KR101979633B1

KR101979633B1 - 대사증후군 예측 또는 진단용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101979633B1
Application number: KR1020180001754A
Authority: KR
Inventors: 이주영; 문상훈; 김봉조; 이영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2019-05-21

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 증폭 또는 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물에 관한 것으로, 한국인의 대사증후군의 위험도 예측 또는 객관적인 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 및 이의 용도{SNP markers for metabolic syndrome and use thereof}

본 발명은 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커에 관한 것으로, 보다 자세하게는 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물, 상기 SNP 마커를 증폭 또는 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 SNP 마커를 이용한 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

대사증후군(metabolic syndrome, MetS)은 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 고밀도지단백 콜레스테롤(hidg-density lipoprotein cholesterol, HDL), 허리 둘레(waist circumference, WC), 공복 혈당(fasting plasma glucose, FPG) 및 혈압(blood pressure, BP)의 다섯 가지 항목 중에서, 정상 범위를 벗어나는 항목이 3가지 이상일 경우를 말하며, 모든 성인병 즉, 비만, 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 주요 원인이 된다. 대사증후군 환자들은 당뇨나 고혈압과 같은 만성 질환의 발병 위험도가 높을 뿐 아니라 심혈관 질환으로 인한 돌연사의 위험까지 있어, 발병 원인에 기초한 적절한 치료가 매우 중요하다. 대사증후군의 발병의 근본적 원인은 잘 알려져 있지 않으나, 유전적 원인과 환경적 원인 모두에 영향을 받는 것으로 여겨지고 있다.

유전체연구 기술 발달에 힘입어 한 사람에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)과 질병발생과의 관련성을 동시에 살펴보는 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS) 방법이 대세를 이루게 되었다. 전장 유전체 연관 분석은 약 50만-200만 개 SNP의 유전자형을 탐색하여 질병과의 연관성을 통계적으로 분석하는 방법을 일컫는다. 현재까지 이 방법으로 약 2,000개 이상의 유전변이들이 전 세계적으로 발굴되었으며, GWAS를 이용한 대사증후군에 대한 감수성 유전자들을 동정하고자 하는 시도가 이루어지고 있으며 아직까지 대사증후군의 결정적 인자는 확인되지 않은 상태이다.

현재까지 대부분의 연구는 서양인을 대상으로 대사증후군 관련 변이들을 동정하고자 하는 시도만 있을 뿐, 한국인을 대상으로 한 대사증후군 관련 변이에 대한 연구는 미흡한 실정이었다. 게다가 DNA 유전자형과 형질(trait)간의 연관성을 검출하는 데에 있어 상당히 큰 실험 표본의 크기가 요구되나, 비용 및 시료 채취 문제로 인해 GWAS의 표본 크기를 증가시키는 데에는 제약이 있다.

이에 본 발명자들은 한국인의 대사증후군과 관련된 유전자형을 확인하기 위해 동일한 표본 크기를 이용하여 변이(variant)를 검출하는 데에 있어, 단일 유전변이 연관 분석(single variant association analysis)보다 통계적으로 향상된 다중 유전자형-다중 형질 분석(multiple genotype-multiple phenotype)을 수행한 결과, 대사증후군과 관련된 유의한 SNP 쌍을 확인하고, 상기 SNP 쌍은 인슐린 분비 및 지질 대사와 관련된 유전자의 발현 조절과 관련이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 상기 SNP 마커를 이용한 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 증폭 또는 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 SNP 마커는 대사증후군 발병과 높은 연관성이 있는 신규한 마커로, 대사증후군 환자들에게서 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 유전자형이므로 대사증후군의 존재 또는 위험 유무를 조기에 효과적으로 진단할 수 있다. 특히, 본 발명의 SNP 마커는 한국인 집단을 대상으로 수행된 유전자 데이터에 근거하여 발굴한 마커로, 서양인을 대상으로 연구한 마커를 사용하는 경우에 비하여 한국인의 대사증후군의 위험도 예측 또는 객관적인 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 대사증후군을 예측 또는 진단할 수 있는 SNP 마커 발굴을 위한 발굴단계(discovery stage) 및 재현성 검증 단계(replication stage)를 간략하게 나타낸 흐름도이다.
도 2의 (A)는 전혈(whole blood)에서 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현과 rs1242229 의 P값(p-value)을 나타낸 것이고, (B)는 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현과 rs7107152 의 P값(p-value)을 나타낸 것이다.
도 3의 (A) 및 (B)는 각각 rs7107152 유전자형에 따른 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이고, (C) 및 (D)는 각각 rs1242229 유전자형에 따른 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 rs7107152에 대한 NESDA NTR Conditional eQTL 카탈로그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 rs1242229에 대한 NESDA NTR Conditional eQTL 카탈로그 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 RegulomeDB에서 rs1242229의 표적 유전자를 나타낸 것이다.
도 7은 11q23.3에서 유의한 SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)의 GWAS 결과를 나타낸 것으로, 빨간색 막대는 rs7107152 및 rs1242229를 나타낸 것이고, 녹색 막대는 GWAS 카탈로그에 보고된 SNP를 나타낸 것이다.
도 8은 SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)-대사증후군 구성요소 형질(MetS component trait) 연관 분석의 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 증폭 또는 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물.

본 발명에서, 용어 "SNP(single nucleotide polymorphism, 단일염기다형성)"는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 말한다.

본 발명에서 용어 "상기 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드" 및 "서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드"는 대사증후군에 관여하는 유전자의 SNP를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)을 말하며, 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치는 13번째 염기이고, 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치는 13번째 염기이다.

NCBI refSNP ID	서열번호	염기서열 (5'→3')
rs1242229	1	ACATCTCCTGAA[A/G]ACAGGGACAACT
rs7107152	2	TGCCTCTCTTAC[A/G]TGGAttatttat

상기 대사증후군(metabolic syndrome, 이하 MetS)은 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 고밀도지단백 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol, HDL), 허리 둘레(waist circumference, WC), 공복 혈당(fsting plasma glucose, FPG) 및 혈압(blood pressure, BP)의 측정 결과로부터 정의되며 진단될 수 있다. 대사증후군은 트리글리세라이드(TG), 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL), 허리 둘레(WC), 공복 혈당(FPG) 및 혈압(BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 인자가 정상 범위를 벗어난 경우로서, 구체적으로 트리글리세라이드(TG)는 150 mg/dL 이상; 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL)은 남자의 경우 40 mg/dL 이하, 여자의 경우 50 mg/dL 이하; 허리 둘레(WC)는 남자의 경우 90 cm 이상, 여자의 경우 80 cm 이상; 공복 혈당(FPG)은 110 mg/dL 이상; 혈압(BP)은 130 mmHg(수축기 혈압, SBP)/85 mmHg(이완기 혈압, DBP) 이상인 경우 정상 범위를 벗어난 것으로 판정할 수 있다.

상기 제제는 상기 SNP 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭 또는 검출할 수 있는 프라이머쌍 또는 프로브일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 SNP 부위를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific) 프로브로서, 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로 부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째 염기 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째 염기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 다중 SNP-다중 형질(multiple SNP-multiple trait, 이하 multi SNP-multi trait) 연관 분석과 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multiple trait, 이하 single SNP-multi trait) 연관 분석을 수행한 결과, 다중 SNP-다중 형질 연관 분석에서만 유의한 SIDT2, UBASH3B 및 CUX2 유전자 각각의 SNP 쌍(pair)을 확인하였다(표 2 및 표 3 참조).

또한, 본 발명자들은 SIDT2, UBASH3B 및 CUX2의 SNP 쌍 중 SIDT2의 SNP 쌍(rs1242229 및 rs7107152)는 NHGRI-EBI GWAS 카탈로그에 보고된 바가 없으며, 유전자 기반 SNP 세트-다중 형질(gene based SNP set-multiple trait) 연관 분석에서도 유의함을 확인하였다(표 4 참조).

또한, 본 발명자들은 SIDT2의 SNP 쌍인 rs1242229 및 rs7107152는 인슐린 분비에 관여하는 SIDT2(SID1 transmembrane family member 2)와 지질 대사에 관여하는 TAGLN(Transgelin, sm22α)의 발현과 높은 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 SNP 쌍-대사증후군 구성요소 형질(SNP pair-MetS component trait) 연관 분석한 결과, rs1242229 및 rs7107152은 대사증후군 구성요소 형질과도 연관성이 있으며, 그 중에서 HDL과 TG에 주로 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 9 참조).

따라서, 본 발명의 SNP 마커는 대사증후군과 유의한 연관성을 나타내고, 인슐린 분비 또는 지질 대사에 관여하는 유전자 발현, 대사증후군의 구성요소 형질과도 상관 관계를 나타내므로, 대사증후군 예측 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 키트는 대사증후군 예측 또는 진단용 마커인 SNP 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 대사증후군을 예측 또는 진단할 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있다.

상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "개체"는 대사증후군 예측 또는 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다. 상기 개체의 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단일염기다형성의 확인은 서열 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), PCR-RFLP(PCR-resctriction fragment length polymorphism) 및 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험 대상자

대사증후군(Metabolic syndrome, 이하 MetS)과 관련된 감수성 변이 세트(variant set)를 확인하기 위해, 발굴(discovery)과 재현성 검증(replication)의 2가지 단계를 통해 다중 SNP-다중 형질 분석(multi SNP-multi trait analysis)을 수행하였다.

발굴 단계에서 KARE(Korea Association REsource)로 알려진 안성 및 안산 연구의 게놈 데이터를 사용하였다. 이후 재현성 검증 단계에서는 전장 유전체 연관 분석(genome-wide association study, GWAS)에서도 사용된 HEXA(Health Examinee cohort) 연구의 데이터를 사용하였다. 참가자의 연령은 40세에서 69세 사이이고, 참가자로부터 사전 동의를 얻었으며, 본 연구는 질병관리본부 기관생명위원회의 생명윤리위원회 승인을 받아 수행되었다.

구체적으로 KARE 데이터는 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 5.0으로 유전자형이 결정된 10,004개의 샘플로 이루어져 있다. 이 중, 352,228개의 SNP가 있는 8,842명의 샘플을 선택하였다. 모호한 염색체 번호와 위치를 가진 245개의 SNP를 제외하고 약물 복용 중인 1,631명의 샘플을 제외하여, 351,983개의 SNP를 가진 7,211명의 샘플을 사용하였다.

발굴한 SNP에 대한 재현성 검증 분석의 경우, HEXA 연구의 3,701명의 참가자 중 약물 복용 중인 참가자를 제외한 2,838명을 대상으로 하였다. 도 1은 본 발명의 발굴 단계 및 재현성 검증 단계를 간략하게 나타낸 흐름도이고, 표 2는 발굴 및 재현성 검증 단계에 사용된 참가자의 특성을 정리한 것이다.

형질(Traits)	발굴 (Discovery)	재현성 검증 (Replication)
형질(Traits)	KARE (n=7,211)	HEXA (n=2,838)
나이 (Age)	51.16 (8.73)	51.76 (7.92)
성별 (Sex, m/f)	3565/3646	1223/1615
대사증후군 (환자군(case)/대조군(control)/ 미확인(not determined))	1328/5870/13	309/2529/0
최대 혈압 (systolic blood pressure, SBP)	115.30 (17.17)	120.15 (14.14)
최소 혈압 (diastolic blood pressure, DBP)	74.10 (11.31)	76.28 (9.76)
공복 혈당 (fasting plasma glucose, FPG)	86.08 (18.84)	91.38 (22.93)
트리글리세라이드 (triglycerides, TG)	157.88 (103.06)	119.20 (90.95)
log TG	4.93 (0.49)	4.60 (0.57)
고밀도지단백 콜레스테롤 (high-density lipoprotein cholesterol, HDL)	45.03 (10.06)	55.53 (13.44)
허리 둘레 (waist circumference, WC)	81.90 (8.67)	81.56 (8.61)

(n: 표본 크기; 상기 값은 평균값을 나타낸 것이고, 괄호 안의 값은 표준 편차를 나타낸 것이다.)

< 실시예 2> 연관 분석(association analysis)을 위한 대사증후군의 형질(trait)

대사증후군(MetS) 판정을 위한 구성요소(component)로서 5개의 형질을 고려하였다. 대사증후군의 정의로서, NCEP의 성인에서의 고콜레스테롤혈증의 검출, 평가 및 치료 기준에 관한 3판(National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evalution and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel) Ⅲ) 최종 보고서 가이드라인을 이용하였다. 정확한 분석을 위해 허리 둘레(waist circumference)에 관한 기준은 아시아 기준으로 남자의 경우 90 cm 이상, 여자의 경우 80 cm 이상으로 각각 수정하였다.

참가자들이 하기 5개의 항목 중 3개에 해당될 경우, 대사증후군으로 판정하였다.

(1) 트리글리세라이드(triglyceride, 이하 TG): 150 mg/dL 이상

(2) 고밀도지단백 콜레스테롤(hidg-density lipoprotein cholesterol, 이하 HDL): 남자의 경우 40 mg/dL 이하, 여자의 경우 50 mg/dL 이하

(3) 허리 둘레(waist circumference, 이하 WC): 남자의 경우 90 cm 이상, 여자의 경우 80 cm 이상

(4) 공복 혈당(fasting plasma glucose, 이하 FPG): 110 mg/dL 이상

(5) 혈압(blood pressure, 이하 BP): 130 mmHg(수축기 혈압, SBP)/85 mmHg(이완기 혈압, DBP) 이상

< 실시예 3> 다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait) 연관 분석

발굴 단계의 7,211개의 샘플과 재현성 검증 단계의 2,838개의 샘플의 다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait) 전장 유전체 연관 분석은 MFQLS(Family based Quasi Likelihood Score test) 방법으로 다중 유전자형(multiple genotype)과 다중 표현형(multiple phenotype) 간의 결합 분석(joint analysis)을 수행하였다.

MFQLS 방법을 수행하여, 발굴 단계에서 27개의 SNP 쌍이 대사증후군(MetS)과 유의하게 연관되어 있음을 확인하였다. 하기 표 3 및 표 4를 참고하면, 발굴 및 재현성 검증 단계에서, 27개의 SNP 쌍은 5 × 10^- ⁸이하의 전장 유전체(genome-wide)의 유의성 임계값을 만족하였다.

대사증후군(metabolic syndrome) 용어를 이용한 키워드 검색을 통해, GWAS 카탈로그에 포함된 단일 변이 연관(single variant association) 결과를 조사하였다. SIK3, SIDT2, UBASH3B 및 CUX2의 4개의 유전자의 SNP 총 6 쌍은 GWAS 카탈로그에 나열되어 있지 않았지만, 21개의 SNP 쌍으로 매핑된 유전자는 이미 알려진 것으로, 지질, 혈압 및 공복 혈당과 같은 MetS 또는 MetS 구성요소 형질(component trait)과 관련된 유전자였다(표 3 참조).

< 실시예 4> 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multi trait) 연관 분석

다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait) 분석으로 확인된 27개의 SNP 쌍이 다른 접근법에서도 유의한지 평가하기 위해, 단일 유전자형(single genotype)과 다중 표현형(multiple phenotype) 간의 결합 분석(joint analysis)을 수행하였다. 이를 위해, SNP 및 다중 형질을 단일 테스트의 통계로 통합시켰다. 분석 시 연령과 성별과 같은 공변량(covariants)을 조정하였다.

다중 SNP-다중 형질(multiple SNP-multiple trait) 분석에서 유의했지만 GWAS 카탈로그에 나열되지 않은 6개의 SNP 쌍을 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multiple trait)분석을 통해 검사하였다. 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multi trait) 분석 결과, SIK3의 인트론에 위치한 SNP(intronic SNP)는 전장 유전체(genome-wide)의 유의성을 나타내지만, SIDT2, UBASH3B 및 CUX의 SNP는 이 접근법에서 여전히 유의하지 않았다(표 3 및 표 4 참조).

따라서, 27개의 SNP 쌍 중에서 SIDT2, UBASH3B 및 CUX2 각 유전자의 3개의 SNP 쌍은 다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait)분석에서만 유의하고 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multi trait)분석에서는 유의하지 않음을 확인하였다(표 4 참조).

그 중, UBASH3B 및 CUX2 유전자의 SNP는 NHGRI-EBI GWAS 카탈로그 (https://www.ebi.ac.uk/gwas/)에 대사증후군과의 연관성에 대해서는 보고되지 않았으나, 대사증후군의 구성요소(component) 형질과의 연관성은 보고되어 있다. 반면에, SIDT2 유전자는 NHGRI-EBI GWAS Catalogue (https://www.ebi.ac.uk/gwas/)에 대사증후군 뿐만 아니라 대사증후군 구성요소 형질과의 연관성에 관해 보고된 바 없었다.

< 실시예 5> 유전자 기반 SNP 세트-다중 형질(gene based SNP set-multi trait) 연관 분석

SNP 쌍(pair SNPs) 그리고 유전자 기반의 SNP 세트(gene-based SNPs sets)와 같은 이러한 다중 SNP의 두 가지 유형들은 다중 유전자형(multiple genotype)로 간주되었다. 다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait)분석을 위한, MFQLS는 다중 형질(multi-traits)과 다중 SNP를 통계학적 분석을 위한 자료로 이용하였다.

351,983 개의 SNP 중에서 각 SNP 쌍에 인접한 총 344,678 개의 SNP 쌍을 선별하고, 14,475 개의 SNP 세트를 유전자 기반 분석을 위해 선별하였다. 하기 표 5는 유전자 기반의 검사 결과를 나타낸 것이다.

유전자 (GENE)	SNP 세트 (SNP set)	염색체 (Chromosome)	위치 (Position, hg19)	최대r² (Maximum r²)	P-값(P-value)
					발굴 (Discovery)	재현성 검증 (Replication)
PAFAH1B2	rs12420127	11	1.17E+08	0.466	4.00E-07	3.99E-03
	rs10790175		1.17E+08
	rs10892082		1.17E+08
SIDT2	rs2229	11	1.17E+08	0.456	2.31E-07	3.83E-03
	rs1242229		1.17E+08
	rs1784042		1.17E+08
	rs7107152		1.17E+08
CUX2	rs7952972	12	1.12E+08	0.561	3.28E-10	6.34E-02
	rs886126		1.12E+08
	rs7300082		1.12E+08
	rs4766553		1.12E+08
	rs1265566		1.12E+08
	rs9783423		1.12E+08
	rs7398833		1.12E+08
	rs16941414		1.12E+08
	rs6489979		1.12E+08
	rs16941284		1.12E+08
	rs16941319		1.12E+08
	rs11065851		1.12E+08
	rs756825		1.12E+08
	rs7300860		1.12E+08

PAFAH1B2와 SIDT2와 같은 두 유전자의 SNP 세트는 발굴 단계에서 10^-7 미만의 유의한 P-값을 나타내었고, 재현성 검증 단계에서도 0.05 미만으로 유의하게 나타났다. 그러나 CUX2에서 15개의 SNP를 사용한 테스트 결과는 발굴 단계에서 만족되었지만, 재현성 검증 분석에서 P-값 0.06으로 유의하지 않은 것으로 나타났다(표 5 참조).

CUX2 유전자의 SNP 세트의 경우, 재현성 검증 단계에서 P-값 0.06으로 확인되었으며, 이는 표본 크기의 문제인 것으로 보인다. 표본 크기를 늘리면 통계적 유의성을 만족할 것으로 예상된다.

SNP 세트를 이용한 유전자 기반 SNP 세트-다중 형질 연관 분석에서도 SIDT2의 rs7107152 및 rs1242229는 대사증후군과 통계적 유의성을 나타냈으며, 이는 SIDT2와 MetS의 연관성을 뒷받침한다.

< 실시예 6> SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)와 유전자 발현 사이의 상관 관계

두 가지 유의한 SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)에 따른 각각의 유전자 발현 패턴을 조사하기 위해, 발현 양적 형질 위치 정보(expression quantitative trait loci information)를 제공하는 3가지 온라인 데이터 자료인 Genotype-Tissue Expression (GTEx) (https://www.gtexportal.org/home/), NESDA NTR Conditional eQTL Catalog (https://eqtl.onderzoek.io/) 및 RegulomeDB (http://www.regulomedb.org/)를 사용하였다.

3개의 데이타베이스 모두 2개의 SNP가 SIDT2 및 TAGLN 유전자 발현 패턴과 높은 상관 관계가 있음을 보여주었다.

GTEx에서, rs7107152의 경우 전혈에서의 SIDT2 및 TAGLN 유전자 발현의 통계적 유의성은 각각 P = 2.19 × 10^-10 및 P = 3.40 × 10^-40이었고, rs1242229의 경우 P-값은 1.27 × 10^-10 및 1.04 × 10^-11 이었다(도 2 참조). 도 3은 2개의 SNP의 유전자형에 따른 유전자 발현 양상을 나타낸 것이다. 도 3의 (A) 및 (B)는 각각 rs7107152의 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이고, 도 3의 (C) 및 (D)는 각각 rs1242229의 SIDT2 및 TAGLN의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.

NESDA NTR Conditional eQTL Catalog에서도 2개의 SNP는 유사한 유전자 발현 양상을 보였다(도 4 및 도 5 참조). rs1242229는 주로 SIDT2와 TAGLN의 발현과 높은 상관관계가 있으나, rs71071152는 SIDT2와 TAGLN뿐만 아니라 PCSK7과 PAFAH1B2의 유전자 발현과도 높은 상관 관계가 있는 것으로 나타냈다(도 4 및 도 5 참조).

도 6은 RegulomeDB에서 rs1242229의 표적 유전자를 나타낸 것이다.

3 개의 온라인 데이타베이스에서, SIDT의 인트론에 위치한 두 개의 MetS 관련 SNP인 rs7107152 및 rs1242229는 SIDT2 자체 그리고 TAGLN 유전자의 발현 패턴과 높은 상관 관계가 있다는 것을 발견했다(도 2 및 도 3 참조).

SIDT2(SID1 transmembrane family member 2)는 리소좀성 막 단백질(lysosomal integral membrane protein)이며, 인슐린 분비에 중요한 역할을 하고, 지질 대사에 관여하는 것으로 알려져있다. TAGLN(Transgelin, sm22α)은 평활근 세포에서 풍부하게 발현되는 액틴 결합 단백질로, 지질 대사, 염증 및 조혈과 관련이 있는 것으로 알려져있다. 이를 바탕으로, 상기 SNP 쌍이 대사증후군(MetS)과 관련된 표적 유전자인 SIDT2와 TAGL의 유전자 발현을 조절하여, 결과적으로 유전자 인슐린 분비, 지질 대사 및 지방 생성에 영향을 주는 방식으로 대사증후군(MetS)의 발병과 연관됨을 가정할 수 있다.

< 실시예 7> SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)와 GWAS SNP와의 상관 관계

본 발명에서 확인된 SNP(rs7107152 및 rs1242229)와 최근에 GWAS 카탈로그에보고된 인접한 SNPs의 상관 관계를 확인하기 위해, SNAP(SNP Annotation and Proxy Search)를 사용하여 pairwise LD 분석을 수행했다. GWAS 카탈로그에 보고된 인접한 SNP는 인트론 상의 변이(intronic variant)인 HDL 콜레스테롤 레벨과 관련된 rs530885291와 유전자 사이의 변이(intergenic variant)인 트리글리세라이드 레벨과 관련된 rs508487이다.

Pairwise LD 분석 결과, rs1242229는 rs508487와 r²=0.167의 낮은 제곱 상관 관계를 보였다(도 7 참조). 또한, rs7107152와 rs530885291 사이의 상관 점수는 컷오프(cutoff) 점수보다 낮은 상관 점수때문에 계산할 수 없었다.

GWAS 카탈로그에 수록된 rs530885291 및 rs508487은 각각 rs7107152 및 rs1242229에 인접해 있으나 SNP 간의 pair-wise LD 점수는 낮았다. 이는 각 SNP 간에 상관 관계가 거의 없으며, 서로 독립적임을 나타낸다.

< 실시예 8> SNP 쌍-대사증후군( MetS ) 구성요소(component) 형질의 연관 분석

어떤 대사증후군(MetS)의 구성요소 형질이 SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)과 관련이 있는지를 결정하기 위해, 우리는 SNP 쌍과 각 MetS 구성요소 형질 사이의 연관 분석을 수행했다.

도 8은 SNP 쌍-MetS 구성요소 형질 연관 분석(SNP pair-MetS component trait association analysis) 결과를 나타낸 것이다. 결과적으로, SNP 쌍은 HDL (P = 5.87 × 10^-5), TG (P = 1.67 × 10^-9), WC (P = 0.75), FPG (P = 0.55), SBP (P = 0.29 ), DBP (P = 0.07)와 각각 상관 관계가 있었다.

도 8은 SNP 쌍(rs7107152 및 rs1242229)은 MetS의 구성요소 형질(component trait) 중에서 HDL과 TG에 주로 영향을 미치며, 이는 지질 대사 경로의 유전자가 MetS의 유전적 배경에 중요한 역할을 함을 뒷받침하는 것이다.

따라서, 다중 SNP-다중 형질(multiple SNP-multiple trait) 분석은 두 개의 SNP rs7107152 및 rs1242229와 MetS의 연관성뿐만 아니라, SIDT2와 MetS 또는 MetS 구성요소 형질의 연관성도 제시한다.

본 발명에서는 총 10,049 개의 한국 표본을 사용하여 대사증후군(MetS)과 관련된 유전자형을 확인하기 위해, 다중 SNP-다중 형질(multiple SNP-multiple trait)분석을 수행했다. 다중 유전자형 및 표현형 분석 후, 27개의 SNP 쌍이 발굴 단계에서 대사증후군과 유의하게 연관되었고, 재현성 검증 단계에서도 확인되었다. 그 중, 단일 유전자형과 다중 표현형의 결합 분석(joint analysis)을 통해 SIDT2, UBASH3B 및 CUX2 각 유전자에서 3개의 SNP 쌍이 다중 SNP-다중 형질(multi SNP-multi trait)분석에서만 유의하고, 단일 SNP-다중 형질(single SNP-multi trait)분석에서는 유의하지 않다는 것을 발견했다. SIDT2 유전자는 NHGRI-EBI GWAS Catalogue (https://www.ebi.ac.uk/gwas/)에서 이전에 보고된 바가 없었고, 유전자기반 SNP 세트(gene-based SNP set)와 다중 형질 분석(multi trait analysis)에서도 유의하였다. 또한, SIDT2의 rs7107152 및 rs1242229는 SIDT2 및 TAGLN 유전자의 발현과 상관 관계가 높고, 특히 대사증후군(MetS)의 HDL과 TG에 주로 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 SIDT2의 rs7107152 및 rs124229는 대사증후군(MetS)를 진단하는 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Center For Disease Control And Prevention <120> SNP markers for metabolic syndrome and use thereof <130> 2017P-11-055 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (13) <223> n is A or G <400> 1 acatctcctg aanacaggga caact 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (13) <223> n is A or G <400> 2 tgcctctctt acntggatta tttat 25

Claims

서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 증폭 또는 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 상기 SNP 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭 또는 검출할 수 있는 프라이머쌍 또는 프로브인, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물.
제2항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 SNP 부위를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 이루어진 것인, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단용 SNP 마커 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단용 키트.
제4항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단용 키트.
개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 13번째의 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법.
제6항에 있어서,
상기 단일염기다형성의 확인은 서열 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), PCR-RFLP(PCR-resctriction fragment length polymorphism) 및 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것인, 한국인의 대사증후군 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법.