CN110863052A - Egfr基因t790m位点检测试剂盒 - Google Patents

Egfr基因t790m位点检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述试剂盒包括a)引物对；b)上游探针、下游探针、发夹探针；以及c)两种纳米金探针。上述引物和探针能够实现在闭管条件下对EGFR基因T790M位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染，并可用于EGFR基因靶向药物的耐药性检测。

Description

EGFR基因T790M位点检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种EGFR基因T790M位点检测试剂盒。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在非小细胞癌症的治疗中发挥着重要的作用，针对该受体的靶向药物已经有数十种，并广泛应用于临床。在使用靶向药物治疗前，需要先进行EGFR基因位点的突变检测，根据基因的特定基因位点是否发生突变来决定靶向药物的治疗方案，如EGFR基因T790M位点发生突变时会造成某些靶向药物治疗的无效，需要在治疗中避开一些药物的使用。通常，在获得的临床样本中不仅含有突变基因，也会含有大量野生型基因，由于两者之间的序列常常仅有一个碱基的差异，因此针对性的检测突变基因的难度很大。目前针对这类的基因位点检测多是基于分子检测的方法完成，使用较多技术平台是ARMS-PCR技术和二代测序技术，这些方法能够检测低至1％左右的基因突变，但是由于试剂盒的成本较高(或者对操作者的要求较高)，给患者带来较大的经济负担。
发明内容
本发明通过可见光波长快速检测纳米金探针与模板杂交情况实现对EGFR基因T790M突变位点的检出，不需要昂贵的实时荧光PCR仪器，也不需要昂贵且操作复杂的二代测序仪器，从而为EGFR基因T790M突变位点检测提供一种更为经济、简洁、快速的方式。
具体的，本发明涉及一种EGFR基因T790M位点检测试剂盒，包括：
a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4、5、6所示的下游探针中的至少一条、SEQ ID NO：7所示的发夹探针；以及
c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核酸片段。
上述引物和探针能够实现在闭管条件下对EGFR基因T790M位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染，并可用于EGFR基因靶向药物的耐药性检测。
根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其由如上所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒混合配制得到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所提供试剂盒的使用原理示意图；
图2为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点检测不同检测体系优化结果；
图3为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点检测试剂的灵敏度检测结果；
图4为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点检测试剂中干扰物质的影响检测结果；
图5为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点检测试剂的特异性验证结果；
图6为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点检测试剂检测实际临床样本结果；
图7为本发明一个实施例中EGFR基因T790M突变位点实际临床样本的实时荧光PCR检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)基因T790M位点检测试剂盒，包括：
a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4、5、6所示的下游探针中的至少一条、SEQ ID NO：7所示的发夹探针；以及
c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核酸片段。
本发明所提供的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒对基因突变区域序列进行检测，每例样本仅需一管检测试剂即可完成判读，无需额外操作，同时也无需昂贵的实时荧光PCR扩增检测设备。其检测原理主要有三个阶段构成，第一阶段为模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段为信号产生和积累，通过探针与扩增模板的特异性结合、内切酶参与、纳米金探针与信号分子杂交，实现对目标模板向信号分子的高效率转化；第三阶段为信号判读，通过可见光强度差值判读，实现对EGFR基因T790M突变位点的快速检测。探针增加为保障通过以上三个阶段实现在闭管条件下对EGFR基因T790M突变位点的高灵敏、高分辨、低成本检测。
其中，下游探针优选采用SEQ ID NO：5所示的探针。
在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为1nm～200nm。
在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为5nm～80nm。
在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为10nm～30nm。
在一些实施方式中，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核酸片段独立地通过连接片段与所述纳米金颗粒连接，且所述连接片段彼此不杂交，也不与a)和b)发生杂交。
在本发明中，“杂交”评定的标准是指核酸在严格条件下不发生杂交。对本领域技术人员而言，这种“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。或者，两个核酸片段在如Sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×SSC中杂交，然后在50℃的2×SSC中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×SSC和用于高严格性50℃下的2.0×SSC之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温的用于高严格性的65℃之间变化。在一个具体的实施方式中，严格条件为在本申请的PCR反应条件。
在一些实施方式中，所述连接片段的长度为1nt～15nt，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14nt；优选5nt～9nt。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA内切酶、dNTP、缓冲液或缓冲盐、可溶性镁盐、Tween-20以及水中的一种或多种。
如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7～pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。缓冲盐溶于溶剂(通常是水)中后能够得到所述缓冲液。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中，所述DNA内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的任一种。
在一些实施方式中，所述可溶性镁盐为MgCl2。
在一些实施方式中，所述水通常没有核酸及核酸酶，例如双蒸水或去离子水。水为蒸馏水、去离子水、反渗水。
本发明还涉及一种组合物，其由如上所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒混合配制得到。
在一些实施方式中，所述组合物为溶液，其中a)中的引物的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，b)中探针的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，c)中纳米金探针的浓度独立地选自0.03μM～0.2μM，所述组合物中还含有靶核酸。
在一些实施方式中，所述组合物的pH为8～9，优选为8.5。
本发明还涉及一种检测EGFR基因T790M位点的方法，其包括：
a)获取如上所述的组合物；
b)进行PCR反应，观测反应体系的颜色变化以判断EGFR基因T790M位点突变情况。
所述方法可用于EGFR基因靶向药物的耐药性检测。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 EGFR基因T790M突变位点检测使用的引物探针
根据EGFR基因T790M突变位点序列设计特异性的引物和探针，检测结果特异性由引物对、探针对共同决定，其设计原理如图1所示。
所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒由引物、常规探针、发夹探针、纳米金探针、反应液和酶液构成，引物和探针序列如下所示，其中下游探针1、2和3任选其一均可用于本发明中。
上游引物：CCCCACGTGTGCCGCCTGCTG(SEQ ID NO：1)；
下游引物：GCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTT(SEQ ID NO：2)；
上游探针：ACCTCCACCGTGCAGCTCATCAC(SEQ ID NO：3)；
下游探针1：CGC CTC GTA G CGCAGCTCATGCCCT(SEQ ID NO：4)；
下游探针2：CGC CTC GTA G CGCAGCTCATGCCCTTCG(SEQ ID NO：5)；
下游探针3：CGC CTC GTA G CGCAGCTCATGCCCTTCGGCT(SEQ ID NO：6)；
发夹探针：CCA GAC CAA GTA GCA ATC CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGGATCTACGAGGCG CAC GAT ATG GTT CAT(SEQ ID NO：7)；
纳米金探针1：Au-TAATATT-ATG AAC CAT ATC GTG(SEQ ID NO：8)；
纳米金探针2：TGC TAC TTG GTC TGG(SEQ ID NO：9)-TTAATAT-Au。
实施例2 EGFR基因T790M突变位点检测不同检测体系优化
本实施例应用所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒，由于下游探针在本实验中对T790M的检出起到关键作用，因此设计了三条该探针，分别采用一对引物、上游探针、纳米金探针、反应液和酶液与下游探针1～3中的一种组合，检测不同T790M百分比突变含量的模板，用于优选出更佳的检出体系。
该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～3中的一种、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入混合比例分别为50％、10％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％的待测模板(模板序列为：5-CCC CCA CGT GTG CCG CCT GCT GGG CAT CTG CCT CAC CTCCAC CGT GCA GCT CAT CAC GCA GCT CAT GCC CTT CGG CTG CCT CCT GGA CTA TGT CCGGGA ACA CAA AGA CAA TAT TGG CTC CCA GTA CCT GCT C-3)。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；63℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图2中。图2的结果显示，针对下游探针1～3的检测反应，本发明试剂盒均可检测至少低至0.5％的T790M混合百分比模板，其中下游探针2、下游探针3能够进一步检测低至0.2％的T790M混合百分比模板，但是下游探针3检测体系的阴性背景较下游探针2检测体系高。由此可知下游探针1～3均能达到较好的检出效果，并且优选下游探针2于本发明试剂盒。
实施例3 EGFR基因T790M突变位点检测试剂的灵敏度
本实施例应用所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒，分别考察了不同百分比浓度的EGFR基因T790M突变位点阳性参考品在不同核酸模板用量下的检出情况，用来验证本发明所述方法的优越性。
该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～3中的一种、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入混合比例分别为50％、10％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％的待测模板(模板与实施例2一致)，核酸模板总用量分别为3×104拷贝、3×103拷贝、3×102拷贝。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；63℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图3中。图3的结果显示本发明试剂盒在模板总用量分别为3×104拷贝、3×103拷贝、3×102拷贝下，能够检出T790M混合百分比模板的最低百分比分别为0.2％、0.5％和1％，即随着模板用量降低，本发明试剂盒检出T790M混合百分比模板的最低百分比是逐渐降低的，这与理论值相符。在总模板用量分别为3×104拷贝、3×103拷贝、3×102拷贝时加入反应体系的突变模板分子分别约为60拷贝、15拷贝、3拷贝，也即在突变模板分子仅为3拷贝时依然能够检测出阳性信号，显示本发明所述方法具有显著的优越性。
实施例4 EGFR基因T790M突变位点检测试剂的抗干扰性
本实施例应用所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒，分别检测了加入不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)的样本，用来验证本发明所述检测方法检测实际样本时干扰物质对结果的影响。
该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～3中的一种、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入混合比例分别为10％和0％的待测模板(模板与实施例2一致)，核酸模板总用量均为3×104拷贝，同时向检测体系中分别加入不同干扰物质(0.1mg/ml血红蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L胆固醇、0.1％乙醇)。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；63℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图4中。图4的结果显示不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)不会影响本发明试剂盒的检测结果。
实施例5 EGFR基因T790M突变位点检测的特异性
本实施例应用所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒，分别检测了不同来源的核酸样本，分别有人gDNA、L858R DNA(EGFR基因21号外显子突变质粒)、L747_P753>S(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)、E746_T751>I(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)、E746_T751del(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)，用来验证本发明所述的方法检测核酸样本时的特异性。
该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～3中的一种、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入人gDNA、L858R DNA、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del及对照(PC-阳线对照和NC-阴性对照)模板(模板与实施例2一致)。反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；63℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图5中。图5的结果显示不同来源的核酸(分别有人gDNA、L858R DNA、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del)检测结果均为阴性，显示了本检测试剂盒良好的特异性。
实施例6 EGFR基因T790M突变位点检测试剂检测实际临床样本
本实施例应用所述的EGFR基因T790M突变位点检测试剂盒，分别检测了12例临床实际样本，用来评价本发明所述的检测方法检测实际样本的能力。
该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～3中的一种、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入10例不同临床样本(S1～S10分别代表不同的临床样本)及对照(PC-阳线对照和NC-阴性对照)模板(模板与实施例2一致)。反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；63℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图6中。图6的结果与实时荧光PCR检测结果(图7)一致，这显示本发明检测试剂盒能够正常的反映临床样本的检测结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市宝创生物技术有限公司
<120> EGFR基因T790M位点检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
ccccacgtgt gccgcctgct g 21
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gcaggtactg ggagccaata ttgtcttt 28
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
acctccaccg tgcagctcat cac 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 6
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
ccagaccaag tagcaatccg tctcggtttt ccgagacgga tctacgaggc gcacgatatg 60
gttcat 66
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
atgaaccata tcgtg 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
tgctacttgg tctgg 15

Claims (10)

1.EGFR基因T790M位点检测试剂盒，包括：
a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4、5、6所示的下游探针中的至少一条、SEQID NO：7所示的发夹探针；以及
c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核酸片段。
2.根据权利要求1所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核酸片段独立地通过连接片段与所述纳米金颗粒连接，且所述连接片段彼此不杂交，也不与a)和b)发生杂交。
3.根据权利要求2所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述连接片段的长度为1nt～15nt。
4.根据权利要求3所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述连接片段的长度为5nt～9nt。
5.根据权利要求1～4任一项所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA内切酶、dNTP、缓冲液或缓冲盐、可溶性镁盐、Tween-20以及水中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
7.根据权利要求5所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述DNA内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的任一种。
8.根据权利要求5所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒，所述可溶性镁盐为MgCl2。
9.组合物，其由权利要求1～8任一项所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒混合配制得到。
10.根据权利要求9所述的组合物，所述组合物为溶液，其中a)中的引物的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，b)中探针的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，c)中纳米金探针的浓度独立地选自0.03μM～0.2μM，所述组合物中还含有靶核酸。
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