CN106434940A - 一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括检测HMGCR基因rs17238540位点的两条正向引物及一条反向引物，和检测APOE基因rs7412位点两条正向引物和一条反向引物，和检测APOE基因rs429358位点两条正向引物和一条反向引物，和检测SLCO1B1基因rs4149056位点两条正向引物和一条反向引物。本发明的试剂盒，可以对上述四个位点进行高通量检测，基因分型的结果可以通过软件直观的进行分辨，从而达到对他汀类降脂药计量量化的控制，最大程度的降低副作用的目的。

Description

一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂 盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及多重基因检测的试剂盒及其检测方法，尤其是一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术
他汀类药物，(statins)，是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药在降脂的同时，也带来了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用
HMGCR基因编码的是胆固醇合成的限速酶，是胆固醇反馈抑制的重要调控位点。该酶的多态性影响个体血液中的胆固醇浓度。当服用他汀类药物后，rs17238540位点携带G等位基因的个体比携带T等位基因的个体，降低血液中胆固醇的效果不理想。
载脂蛋白E(APOE)参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，在胆固醇转运和脂蛋白代谢中起着重要作用，是主要的胆固醇与脂蛋白在体内转化代谢的调节蛋白之一，其基因多态性导致个体间血脂和脂蛋白水平产生明显差异，也会影响个体对他汀类药物的反应。当服用他汀类药物后，rs7412位点携带C等位基因的个体比携带T等位基因的个体，降血脂效果不理想；rs429358位点携带C等位基因的个体比携带T等位基因的个体，降血脂效果不理想。
SLC01B1编码的蛋白，主要存在于人体肝脏的基底外侧膜，主要承担将多种内源性和外源性物质由血转运至肝脏，SLC01B1基因的多态性影响个体转运他汀药物到肝脏发挥作用的效率。在rs4149056位点携带C等位基因的个体，转运他汀药物到肝脏效率较低，而血液中药物浓度高，发生不良反应的风险增高。
目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨率溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序技术是公认的检测基因突变的金标准，但其设备成本高、检测周期长、检测通量低、检测灵敏度低、对实验人员的技术操作要求高、结果判定步骤繁琐等原因，较难形成商业化的诊断产品；限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度同样不高、操作步骤繁琐，检测的结果仍需要进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，因此也无法应用到临床上。芯片检测因其检测结果的准确性和重复性较差，实验周期长等缺点，也不适于开发临床检测试剂盒。荧光定量PCR的检测方法拥有成本低、灵敏度高、特异性强，结果的重复性好等优点，是检测SNP的非常好的一种检测手段，但是常规的Taqman探针法探针订购成本太高，多个位点同时检测时很难保证所有引物探针在同一扩增条件下均达到非常好的扩增效果。因此，急需要找到一种简便易行的基因分型方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种快速、简便、经济、实用的用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒及其检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，包括2X qPCR混合反应液、检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix、检测APOE基因rs7412位点的引物mix、检测APOE基因rs429358位点的引物mix和检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix；所述检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix含有检测该SNP位点的两条特异性正向引物及一条反向引物，所述的检测APOE基因rs7412位点的引物mix含有检测该SNP位点的两条特异性正向引物及一条反向引物，所述的检测APOE基因rs429358位点的引物mix含有检测该SNP位点的两条特异性正向引物及一条反向引物，所述的检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix含有检测该SNP位点的两条特异性正向引物及一条反向引物；所述检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，所述检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，所述检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示，所述检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14所示。
所述的2X qPCR混合反应液中含PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、两条分别用FAM和HEX标记的通用荧光探针，FAM标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.1所示，HEX标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：提取待检测样本的基因组DNA，然后分成4个反应管(a、b、c、d)进行检测，首先在每个反应管中分别加入2X qPCR混合反应液，然后在第一反应管(a)加入检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix；在第二反应管(b)加入检测APOE基因rs7412位点的引物mix；在第三反应管(c)加入检测APOE基因rs429358位点的引物mix；在第四反应管(d)加入检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix，最后在4个反应管(a、b、c、d)中加入待检测样本的基因组DNA，进行核酸样本的荧光定量PCR扩增，在37℃进行荧光信号的扫描，使用LightCycler 480 Software release软件中的Endpiont Genotyping模块根据两种荧光信号的强度及比值对基因型进行自动判别。
所述PCR扩增程序如下：
预变性的条件为：温度为94℃，时间为15秒；
PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成；
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：起始温度为61℃，每一轮扩增循环温度递减0.5℃，直至扩增循环结束，时间为60秒；
第二阶段由29轮循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：温度为55℃，时间为60秒；
信号扫描条件为：温度为37℃，时间为60秒。
本发明的有益效果是：本发明的试剂盒能快速、简便、经济、实用的对基因分型，并且通过与一代测序技术检测结果比对，结果符合度高达99％以上，有望在临床快速基因分型中得到广泛应用。解决现有其他检测技术价格昂贵、效率低下及通量不高的问题。
附图说明
图1为采用本发明试剂盒中的检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对四个样品的检测结果图。
图2为图1中所示的1-1、1-2、1-3、1-4四个待测样本的一代测序(Sanger测序)图。
图3为采用本发明试剂盒中的检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对四个样品的检测结果图。
图4为图3中所示的2-1、2-2、2-3、2-4四个待测样本的一代测序(Sanger测序)图。
图5为采用本发明试剂盒中的检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对四个样品的检测结果图。
图6为图5中所示的3-1、3-2、3-3、3-4、3-5五个待测样本的一代测序(Sanger测序)图。
图7为采用本发明试剂盒中的检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对五个样品的检测结果图。
图8为图7中所示的4-1、4-2、4-3、4-4四个待测样本的一代测序(Sanger测序)图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，所述试剂盒包括包括2X qPCR混合反应液，检测HMGCR基因rs17238540位点的两条正向引物及一条反向引物，和检测APOE基因rs7412位点两条正向引物和一条反向引物，和检测APOE基因rs429358位点两条正向引物和一条反向引物，和检测SLCO1B1基因rs4149056位点两条正向引物和一条反向引物。
所述检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACAATGGATTAGGCTGATATGACC SEQID NO.3
A等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACAATGGATTAGGCTGATATGACA SEQID NO.4
反向引物：TAATTGGTCTTTTCCAAACTCTTT SEQ ID NO.5
所述检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGTACACTGCCAGGCG SEQ ID NO.6
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGTACACTGCCAGGCA SEQ ID NO.7
反向引物：CGATGCCGATGACCTGC SEQ ID NO.8
所述检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGGACATGGAGGACGTGC SEQ IDNO.9
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACATGGAGGACGTGT SEQ IDNO.10
反向引物：CGGTACTGCACCAGGCG SEQ ID NO.11
所述检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTCATACATGTGGATATATGC SEQ IDNO.12
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGGTCATACATGTGGATATATGT SEQID NO.13
反向引物：TCCACGAAGCATATTACCCATGAA SEQ ID NO.14
其中，所述正向引物均由两部分序列结合而成：野生型正向引物的5’端为通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO.1)，3’端为识别相应位点的特异序列；突变型正向引物的5’端为通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO.2)，3’端为识别相应位点的特异序列。
所述的2X qPCR混合反应液中含PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、两条分别用FAM和HEX标记的通用荧光探针，FAM标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.1所示，HEX标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明试剂盒的检测方法，扩增程序如下所示：
预变性的条件为：温度为94℃，时间为15秒；
PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成；
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：起始温度为61℃，每一轮扩增循环温度递减0.5℃，直至扩增循环结束，时间为60秒；
第二阶段由29轮循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：温度为55℃，时间为60秒；
信号扫描条件为：温度为37℃，时间为60秒。
本发明的引物(primer)是PCR(聚合酶链式反应)技术中的重要组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。野生型正向引物的5’通用序列与2X PCR混合反应液中用FAM荧光染料标记的通用序列一致；突变型正向引物的5’通用序列与2X PCR混合反应液中用HEX荧光染料标记的通用序列一致；携带荧光染料标记的通用序列用于为荧光定量PCR扩增完成后提供荧光信号。
本发明的工作原理是：针对每个位点分别设计了两条特异性正向引物和一条反向引物。两条特异性正向引物3’端最后一个核苷酸分别与突变位点所检测的碱基互补配对，在PCR(聚合酶链式反应)扩增时联合反向引物对待测DNA模板进行特异性扩增。PCR前10个循环的扩增采用了Touchdown PCR，即降落PCR，是优化和改良后的一种PCR方法，指每一个(或n个)循环降低0.5℃(或n℃)退火温度，直到达到一个较低的退火温度(Touchdown退火温度)，以此来保证不同Tm值的引物均可以与相应的待测DNA模板结合并进行特异性扩增。随后进行的29个循环的PCR扩增过程中，2X PCR混合反应液中的分别用FAM和HEX标记的两条通用探针会以前10轮PCR扩增时产生的PCR产物为模板，配合反向引物产生出携带有不同荧光染料标记的PCR产物。最后在37℃进行荧光信号的扫描，由软件根据两种荧光信号的强度及比值对基因型进行自动判别。
本发明与现有技术相比具有以下的优点和效果：
1、本发明采用特殊设计的引物，荧光信号由PCR混合液中的两种携带不同荧光染料标记的通用序列提供，无需单独设计特异性探针，极大的减少了研发周期及检测成本。
2、本发明采用特殊的PCR程序，大大减少了由于Tm值太低而导致的引物与模板在错误位点的结合，从而提高了PCR效率和灵敏度，为临床他汀类降脂药用药剂量调整提供可靠的依据。
3、本发明采用的SNP位点基因分型软件，可以直观的自动判别每个待测位点的基因型，无需通过Ct值的繁琐计算，极大的降低了结果判读时的人为失误，并缩短了结果判读的时间，提高了检测效率。
4、本发明的试剂盒，可以根据待测样本数量的多少，灵活的选用8连管、96孔板或者384孔板进行检测，一次的检测通量分别为1人份、28人份和124人份。
5、本发明的试剂盒，可以实现高准确度、高效率的对HMGCR基因rs17238540位点、APOE基因rs7412位点、APOE基因rs429358位点和SLCO1B1基因rs4149056共四个SNP位点检测，从而达到对他汀类降脂药用药剂量的量化控制，甚至对血栓性疾病的预防、抗凝药物的选择、新抗凝药的研发、血栓性的疾病预后也起到一定的作用。
实施例1
一种用于指导他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒包含：2X PCR混合反应液、检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix和检测APOE基因rs7412位点的引物mix和检测APOE基因rs429358位点的引物mix和检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix。
所述检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
G等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACAATGGATTAGGCTGATATGACC SEQID NO.3
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACAATGGATTAGGCTGATATGACA SEQID NO.4
反向引物：TAATTGGTCTTTTCCAAACTCTTT SEQ ID NO.5
所述检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGTACACTGCCAGGCG SEQ ID NO.6
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGTACACTGCCAGGCA SEQ ID NO.7
反向引物：CGATGCCGATGACCTGC SEQ ID NO.8
所述检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGGACATGGAGGACGTGC SEQ IDNO.9
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACATGGAGGACGTGT SEQ IDNO.10
反向引物：CGGTACTGCACCAGGCG SEQ ID NO.11
所述检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如下所示：
C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTCATACATGTGGATATATGC SEQ IDNO.12
T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGGTCATACATGTGGATATATGT SEQID NO.13
反向引物：TCCACGAAGCATATTACCCATGAA SEQ ID NO.14
其中，所述正向引物均由两部分序列结合而成：野生型正向引物的5’端为通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO.1)，3’端为识别相应位点的特异序列；突变型正向引物的5’端为通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO.2)，3’端为识别相应位点的特异序列。
实施例2
一种用于指导他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒采用的PCR扩增方法包括以下步骤：
第一步：待测样本基因组DNA提取
(1)从患者抽取血液样本。
(2)从血液中获取DNA，采用天根生化(北京)有限公司生产的TGuide血液基因组DNA提取试剂盒(OSR-M102)在其配套的TGuide M16核酸自动提取仪上进行提取。
提取过程如下：
a.往样品管中加入200μl/400μl的哺乳动物全血样本，并加入10μl/20μl蛋白酶K混匀。
b.放置样品管于T型架的孔4位置。运行编号102程序(全血基因组DNA提取程序)，选择相应的样本量体积和最终洗脱体积。
第二步：对DNA进行扩增
采用10ng/10ul反应体系，具体操作为：
1、将上述一系列引物分别与血液基因组DNA、2X PCR混合反应液、去离子水按照一定比例混合构成单独的反应体系，具体见下表：
试剂名称 体积(ul)
基因组DNA(10ng) 2ul
引物mix 1ul
2X PCR混合反应液 5ul
去离子水 2ul
2、对上述反应体系进行PCR循环，PCR循环条件见下表：
第三步：观测结果
表1为采用试剂盒中的检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对四个样品的基因型结果。
表1
如图1所示，在HMGCR基因rs17238540位点的荧光定量PCR扩增体系中，检测G等位基因的特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中FAM荧光标记的引物序列一致，检测T等位基因的特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中HEX荧光标记的引物序列一致。图1中X轴代表了FAM荧光的强度，Y轴代表了HEX荧光的强度，1-1、1-2、1-3、1-4四个样本的检测结果靠近Y轴，说明仅有HEX荧光被检出，因此基因型均为TT纯合。
如图2所示，1-1、1-2、1-3、1-4四个样本在rs17238540位点处仅检测到T等位基因，说明四个样本在rs17238540位点的基因型为TT纯合。一代测序结果与试剂盒检测结果一致。
表2为采用试剂盒中的检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对四个样品的基因型结果。
表2
如图3所示，在APOE基因rs7412位点的荧光定量PCR扩增体系中，检测C等位基因的特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中FAM荧光标记的引物序列一致，检测T等位基因特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中HEX荧光标记的引物序列一致。图3中X轴代表了FAM荧光的强度，Y轴代表了HEX荧光的强度,2-1、2-2和2-3三个样本检测结果靠近X轴，说明只有FAM荧光被检出，因此基因型为CC纯合；2-4样本检测结果靠近对角线的位置，说明FAM和HEX两种荧光均被检出，因此基因型为CT杂合。
如图4所示，2-1、2-2合2-3三个样本在rs7412位点处只检测到C等位基因，所以2-1、2-2合2-3三个样本在rs7412位点的基因型为CC纯合；2-4样本在rs7412位点处同时检测到C和T两种等位基因，所以2-4样本在rs7412位点的基因型为CT杂合。一代测序结果与试剂盒检测结果一致。
表3为采用试剂盒中的检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对5个样品的基因型结果。
表3
如图5所示，在APOE基因rs429358位点的荧光定量PCR扩增体系中，检测C等位基因的特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中FAM荧光标记的引物序列一致，检测T等位基因特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中HEX荧光标记的引物序列一致。图5中X轴代表了FAM荧光的强度，Y轴代表了HEX荧光的强度,3-1样本检测结果靠近X轴，说明只有FAM荧光被检出，因此基因型为CC纯合；3-2和3-3两样本检测结果靠近对角线的位置，说明FAM和HEX两种荧光均被检出，因此基因型为CT杂合；3-4和3-5两个样本的检测结果靠近Y轴，说明只有HEX荧光被检出，因此基因型为TT纯合。
如图6所示，3-1样本在rs429358位点处只检测到C等位基因，所以3-1样本在rs429358位点的基因型为CC纯合；3-2和3-3两个样本在rs429358位点处同时检测到C和T两种等位基因，所以3-2和3-3两个样本在rs429358位点的基因型为CT杂合。3-4和3-5两个样本在rs429358位点处只检测到T等位基因，所以3-4和3-5两个样本在rs429358位点的基因型为TT纯合；一代测序结果与试剂盒检测结果一致。
表4为采用试剂盒中的检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物和一条反向引物对4个样品的基因型结果。
表4
如图7所示，在SLCO1B1基因rs4149056位点的荧光定量PCR扩增体系中，检测C等位基因的特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中FAM荧光标记的引物序列一致，检测T等位基因特异性正向引物5’端序列与2*qPCR反应混合液中HEX荧光标记的引物序列一致。图7中X轴代表了FAM荧光的强度，Y轴代表了HEX荧光的强度,4-1和4-2两样本检测结果靠近对角线的位置，说明FAM和HEX两种荧光均被检出，因此基因型为CT杂合；4-3和4-4两个样本的检测结果靠近Y轴，说明只有HEX荧光被检出，因此基因型为TT纯合。
如图8所示，4-1和4-2两个样本在rs4149056位点处同时检测到C和T两种等位基因，所以4-1和4-2两个样本在rs4149056位点的基因型为CT杂合。4-3和4-4两个样本在rs4149056位点处只检测到T等位基因，所以4-3和4-4两个样本在rs429358位点的基因型为TT纯合；一代测序结果与试剂盒检测结果一致。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (4)

1.一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，其特征在于，包括2XqPCR混合反应液、检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix、检测APOE基因rs7412位点的引物mix、检测APOE基因rs429358位点的引物mix和检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix；4个引物mix均含有检测其SNP位点的两条特异性正向引物及一条反向引物，检测HMGCR基因rs17238540位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示，检测APOE基因rs7412位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，检测APOE基因rs429358位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示，检测SLCO1B1基因rs4149056位点的两条特异性正向引物及一条反向引物序列如SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，其特征在于，所述的2X qPCR混合反应液中含PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、两条分别用FAM和HEX标记的通用荧光探针，FAM标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.1所示，HEX标记的通用荧光探针序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测样本的基因组DNA，然后分成4个反应管(a、b、c、d)进行检测，首先在每个反应管中分别加入2X qPCR混合反应液，然后在第一反应管(a)加入检测HMGCR基因rs17238540位点的引物mix；在第二反应管(b)加入检测APOE基因rs7412位点的引物mix；在第三反应管(c)加入检测APOE基因rs429358位点的引物mix；在第四反应管(d)加入检测SLCO1B1基因rs4149056位点的引物mix，最后在4个反应管(a、b、c、d)中加入待检测样本的基因组DNA，进行核酸样本的荧光定量PCR扩增，在37℃进行荧光信号的扫描，使用LightCycler 480Software release软件中的Endpiont Genotyping模块根据两种荧光信号的强度及比值对基因型进行自动判别。
4.根据权利要求3所述的用于他汀类降脂药个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序如下：
预变性的条件为：温度为94℃，时间为15秒；
PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成；
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：起始温度为61℃，每一轮扩增循环温度递减0.5℃，直至扩增循环结束，时间为60秒；
第二阶段由29轮循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火+延伸：温度为55℃，时间为60秒；
信号扫描条件为：温度为37℃，时间为60秒。
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