CN107058309A - 一种硫代修饰引物及应用该引物的snp检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法，以人基因组SNP位点rs642431为目的基因设计引物，反应体系中采用高保真DNA聚合酶，提高了对特异性引物的识别能力；通过对引物进行硫代修饰，避免了高保真酶将不匹配的碱基切下来；实时定量检测，通过△Ct可以判定分型结果，避免了终点定量会因非特异性扩增造成假阳性的缺陷；通过溶解曲线可以判定是否有非特异性扩增，增加判断的准确度。反应体系中的荧光染料也可以用分子信标探针代替，提高了该方法的可行性，为实验操作提供了多种选择。

Description

一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法
技术领域
本发明属于SNP检测技术领域，特别涉及一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
目前SNP的常用检测方法是等位基因特异性PCR(Allele apecific PCR，AS-PCR)，AS-PCR是基于引物3`端碱基与DNA模板匹配与否来区分SNP位点。理论上，只要末位碱基不配对，那么引物无法有效延伸；但是末位单碱基错配往往不能达到预期的分辨效果。由于PCR反应中DNA呈指数级增长，当与引物3`端碱基错配的DNA模板在第一个循环有少量的扩增时，其复制出来的DNA模板在后续的循环里与原引物的错配就不存在。随着指数级的DNA扩增，错配产物的数量也相当可观。达到影响分辨率的程度。
授权公告号为CN103320514B的发明专利公开了一种检测临近SNP的多重PCR方法，可以解决扩增抑制问题并提高扩增效率；但是该方法需要设计多对引物，工作量较大，操作较为繁琐。因此，提供一种新的SNP检测方法，以提高灵敏性和准确性，防止错配延伸，成为本领域研究人员急需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种硫代修饰引物，所述引物的硫代修饰位点为3`端第一和第二个碱基之间的磷酸二酯键。
本发明另一方面提供了一种应用该引物的的SNP检测方法，包括如下步骤：
S1：设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述特异性引物包括两条上游引物F1、F2和一条下游引物R，所述F1引物和所述F2引物3`端第一位碱基不同，其余序列均相同；
S2：分别对所述F1引物和所述F2引物进行硫代修饰；
S3：用所述引物对目的基因进行PCR扩增；
S4：对实验结果进行分析。
进一步地，所述PCR的反应体系中使用的DNA聚合酶为Pfu高保真DNA聚合酶。
SNP位点的识别，即单个碱基的识别。高保真DNA聚合酶比普通Taq DNA聚合酶对错配碱基的识别能力更强。但是高保真DNA聚合酶具有3`-5`核酸外切酶活性，在PCR的过程中会切掉不匹配的碱基；硫代修饰的作用是改变碱基间的连接方式，将碱基间磷酸二酯键中的氧原子换成硫原子，3`-5`核酸外切酶在PCR过程中不能识别该位点，从而不能将不匹配的碱基切除。由此可以提高SNP检测的特异性和准确性。
进一步地，所述步骤S3中，分别采用F1引物和F2引物为上游引物、以R引物为下游引物进行实时荧光定量PCR。
进一步地，所述PCR的反应体系中包括如下组分：
模板DNA 0.2ng/μl、F1引物或F2引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP 0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶0.02U/μl以及1×的SYBR GREEN。
不同种类生物的不同基因片段大小不同，差距可达两个数量级，用量约在0.02～2ng/μl之间。本研究中应用的是人基因组片段，因此模板用量为0.2ng/μl。
进一步地，所述PCR的反应条件如下：
(1)预变性：98℃ 3min；
(2)扩增：98℃ 10s，58℃ 30s，共40个循环；
(3)扩增曲线：95℃ 15s；60℃ 15s；95℃ 15s。
分别以两种上游引物进行扩增，当特异性引物与模板完全匹配时，引物可以正常延伸，产生扩增曲线；当特异性引物与模板不能匹配时，引物不能延伸，不能产生扩增曲线。由此，可以对模板中的SNP位点起到检测作用。
上述技术方案可以通过设计分子信标探针替代荧光染料，此时，所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：对目的基因通过AS-PCR进行位点识别；
S3.2：分子信标扩增：利用两条分子信标探针对步骤S3.1中得到的扩增产物进行PCR扩增；
S3.3：信号产生：将反向引物结合到步骤S3.2中得到的扩增产物上，进行PCR扩增，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。
第一轮PCR用于识别等位基因，产生大量带有等位基因通用标签的PCR产物；第二轮PCR是以分子信标探针作为引物，结合到通用标签序列部分，进行PCR扩增；第三轮PCR通过反向引物扩增，将分子信标的发夹结构打开，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。
进一步地，所述F1引物的5`端连接有通用标签1，所述F2引物的5`端连接有通用标签2，所述通用标签1和所述通用标签2的碱基序列如下：
通用标签1：5`GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3`；
通用标签2：5`GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3`。
进一步地，两条所述分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，5`端分别标记FAM和HEX作为荧光基团，中间均标记Dabcyl作为淬灭基团。
进一步地，所述步骤S3中PCR反应体系中包括如下成分：
模板DNA 0.2ng/μl、F1引物0.5μM、F2引物0.5μM、R引物0.5μM、分子信标beacon-FAM 0.5μM、分子信标beacon-HEX 0.5uM、dNTP 0.2mM以及Taq DNA聚合酶0.02U/μl；
所述PCR的反应条件如下：
(1)预变性：94℃5min；
(2)扩增：94℃ 20s，58℃ 30s，共36个循环。
将三轮PCR所需的试剂合在一个反应体系中，通过上述反应条件，即可通过一次PCR达到三轮PCR的效果。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法，PCR过程中采用高保真DNA聚合酶，提高了对特异性引物的识别能力，同时对引物进行硫代修饰，避免了高保真酶将不匹配的碱基切下来，提高检测方法的特异性；实时定量检测中，通过扩增曲线可以判定是否有非特异性扩增，利用△Ct判定分型结果，可以避免终点定量因非特异性扩增造成假阳性的问题，具有较高的准确度和灵敏性；该方法还可以借助分子信标探针替代核酸染料，并将三步PCR扩增合为一步反应，以此达到同样的效果，可以提高该方法的可行性，为实验操作提供了多种选择。
附图说明
图1为实验例1中扩增曲线1的示意图；
图2为实验例1中扩增曲线2的示意图；
图3为实验例1中扩增曲线1与扩增曲线2的对比情况；
图4为实验例2中扩增结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种利用碱基错配扩增的SNP检测方法，包括如下步骤：
S1：以人基因组SNP位点rs642431为目的基因,设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述位点碱基序列如下：
所述引物的碱基序列如下：
F1：5`CGGCACACCAGTGTGTGTCT*T3`；
R：5`ATTCTGGGAACCAGGGAAGATGTGG3`；
其中F1引物经过硫代修饰，硫代修饰的位点为3`端倒数第一和倒数第二个碱基之间的磷酸二酯键；
S2：用所述引物对目的基因进行PCR扩增，具体反应体系如下；
模板DNA 10ng、F1引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP 0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶1U以及2.5μl的SYBR GREEN(20×)，补充ddH2O至终体积50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：98℃ 3min；
(2)扩增：98℃ 10s，58℃ 30s，共40个循环；
(3)扩增曲线：95℃ 15s；60℃ 15s；95℃ 15s；
S3：对实验结果进行分析。
实施例2
一种利用碱基错配扩增的SNP检测方法，包括如下步骤：
S1：以人基因组SNP位点rs642431为目的基因(碱基序列同实施例1),设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述引物的碱基序列如下：
F2：5`CGGCACACCAGTGTGTGTCT*G3`；
R：5`ATTCTGGGAACCAGGGAAGATGTGG3`；
其中F2引物经过硫代修饰，硫代修饰的位点为3`端倒数第一和倒数第二个碱基之间的磷酸二酯键；
S2：用所述引物对目的基因进行PCR扩增，具体反应体系如下；
模板DNA 10ng、F2引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP 0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶1U以及2.5μl的SYBRGREEN(20×)，补充ddH2O至终体积50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：98℃ 3min；
(2)扩增：98℃ 10s，58℃ 30s，共40个循环；
(3)扩增曲线：95℃ 15s；60℃ 15s；95℃ 15s；
S3：对实验结果进行分析。
实施例3
一种利用碱基错配扩增的SNP检测方法，包括如下步骤：
S1：以人基因组SNP位点rs645112为目的基因,设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物和分子信标探针，所述位点碱基续列如下：
其中F1引物和F2引物的5`端分别连接有通用标签1和通用标签2，连接有通用标签的引物序列如下：
F1`：5`GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TGGAAAACAG AAGCACTAAGTTCTT3`；
F2`：5`GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TGGAAAACAG AAGCACTAAGTTCTG3`。
R：5`CACAAAGATGATAGAAATTAAGATTTCAATGGC3`；
两条分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，所述分子信标探针的碱基序列如下：
beacon-FAM：FAM-5`ACGCGAAGTTAAGACCTATGCGCGT3`(Dabcyl)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-磷酸化；
beacon-HEX：HEX-5`ACGCGAAGTTAAGACCTATGCGCGT3`(Dabcyl)GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-磷酸化。
S2：用所述引物和分子信标探针对目的基因进行PCR扩增，具体反应体系如下；
模板DNA10ng、F1引物0.5μM、F2引物0.5μM、R引物0.5μM、分子信标beacon-FAM 0.5μM、分子信标beacon-HEX 0.5μM、dNTP 0.2mM以及Taq DNA聚合酶1U，补充ddH2O至终体积50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：94℃ 5min；
(2)扩增：94℃ 20s，58℃ 30s，共36个循环。
S3：对实验结果进行分析。
实验例1
提取目的基因，分别按照实施例1和实施例2中提供的方法对目的基因进行SNP检测，并分别进行多个平行实验；以实施例1的多个平行实验生成扩增曲线1，以实施例2的多个平行实验生成扩增曲线2，并进行比较。
实验结果如图1～3所示，由于F1引物与模板能匹配，而F2引物与模板不能匹配，因此以F2作为上游引物的PCR扩增受到抑制，其扩增曲线的Ct值比以F1为上游引物时更大，并且△Ct＞3，因此认为该位点为纯合。
实验例2
提取目的基因，按照实施例3中提供的方法对目的基因进行SNP检测，并进行多次平行实验，对结果进行分析。实验结果如图4所示，靠近Y轴的数据点最多，占所有数据点中的一半，靠近X轴的数据点和趋向坐标中间的数据点的数量接近。表明该SNP位点上G的纯合子较多，T的纯合子以及G-T杂合子也有检出。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种硫代修饰引物，其特征在于，所述引物的硫代修饰位点为3`端第一和第二个碱基之间的磷酸二酯键。
2.应用权利要求1所述的硫代修饰引物的SNP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述特异性引物包括两条上游引物F1、F2和一条下游引物R，所述F1引物和所述F2引物3`端第一位碱基不同，其余序列均相同；
S2：分别对所述F1引物和所述F2引物进行硫代修饰；
S3：用所述引物对目的基因进行PCR扩增；
S4：对实验结果进行分析。
3.如权利要求2所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系中使用的DNA聚合酶为Pfu高保真DNA聚合酶。
4.如权利要求3所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，分别采用F1引物和F2引物为上游引物、以R引物为下游引物进行实时荧光定量PCR。
5.如权利要求4所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系中包括如下组分：
模板DNA 0.2ng/μl、F1引物或F2引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶0.02U/μl以及1×的SYBR GREEN。
6.如权利要求5所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应条件如下：
(1)预变性：98℃3min；
(2)扩增：98℃10s，58℃30s，共40个循环；
(3)扩增曲线：95℃15s；60℃15s；95℃15s。
7.如权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：对目的基因通过AS-PCR进行位点识别；
S3.2：分子信标扩增：利用两条分子信标探针对步骤S3.1中得到的扩增产物进行PCR扩增；
S3.3：信号产生：将反向引物结合到步骤S3.2中得到的扩增产物上，进行PCR扩增，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。
8.如权利要求7所述的SNP检测方法，其特征在于，所述F1引物的5`端连接有通用标签1，所述F2引物的5`端连接有通用标签2，所述通用标签1和所述通用标签2的碱基序列如下：
通用标签1：5`GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3`；
通用标签2：5`GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3`。
9.如权利要求8所述的SNP检测方法，其特征在于，两条所述分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，5`端分别标记FAM和HEX作为荧光基团，中间均标记Dabcyl作为淬灭基团。
10.如权利要求9所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR反应体系中包括如下成分：
模板DNA 0.2ng/μl、F1引物0.5μM、F2引物0.5μM、R引物0.5μM、分子信标beacon-FAM0.5μM、分子信标beacon-HEX 0.5μM、dNTP 0.2mM以及Taq DNA聚合酶0.02U/μl；
所述PCR的反应条件如下：
(1)预变性：94℃5min；
(2)扩增：94℃20s，58℃30s，共36个循环。
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