CN102827922B

CN102827922B - 级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法

Info

Publication number: CN102827922B
Application number: CN201110161736.3A
Authority: CN
Inventors: 周国华; 马寅姣; 邹秉杰
Original assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Current assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2031-06-16
Also published as: CN102827922A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及级联侵入信号放大反应和纳米金-寡核苷酸探针可视化检测。本发明级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法包括1)第一步侵入信号放大反应，形成flap片段的积累；2)flap片段循环阶段，将flap片段与发夹探针互补杂交，形成flap片段-发夹探针特殊结构，该结构被酶识别后，发夹探针被切割；3)纳米金-寡核苷酸探针检测阶段，利用两种不同寡核苷酸修饰的纳米金探针，可视化检测级联侵入信号放大反应的结果。利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行可视化检测，并且由于侵入信号放大反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

Description

级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及核酸侵入信号放大方法与纳米金-寡核苷酸探针。具体涉及一种级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法。

背景技术

核酸检测已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面。目前常用的核酸检测技术大多基于模板扩增原理，即扩增产物与靶核酸序列相同，如聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）、环介导的核酸等温扩增技术（Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP）、滚环扩增技术（Rolling Cycle Amplification，RCA）、基于核酸序列扩增技术（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA）、转录酶介导的扩增技术（Transcription Mediated Amplification，TMA）、解链酶扩增技术（Helicase DependantAmplification，HDA）、链置换扩增技术（Strand Displacement Amplification，SDA）等。上述核酸扩增方法由于扩增产物与靶核酸序列相同，因此极易造成产物交叉污染，使核酸检测经常出现假阳性的结果。

为了避免扩增产物的交叉污染，近年来发展了一些不扩增靶核酸，而是由靶核酸引发其他信号分子扩增，间接地对靶核酸进行检测的核酸信号扩增检测方法，如分枝DNA法（Branch-DNA，B-DNA）、核酸侵入信号扩增实验（Invader Assay）以及一些基于电化学检测的信号扩增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信号扩增实验均有较高的灵敏度，但它们都需要合成特殊结构或特殊荧光标记的探针，提高了检测成本；而基于电化学检测的信号扩增法往往灵敏度较低，达不到核酸检测的要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于信号放大和纳米金-寡核苷酸探针的可视化核酸检测方法，即提供一种级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明利用纳米金-寡核苷酸探针，可视化检测级联侵入信号放大反应结果，建立了一种高灵敏度的可视化的核酸检测方法。

本方法依次包括以下步骤（反应原理如图2所示）：

（1）级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；

（2）级联侵入信号放大反应的flap片段循环信号扩增阶段：反应体系中的发夹探针可捕获步骤（1）积累的flap片段，并杂交形成一个flap片段-发夹探针特异性结构，该结构也可被反应体系中的核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别，并将发夹探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，被切割的发夹探针与步骤（1）产生的flap片段分离，没有被切割的完整的发夹探针会再次与步骤（1）产生的flap片段杂交，再次形成所述的flap片段-发夹探针特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，从而大量的发夹探针被切割；

3）级联侵入信号放大反应结果纳米金-寡核苷酸探针可视化检测阶段：由于发夹探针5’端和3’端可分别与两种纳米金-寡核苷酸探针互补杂交，可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，从而引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，并由此引发粒子光学性质的改变，产生发夹探针的检测信号，即反应体系从红色变为紫色；当反应体系中有靶核酸存在时，可触发级联信号放大反应，在酶的作用下，大量发夹探针被切割；待级联信号放大反应结束后，向反应体系中加入两种纳米金-寡核苷酸探针；这时，由于发夹探针被切割，不能将两种纳米金-寡核苷酸探针连接，则不能引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，反应体系颜色不发生变化，仍然为红色；相反，当反应体系中不存在靶核酸或靶核酸浓度过低时，则无级联信号放大反应发生或级联信号放大反应作用不明显，体系中存在的发夹探针可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，反应体系颜色由红色变为紫色，从而显示该体系中无靶核酸存在或靶核酸浓度过低。

上述的可视化核酸检测方法，其在于该方法能够检测到浓度为10fmol/L的靶核酸序列。

上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的靶核酸为DNA或RNA。

上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的核酸侵入反应体系包含MOPS、Tween-20、Nonidet P40、上游探针、下游探针、发夹探针、MgCl₂以及靶核酸。优选为：10mmol/L MOPS，pH7.5，0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，0.1μmol/L上游探针，0.2μmol/L下游探针，0.2μmol/L发夹探针，7.5mM MgCl₂和靶核酸。

上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的核酸5’外切酶或5’flap内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。优选为AfuFEN。

上述的可视化核酸检测方法，其在于步骤（1）或（2）所述的反应温度可以通过恒温水浴仪实现；步骤（3）所述的纳米金-寡核苷酸探针检测结果可通过人眼直接观察，或拍照保存结果。

本发明的有益效果：

在本发明整个核酸信号扩增检测方法过程中，只有第一步核酸侵入信号扩增中的上、下游探针需要针对不同模板进行设计，其它各步骤中的成分均可通用，并且上、下游探针和发夹探针不需要任何修饰，成本低。

由于核酸5’外切酶或5’flap内切酶仅识别上下游探针形成的特异结构，对模板序列没有要求，所以本方法可以检测任意模板，而无序列限制。

本发明中使用的发夹探针，其3’端和5’可分别与两种纳米金-寡核苷酸探针杂交，可利用该探针的这一性质，实现对级联侵入信号放大反应的可视化检测。

利用本发明提供的方法进行核酸检测时，扩增产物与靶核酸序列无关，不会造成扩增产物的交叉污染是本发明的一大特色。

利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

附图说明

图1为核酸侵入反应中核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别的探针-待测核酸特异性结构示意图。

图2为本发明级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法的原理图。

图3为实施例1检测结果图。其中，1-7：靶核酸的终浓度为330pmol/L、33pmol/L、3.3pmol/L、0.33pmol/L、0.03pmol/L、0.01pmol/L和0.003pmol/L；N：反应体系中不含靶核酸的空白对照组。

图4为实施例2检测结果图。其中，P：反应体系中含有靶核酸的阳性对照；a-f：含单碱基突变核酸；N：反应体系中不含靶核酸的空白对照组。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1利用级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法检测人工合成寡核苷酸片段

本实施例检测了不同浓度的人工合成的单链DNA模板，用来验证本发明所陈述的核酸检测方法的可行性并考察了方法的灵敏度，同时本实施例中还检测了与靶核酸序列分别有一个核苷酸不同的六条寡核苷酸，用来验证本发明所陈述的方法对序列的特异性。

反应条件及反应过程为：

1）级联侵入信号放大反应

核酸侵入反应体系组成为10mmol/L MOPS，pH7.5，0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，0.1μmol/L上游探针（序列为：5’-TGGTTCCTCCTGAGGCCTCC-3’，即SEQ ID NO.1），0.2μmol/L下游探针（序列为：5’-CGCGCCGAGGTCTCCTTGGGTTGTAGA-3’，即SEQ ID NO.2），0.2μmol/L发夹探针（序列为：5’-GTCTTGTGGTACTGCACTCGTCTCGGTTTTCCGAGACGAGTCCTCGGCGCGAATATTGATAATCAT-3’，即SEQ ID NO.3）7.5mM MgCl₂，向该体系中分别加入330pmol/L、33pmol/L、3.3pmol/L、0.33pmol/L、0.03pmol/L、0.01pmol/L和0.003pmol/L、0pmol/L的待测核酸（序列为：5’-TCTACAACCCAAGGAGAGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.4）。经95℃孵育5分钟后，向各管中加入71ng的AfuFEN，63℃反应4小时，各管反应总体积均为10μL。

2）纳米金-寡核苷酸探针可视化检测

级联侵入信号放大反应结束后，向每个反应管加入两种纳米金-寡核苷酸探针（寡核苷酸探针序列分别为：a:5’-AAAAAAAAAAATGATTATCAATATT-3’，即SEQ ID NO.5;b:5’-GCAGTACCACAAGACAAAAAAAAAA-3’，即SEQ ID NO.6）各10μl，各管检测总体积均为30μL。55℃孵育40min，结果数码相机拍照记录。

实施例1的结果示于图3中。图3中330pmol/L、33pmol/L、3.3pmol/L、0.33pmol/L、0.03pmol/L、0.01pmol/L的待测核酸的反应体系的颜色均为红色，0.003pmol/L、0pmol/L待侧核酸的反应体系的颜色为紫色。图3的结果显示，本发明所陈述的方法能够检测到10fmol/L的待测核酸序列。

实施例2利用级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法实现单碱基差异模板的区分检测

本实施例检测了与靶核酸在不同位置有一个碱基差异的六条人工合成突变模板（序列分别为：a:5’-TCTACAACCCAAGGAGTGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.7;

b:5’-TCTACAACCCAAGGACAGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.8;

c:5’-TCTACAAGCCAAGGAGAGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.9;

d:5’-TCTACAACCCAAGGAGACAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.10;

e:5’-TCTACAACCCAAGGAGAGAGCCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID NO.11;

f:5’-TCTACAACCCAAGGAGAGAGGCCTCAGGACGAACCA-3’，即SEQ ID NO.12;）

各突变模板的序列与实施例1中的靶核酸序列仅在不同位置处有一个碱基的差异，各突变点位置如附图4中字母标注所示，各位点均突变为与实施例1中的靶核酸序列对应位点互补的碱基，即a处为T、b处为C、c处为G、d处为C、e处为C、f处为C，用来考察本发明中的方法检测核酸时区分单碱基差异的能力。

1）级联侵入信号放大反应

核酸侵入反应体系组成为10mM MOPS，pH7.5，0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40，0.1μmol/L上游探针（SEQ ID NO.1），0.2μmol/L下游探针（SEQ ID NO.2），0.2μmol/L发夹探针（SEQ ID NO.3）7.5mmol/L MgCl₂，向该体系中分别加入0.33pmol/L的靶核酸（同实施例1的待测核酸片段SEQ ID NO.4）、0.33pmol/L含有单碱基突变的模板，以及不含模板的空白对照，经95℃孵育5分钟后，向各管中加入71ng的AfuFEN，63℃反应4小时，各管反应总体积均为10μL。

2）纳米金-寡核苷酸探针可视化检测

级联侵入信号放大反应结束后，向每个反应管加入两种纳米金-寡核苷酸探针（SEQ IDNO.5,SEQ ID NO.6）各10μl，各管检测总体积均为30μL。55℃孵育40min，结果数码相机拍照记录。

实施例2的检测结果示于图4中。图4中单碱基突变a,b,c对反应影响都较大，使得级联侵入信号放大反应不能发生，反应体系仍为紫色;d介于红色和紫色之间;e,f对反应影响较小，与阳性结果相同，体系变为红色。a、b、c处于下游探针与靶序列杂交处，由于下游探针与靶序列在反应体系中结合不稳定，处于杂交解离的动态循环中，所以在杂交处有一个核苷酸不互补杂交，就会很大的影响到下游探针与靶序列互补的稳定性。而上游探针与靶核酸结合稳定，有一个碱基不稳定影响不大。但同时也要考虑到酶切位点，越靠近位点越会影响到酶和结构的结合。所以d虽然处于上游探针与靶序列杂交处，但是因为靠近酶切位点，对酶切有影响，所以介于紫色和红色之间。e、f处于上游探针与靶序列杂交处，且距离酶切位点较远，对反应影响不大，检测结果仍为红色。所以有两个因素影响特异性：一是酶切位点附近如果发生变化会对反应有影响；二是下游探针和靶序列结合不稳定也影响特异性。

这一特点说明级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化检测核酸这一方法，具有检测SNP及点突变位点的潜力。图4结果表明，本专利提供的核酸检测方法能够实现对单碱基差异的不同模板的区分检测，碱基突变位置越靠近侵入位点，与完全匹配的模板的检测结果差异越大，说明本方法具有极高的检测特异性。

Claims

1.级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法，其特征在于依次包括以下步骤：

（1）级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5~10 ℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；

（3）级联侵入信号放大反应结果纳米金-寡核苷酸探针可视化检测阶段：由于发夹探针5’端和3’端可分别与两种纳米金-寡核苷酸探针互补杂交，可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，从而引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，并由此引发粒子光学性质的改变，产生发夹探针的检测信号，即反应体系从红色变为紫色；当反应体系中有靶核酸存在时，可触发级联信号放大反应，在酶的作用下，大量发夹探针被切割；待级联信号放大反应结束后，向反应体系中加入两种纳米金-寡核苷酸探针；这时，由于发夹探针被切割，不能将两种纳米金-寡核苷酸探针连接，则不能引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，反应体系颜色不发生变化，仍然为红色；相反，当反应体系中不存在靶核酸或靶核酸浓度过低时，则无级联信号放大反应发生或级联信号放大反应作用不明显，体系中存在的发夹探针可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，反应体系颜色由红色变为紫色，从而显示该体系中无靶核酸存在或靶核酸浓度过低。

2.根据权利要求1所述的可视化核酸检测方法，其特征在于该方法能够检测到浓度为10 fmol/L的靶核酸序列。

3.根据权利要求1所述的可视化核酸检测方法，其特征在于所述的靶核酸为DNA或RNA。

4.根据权利要求1所述的可视化核酸检测方法，其特征在于所述的核酸侵入反应体系包含 MOPS、 Tween-20、Nonidet P40、上游探针、下游探针、发夹探针、MgCl₂以及靶核酸。

5.根据权利要求4所述的可视化核酸检测方法，其特征在于所述的核酸侵入反应体系包括10 mmol/L MOPS，pH 7.5，0.05 % Tween-20，0.05 % Nonidet P40，0.1μmol/L上游探针，0.2 μmol/L下游探针，0.2 μmol/L发夹探针，7.5 mM MgCl₂和靶核酸。

6.根据权利要求1所述的可视化核酸检测方法，其特征在于所述的核酸5’外切酶或5’flap内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。

7.根据权利要求6所述的可视化核酸检测方法，其特征在于所述的5’flap内切酶为AfuFEN。

8. 根据权利要求1所述的可视化核酸检测方法，其特征在于步骤（1）所述的反应温度可以通过恒温水浴仪实现；步骤（3）所述的纳米金-寡核苷酸探针检测结果可通过人眼直接观察，或拍照保存结果。