CN104711344A

CN104711344A - 华法林个体化用药基因检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN104711344A
Application number: CN201510029254.0A
Authority: CN
Inventors: 郭成贤; 阳国平; 袁洪; 谭鸿毅; 陈智兵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2015-06-17

Abstract

本发明公开了一种华法林个体化用药基因检测试剂盒。该试剂盒包括SEQ ID NO.1至18所示的引物。该试剂盒具有经济、方便、快速、灵敏度高、特异性强、结果可靠等特点。该试剂盒为临床提高华法林应用的安全性(降低出血风险)和有效性(抗栓塞)提供了一种全新的快速简便的方法，适合于临床广泛的推广应用。

Description

华法林个体化用药基因检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能用于快捷检测华法林个体化用药相关基因常见多态性位点的试剂盒。

背景技术

华法林是临床上最常用的抗凝药物，在美国华法林每年的处方量在所有药物中排名第一。华法林主要用于血栓栓塞性疾病的治疗，如房颤、静脉血栓等。但是由于其治疗窗窄，个体差异大(不同患者所需剂量相差最高可达二十倍以上)，易导致过度抗凝或抗凝不足的不良事件发生。

现在研究表明遗传因素是导致华法林个体差异的主要原因。华法林是由S-华法林对映体和R-华法林对映体组成的消旋体，主要在肝脏中由肝微粒体酶代谢。更具生物活性的S-华法林由CYP2C9(细胞色素P4502C9)代谢。VKORCl(维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1)是华法林作用的靶点，其能够将维生素K环氧化物还原成维生素K的氢醌式，进而参与凝血因子II、VII、IX、X的活化。多项研究表明，华法林相关基因的单核甘酸多态性(SNPs)与个体所需华法林剂量有关，并与华法林使用过程中抗凝不足或者出血等副作用的发生相关。华法林药物基因主要可以分为两类，首先是与华法林作用代谢和作用靶点相关的基因，如CYP2C9、VKORC1等；其次是与体内维生素K1代谢循环相关的基因，如CYP4F2、GGCX、EPHX1等。这些基因不同程度的影响华法林个体差异。在服用非华法林初始阶段，CYP2C9(rs1799853和rs1057910)多态性可引起2～3倍出血概率的发生。VKORC1基因多态性(rs9923231)对华法林的个体差异起着最重要的影响。CYP4F2基因多态性(rs2108622)突变纯合子患者所需剂量为野生型患者的2倍。GGCX基因多态性(rs699664)可解释2.3％个体间华法林差异。EPHX1基因多态性(rs1051740)可解释3.7％个体间华法林差异。美国FDA(食品药品管理局)于2007年、2010年两次修改说明书，要求华法林使用时要根据遗传信息个体化给药。仅根据CYP2C9和VKORC1的基因型就可以初步推算华法林的使用剂量(表1)。进一步根据多基因型及患者的基本信息建立的华法林给药剂量预测公式能更加准确的预测华法林的使用剂量。

表1根据VKORC1和CYP2C9基因型推荐的华法林每天的给药剂量(mg/d)

随着华法林起始剂量预测公式在临床的推广应用，对其用药相关基因(CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、GGCX以及EPHX1)的多态性检测越来越受到临床医生的关注。开发稳定、经济、快捷、方便的华法林用药相关基因检测技术及试剂盒服务于临床和患者，显得越来越重要。现有的华法林用药相关基因检测技术有直接测序法(该方法过程比较繁琐、耗时长，费用昂贵)，荧光定量PCR(荧光探针成本较高)，高效液相色谱法(DHPLC)(结果判读容易出错，且当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量等)，高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)(只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求有足够的PCR模板，对仪器要求高)，突变体富集PCR(需要两次PCR，而且需要酶切、操作复杂、耗时长、且容易污染)，合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)(该方法操作步骤比较繁琐，受实验条件影响较大，容易出现假阴性)，聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)(需要酶切、耗时长)，芯片分析(灵活性差，仪器设备较贵，成本较高)等。

发明内容

本发明旨在提供一种快捷、准确、高效、经济、实用，利于临床推广应用的检测CYP2C9(rs1799853和rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs699664)、EPHX1(rs1051740)基因多态性的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的而技术方案为：

所述华法林个体化用药基因检测试剂盒中包括如下等位基因特异PCR引物：

基因CYP2C9rs1799853(序列如SEQ ID NO.19所示)扩增引物：

野生型引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAC-3′(SEQ ID NO.1)；

突变性引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAT-3′(SEQ ID NO.2)；

公共引物：5′-ACATGTTCTGGAATAGGTAATG-3′(SEQ ID NO.3)；

基因CYP2C9rs1057910(序列如SEQ ID NO.20所示)扩增引物：

野生型引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGT-3′(SEQ ID NO.4)；

突变性引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGG-3′(SEQ ID NO.5)；

公共引物：5′-CCATCTTCTTGCCAAGCTGACC-3′(SEQ ID NO.6)；

基因VKORC1rs9923231(序列如SEQ ID NO.21所示)扩增引物：

野生型引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAG-3′(SEQ ID NO.7)；

突变性引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAA-3′(SEQ ID NO.8)；

公共引物：5′-TCCTTGCTGCCCACGCCATA-3′(SEQ ID NO.9)；

基因CYP4F2rs2108622(序列如SEQ ID NO.22所示)扩增引物：

野生型引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTC-3′(SEQ ID NO.10)；

突变性引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTT-3′(SEQ ID NO.11)；

公共引物：5′-ATCTCCCGCCATGTCACCCA-3′(SEQ ID NO.12)；

基因GGCX rs699664(序列如SEQ ID NO.23所示)扩增引物：

野生型引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGT-3′(SEQ ID NO.13)；

突变性引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGC-3′(SEQ ID NO.14)；

公共引物：5′-GATGGCCGCACTGGCGAACTGG-3′(SEQ ID NO.15)；

基因EPHX1rs1051740(序列如SEQ ID NO.24所示)扩增引物：

野生型引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTC-3′(SEQ ID NO.16)；

突变性引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTT-3′(SEQ ID NO.17)；

公共引物：5′-CCTCCAGAGTAGCTGGGATTAC-3′(SEQ ID NO.18)。

上述引物能应用于制备检测华法林个体化用药基因多态性试剂。

下面对本发明作进一步说明：

本发明的试剂盒采用等位基因特异PCR技术(ARMS-PCR)，包含：CYP2C9(rs1799853)多态性检测反应液、CYP2C9(rs1057910)多态性检测反应液、VKORC1(rs9923231)多态性检测反应液、CYP4F2(rs2108622)多态性检测反应液、GGCX(rs699664)多态性检测反应液、EPHX1(rs1051740)多态性检测反应液、阴性对照反应液、阳性对照反应液及内参基因(β-actin)反应液等组份。

本发明试剂盒中的反应液包含引物、PCR缓冲液、MgCl₂、Taq酶、dNTPs以及ddH2O等。在使用时只需在基因反应液中加入1～2μL DNA模版即可，阴性对照(去离子水)及阳性对照(构建的质粒DNA)直接上机扩增。所述的引物即为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.18所示的序列。

本发明所述试剂盒的使用步骤如下：

1.采集样本，提取DNA

采用口腔拭子或静脉采血获取样本，提取DNA。

2.核酸扩增

每个样品包括两个反应:即管1和管2的扩增反应。在管1中加入野生型引物和共用引物，在管2中加入突变型引物和共用引物。

配制25μL反应体系，包括：反应液24.5μL(PCR缓冲液5μL，dNTP 0.5μL，特性引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，双蒸去离子水18.3μL)、20ng基因组DNA 0.5μL。阴性对照及阳性对照直接取25μL。PCR反应扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s、52～62℃退火30s、70℃延伸50s，进行32个循环后，72℃再延伸5min，将温度降至4℃终止反应。

3.经1.5％琼脂糖凝胶电泳后读取结果。

结果判读：管1出现条带，管2无条带，说明是野生型；管1出现条带，管2也出现条带说明是突变杂合子；管1无条带，管2出现条带说明是突变纯合子。

本发明采用等位基因特异PCR技术，设计引物特异性高，能够快速检测华法林个体化用药相关基因多态性检测，适合广泛应用于指导临床华法林个体化用药。与现有技术比较，具有结果可靠、成本低廉、操作简单、检测速度快，工作设备要求低等优点(表2)。

表2常见的基因多态性检测方法比较

本发明采用敏感性及特异性均较高的等位基因特异PCR法(ARMS-PCR法)检测CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、GGCX以及EPHX1基因在中国人群中与华法林用药相关基因的常见多态性位点。该技术的原理是将待测的突变碱基设计于突变引物的3′端，利用Taq酶缺乏3′端至5′端外切酶的活性，延伸反应因磷酸酯键形成困难而受阻，扩增反应后，根据普通电泳图谱即可确定所检测的基因型。该技术是目前用于确定等位基因多态性检测的最直接、最简单的方法，具有操作简单，特异性和灵敏性高，重复性好，分析速度快，成本低廉等优点，更适合临床应用推广。本发明的试剂盒为临床提高华法林应用的安全性(降低出血风险)和有效性(抗栓塞)提供了一种全新的快速简便的方法，该试剂盒可广泛应用于临床需要服用华法林患者的初始剂量判断。

附图说明

图1为采用本发明试剂盒检测CYP2C9(rs1799853)、CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs699664)以及EPHX1(rs1051740)的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例1

基因CYP2C9rs1799853扩增引物：

野生型引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAC-3′(SEQ ID NO.1)；

突变性引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAT-3′(SEQ ID NO.2)；

公共引物：5′-ACATGTTCTGGAATAGGTAATG-3′(SEQ ID NO.3)；

基因CYP2C9rs1057910扩增引物：

野生型引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGT-3′(SEQ ID NO.4)；

突变性引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGG-3′(SEQ ID NO.5)；

公共引物：5′-CCATCTTCTTGCCAAGCTGACC-3′(SEQ ID NO.6)；

基因VKORC1rs9923231扩增引物：

野生型引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAG-3′(SEQ ID NO.7)；

突变性引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAA-3′(SEQ ID NO.8)；

公共引物：5′-TCCTTGCTGCCCACGCCATA-3′(SEQ ID NO.9)；

基因CYP4F2rs2108622扩增引物：

野生型引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTC-3′(SEQ ID NO.10)；

突变性引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTT-3′(SEQ ID NO.11)；

公共引物：5′-ATCTCCCGCCATGTCACCCA-3′(SEQ ID NO.12)；

基因GGCX rs699664扩增引物：

野生型引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGT-3′(SEQ ID NO.13)；

突变性引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGC-3′(SEQ ID NO.14)；

公共引物：5′-GATGGCCGCACTGGCGAACTGG-3′(SEQ ID NO.15)；

基因EPHX1rs1051740扩增引物：

野生型引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTC-3′(SEQ ID NO.16)；

突变性引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTT-3′(SEQ ID NO.17)；

公共引物：5′-CCTCCAGAGTAGCTGGGATTAC-3′(SEQ ID NO.18)。

实施例2

1.标本采集

采集患者外周静脉血2ml，枸橼酸钠抗凝，4℃保存，24～48h提取DNA。

2.基因组DNA提取

根据DNA提取试剂盒操作说明书提取DNA：

1)取1.5mL离心管一支(高温灭菌)，加入900μL细胞裂解液。

2)用1mL移液枪头吸放新鲜全血5～6次以混匀血液，取300μL血样移至上述加有细胞裂解液的离心管中，上下颠倒离心管5～6次混匀。

3)室温下孵育10min以裂解红细胞，期间上下颠倒离心管2～3次以混匀。然后室温下13500×g离心20see。

4)移弃上清液，剩余约10～20μL液体于管内，勿搅动白色沉淀。

5)涡旋振荡器上剧烈混匀10～15sec。

6)向重悬细胞溶液中加入300μL核裂解液，用1mL移液枪头吸放溶液5～6次以裂解白细胞，此时溶液变得很粘稠。

7)向核裂解物中加入100μL蛋白沉淀液，涡旋振荡器上剧烈振荡10～20sec。

8)室温下135000×g离心3min，此时可见深棕色蛋白沉淀。

9)将上清转至干净的装有300μL室温异丙醇的l.5mL离心管中。

10)轻轻上下颠倒混匀溶液，直至形成肉眼可见的白色线状或絮状DNA沉淀。

11)室温下135000×g离心1min，可见白色小块状DNA沉淀。

12)移弃上清液，加入300μL室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次以清洗DNA沉淀和管壁，然后室温下135000×g离心1min。

13)1mL移液枪小心吸走乙醇溶液。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10～15min。

14)向离心管中加入30μLDNA溶解液，溶解分装，4℃或-20℃保存备用。

3.DNA浓度和完整性检测

1)浓度测定：根据核酸浓度测定仪说明书进行样本浓度的测定。选择dsDNA检测，以灭菌双蒸水为空白对照进行仪器校正，取2μL gDNA样本加198μL灭菌水进行检测，仪器显示该样本DNA的浓度，OD260/OD280和OD260/OD230。OD260/OD280值在1.6-1.8内说明纯度比较高，符合要求，如果比值大于1.8表明有RNA的污染，小于1.6表明存在蛋白质等的污染。如果DNA浓度过低或纯度不符合要求，则重新提取gDNA。

2)完整性检测：取gDNA 4μL，加入6×loading buffer 1μL，混匀，用1％的琼脂糖凝胶进行分离，100V电泳30min。电泳结束后，用紫外凝胶成像系统查看gDNA的完整性及有无小的DNA片段。

4.核酸扩增

配制25μL反应体系，包括：反应液24.5μL(PCR缓冲液5μL，dNTP 0.5μL，特性引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，双蒸去离子水18.3μL)、50ng基因组DNA 0.5μL。阴性对照及阳性对照直接取25μL。PCR反应扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s、52～62℃退火30s、70℃延伸50s，进行32个循环后，72℃再延伸5min，将温度降至4℃终止反应。

5.经1.5％琼脂糖凝胶电泳后读取结果

实施例3

收集房颤患者30例，采集患者外周静脉血2ml，提取DNA，测定浓度、纯度，使用本发明试剂盒进行CYP2C9(rs1799853)、CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs699664)和EPHX1(rs1051740)基因多态性进行检测，同时采用焦磷酸测序法进行验证。结果本试剂盒检测方法所获基因型与测序结果全部一致。

实施例4

患者张某，男，63岁，身高173厘米，体重63kg。因胸部不适住心内科治疗，后经查体、实验室检测及影像学检测，诊断为房颤，需使用华法林治疗。

采集患者外周静脉血2ml，提取DNA，测定浓度、纯度，使用试剂盒配制好的反应液进行扩增，电泳。确定患者是CYP2C9rs1799853野生型纯合子、CYP2C9rs1057910野生型纯合子，VKORC1rs9923231野生型患者、CYP4F2rs2108622野生型纯合子、GGCXrs699664野生型纯合子以及EPHX1rs1051740野生型纯合子。建议华法林初始使用剂量为：26mg/周，患者服用推荐剂量华法林1周后，达到目标INR值2.0，减少了患者频繁INR值检测的次数。

Claims

1.华法林个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下等位基因特异PCR引物：

基因CYP2C9rs1799853扩增引物：

野生型引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAC-3′；

突变性引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAT-3′；

公共引物：5′-ACATGTTCTGGAATAGGTAATG-3′；

基因CYP2C9rs1057910扩增引物：

野生型引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGT-3′；

突变性引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGG-3′；

公共引物：5′-CCATCTTCTTGCCAAGCTGACC-3′；

基因VKORC1rs9923231扩增引物：

野生型引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAG-3′；

突变性引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAA-3′；

公共引物：5′-TCCTTGCTGCCCACGCCATA-3′；

基因CYP4F2rs2108622扩增引物：

野生型引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTC-3′；

突变性引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTT-3′；

公共引物：5′-ATCTCCCGCCATGTCACCCA-3′；

基因GGCX rs699664扩增引物：

野生型引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGT-3′；

突变性引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGC-3′；

公共引物：5′-GATGGCCGCACTGGCGAACTGG-3′；

基因EPHX1rs1051740扩增引物：

野生型引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTC-3′；

突变性引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTT-3′；

公共引物：5′-CCTCCAGAGTAGCTGGGATTAC-3′。

2.如权利要求1所述的引物在制备检测华法林个体化用药基因多态性试剂中的应用；所述引物为：

基因CYP2C9rs1799853扩增引物：

野生型引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAC-3′；

突变性引物：5′-GGGAAGAGGAGCATTGAGGAAT-3′；

公共引物：5′-ACATGTTCTGGAATAGGTAATG-3′；

基因CYP2C9rs1057910扩增引物：

野生型引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGT-3′；

突变性引物：5′-CTGGTGGGGAGAAGGTCAGG-3′；

公共引物：5′-CCATCTTCTTGCCAAGCTGACC-3′；

基因VKORC1rs9923231扩增引物：

野生型引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAG-3′；

突变性引物：5′-ACCTGAAAAACAACCATTGGCAA-3′；

公共引物：5′-TCCTTGCTGCCCACGCCATA-3′；

基因CYP4F2rs2108622扩增引物：

野生型引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTC-3′；

突变性引物：5′-CTCAGGGTCCGGCCACTT-3′；

公共引物：5′-ATCTCCCGCCATGTCACCCA-3′；

基因GGCX rs699664扩增引物：

野生型引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGT-3′；

突变性引物：5′-CAACAGTTGTTGCAACCTGC-3′；

公共引物：5′-GATGGCCGCACTGGCGAACTGG-3′；

基因EPHX1rs1051740扩增引物：

野生型引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTC-3′；

突变性引物：5′-TGGAGATTCTCAACAGTT-3′；

公共引物：5′-CCTCCAGAGTAGCTGGGATTAC-3′。