监测真皮间质液中EB病毒的脱氧核糖核酸,但是需要可穿戴式微流控电化学重组酶聚合酶扩增技术支持。尤其是ISF中的miRNA表达水平低并且水凝胶微针样本提取量有限,通过微针对miRNA检测是一个巨大的挑战。DNA水凝胶包括纯DNA水凝胶和杂化DNA水凝胶两种形式,纯DNA水凝胶由DNA构建块自组装而成;杂化DNA水凝胶是将DNA交联剂接枝到合成聚合物上。DNA水凝胶具有亲水性的三维网络结构,由于其独特而迷人的性质,包括生物相容性、生物降解性、可吸收性和包封性,引起了人们的极大兴趣。生物刺激的响应性DNA水凝胶已广泛应用于细胞工程、生物传感系统和药物输送等领域。然而,现有技术并没有有关将DNA水凝胶用于制备微针以实现生物标志物miRNA原位同步检测的报道。
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片及其制备方法与应用,旨在解决现有微针机械强度不足、吸水膨胀率较低以及无法实时检测生物标志物miRNA的问题。
本发明的技术方案如下:
一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,包括步骤:
提供一种DNA水凝胶,所述DNA水凝胶由分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的6条DNA链制成,其中,S3中序列设置有荧光基团,S6中序列设置有荧光猝灭基团,所述S3左右两端分别和S2和S4结合,S1与S2结合,S5和S6结合在S3的中间区域,所述S3中间区域为生物标志物miRNA的刺激响应位点;
提供一种燃料链,所述燃料链用于与所述S3结合后将生物标志物miRNA和S5从所述S3中置换下来;
将所述DNA水凝胶、燃料链、甲基丙烯酸化透明质酸溶液和光引发剂混合,得到混合溶液;
将所述混合溶液加入到预制的聚二甲基硅氧烷微针阴模中,离心处理后再经过光照固化处理,制得可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述S3保留了与生物标志物miRNA结合的第一粘性末端。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述生物标志物miRNA与S3结合后将S6置换下来,并暴露出S3的第二粘性末端。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述燃料链从所述第二粘性末端位置结合在S3上,并将S5和生物标志物miRNA置换下来。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述聚二甲基硅氧烷微针阴模的制备包括步骤:
将聚二甲基硅氧烷和固化剂混合,将混合液浇筑在金属商业微针模板表面,抽真空去除气体中的气泡;
将浇筑了混合液的金属商业微针模板放入烘箱中进行加热固化,冷却后将固化的聚二甲基硅氧烷与金属商业微针模板分离,得到聚二甲基硅氧烷微针阴模。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述MeHA溶液的浓度为20-50mg/mL。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述荧光基团为FAM,荧光猝灭基团为BHQ1。
所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其中,所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP),所述光固化处理为蓝光照射,时间为5-30s。
一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片,其中,采用本发明所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法制得。
一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的应用,其中,将本发明所述的可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA。
有益效果:本发明提供了一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,采用MeHA和DNA水凝胶作为微针材料,利用掩模法,将检测miRNA的DNA水凝胶加载到微针上,在提高微针力学性能和膨胀率的同时,待检测miRNA可以触发粘性末端介导的DNA链置换反应,催化裂解交联点产生放大的荧光信号,从而实现原位灵敏地检测ISF中的生物标志物miRNA。
附图说明
图1为本发明一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明DNA水凝胶的结构示意图。
图3为本发明DNA水凝胶的链置换过程原理图。
图4a为S1与S2的碱基配对结合图。
图4b为S2与S3的碱基配对结合图。
图4c为S3与S4的碱基配对结合图。
图4d为S3与S5的碱基配对结合图。
图4e为S3与S6的碱基配对结合图。
图4f为S4与S2的碱基配对结合图。
图4g为miRNA-155与S3的碱基配对结合图。
图4h为燃料链与S3的碱基配对结合图。
图5为本发明制备的DNA水凝胶的TEM图像。
图6为本发明制备的MeHA/DNA-MNs贴片的机械压缩试验图。
图7为本发明制备的MeHA/DNA-MNs的溶胀率表征图。
图8为实施例1制得的MeHA/DNA-MNs贴片在琼脂糖凝胶中暴露于不同浓度miRNA-155后的荧光图。
图9为实施例2制得的MeHA/DNA-MNs贴片插入新鲜猪尸体皮肤的荧光图。
图10为实施例3制得的MeHA/DNA-MNs贴片插入经MCF-7癌细胞处理和未处理的小鼠背部的荧光图。
具体实施方式
本发明提供一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片及其制备方法与应用,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
请参阅图1,图1为本发明提供的一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法较佳实施例的流程图,如图所示,其包括步骤:
S10、提供一种DNA水凝胶,所述DNA水凝胶由分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的6条DNA链制成,其中,S3中序列设置有荧光基团,S6中序列设置有荧光猝灭基团,所述S3左右两端分别和S2和S4结合,S1与S2结合,S5和S6结合在S3的中间区域,所述S3中间区域为生物标志物miRNA的刺激响应位点;
S20、提供一种燃料链,所述燃料链用于与所述S3结合后将生物标志物miRNA和S5从所述S3中置换下来;
S30、将所述DNA水凝胶、燃料链、甲基丙烯酸化透明质酸溶液和光引发剂混合,得到混合溶液;
S40、将所述混合溶液加入到预制的聚二甲基硅氧烷微针阴模中,离心处理后再经过光照固化处理,制得可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片。
本实施例采用MeHA和DNA水凝胶为微针材料,利用掩模法,将检测miRNA的DNA水凝胶加载到微针上,在提高微针力学性能和膨胀率的同时,待检测miRNA可以触发粘性末端介导的DNA链置换反应,催化裂解交联点产生放大的荧光信号,从而实现原位灵敏地检测ISF中的生物标志物miRNA。本发明方法所用设备简单、操作安全,制得微针贴片成分简单,生物相容性较好,且机械性能良好,足够插入皮肤表层,并且可以在短时间内提取足够的皮肤间质液。
具体来讲,DNA采用双螺旋结构,由A和T与G和C碱基对之间氢键配对建立的作用力,这两个单链组分是反向平行的;螺旋是拓扑线性的;这些是DNA能集成三维结构的关键特性。基于DNA严格遵循碱基互补配对原则人类可以根据预期目标设计并组装成三维DNA纳米结构。DNA自组装也可以用来设计和构建DNA水凝胶。DNA水凝胶是DNA分子自组装形成的一种介于流体和固体之间的亲水材料,一般为宏观可见的水凝胶材料。DNA水凝胶是由许多序列互补的DNA链通过相互杂交形成的三维网络结构。和其他材料形成的水凝胶相比,DNA水凝胶具有许多优势,如生物相容性好、可生物降解、以及具备多种可设计的刺激响应单元等,因此DNA水凝胶的设计和制备成为近年来广泛关注的焦点。本实施例选用DNA水凝胶和MeHA作为微针的主要材料,一方面DNA非常稳定,尽管DNA可以通过加热变性,但在较低的温度下很容易发生复活;其次,DNA折叠遵循简单的碱基互补配对原则,可以准确预测DNA二级结构。因此,可以用最少的关于DNA三维结构的信息来设计材料。第三,DNA合成和修饰比较简便可以结合各种光学信号机制,因此本实施例在DNA水凝胶里设计了荧光基团和荧光猝灭基团,以此来产生荧光信号。另一方面MeHA交联之后具有很好的机械性能和吸水膨胀性能。
在本实施例中,所述DNA水凝胶由分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的6条DNA链制成,其中,S3中序列设置有荧光基团,S6中序列设置有荧光猝灭基团,所述S3左右两端分别和S2和S4结合,S1与S2结合,S5和S6结合在S3的中间区域,所述S3中间区域为生物标志物miRNA的刺激响应位点。所述DNA水凝胶是针对靶标miRNA系列,设计DNA片段碱基序列,根据碱基互补配对原则,自组装成的一种短链DNA自组装微凝胶。
以乳腺癌标志物miRNA-155的碱基序列为出发点举例,首先根据miRNA-155的碱基序列设计S3链。其中,miRNA-155的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,其序列为:UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG;
所述S3的碱基序列如SEQ ID NO.2所示,其序列为:
CTCTAAAACCCCGTCGACACCCCTAT/FAM/CACGATTAGCATTAAGTTCCGGTGAAGGATGCCTGGCACCATGTTATCTCGTACTAT;
基于碱基互补原则,根据所述S3设计S2、S4、S5和S6,根据S2设计S1,所述S1的碱基序列如SEQ ID NO.3所示,其序列为:
AGTCGTTAACTATGACGTCTAAACTTATGATCAGA;
所述S2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示,其序列为:AGACGTCATAGTTAACGACTTCTGATCATAAGTTTATAGTACGAGATAACATG;
所述S4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示,其序列为:
GTCGACGGGGTTTTAGAGCATGTTATCTCGTACTAT;
所述S5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示,其序列为:
GTGCCAGGCATCCTTCAC;
所述S6的碱基序列如SEQ ID NO.7所示,其序列为:
CGGAACTTAATGCTAATCGT/BHQ1/。
在本实施例中,如图2、图3以及图4a图4f所示,所述S3的左右两端序列分别和S2和S4结合,中间部分序列为miRNA-155的刺激响应位点,S5、S6也与所述S3结合,在所述S3链和S6链上修饰了荧光基团和荧光猝灭基团。如图3所示,所述S3链上保留了第一粘性末端(即粘性末端1),以便于miRNA-155从该位置结合在S3链上(如图4g所示),并将S6置换下来使荧光恢复;进一步地,如图3所示,当所述miRNA-155结合在S3链上后,会使S3暴露出第二粘性末端(即粘性末端2),此时燃料链会从所述第二粘性末端位置开始结合在S3中,并将S5链和miRNA-155从S3中置换下来,释放的miRNA-155进一步诱导另一个循环用于扩增检测。所述燃料链与所述S3的互补序列多于生物标志物miRNA-155与所述S3的互补序列,其结构更稳定,因此容易将S5链和miRNA-155从S3中置换下来。所述燃料链的的碱基序列如SEQ IDNO.8所示,其序列为:ATCCTTCACCGGAACTTAATGCTAATCGT。
本实施例中,由于S5事先结合在S3链上将第二粘性末端封堵,所以当miRNA-155不存在的时候,燃料链是不会将S6置换下来产生荧光信号的。为了使荧光信号最大化我们在支链的基础上加入S1、S2链,S1、S2链部分互补延伸,并且S2另一端和S3链结合,这样6条链基于碱基互补配对和能量最低原则可以自组装成DNA水凝胶微球。
本实施例设计的DNA水凝胶并不限于上述实施例,所述DNA水凝胶只需要改变和miRNA结合的部分序列就可以对另一种miRNA进行检测。
在一些实施方式中,所述荧光基团为FAM,但不限于此;所述荧光猝灭基团为BHQ1,但不限于此。
在一些实施方式中,所述MeHA溶液的制备包括步骤:向透明质酸(HA)溶液中加入甲基丙烯酸酐(MA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF),调节pH为8-10,室温反应12-24h后,制得所述MeHA溶液。
在一些实施方式中,所述DNA水凝胶的制备包括以下步骤:
首先将分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的DNA链粉末溶解在磷酸盐缓冲溶液(PBS,10μM,pH7.2-7.4)中,配制成100μM的DNA原始溶液;
其次将S1、S2、S3、S4、S5和S6原始溶液各取10μL分装在pcr管中,放入pcr仪中95℃退火4min,并冷却至4℃至少2.5h;
然后将S1(100μM,10μL)和S2(100μM,10μL)的DNA溶液混合,在37℃孵育4h,制备主链部分;将S3(100μM,10μL)、S4(100μM,10μL)、S5(100μM,10μL)和S6(100μM,10μL)混合,在37℃孵育4h,制备支链部分;
最后将主链部分和支链部分混合,在37℃孵育4h,制备DNA水凝胶,所述DNA水凝胶的透射电镜图如图5所示。
在一些实施方式中,MeHA的制备包括步骤:
首先将2.0g HA溶解在100mL去离子水中,并在4℃下连续搅拌过夜;
然后将66.7mL DMF和2.38mL MA分别滴加到上述溶液中;
其次用1M NaOH将溶液的pH调节到pH 8-9,反应在4℃下连续搅拌18h;最后向反应液中加入氯化钠(NaCl),使NaCl浓度达到0.5M,然后在乙醇中沉淀出MeHA。沉淀用乙醇洗涤三次,然后溶解在去离子水中,溶液与去离子水透析5-7天,纯化产物冷冻干燥,得到MeHA。
本实施例中,所述透明质酸的分子量优选为200-400kDa。
在一些实施方式中,交联微针(MNs)贴片的制备具体包括步骤:
将MeHA(20-50mg mL-1)、LAP(2-3mg mL-1)、DNA水凝胶(100-500nM)和燃料链(200-1000nM)溶于PBS,混合物被浇注到PDMS模具中,直到填满模腔;然后将PDMS模具在3500-5000rpm下离心4-6分钟,迫使材料进入针孔;之后暴露在蓝光下5-30s;最后在20-30℃干燥12-15小时后,MeHA/DNA-MNs贴片被小心地从模具中分离出来并进行修剪,即制得微针贴片。
在本实施例中,根据交联度的区别,交联时间较长时,微针的机械性能比较好,但是膨胀率会显著降低,交联时间较短时,微针的吸水膨胀率较高,但是机械性能又会变差。本实施例对不同蓝光照射时间下制得的微针贴片的机械性能和膨胀性能进行了测试,结果分别如图6和图7所示,从图6和图7可以看出,综合考虑蓝光照射时间为10-20s是制备微针贴片的最佳选择,其机械性能和膨胀性能较佳。而LAP光引发剂用405nm光源即可引发,细胞毒性小,生物相容性好,作用浓度低,固化时间短,可达到微量高效的效果。本实施例系统研究并优化了实验参数(包括:离心转速、时长、光照时间、干燥温度),通过调控离心转速、时长、和优化光照时间,成功制备出形貌良好的微针贴片。本实施例中,所述加入的燃料链浓度为DNA水凝胶浓度的两倍。
在一些实施方式中,还提供一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片,其采用本发明所述可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法制得。本发明制备的微针贴片可实现体内miRNA的原位检测,且解决了水凝胶微针贴片力学性能不足,样品提取量太少,需要对样品进行离心分离后再进行检测,操作步骤繁琐等技术问题。
在一些实施方式中,还提供一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的应用,其中,将本发明所述的可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片用于检测组织间隙液中乳腺癌标志物miRNA。作为举例,所述乳腺癌标志物为miRNA-155。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明:
实施例1
1)MeHA溶液的制备:称取2.0g HA溶解在100mL去离子水中,并在4℃下连续搅拌过夜。然后将66.7mL DMF和2.38mL MA分别滴加到溶液中。其次用1M NaOH将溶液的pH调节到pH 8~9,反应在4℃下连续搅拌18h。最后向反应液中加入NaCl,使NaCl浓度达到0.5M,然后在乙醇中沉淀出MeHA。沉淀用乙醇洗涤三次,然后溶解在去离子水中,透析5-7天以纯化产物(截留量12~14KDa透析袋),冷冻干燥得到固体产物并在4℃下储存;所述固体产物溶于去离子水中,得到MeHA溶液。
2)DNA凝胶的制备:将分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的DNA链粉末溶解在PBS(10μM,pH7.2~7.4)中,配制成100μM的DNA原始溶液。其次将S1、S2、S3、S4、S5和S6原始溶液各取10μL分装在pcr管中,放入pcr仪中95℃退火4min,并冷却至4℃至少2.5h。然后将S1(100μM,10μL)和S2(100μM,10μL)的DNA溶液混合,在37℃孵育4h,制备主链部分。将S3(100μM,10μL)、S4(100μM,10μL)、S5(100μM,10μL)和S6(100μM,10μL)混合,在37℃孵育4h,制备支链部分。最后将主链部分和支链部分混合,在37℃孵育4h,制备DNA水凝胶。
3)微针贴片的制备:用PBS配制1.5mL浓度为2.5mg/mL的LAP溶液,加入45mgMeHA,24μLDNA凝胶,使得MeHA的浓度为30mg/mL,DNA凝胶的浓度为100nM。取1.00mL混合均匀的预聚体溶液加入模具中,离心(4000rmp,5min)确保溶液进入模腔,蓝光照射10s固化。最后,MNs在室温下干燥,并在使用前储存在4℃。
4)配制含有不同浓度miRNA-155的琼脂糖凝胶。取25mLPBS,0.5g琼脂糖加入100mL烧杯中,放入微波炉微波30秒,取出烧杯摇匀,重复三次以使琼脂糖完全溶解。取3个共聚焦皿分别加入5mL琼脂糖溶液,加入不同量miRNA-155,充分混匀,使得最终凝固的琼脂糖凝胶中miRNA-155浓度分别为0nM、10nM和500nM。
5)将制备好的微针贴片拇指按压进琼脂糖凝胶中,37℃孵育4h,然后用激光共聚焦显微镜成像。
所述方法制备的微针贴片可以插入掺有不同浓度miRNA-155的琼脂糖凝胶中,随着miRNA-155浓度增加,荧光信号增强,如图8所示。
实施例2:
1)MeHA溶液的制备:同实施例1中的步骤1。
2)DNA凝胶的制备:同实施例1中的步骤2。
3)微针贴片的制备:同实施例1中的步骤3。
4)皮肤模型制备:将新鲜猪皮用水洗涤(3次)并转移到培养皿中,实验组用浓度为1μM的miRNA-155溶液浸泡24小时,用PBS冲洗表面附着的miRNA-155。对照组用PBS浸泡24小时。
5)将制备好的微针贴片拇指按压进猪皮模型中,37℃孵育4h,然后用激光共聚焦显微镜成像。
所述方法制备的微针贴片可以插入猪皮模型中,与未经miRNA-155预处理的对照相比,经miRNA孵育的猪皮肤中的MNs具有较强的荧光,如图9所示。
实施例3:
1)MeHA溶液的制备:同实施例1中的步骤1。
2)DNA凝胶的制备:同实施例1中的步骤2。
3)微针贴片的制备:同实施例1中的步骤3。
4)肿瘤小鼠模型的建立:将6只小鼠随机分成两组(每组三只小鼠)进行不同的处理。在对照组中,PBS(pH7.4,80μL,10mM)皮下注射到每个小鼠的右腋下。在24小时内给小鼠提供食物和循环水。温度约为24℃。在实验组中,将含有5×106个MCF-7细胞的PBS(pH7.4,80μL,10mM)皮下注射到每只小鼠的右腋下以获得患癌小鼠。饲养环境与对照组相同。肿瘤的体积用以下公式计算:体积=(肿瘤长度)×(肿瘤宽度)2/2。当肿瘤大小达到约80mm3时,将MNs贴片压入肿瘤位置的皮肤中。然后用医用胶带固定。4小时后,将MNs拔出进行荧光成像。结果如图10所示,从图10可以看出本实施例方法制备的微针贴片可以插入小鼠皮肤中与未携带肿瘤的小鼠相比,MNS穿透荷瘤小鼠皮肤的荧光强度明显增强。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种可刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片及其制备方法与应用
<160> 8
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
uuaaugcuaa ucgugauagg gg 22
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
ctctaaaacc ccgtcgacac ccctatcacg attagcatta agttccggtg aaggatgcct 60
ggcaccatgt tatctcgtac tat 83
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
agtcgttaac tatgacgtct aaacttatga tcaga 35
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
agacgtcata gttaacgact tctgatcata agtttatagt acgagataac atg 53
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
gtcgacgggg ttttagagca tgttatctcg tactat 36
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
gtgccaggca tccttcac 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
cggaacttaa tgctaatcgt 20
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
atccttcacc ggaacttaat gctaatcgt 29
Claims (6)
1.一种用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其特征在于,包括步骤:
提供一种DNA水凝胶,所述DNA水凝胶由分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6的6条DNA链制成,其中,S3中序列设置有荧光基团,S6中序列设置有荧光猝灭基团,所述S3左右两端分别和S2和S4结合,S1与S2结合,S5和S6结合在S3的中间区域,所述S3中间区域为生物标志物miRNA的刺激响应位点;所述S3保留了与生物标志物miRNA结合的第一粘性末端;
提供一种燃料链,所述燃料链用于与所述S3结合后将生物标志物miRNA和S5从所述S3中置换下来;所述生物标志物miRNA与S3结合后将S6置换下来,并暴露出S3的第二粘性末端;所述燃料链从所述第二粘性末端位置结合在S3上,并将S5和生物标志物miRNA置换下来;
将所述DNA水凝胶、燃料链、甲基丙烯酸化透明质酸溶液和光引发剂混合,得到混合溶液;
将所述混合溶液加入到预制的聚二甲基硅氧烷微针阴模中,离心处理后再经过光照固化处理,制得刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片;
其中,所述S1的碱基序列如SEQ ID NO.3所示,所述S2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示,所述S3的碱基序列如SEQ ID NO.2所示,所述S4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示,所述S5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示,所述S6的碱基序列如SEQ ID NO.7所示,所述燃料链的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其特征在于,所述聚二甲基硅氧烷微针阴模的制备包括步骤:
将聚二甲基硅氧烷和固化剂混合,将混合液浇筑在金属商业微针模板表面,抽真空去除气体中的气泡;
将浇筑了混合液的金属商业微针模板放入烘箱中进行加热固化,冷却后将固化的聚二甲基硅氧烷与金属商业微针模板分离,得到聚二甲基硅氧烷微针阴模。
3.根据权利要求1所述用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其特征在于,所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液的浓度为20-50mg/mL。
4.根据权利要求1所述用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其特征在于,所述荧光基团为FAM,荧光猝灭基团为BHQ1。
5.根据权利要求1所述用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法,其特征在于,所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂,所述光照固化处理为405nm蓝光照射,时间为5-30s。
6.一种用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片,其特征在于,采用权利要求1-5任一所述用于检测组织间隙液中癌症标志物miRNA的刺激性响应的DNA水凝胶微针贴片的制备方法制得。
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