CN104999069A - 一种dna催化循环网络诱导的dna-纳米金组装方法及其在单碱基突变检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法以及此种方法在单碱基突变检测中的应用。本发明提供的检测手段操作方便，在常温下反应即可，尤其是DNA-纳米金复合物是非特异性的，无需重新制备，极大地降低了实验工作量的同时也方便此技术用于不同DNA目标链的检测。在实际检测中通过颜色差异以及紫外可见分光光度计就可以进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分子检测技术领域，具体涉及一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法以及此种方法在单碱基突变检测中的应用。
背景技术
单碱基突变是一种普遍存在的基因变异种类，在人类基因组中几乎有1％的等位基因会出现单碱基突变。单碱基突变的检测现在也开始越来越受关注，因为在人类DNA基因序列中的变异对疾病的诊断以及药物设计都具有很大的意义。
目前为止，实现单碱基突变检测的方法有很多种，其中重要的方法有酶辅助方法以及DNA杂交的方法。酶辅助的方法可以在室温下操作并且具有很高的灵敏度以及强的特异性，但是操作的过程复杂，反应体系的特异性跟酶的活性相关。在DNA杂交的方法中主要存在荧光标记方法以及纳米金标记的比色法，纳米金比色法相对于荧光标记的方法的优势在于可以有效的克服荧光淬灭的影响并且无需使用复杂的仪器设备检测。
在目前已经实现的纳米金辅助的DNA单碱基突变检测手段中主要有纳米金均相反应体系以及纳米金颗粒参与的微阵列体系。利用纳米金的均相反应实现单碱基突变的检测技术首先由Mirkin提出[Mirkin CA.Science1997.227,1078]，该技术的关键则是利用互补的杂交链存在发生单碱基突变以后Tm值的变化，通过控制实验温度就可以有效区分开存在单碱基突变的体系。而纳米金参与的微阵列体系[Mirkin CA.Science 2000.289,1757]具有更高的灵敏度。但是操作中反复的冲洗步骤是实验的关键所在，因此增加了该技术在实际应用中的难度。
发明内容
为了克服现有技术中在DNA单碱基突变上检测的困难，本发明人进行了深入研究，发明了一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法，本方法操作简单，并且实验用到的DNA-纳米金复合物无需重新制备，只要变化DNA催化循环网路就可满足于不同DNA检测的需求，这极大地降低了实验工作量的同时也让该方法变得更为简便实用。此方法在单碱基突变的检测中效果十分突出，与完全互补目标链相比发生单碱基突变的DNA目标链实验现象差异巨大，不同单碱基突变位点发生的任何突变(错配，插入，删除)在此方法中均可实现检测。因此，相信此方法可以在以后应用于实际检测中。
具体地，本发明提供以下各项：
1.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的试剂盒，其中包括：
1)DNA底物链，所述DNA底物链由连接链和保护链杂交而成，其中所述连接链从5’端到3’端依次由区域1、区域2、区域3、区域4、区域5连接而成，所述保护链从3’端到5’端依次由任选的区域a*、区域2*、区域3*、区域4*、区域6*连接而成，其中，区域2、区域3、区域4组成的连接链中间部分与区域2*、区域3*、区域4*组成的保护链中间部分完全互补，保护链除任选的区域a*和区域2*外的其它部分与目标链互补，区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端；
2)燃料链，所述燃料链为与保护链互补的单链DNA；
3)连接有纳米金1的DNA双链1和连接有纳米金2的DNA双链2，其中，所述DNA双链1由纳米金连接链1和纳米金保护链1杂交而成，所述DNA双链2由纳米金连接链2和纳米金保护链2杂交而成，所述纳米金连接链1从3’端到5’端依次由区域7*、区域1*、区域2*连接而成，所述纳米金保护链1由区域1组成，所述纳米金连接链2从3’端到5’端依次由区域4*、区域5*、区域8*连接而成，所述纳米金保护链2由区域5组成，其中，所述DNA双链1和所述DNA双链2分别通过区域7*或区域8*与连接有区域7或区域8的纳米金1和纳米金2相连，并且DNA双链1中的纳米金连接链1的区域1*和区域2*与步骤1)所述连接链的区域1和区域2互补，DNA双链2中的纳米金连接链2的区域4*和区域5*与步骤1)所述连接链的区域4和区域5互补；
其中区域1与区域1*、区域2与区域2*、区域3与区域3*、区域4与区域4*、区域5与区域5*、区域6与区域6*、区域7与区域7*、区域8与区域8*分别完全互补。
2.根据1所述的试剂盒，其中所述燃料链的两端分别含有碱基错配。
3.根据2所述的试剂盒，所述碱基错配的位置是燃料链中区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基。
4.根据2所述的试剂盒，其中所述燃料链两端与保护链互补的粘性末端分别增加1-3个碱基，形成区域a和区域b。
5.根据1所述的试剂盒，所述目标链的长度范围在10-50个碱基之间。
6.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据需要检测的DNA目标链来设计1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；
2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链样品中完成DNA-纳米金的组装.
7.一种检测DNA单碱基突变的方法，所述方法包括如下步骤：
1)根据需要检测的DNA目标链来设计1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；
2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链和突变链样品中完成DNA-纳米金的组装；
3)根据DNA-纳米金组装的紫外动力学过程和颜色差异检测DNA单碱基突变。
8.根据6或7所述的方法，其中燃料链与底物链的摩尔比在5：1到10：1之间。
9.根据6或7所述的方法，其中所述DNA-纳米金的组装在PBS缓冲液中进行。
10.根据7所述的方法，其中所述单碱基突变包括错配、插入和删除。
本发明中，除了修饰在纳米金表面的DNA系列长度为固定长度，并与检测目标链无关无需重新设计之外，其他DNA序列的长度根据实际检测目标链的长度而定。
所述修饰在纳米金表面的DNA的长度优选为31个碱基。
发明详述
本发明第一个方面提供一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法，原理如图1所示：
其中，保护链与连接链杂交经过纯化后形成底物，底物上的区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端，目标链上的区域6与之互补，目标链可以将底物中的连接链替换下来，燃料链为DNA链替换提供动力，也就是说燃料链会将目标链替换下来让目标链DNA继续发挥作用，使得DNA催化循环网络得以运行。被目标链替换下来的连接链会引发DNA-纳米金的组装，首先连接链上的区域2和区域4会分别与纳米金连接链-1中的区域2*以及纳米金连接链-2中的区域4*发生作用，然后连接链会将纳米金保护链-1和纳米金保护链-2替换下来从而将纳米金-1和纳米金-2连接起来。特别需要指出的是在实验和过程中需要加入大量的燃料链，但是实验发现在高浓度条件下，燃料链中的区域2和区域4会分别与纳米金连接链-1中的区域2*以及纳米金连接链-2中的区域4*相连接导致DNA-纳米金发生聚集，也就是在没有加入目标链的情况下纳米金体系就已经发生组装，此种情况下纳米金连接链-1中的区域2*和纳米金连接链-2中的区域4*中的碱基个数均为5。为了防止这种现象，我们对燃料链进行改进，将燃料链中的区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基发生错配，这样就不会导致在加入燃料链的情况下发生DNA-纳米金聚集的情况。此外，为了保证燃料链的替换能力不下降，我们在保证整个系统稳定的前提下将发生错配的燃料链两端的与保护链互补的粘性末端的碱基增加了3个，将其命名为区域a和区域b。
另一方面，本发明提供了一种基于DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装的单碱基突变检测方法。其特征在于，不同DNA目标链触发DNA催化网络循环反应能力的不同，从而释放出不同量的DNA连接链，而DNA连接链能够起到组装DNA-纳米金的作用。因此，DNA目标链是否发生单碱基突变可以体现在DNA-纳米金组装速率的差异上。通过对比加入DNA目标链和突变链的DNA-纳米金组装的动力学实验过程以及颜色反应差异可以实现DNA单碱基突变的检测。此种检测手段无需复杂仪器，操作方便。通过Nearest-neighbor model计算得知，在该DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装的体系中，目标链和保护链的粘性末端碱基个数为5/5时，该体系区分完全互补目标链和发生单碱基突变的目标链的能力最强。利用此种方法可以检测目标链所有位置的单碱基突变(错配，插入和删除)，并且与完全互补配对的目标链相比，一旦目标链发生突变整个DNA催化体系基本不会运行，从紫外和颜色反应来看也不会检测到反应信号，反应速率差异十分明显，说明该方法对单碱基突变的检测效果十分突出。
本发明的检测方法具体包括如下步骤：
第一步：根据需要检测的DNA目标链来设计DNA催化循环网络中所需要的各种单链DNA序列；
第二步：巯基DNA序列修饰的纳米金的制备；
第三步：通过退火得到各种DNA复合双链；
第四步：将退火杂交所得的底物双链利用DNA凝胶电泳技术进行纯化；
第五步：巯基DNA序列修饰纳米金与过量的互补的DNA复合双链反应12小时后离心除去过量DNA复合双链，形成具有与DNA连接链反应功能的DNA复合双链-纳米金复合物；
第六步：利用DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装，优化该体系各参数，最终利用优化好的参数实现DNA-纳米金的组装；
第七步：利用优化好的DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装体系进行单碱基突变的检测。通过对比实验加入完全互补目标链与突变目标链，检测两个反应体系的反应速率差异，最终实现单碱基突变的检测。
需要说明的是该体系的反应都是在0.1M PBS缓冲液(10mM PB,0.1M NaCl)条件下反应的，包括所有的DNA单双链也是溶解在这种缓冲液中。其中第四步中的底物链与DNA-纳米金复合物的最佳摩尔比例在30:1到100:1的之间的范围，燃料链与底物链的最佳摩尔比例在5:1到10:1的之间。所述被检DNA目标链长度范围在10-50个碱基之间。检测目标链的浓度为底物链浓度的0.1％到10％之间。
本发明的突出优势如下：
本发明是首次用参数可调的DNA催化循环网络诱导的可控DNA-纳米金组装方法实现的单碱基突变检测。本发明提供的DNA-纳米金复合物无需重新制备适用于不同的DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装反应，极大地节省资金和实验劳动时间的同时让该方法更为实用，该方法操作简单，信号表征简单，无需复杂仪器，在实际应用中通过颜色反应以及紫外可见分光光度计图谱就可以进行检测。该方法解决了之前的检测技术中存在的需要复杂操作或者使用精密的仪器才能进行检测的困难。此外，该方法对单碱基突变检测的效果好，对目标链所有位置的单碱基突变的所有类型：碱基错配、碱基缺失以及碱基插入都有非常好的检测效果。
附图说明
图1为DNA催还循环网络诱导的DNA-纳米金组装原理图。
图2为实验用到的三种重要DNA结构的示意图。其中(a)中的三个DNA结构分别为Ⅰ(由保护链和连接链杂交形成的底物链)，Ⅱ(纳米金连接链1和纳米金保护链1形成的DNA双链1；纳米金连接链2和纳米金保护链2形成的DNA双链2)，以及Ⅲ(两种巯基DNA修饰的纳米金，纳米金1和纳米金2)；(b)为DNA双链1与纳米金1杂交的过程图以及DNA双链2与纳米金2杂交的过程图。
图3为该体系采用错配燃料链驱动DNA催化循环网络的实验依据图。
图4为不同粘性末端长度的目标链对DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装体系反应速率的影响的紫外可见动力学图谱的结果图。
图5为利用DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法进行不同浓度的完全互补目标链检测的紫外可见动力学图谱的结果图。
图6为利用DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法进行不同位置不同单碱基突变类型检测的紫外可见动力学图谱的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行具体说明。
本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了比较详细的实施方式和过程。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明保护的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步的调整，未注明的实验条件通常按照常规实验中的条件。
本实施例中用到所有的试剂都是分析纯级别，购买以后直接使用。实施例中用到的氯金酸，柠檬酸三钠，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，磷酸二氢钠(NaH2PO4)，氯化钠(NaCl)，盐酸，硝酸都是从国药集团购买的。从阿法埃莎(Alfa Aesar)购买三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。寡聚核苷酸(DNA)从上海生工购买。实施例中用到的主要仪器是美国安捷伦公司的Cary-300紫外可见分光光度计。
本实施例主要通过对比实验验证基于DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装来实现单碱基突变检测的可行性，通过颜色比对以及紫外动力学谱图观察比较对发生突变的DNA目标链进行检测。以下实例进一步验证了DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装来实现单碱基突变检测的可行性。
第一步，利用巯基修饰DNA中的巯基与纳米金表面反应可以形成S-Au共价键的原理将纳米金球表面修饰上巯基DNA：
1.巯基DNA单链与直径为13nm纳米金球以350:1摩尔比混合，在4℃环境下放置16小时。
2.加入PB缓冲液，使溶液中PB浓度为10mM,然后在4℃环境放置12小时。
3.逐步加入NaCl溶液使溶液中NaCl浓度从0.1M增加至0.2M再增加至0.3M，溶液在每个NaCl浓度下于4℃环境下放置8小时。
4.在离心机13000转/分钟的转速下离心30分钟。
5.取出上清液加入0.1M PBS缓冲液，重复离心三次。
6.最后在加入0.1M PBS缓冲液在4℃保存DNA-纳米金溶液。
7.利用紫外可见分光光度计测定DNA-纳米金溶液摩尔浓度。
第二步，通过退火杂交制备各种DNA复合双链：
1.将无修饰的DNA单链溶解在0.1M PBS缓冲液中，用紫外可见分光光度计标定单链DNA溶液的摩尔浓度。
2.将互补的两种单链DNA溶液混合，用恒温金属浴迅速加热至90℃后保持15分钟，然后缓慢冷却至室温。利用此法退火得到各种DNA复合双链并在4℃条件下保存。
第三步，将退火杂交所得的底物双链利用DNA凝胶电泳技术进行纯化：
第四步，制备具有与DNA连接链反应功能的DNA复合双链-纳米金复合物：
1.将两种巯基DNA序列修饰的纳米金各自与过量的互补的DNA复合双链混合后反应12小时。
2.在13000转/分钟的转速下离心两次除去过量DNA复合双链。
3.将所得DNA复合双链-纳米金复合物重新分散在0.1M PBS缓冲液中。
第五步，燃料链设计的优化：
1.如前所述，在实验和过程中需要加入大量的燃料链来提高DNA催化循环网络的运转能力，即提高燃料链替换目标链的能力，但是实验发现在高浓度条件下(如图1所示)，燃料链中的区域2和区域4会分别与纳米金连接链-1中的区域2*以及纳米金连接链-2中的区域4*相连接导致DNA-纳米金发生聚集，也就是在没有加入目标链的情况下纳米金体系就已经发生组装，此种情况下纳米金连接链-1中的区域2*和纳米金连接链-2中的区域4*中的碱基个数均为5。为了防止这种现象，我们对燃料链进行改进，将燃料链中的区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基发生错配，这样就不会导致在加入燃料链的情况下发生DNA-纳米金聚集的情况。此外，为了保证燃料链的替换能力不下降，我们在保证整个系统稳定的前提下将发生错配的燃料链两端的与保护链互补的粘性末端的碱基增加了3个，将其命名为区域a和区域b。
2.在反应器1和2中都加入等量的两种DNA复合双链-纳米金复合物(8nM)，然后在反应器1中加入完全互补的燃料链(4μM)，在反应器2中加入发生两端错配的燃料链(4μM)。通过紫外动力学图谱观察实验过程。
该步骤中涉及的序列如下：
纳米金链-1的序列(5'到3')
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTGAGGAGTATTGGTG(SEQ ID NO:1)
纳米金链-2的序列(5'到3')
ATAGGGAGAGAAGGTGTTTTTTTTTTTTTTT-SH(SEQ ID NO:2)
纳米金连接链-1的序列(5'到3')
ACACCCATCTCACTACCTACCACCAATACTCCTCAC(SEQ IDNO:3)
纳米金连接链-2的序列(5'到3')
CACCTTCTCTCCCTATCAATCCACACTTCCACTCTC(SEQ ID NO:4)
纳米金保护链-1的序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATG(SEQ ID NO:5)
纳米金保护链-2的序列(5'到3')
TGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:6)
完全互补燃料链序列(5'到3')
GGTGTTGGGTGTGTATAGTGGAGAG(SEQ ID NO:7)
错配燃料链序列(5'到3')
TGAGGTGATGGGTGTGTATAGTGTAGAGGTC(SEQ ID NO:8)
实验结果如图3所示，完全互补燃料链会引起整个反应体系不稳定，而发生错配的燃料链会让整个反应体系在无目标链存在的情况下保持稳定，这符合实验继续进行的要求。
第六步，不同粘性末端长度的目标链对DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装体系反应速率的影响：
1.在各个反应器中加入等量的两种DNA复合双链-纳米金复合物(8nM)，加入底物链(400nM),加入错配的燃料链(4μM)。
2.在各个反应器中分别加入不同粘性末端长度的目标链(7nM)，通过紫外动力学图谱观察实验过程。
该步骤中涉及的序列如下：
纳米金链-1的序列(5'到3')
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTGAGGAGTATTGGTG(SEQ ID NO:1)
纳米金链-2的序列(5'到3')
ATAGGGAGAGAAGGTGTTTTTTTTTTTTTTT-SH(SEQ ID NO:2)
纳米金连接链-1的序列(5'到3')
ACACCCATCTCACTACCTACCACCAATACTCCTCAC(SEQ IDNO:3)
纳米金连接链-2的序列(5'到3')
CACCTTCTCTCCCTATCAATCCACACTTCCACTCTC(SEQ ID NO:4)
纳米金保护链-1的序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATG(SEQ ID NO:5)
纳米金保护链-2的序列(5'到3')
TGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:6)
连接链序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATGGGTGTTGGGTGTGTATAGTGGAGAGTGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:9)
保护链的序列(5'到3')
CCTGACCTCTCCACTATACACACCCAACACCTCA(SEQ ID NO:10)
错配燃料链序列(5'到3')
TGAGGTGATGGGTGTGTATAGTGTAGAGGTC(SEQ ID NO:8)
目标链：5/4序列(5'到3')
TTGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:11)
目标链：5/5序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:12)
目标链：6/4序列(5'到3')
TTGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAGG(SEQ ID NO:13)
目标链：6/5序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAGG(SEQ ID NO:14)
实验结果如图4所示，从图中可以看出不同粘性末端长度的目标链对整个体系反应的影响，同时通过Nearest-neighbor model计算模型分析，为了让单碱基突变检测有最佳的区分度，在后面的实验中我们选取了目标链粘性末端长度与保护链粘性末端长度皆为5个碱基的目标链序列，即目标链：5/5序列。
本文中5/4中的5指的是体系正向反应时目标链的粘性末端碱基个数是5，4指的是对应逆向反应时保护链的粘性末端碱基个数是4，其他的5/5，6/4，6/5也是如此。
第七步，用DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法进行不同浓度的完全互补目标链检测：
1.在各个反应器中加入等量的两种DNA复合双链-纳米金复合物(8nM)，加入底物链(400nM),加入错配的燃料链(4μM)。
2.在各个反应器中分别加入不同摩尔浓度的目标链，通过紫外动力学图谱观察实验过程。
该步骤中涉及的序列如下：
纳米金链-1的序列(5'到3')
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTGAGGAGTATTGGTG(SEQ ID NO:1)
纳米金链-2的序列(5'到3')
ATAGGGAGAGAAGGTGTTTTTTTTTTTTTTT-SH(SEQ ID NO:2)
纳米金连接链-1的序列(5'到3')
ACACCCATCTCACTACCTACCACCAATACTCCTCAC(SEQ IDNO:3)
纳米金连接链-2的序列(5'到3')
CACCTTCTCTCCCTATCAATCCACACTTCCACTCTC(SEQ ID NO:4)
纳米金保护链-1的序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATG(SEQ ID NO:5)
纳米金保护链-2的序列(5'到3')
TGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:6)
连接链序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATGGGTGTTGGGTGTGTATAGTGGAGAGTGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:9)
保护链的序列(5'到3')
CCTGACCTCTCCACTATACACACCCAACACCTCA(SEQ ID NO:10)
错配燃料链序列(5'到3')
TTGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:8)
目标链：5/5序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:12)
实验结果如图5所示，从图中可以看出该体系对不同浓度的目标链检测有很好的区分效果，并且在第浓度下仍对目标链有检测效果，满足了实际检测中检测已知致病基因DNA序列的要求。本实例的操作简单，无需严格操作条件，DNA-纳米金复合物无需重新制备，节约了实验成本。
第八步，利用DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法进行不同位置不同单碱基突变类型检测：
1.在各个反应器中加入等量的两种DNA复合双链-纳米金复合物(8nM)，加入底物链(400nM),加入错配的燃料链(4μM)。
2.在各个反应器中分别加入不同突变位置和不同突变类型的目标链(14nM)，通过紫外动力学图谱观察实验过程。
该步骤中涉及的序列如下：
纳米金链-1的序列(5'到3')
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTGAGGAGTATTGGTG(SEQ ID NO:1)
纳米金链-2的序列(5'到3')
ATAGGGAGAGAAGGTGTTTTTTTTTTTTTTT-SH(SEQ ID NO:2)
纳米金连接链-1的序列(5'到3')
ACACCCATCTCACTACCTACCACCAATACTCCTCAC(SEQ IDNO:3)
纳米金连接链-2的序列(5'到3')
CACCTTCTCTCCCTATCAATCCACACTTCCACTCTC(SEQ ID NO:4)
纳米金保护链-1的序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATG(SEQ ID NO:5)
纳米金保护链-2的序列(5'到3')
TGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:6)
连接链序列(5'到3')
GTAGGTAGTGAGATGGGTGTTGGGTGTGTATAGTGGAGAGTGGAAGTGTGGATTG(SEQ ID NO:9)
保护链的序列(5'到3')
CCTGACCTCTCCACTATACACACCCAACACCTCA(SEQ ID NO:10)
错配燃料链序列(5'到3')
TTGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:8)
目标链：5/5序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:12)
错配m2C序列(5'到3')
TCGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:15)
错配m3T序列(5'到3')
TGTGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:16)
错配m4A序列(5'到3')
TGGATGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:17)
错配m5C序列(5'到3')
TGGGCGTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:18)
错配m6T序列(5'到3')
TGGGTTTGTATAGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:19)
错配m13C序列(5'到3')
TGGGTGTGTATACTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:20)
错配m20A序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAAGTCAG(SEQ ID NO:21)
错配m23T序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTTAG(SEQ ID NO:22)
错配m25C序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAC(SEQ ID NO:23)
插入i13A序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGATGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:24)
插入i13T序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:25)
插入i13C序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGCTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:26)
插入i13G序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGGTGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:27)
插入i23A序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCAAG(SEQ ID NO:28)
插入i23T序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCTAG(SEQ ID NO:29)
插入i23C序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCCAG(SEQ ID NO:30)
插入i23G序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTCGAG(SEQ ID NO:31)
删除d13序列(5'到3')
TGGGTGTGTATATGGAGAGGTCAG(SEQ ID NO:32)
删除d23序列(5'到3')
TGGGTGTGTATAGTGGAGAGGTAG(SEQ ID NO:33)
实验结果如图6所示，与完全互补配对的目标链相比，一旦目标链发生突变(错配，插入和删除)整个DNA催化体系基本不会运行，从紫外和颜色反应来看也不会检测到反应信号，反应速率差异十分明显，说明该方法对单碱基突变的检测效果十分突出。本实例的操作简单，无需严格操作条件，DNA-纳米金复合物无需重新制备，节约了实验成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要指出的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，而且，在阅读了本发明的内容之后，本领域相关技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的试剂盒，其中包括：
1)DNA底物链，所述DNA底物链由连接链和保护链杂交而成，其中所述连接链从5’端到3’端依次由区域1、区域2、区域3、区域4、区域5连接而成，所述保护链从3’端到5’端依次由任选的区域a*、区域2*、区域3*、区域4*、区域6*连接而成，其中，区域2、区域3、区域4组成的连接链中间部分与区域2*、区域3*、区域4*组成的保护链中间部分完全互补，保护链除任选的区域a*和区域2*外的其它部分与目标链互补，区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端；
2)燃料链，所述燃料链为与保护链互补的单链DNA；
3)连接有纳米金1的DNA双链1和连接有纳米金2的DNA双链2，其中，所述DNA双链1由纳米金连接链1和纳米金保护链1杂交而成，所述DNA双链2由纳米金连接链2和纳米金保护链2杂交而成，所述纳米金连接链1从3’端到5’端依次由区域7*、区域1*、区域2*连接而成，所述纳米金保护链1由区域1组成，所述纳米金连接链2从3’端到5’端依次由区域4*、区域5*、区域8*连接而成，所述纳米金保护链2由区域5组成，其中，所述DNA双链1和所述DNA双链2分别通过区域7*或区域8*与连接有区域7或区域8的纳米金1和纳米金2相连，并且DNA双链1中的纳米金连接链1的区域1*和区域2*与步骤1)所述连接链的区域1和区域2互补，DNA双链2中的纳米金连接链2的区域4*和区域5*与步骤1)所述连接链的区域4和区域5互补；
其中区域1与区域1*、区域2与区域2*、区域3与区域3*、区域4与区域4*、区域5与区域5*、区域6与区域6*、区域7与区域7*、区域8与区域8*分别完全互补。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述燃料链的两端分别含有碱基错配。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述碱基错配的位置是燃料链中区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述燃料链两端与保护链互补的粘性末端分别增加1-3个碱基，形成区域a和区域b。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述目标链的长度范围在10-50个碱基之间。
6.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据需要检测的DNA目标链来设计权利要求1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；
2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链样品中完成DNA-纳米金的组装。
7.一种检测DNA单碱基突变的方法，所述方法包括如下步骤：
1)根据需要检测的DNA目标链来设计权利要求1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；
2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链和突变链样品中完成DNA-纳米金的组装；
3)根据DNA-纳米金组装的紫外动力学过程和颜色差异检测DNA单碱基突变。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中燃料链与底物链的摩尔比在5：1到10：1之间。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述DNA-纳米金的组装在PBS缓冲液中进行。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述单碱基突变包括错配、插入和删除。
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