CN104561243A - 耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法。本发明的检测方法包括1）靶核酸扩增和信号转化阶段，将靶核酸序列进一步扩增并将对靶核酸的检测转化为对发卡探针片段的检测；2）纳米探针杂交阶段，在扩增反应结束后，在相应的条件下特殊纳米探针将产生聚集或分散的现象,利用该现象可实现对靶核酸的区分检测。利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测，因此，该发明不仅可以应用于对模板的检测还可应用于对仅有单碱基区分的SNP分型以及基因突变中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法。
背景技术
目前基于对核酸的检测技术已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面，例如聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，该技术可以实现模板的指数扩增，放大百万倍，但是这类技术通常由于特异性的限制，使得不能满足于对一些区分单碱基靶核酸的样本检测，例如，在检测基因突变的样本时，由PCR发展起来的实时PCR（Real Time PCR，RT-PCR）技术不仅特异性有限，区分度低，需要专门的仪器设备，而且检测成本也较高。而基于信号放大的核酸侵入反应是依赖于一种特殊的核酸内切酶的信号扩增反应，该反应不仅特异性好，还具有恒温、反应成本低的优点，目前已经有一种基于核酸侵入反应和生物纳米金技术相偶联进行分子检测的技术（见专利“级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法”，专利申请号“201110161736.3”），但由于该技术灵敏度低，仅能检测模板含量为6×104拷贝/μL以上的样本，仍不能满足绝大多数临床样本直接检测的要求。因此，在实际样本的检测过程中，还需要对待测模板进行预先PCR扩增，开管后取出扩增产物，然后再进行核酸侵入反应和生物纳米金显色反应；但是开管后取出扩增产物极易造成扩增产物的交叉污染，出现假阳性结果。假阳性结果是临床中绝对应该避免的，为此我们发明了在单管中依次完成扩增反应、侵入反应和显色反应的方法，无需开管操作，避免了开管造成的扩增产物的交叉污染。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的极易造成假阳性结果的不足，提供一种通过控制反应温度的方式实现核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应以及生物纳米颗粒显色反应在同一管中依次进行，实现对核酸模板中的特定序列进行闭管比色检测的方法。
本发明通过温度控制实现将核酸扩增反应与核酸侵入反应（Invasive reaction）以及生物纳米颗粒显色反应相偶联依次在同管闭管中进行，利用核酸修饰的纳米颗粒聚集状态的改变对检测结果进行区分，建立了一种高灵敏度、高特异性、低成本且便捷的可视化核酸检测新方法。
通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现基于三个反应的同管闭管检测核酸模板；在反应过程中，通过控制温度条件，优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针修饰的纳米颗粒（图5）进行杂交反应并对被切割的核酸片段进行比色检测，当待测样本中存在靶核酸序列时纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态；
所述的控制反应温度实现核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应同管闭管进行，并且优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，要求核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少3℃，优选5-10℃；
所述的核酸侵入反应的反应体系包括针对靶核酸特异性的一对探针，核酸5’外切酶或5’flap内切酶、以及一个发卡探针；
所述的靶核酸特异性的一对探针要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap片段，利用核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的探针-待测核酸特异性结构（图1），并将下游探针5’flap片段连同被侵入的碱基切断，而形成的5’flap片段又与发卡探针进行杂交，进一步形成为核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链的“侵入结构”（图4），从而将发卡探针切成两个部分，随着5’flap片段的积累，被切开的发卡探针也进一步积累；
所述的下游探针（图2），其3’和5’端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针互补的序列，中间部分为模板序列特异的互补序列。
所述的发卡探针（图3），其3’和5’端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针互补的序列，毗邻3’端与纳米颗粒表面修饰的探针互补片段的序列与flap片段互补形成侵入一个碱基的flap-发卡探针特异性侵入结构；被切开的发卡探针能够与所述的两种核酸探针修饰的纳米颗粒杂交而使纳米颗粒保持分散状态。
本发明所述的核酸扩增反应可以是指聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、恒温指数扩增方法EXPAR、滚环扩增反应RCA、连接扩增反应LCR、解旋酶依赖的核酸扩增反应HDA，优选聚合酶链式反应进行核酸扩增。
本发明所述的通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米金显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的闭关检测方法，具体技术方案如图6以及图7所示，优选包括以下步骤：
1）设计并合成核酸扩增反应使用的核酸模板特异性的扩增引物对，核酸侵入反应使用的针对靶核酸特异性的一对探针和一个发卡探针（或者一条上游探针、一条两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针），以及能够与发卡探针（或者与两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针）杂交的两种核酸探针修饰的纳米颗粒；其中，所述的针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；
2）向同一管中加入包含步骤1）涉及的引物、探针以及核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶在内的核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应的反应体系；
3）通过控制核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少3℃，实现优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针修饰的纳米颗粒进行杂交反应并对被切割的核酸片段进行比色检测，具体过程为：
a）模板序列扩增阶段：通过核酸扩增反应扩增出核酸侵入信号扩增所需要序列长度的靶核酸；
b）核酸侵入反应信号转化阶段：所述的靶核酸与所述的靶核酸特异性的一对探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，反应体系中的核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶会识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；而切割形成的flap片段与发卡探针杂交进一步形成核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链的“侵入结构”，从而将发卡探针切成两个部分，随着5’flap片段的积累，被切开的发卡探针也进一步积累；
c）核酸修饰纳米颗粒杂交显色阶段：核酸扩增反应和核酸侵入反应结束以后，反应体系于30-65℃进行两种核酸探针修饰的纳米颗粒与发卡探针杂交；当反应体系中不含有靶核酸时，不会发生步骤1）的核酸扩增反应和步骤2）的核酸侵入反应，不能将发卡探针切开导致两种核酸探针修饰的纳米颗粒与发卡探针杂交，从而引起纳米颗粒聚集，结果是阴性；当反应体系中含有靶核酸时，发生步骤1）的核酸扩增反应和步骤2）的核酸侵入反应，发卡探针被切开，它们与纳米颗粒中的两种核酸探针杂交，使纳米颗粒保持分散状态，结果是阳性；也可采用比色法，根据纳米颗粒分散或聚集时在一定波长下最大吸收峰的偏移从而进行结果判读。
当反应体系中为两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针时，在反应进行到步骤2）核酸侵入反应阶段，下游探针与上游探针一起与模板进行互补配对，形成核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶会识别所述的探针-靶核酸特异性结构，在核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶将下游探针切割为两个部分，这种切割后的下游探针随着反应的进行而积累。当进入步骤3）核酸修饰纳米颗粒杂交显色阶段后，反应体系于30-65℃进行两种核酸探针修饰的纳米颗粒与之进行杂交反应。若体系中不含有靶核酸时，不会发生步骤1）的核酸扩增反应和步骤2）的核酸侵入反应，带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针不会被切开，在杂交反应以后使纳米颗粒聚集，结果是阴性；当反应体系中含有靶核酸时，发生步骤1）的核酸扩增反应和步骤2）的核酸侵入反应，带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针被切开，在杂交反应以后纳米颗粒仍然为分散状态，结果是阳性。
本发明所述的核酸优选DNA或RNA。
本发明所述的核酸扩增反应、核酸侵入反应和纳米颗粒杂交反应的反应体系至少包含Tris、Na离子、Mg离子、核酸模板扩增酶、核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶、核酸模板特异性的上游扩增引物、核酸模板特异性的下游扩增引物、靶核酸特异性的上下游探针、发卡探针（或两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针）、两种核酸探针修饰的纳米颗粒以及靶核酸。
本发明所述的核酸模板扩增用酶优选Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶，进一步优选Taq DNA聚合酶。
本发明所述的核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶是指TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN，优选AfuFEN。
本发明所述的纳米颗粒是指不同尺寸的纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米硅颗粒，优选13nm的纳米金进行修饰和杂交反应。
本发明所述的方法，其特征在于纳米颗粒在被核酸修饰后，还需被进一步用巯基修饰的PEG、寡肽、硅烷化试剂或者其他有机小分子对纳米颗粒表面未被修饰的部分进行再次封阻，优选硅烷化试剂。
所述的纳米金表面修饰的两种探针序列分别为GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAAA-SH和SH-AAA AAA AAA AAT GGT TCA TCA CGA T-C3；所述的发卡探针序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明方法所述的反应以及检测温度控制通过循环温度控制装置实现，优选通过PCR热循环仪实现。
本发明的有益效果：
在本发明的检测方法过程中，只有上、下游引物以及上、下游探针需要针对不同模板进行设计，其它各步骤中的成分均可通用。
由于DNA聚合酶对序列扩增是通用的，且核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶仅识别上下游探针形成的特异结构，对模板序列没有要求，所以本方法可以检测任意模板，而无序列限制。
本发明采用的单管闭管实现对模板的特异性检测，在反应后无需开盖，有效的解决了核酸模板扩增过程中反应体系易于污染的问题。
本发明采用的纳米金探针有比较成熟的方法合成，成本低，且性质稳定，同时由于通过纳米金是否聚集判定结果，使得使用该方明对核酸进行检测时非常方便。
本发明采用了特殊修饰的纳米探针，增加了其热稳定性，使得可以与核酸扩增反应以及核酸侵入反应同管存在，进而实现闭关检测。
利用本发明提供的方法进行核酸检测时，先对靶核酸进行扩增，再采用核酸侵入信号放大反应对靶核酸的信号进一步的放大，实现了短时间内高灵敏度的核酸检测，且同管进行三个反应，简化了操作步骤，降低了人为操作要求。
利用本发明提过的检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测，因此在突变检测，尤其是低丰度突变便检测过程中具有很大的应用前景。
附图说明
图1关于核酸侵入反应中核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶识别的探针-待测核酸特异性结构示意图。
图2是关于本发明中带有杂交互补序列的下游探针。
图3是关于本发明中发卡探针的结构示意图。
图4是关于本发明发卡探针与flap片段形成的核酸5’flap外切酶或5’flap内切酶识别的探针-待测核酸特异性结构示意图。
图5是纳米探针修饰示意图。
图6是关于本发明方法的原理示意图。
图7是关于本发明方法的原理示意图。
图8是关于实施例1检测结果图。
图9是关于实施例1紫外吸收检测结果图。
图10是关于实施例2检测结果图。
图11是关于实施例2紫外吸收检测样本1486结果图。
图12是关于实施例2紫外吸收检测样本1487结果图。
图13是关于实施例2紫外吸收检测样本1488结果图。
图14为实施例3检测结束0小时后的紫外吸收检测结果。
图15为实施例3检测结束0小时后的检测结果。
图16为实施例3检测结束0.5小时后的紫外吸收检测结果。
图17为实施例3检测结束0.5小时后的检测结果。
图18为实施例3检测结束1小时后的紫外吸收检测结果。
图19为实施例3检测结束1小时后的检测结果。
图20为实施例3检测结束2小时后的紫外吸收检测结果。
图21为实施例3检测结束2小时后的检测结果。
图22为实施例3检测结束4小时后的紫外吸收检测结果。
图23为实施例3检测结束4小时后的检测结果。
图24为实施例3检测结束过夜后的紫外吸收检测结果。
图25为实施例3检测结束过夜后的检测结果。
有关附图的详细说明参见如下详细描述部分的内容。
具体实施方式
实施例1利用核酸扩增反应结合级联核酸侵入反应与纳米金显色检测的单管闭管可视化核酸检测方法检测紫外定量的基因组DNA。
采用全基因组DNA梯度稀释后作为模板进行检测，以考察本发明所述的方法的灵敏度。
反应条件：
该步反应体系组成为10mM Tris-HCl（pH7.5），0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，，4mM MgCl2，30mM NaCl，0.5μM上游引物（序列为：5’-CCG GGA GTT GGG CGA GTA C-3’，Tm值为70.8℃，SEQ ID NO.1），0.5μM下游引物（序列为：5’-GCC CCC AGC AGG TCCC-3’，Tm值为71.8℃，SEQ ID NO.2），0.2μM上游探针（序列为：5’-CTC TGC CAC CAGCTC CCA-3’，Tm值为68.5℃，SEQ ID NO.3），0.2μM下游探针（野生型探针序列为：5’-CGCGCC GAG GCG AAC TTG GGC GAG-C3-3’，Tm值为62.5℃，），0.2μM发卡探针（序列为：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCGATC GTG ATG AAC CAT C3-3’，Tm值为78.5℃），加入两种修饰的纳米探针（探针1序列：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-SH，Tm值为62.4℃，探针2序列：SH-AAA AAAAAA AAT GGT TCA TCA CGA T-C3，Tm值为55℃）各2.5μL，向该体系中加入1μL人全血提取的基因组DNA不同稀释产物，加入106ng的Afu FEN1核酸内切酶，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s,35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min。
结果示于图8以及图9。图8和图9的结果显示，该方法可以检测4ng的基因组DNA的量。
实施例2利用核酸扩增反应结合级联核酸侵入反应与纳米探针显色检测的单管闭管可视化核酸检测方法检测SNP位点分型。
采用本发明检测SNP位点分型需要针对检测位点不同的分型分别设计相应的下游探针，分两管进行检测，当反应体系含有与下游探针匹配的模板时，与纳米探针杂交后呈分散状态；而当反应体系不含有与下游探针匹配的模板时，与纳米探针杂交后则会聚集，从而实现对SNP位点分型。
反应条件：
该步反应体系组成为10mM Tris-HCl（pH7.5），0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，，4mM MgCl2，30mM NaCl，0.5μM上游引物（序列为：5’-CCG GGA GTT GGG CGA GTA C-3’，Tm值为70.8℃，SEQ ID NO.1），0.5μM下游引物（序列为：5’-GCC CCC AGC AGG TCCC-3’，Tm值为71.8℃，SEQ ID NO.2），0.2μM上游探针（序列为：5’-CTC TGC CAC CAG CTCCCA-3’，Tm值为68.5℃，SEQ ID NO.3），0.2μM下游探针（野生型探针序列为：5’-CGC GCCGAG GCG AAC TTG GGC GAG-C3-3’，Tm值为62.5℃），0.2μM发卡探针（序列为：5’-GTCTTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTGATG AAC CAT C3-3’，Tm值为78.5℃，），加入两种修饰的纳米探针（探针1序列：GCA GTACCA CAA GAC AAA AAA AAA A-SH，Tm值为62.4℃，探针2序列：SH-AAA AAA AAA AATGGT TCA TCA CGA T-C3，Tm值为55℃）各2.5μL，向该体系中分别加入1μL三例样本(样本1486、1487以及1488)的全血提取基因组DNA，加入106ng的Afu FEN1核酸内切酶，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s,35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min。
结果示于图10～13。图10～13的结果显示，该方法可以检测实际样本的基因组DNA分型，三例样本检测结果显示，1486以及1488两例样本野生型检测管和突变型检测管分别呈现红色，说明，这两例样本均为杂合型样本，样本1487野生型检测管为红色、突变型检测管为无色，说明该例样本为野生纯合型。因此，这三例样本中有一例野生纯合样本，两例突变杂合样本。
实施例3核酸扩增反应结合级联核酸侵入反应与纳米金显色检测的单管闭管可视化核酸检测后不同放置时间对纳米金沉淀的影响。
采用全基因组DNA作为模板进行检测，检测反应结束后放置于室温不同时间，以考察本发明所述的方法的纳米金聚集反应的沉淀情况。
反应条件：
该步反应体系组成为10mM Tris-HCl（pH7.5），0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，，4mM MgCl2，30mM NaCl，0.5μM上游引物（序列为：5’-CCG GGA GTT GGG CGA GTA C-3’，Tm值为70.8℃，SEQ ID NO.1），0.5μM下游引物（序列为：5’-GCC CCC AGC AGG TCCC-3’，Tm值为71.8℃，SEQ ID NO.2），0.2μM上游探针（序列为：5’-CTC TGC CAC CAG CTCCCA-3’，Tm值为68.5℃，SEQ ID NO.3），0.2μM下游探针（野生型探针序列为：5’-CGC GCCGAG GCG AAC TTG GGC GAG-C3-3’，Tm值为62.5℃），0.2μM发卡探针（序列为：5’-GTCTTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTGATG AAC CAT C3-3’，Tm值为78.5℃，），加入两种修饰的纳米探针（探针1序列：GCA GTACCA CAA GAC AAA AAA AAA A-SH，Tm值为62.4℃，探针2序列：SH-AAA AAA AAA AATGGT TCA TCA CGA T-C3，Tm值为55℃）各2.5μL，向该体系中加入1μL人全血提取的基因组DNA，加入106ng的Afu FEN1核酸内切酶，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s,35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min。
结果示于图14～图25。图14～图25的结果显示，随着放置时间的延长，阴性结果的反应体系中的纳米金颗粒逐渐聚集下沉，使上清的颜色越来越透明澄清，而阳性结果的反应体系的纳米金颗粒则一直保持稳定分散的状态，这使得随着反应结束后放置时间的延长，阴性和阳性结果的区分越来越明显，因此，该方法检测的纳米金颗粒随着放置时间的延长聚集的纳米金探针发生沉淀，使检测结果可以有更加明显的区分。
Claims (15)
1.通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，其特征在于反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现核酸模板的单管密封式检测，即先在较高温度条件下优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着通过降低温度进行核酸侵入反应产生靶序列特异性的核酸片段，最后再通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，通过对最终反应产物的比色检测实现结果的判断。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的在较高温度条件下优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，要求核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度3℃以上，优选5-10℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的通过降低温度进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，要求核酸侵入反应的反应温度较之核酸扩增反应的最低温度降低3℃以上，优选降低5-10℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的通过降低温度使末端连接纳米颗粒的核酸探针与反应体系中的互补序列杂交，要求降低温度3℃以上，优选5-10℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸扩增反应选自聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、滚环扩增反应RCA、连接扩增反应LCR中的任意一种，优选聚合酶链式反应PCR。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸侵入反应，是指针对靶核酸特异性序列分别设计一条上游探针和一条下游探针，当上下游探针与靶核酸杂交后，要求上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，其中下游探针两端各有一段翘起片段，分别称为5’flap和3’arm，当体系中存在待测靶标时就形成核酸侵入结构，下游探针被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切断产生游离的5’flap和含有3’arm的游离片段。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸侵入反应，也是指级联核酸侵入反应，即针对靶核酸特异性序列设计一条上游探针和一条下游探针、以及一个与靶序列无关的发卡探针，当上下游探针与靶核酸杂交后，要求上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap；发卡探针用于与切割产生的游离5’flap形成新的核酸侵入结构，其中发卡探针两端各附加一段序列，分别称为5’arm和3’arm，当体系中存在待测靶标时就形成核酸侵入结构，下游探针被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切断产生游离的5’flap，该游离的5’flap又与发卡探针形成核酸侵入结构,被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切断产生游离的5’arm和含有3’arm的游离片段。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的生物纳米颗粒显示反应，是指分别设计两种一端修饰有纳米颗粒的核酸探针，要求能分别与权利要求6中的下游探针5’flap和3’arm互补杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的5’flap和含有3’arm的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，最终反应产物中纳米颗粒聚集状态的不同会使溶液的颜色发生变化。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的生物纳米颗粒显示反应，也是指分别设计两种一端修饰有纳米颗粒的核酸探针，要求能分别与权利要求7中的发夹探针5’arm和3’arm互补杂交，当待测样本中存在靶核酸序列时被切割的5’arm和含有3’arm的核酸片段使纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态，最终反应产物中纳米颗粒聚集状态的不同会使溶液的颜色发生变化。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸扩增反应、核酸侵入反应和纳米颗粒显色反应的反应体系至少包含1～100mM Tris、20～150mM钠离子和2～30mM镁离子，优选5～30mM Tris、20～80mM钠离子和4～10mM镁离子。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纳米颗粒表面被核酸修饰后，还需进一步用巯基修饰的PEG或类似物、硅烷化试剂、寡肽或者其他有机小分子进一步封阻纳米颗粒表面未被探针结合的部分，优选硅烷化试剂。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其特征在于所述的纳米颗粒选自不同尺寸的纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米硅颗粒，优选13nm的纳米金颗粒。
13.根据权利要求1或6中任一项所述的方法，其特征在于所述的连接纳米颗粒的核酸探针以及核酸侵入反应中的下游探针，其3’端需修饰C3、C6、C12、C18、磷酸基、氨基、生物素、炔基、叠氮基、双脱氧核糖核苷酸、偶氮苯，优选C3修饰。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的比色测定，是指采用分光光度法或裸眼比较法测定最终反应产物中纳米颗粒聚集状态；对于纳米金颗粒来说，分散时溶液显红色，在波长为520nm-550nm有最大吸收峰，为阳性结果；聚集时，最大吸收峰向红光方向偏移，长时间放置或离心后聚集到管底形成沉淀，溶液呈无色，为阴性结果。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸为DNA或RNA。
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Effective date of registration: 20181123 Address after: 210002 No. 305 Shandong Road, Xuanwu District, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: General Hospital of the Eastern War Zone of the Chinese People's Liberation Army Address before: 210002 No. 293 East Zhongshan Road, Jiangsu, Nanjing Patentee before: Zhou Guohua |
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