CN105441584A - 一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法。该试剂盒是基于基因芯片使用的，共包含三组引物。检测时使用三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型。检测结果表明：该试剂盒特异性强，灵敏度高，可以同时检测出待测样品的7种突变型和3种基因型，7种突变型包括180M型、181T型、181V型、204I型、204V型、236T型、1896A型，3种基因型包括HBV/B型、HBV/C型、HBV/D型。

Description

一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，是引起急、慢性肝炎的主要病原之一，并可导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。我国是乙型肝炎的高发国家，2009年卫生部公报显示2008年乙肝发病率为106.54/10万人，发病人数为141万例。HBV感染威胁国民健康，HBV的及早诊断和正确治疗应该受到极大关注。

干扰素、拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和即将上市的替诺福韦均为国内抗病毒的一线药物，随着抗病毒治疗药物的广泛应用，同时HBV逆转录酶缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，HBV重要位点的基因突变可导致氨基酸侧链的柔性减低，并在HBV的DNA聚合酶和核苷类似物三磷酸盐之间形成空间位阻，与核苷类似物三磷酸盐的结合力下降，从而导致核苷类似物抗病毒药物的耐药发生。目前已发现的HBV耐药变异位点主要集中在P基因的Pol/RT区域，该区域由344个氨基酸编码序列组成，常见的耐药突变类型包括rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V和rtN236T等。干扰素的治疗与1896G→A位点突变有关，但是1896位点突变是否发生干扰素耐药，目前还存在一定争议。

同一病毒核苷酸序列的差异，表现为HBV不同的基因型。迄今为止，根据HBV全基因核苷酸序列的异质性≥8％或S区基因序列差异≥4％，将HBV分为A～H八种基因型。在我国内地主要流行B、C和D3种HBV基因型，所占比例分别为32.06％、67.38％和0.56％。HBV导致的肝癌中，B基因型比C基因型发生单一肿瘤者多，同时伴随更多的卫星病灶，HBV/C基因型携带者大多有慢性肝病，HBV/D基因型感染者多无症状且HBeAg血清转换较早。

近年来，HBV耐药性问题日趋严重，对其耐药性检测在乙型肝炎的治疗中有着举足轻重的作用。同时对HBV感染者进行基因分型检测，明确其基因型，进一步揭示基因型与病情进展与转归的关系，可为临床医生提供更明确的病因诊断，从而拟定抗病毒治疗方案。对乙型肝炎病毒的分型情况和与用药相关情况进行定性检测，以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查等领域。寻找一种简便、快速、准确的检测耐药和分型的方法成为许多乙肝科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急待解决的问题。

目前用于HBV耐药和分型的分子检测方法主要有：测序法、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、实时荧光定量PCR方法、线性探针反向杂交法、PCR-基因芯片法等。⑴测序法是HBV基因检测的金标准，准确率高，但灵敏度较低、混合基因型检测能力差(需要筛选大量克隆)，需要测序仪及昂贵的试剂，不适用于临床检测；⑵RFLP方法不需要复杂设备、试剂，但目前方法标准化程度差；⑶定量PCR方法灵敏度高，但通量低，难以检测多基因位点变异；⑷线性探针反向杂交法(INNO-LiPA)扩展性差、肉眼判读容易误判，检测成本高(进口商业试剂盒)，难以在国内临床实验室常规开展。

目前临床需要高通量、高特异性、操作简单，结果判断能自动化的检测方法，因此，研发快速灵敏的乙肝实验室耐药和分型检测技术，存在着巨大的市场需求。基于基因检测的生物芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性位点检测的新方法，是物理学、微电子学与生命科学等学科的交叉结合，该技术以其分析速度快、可多指标并行检测、所需试剂及样品量少等优势适应了这一需要，为解决这些问题提供了新的科技手段。

基因芯片的原理是将多种探针固定在基片上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。由于该法同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对大量样品进行检测和分析。针对乙肝耐药和分型检测，可以利用芯片技术，将目前已明确的耐药突变探针和分型探针全部固定到一张芯片上，只需一次杂交，即可获得某一样品的多位点、多药物的耐药检测结果和分型结果。目前用基因芯片检测HBV耐拉米夫定基因突变已取得一定成果。结果表明方法准确、快速，特异性高，信息量大，成本较低，可准确地确定突变类型和分型信息，具有明确的应用价值。

在检测突变和SNP，尤其是临床相关的检测时，非常关注提高芯片检测的灵敏度和特异性。实现这一目标的主要障碍在于，由于标记的靶标核酸与固定于芯片表面的寡核苷酸探针之间的杂交反应是影响芯片检测关键因素，作为双链的DNA只有一条链能够与固定于芯片表面的探针进行杂交反应，另外一条链因竞争而充当了该杂交反应的干扰因素。因此，制备单链DNA的不对称PCR反应非常必要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的试剂盒。

上述所述的试剂盒包括如下三组引物：

(1)用于检测乙型肝炎病毒6种突变型的第一组引物，包括：

所述乙型肝炎病毒6种突变型为180M型、181T型、181V型、204I-ATC型、204V型和236T型；

a、用于检测180M型的引物为：SEQIDNO.4中第23-42位核苷酸分子所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

b、用于检测181T型的引物为：SEQIDNO.5中第22-41位核苷酸分子所示的和SEQIDNO.8中第22-42位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

c、用于检测181V型的引物为：SEQIDNO.3中第23-42位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

d、用于检测204I-ATC型的引物为：SEQIDNO.1中第24-47位核苷酸分子所示和SEQIDNO.6中第24-47位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

e、用于检测204V型的引物为：SEQIDNO.2中第23-45位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

f、用于检测236T型的引物为：SEQIDNO.7中第23-48位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

(2)用于检测乙型肝炎病毒的3种基因型的第二组引物，包括：

所述乙型肝炎病毒的3种基因型为HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型；

g、用于检测HBV/B型的引物为：SEQIDNO.13中第22-44位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.17所示的和SEQIDNO.18所示的引物；

h、用于检测HBV/C型的引物为：SEQIDNO.15中第21-39位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.19所示的引物；

i、用于检测HBV/D型的引物为：SEQIDNO.16中第21-39位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.20所示的引物；

(3)用于检测乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三组引物，包括：

j、用于检测1896A型的引物为：SEQIDNO.22中第25-43位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.24所示的、SEQIDNO.25所示的和SEQIDNO.26所示的引物；

k、用于检测204I-ATT型的引物为：SEQIDNO.21中第24-42位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.27所示的引物。

上述试剂盒中，所述的正向引物序列的5’端均连接有标签序列，每种突变型和基因型所对应的标签序列各不相同；各标签序列为与引物扩增模板序列不配对的寡核苷酸序列。

上述试剂盒中，所述与正向引物配对的引物标记有荧光素，具体是在与正向引物配对的引物5’端标记有荧光素；所述荧光素具体为四甲基罗丹明荧光素。

上述试剂盒中，所述的引物如下：

用于检测180M型的引物为：SEQIDNO.4所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测181T型的引物为：SEQIDNO.5所示的正向引物、SEQIDNO.8所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测181V型的引物为：SEQIDNO.3所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测204I-ATC型的引物为：SEQIDNO.1所示的正向引物、SEQIDNO.6所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测204V型的引物为：SEQIDNO.2所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测236T型的引物为：SEQIDNO.7所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测HBV/B型的引物为：SEQIDNO.13所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.17所示的引物、与正向引物配对的SEQIDNO.18中所示的引物；

用于检测HBV/C型的引物为：SEQIDNO.15所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.19所示的引物；

用于检测HBV/D型的引物为：SEQIDNO.16所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.20所示的引物；

用于检测1896A型的引物为：SEQIDNO.22所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.24所示的引物、与正向引物配对的SEQIDNO.25所示的引物和与正向引物配对的SEQIDNO.26所示的引物；

用于检测204I-ATT型的引物为：SEQIDNO.21所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.27所示的引物。

上述试剂盒中，所述的试剂盒还包括连接有探针的基因芯片，所述探针与所述标签序列一一对应和特异性结合。

上述试剂盒中，所述的探针的序列如下：

(1)用于检测1896A型的探针的序列如SEQIDNO.28所示；

(2)用于检测204I型的探针的序列如SEQIDNO.29所示；

(3)用于检测180M型的探针的序列如SEQIDNO.31所示；

(4)用于检测236T型的探针的序列如SEQIDNO.32所示；

(5)用于检测181T型的探针的序列如SEQIDNO.33所示；

(6)用于检测181V型的探针的序列如SEQIDNO.34所示；

(7)用于检测204V型的探针的序列如SEQIDNO.36所示；

(8)用于检测B型的探针的序列如SEQIDNO.30所示；

(9)用于检测C型的探针的序列如SEQIDNO.37所示；

(10)用于检测D型的探针的序列如SEQIDNO.38所示。

上述试剂盒中，所述用于检测乙型肝炎病毒6种突变型的第一组引物还包括：用于放大整体信号的SEQIDNO.10所示的引物；

所述用于检测乙型肝炎病毒的3种基因型的第二组引物还包括：用于放大整体信号的SEQIDNO.10所示的引物和放大B基因型信号的SEQIDNO.14所示的引物；

所述用于检测乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三组引物还包括：用于放大1896A型信号的SEQIDNO.23所示的引物。

上述试剂盒中，所述的试剂盒的第一组引物中还包括两对内对照的引物：

(1)扩增内对照IC1的引物：正向引物如SEQIDNO.11所示；与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

(2)扩增内对照IC2的引物：正向引物如SEQIDNO.12所示；与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

上述试剂盒中，所述的内对照IC1的探针如SEQIDNO.41所示；所述内对照IC2的探针如SEQIDNO.35所示。

上述试剂盒中，所述的探针还包括三个质控探针：

(1)HBV-PB-PC，如SEQIDNO.39所示；

(2)HBV-PB-NC1，如SEQIDNO.40所示；

(3)HBV-PB-QC，如SEQIDNO.42所示。

上述试剂盒中，所述的试剂盒包括使用说明书。

上述所述使用说明书上记载如下内容：

使用上述所述的三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型。

第一组引物在同一个PCR体系中，第二组引物在同一个PCR体系中，第三组引物在同一个PCR体系中。

本发明的另一个目的是提供上述所述的试剂盒在制备检测或辅助检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的产品中的应用。

上述应用中，所述的乙型肝炎病毒7种突变型为180M型、181T型、181V型、204I型、204V型、236T型和1896A型；所述乙型肝炎病毒3种基因型为HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型。

上述所述180M型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第180位氨基酸由亮氨酸(L)突变成甲硫氨酸(M)，相应的该氨基酸的编码基因由CTG/TTG突变成ATG；

上述所述181T型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第181位丙氨酸(A)突变成苏氨酸(T)，相应的该氨基酸的编码基因由GCT突变成ACT；

上述所述181V型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第181位丙氨酸(A)突变成缬氨酸(V)，相应的该氨基酸的编码基因由GCT突变成GTT；

上述所述204I-ATT型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第204位甲硫氨酸(M)突变成异亮氨酸(I)，相应的该氨基酸的编码基因由ATG突变成ATT；

上述所述204I-ATC型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第204位甲硫氨酸(M)突变成异亮氨酸(I)；相应的该氨基酸的编码基因由ATG突变成ATC；

上述所述204V型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第204位甲硫氨酸(M)突变成缬氨酸(V)，相应的该氨基酸的编码基因由ATG突变成GTG；

上述所述236T型突变是HBV的P蛋白的Pol/RT区域中，第236位天冬氨酸(N)突变成苏氨酸(T)，相应的该氨基酸的编码基因由AAC突变成ACC/ACT；

上述所述1896A突变是HBV全基因组序列中，第1896位点的鸟嘌呤(G)突变成腺嘌呤(A)。

上述所述的HBV的P蛋白的Pol/RT区域的氨基酸序列可以为现有技术中公开的任一例，一个具体例子如SEQIDNo.43所示。

上述所述的HBV的全基因组序列可以为现有技术中公开的任一例，一个具体例子如SEQIDNo.44所示。

上述所述的7种突变型与耐药种类的关系如表1所示：

表1、各突变位点与耐药种类的关系

本发明最后一个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的方法。

上述所述的用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的方法包括如下步骤：

使用上述所述的三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型。

第一组引物在同一个PCR体系中，第二组引物在同一个PCR体系中，第三组引物在同一个PCR体系中。

上述所述的方法为非疾病诊断或治疗方法。

本发明还有一个目的是上述所述的试剂盒或方法在鉴定乙型肝炎病毒的耐药性中的应用。

上述应用中，所述药为拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、替诺福韦。

本发明构建了检测乙型肝炎病毒7种突变型和3种基因型的基因芯片检测试剂盒，可快速、准确地检测临床样品中的乙型肝炎病毒各突变型和基因型。将试剂盒扩增试剂中的引物分组，有效的改善了不同引物之间的相互干扰，提高了检测的灵敏度，另一方面，对引物进行的人工突变，有效地解决了检测中出现的非特异信号的问题。本发明的乙型肝炎病毒分型耐药检测试剂盒具有通量大、灵敏度高、特异性强的特点，可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查等领域。

附图说明

图1为180M、204V耐药突变型，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图2为181T耐药突变型，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图3为181V耐药突变型，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图4为204I耐药突变型，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图5为236T耐药突变型，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图6为无耐药突变，1896位点无突变，基因型为HBV/B型。

图7为无耐药突变，1896位点无突变，基因型为HBV/C型。

图8为无耐药突变，1896位点无突变，基因型为HBV/D型。

图9为无耐药突变，1896G→A突变，基因型为HBV/B型。

图10为无耐药突变，1896G→A突变，基因型为HBV/C型。

图11为人类基因组DNA检测结果。

图12为鲱鱼精DNA检测结果。

图13为大肠杆菌DNA检测结果。

图14为试剂盒阳性对照品检测结果。

图15为试剂盒阴性对照品检测结果。

图16为基因芯片的点阵排布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测试剂盒及检测方法

一、试剂盒组成

本发明试剂盒由引物、PCR反应混合液、基因芯片、杂交试剂、阴性对照品、阳性对照品组成。

1、引物

本发明采用带有Tag标签序列的各型特异性引物及与之配对的带有荧光标记的引物对HBV各耐药突变型和基因型进行多重不对称PCR扩增和荧光标记。

多重不对称PCR扩增的引物为带有特异性标签序列的特异性引物，能与目标HBV基因序列特异性结合。该引物5’端加入一段与引物扩增模板序列无关的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列能与芯片固定的探针特异性结合，并且与特异性引物配对引物的5’端标记有四甲基罗丹明荧光素(TAMRA)。

多重不对称PCR反应中使用的引物，共分为三组：第一组引物是用来检测乙型肝炎病毒6种突变型(180M型、181T型、181V型、204I-ATC型、204V型、236T型)；第二组引物用来检测乙型肝炎病毒的3种基因型(HBV/B型、HBV/C型、HBV/D型)；第三种引物是用来检测乙型肝炎病毒的2种突变型(1896A型、204I-ATT型)。并且采用了HBV序列保守区的特异性引物IC1和IC2作为了PCR反应的内对照。三组引物的序列为(下划线部分为标签序列)：

第一组：

扩增204I-ATC位点的特异性引物204I-07n033-7(5’-3’)：GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCCCACTGTTTGGCTTTCAGATATATC(SEQIDNO.1)；

扩增204V位点的特异性引物204V-08n01-3(5’-3’)：TGCACGAGTTGGGTGAGTTTGGCCACTGTTTGGCTTTCAGTTTTG(SEQIDNO.2)；

扩增181V位点的特异性引物181V-0561-3(5’-3’)：AGCTAGACCACTCAGCAGACTCCTCAGTCCGTTTCTCCTCGT(SEQIDNO.3)；

扩增180M位点的特异性引物180M-0261-3(5’-3’)：GTTGGCTAGGAACTGCAAGCACAGGCCTCAGTCCGTTTCACA(SEQIDNO.4)；

扩增181T位点的特异性引物181T-04n02-3(5’-3’)：GCATAGACGTGGCTCAACTGTCCTCAGTCCGTTTCTCCAGA(SEQIDNO.5)；

扩增204I-ATC位点的特异性引物204I-07n010-2C(5’-3’)：GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATACT(SEQIDNO.6)；

扩增236T位点的特异性引物236T-11n03(5’-3’)：CTGTTAAACGTCAGAGCGCAGCCTGTTGTCTGTGGGTATACATTTGAC(SEQIDNO.7)；

扩增181T位点的特异性引物181T-04n10-3(5’-3’)：GCATAGACGTGGCTCAACTGTGCCTCAGTCCGTTTCTCTAGA(SEQIDNO.8)；

扩增IC1的特异性引物IC-NF11(5’-3’)：GGTTCGGATAAGCCTACGCCACTTGTATTCCCATCCCATCATC(SEQIDNO.11)；

扩增IC2的特异性引物179W2(5’-3’)：TCGGCACGCGCGAGATCACCATGTGGGCCTCAGTCCGTTTC(SEQIDNO.12)；

第一组引物中所有特异性引物共用的配对引物spI-F09-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACCGTTGACATACTTTCCAATCAATAGG(SEQIDNO.9)；放大整体信号的引物Sp1-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGAC(SEQIDNO.10)；第二组：

扩增B型的特异性引物180L-BEaF-301c(5’-3’)：TCGAGTACAGGACCCACATCACTGCGTTTTATCATCTTCCTCCG(SEQIDNO.13)；放大B型信号的引物sF-seq(5’-3’)：CTGCTGGTGGCTCCAGTTC(SEQIDNO.14)；扩增C型的特异性引物C-1365-R(5’-3’)：CCGACTCTTACGCTCCTACCCAGCCATGGAAAGGAGGTG(SEQIDNO.15)；

扩增D型的特异性引物Tag-D3-R(5’-3’)：CGCAGGAGTCGTTAGATGGCTGCTGGTGGAAAGATTCTG(SEQIDNO.16)；

扩增B型的与特异性引物配对的引物spT2-BCAl-R-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACTTTTTTTCCCGTGCTGGTAGTTGATG(SEQIDNO.17)；

扩增B型的与特异性引物配对的引物spT2-BcomR-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACTTTTTTGGGATGGGAATACAGGTGC(SEQIDNO.18)；扩增C型的与特异性引物配对的引物C-1365-F-TA(5’-3’)：CTGACGCAACCCCCACTGG(SEQIDNO.19)；

扩增D型的与特异性引物配对的引物D6-F-TA(5’-3’)：ATGCCTGCTAGGTTTTATCC(SEQIDNO.20)；

放大整体信号的引物Sp1-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGAC(SEQIDNO.10)；第三组：

扩增204I-ATT型的特异性引物204I-R07(5’-3’)：GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCCCCCCAATACCACATCGTCA(SEQIDNO.21)；

扩增1896A型的特异性引物204M-1896GA-M-03A1(5’-3’)：TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAAGTGTGCGTTGGGTGGCGTTA(SEQIDNO.22)；放大1896A信号的引物s1870(5’-3’)：GGAGGCTGTAGGCATAAATTGG(SEQIDNO.23)；

扩增1896A型的与特异性引物配对的引物spI-1896R16-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACGAGTAACTCCACAGAAGCTCC(SEQIDNO.24)；

扩增1896A型的与特异性引物配对的引物spI-1896R35-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACCTTGCCTGAGTGCTGTATGGT(SEQIDNO.25)；

扩增1896A型的与特异性引物配对的引物spI-1896R30-TA(5’-3’)：GCACGCTATCACGTTAGACTGAGGTGAACAATGTTCCGG(SEQIDNO.26)；

扩增204I-ATT型的与特异性引物配对的引物204I-F01-TA(5’-3’)：CTGCACTTGTATTCCCATCC(SEQIDNO.27)。

使用时用三组引物分别对待测样品进行多重PCR扩增，并将三组引物扩增的产物进行混合。

2、多重不对称PCR反应混合液

多重不对称PCR反应混合液由正向引物、反向引物、放大信号的引物、dNTP、DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)及5×PCR缓冲液组成。

多重不对称PCR反应液中所使用的酶为热启动酶，热启动酶和PCR反应的其他常规组分均可以使用市售产品，如Promega公司生产的产品，并参照市售产品的说明书配制。其中，DNTPs中掺入一定比例的DUTP，掺入量与DNTPs的比例为1:4-1:2。

3、基因芯片

固定于微阵列芯片的特异性探针能够识别相应标签序列，用于不同的目标基因的检测。基因芯片的材质为硅、玻璃、塑料、水凝胶、硝酸纤维或尼龙；基因芯片上固定有可与特异性标签引物末端TAG序列结合的探针。特异性探针是指能够与特异性引物5’端的标签序列特异性结合的寡核苷酸序列，寡核苷酸序列由15-50个核苷酸组成；特异性探针的5’端连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-25个寡聚dT。

PCR产物中的标签序列可与基因芯片上的探针特异性结合，通过PCR产物中的荧光，实现信号的放大检测。所述7种突变型和3种基因型对应的特异性探针序列(5’-3’)如下：

(1)1896A型的探针序列如序列表中SEQIDNO.28所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，1896A型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.22第1-24位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(2)204I型的探针序列如序列表中SEQIDNO.29所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，204I型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.1第1-23位核苷酸分子所示和/或序列表中SEQIDNO.6第1-23位核苷酸分子所示和/或序列表中SEQIDNO.21第1-23位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(3)B型的探针序列如序列表中SEQIDNO.30所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，B型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.13第1-21位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(4)180M型的探针序列如序列表中SEQIDNO.31所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，180M型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.4第1-22位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(5)236T型的探针序列如序列表中SEQIDNO.32所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，236T型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.7第1-22位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(6)181T型的探针序列如序列表中SEQIDNO.33所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，181T型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.5第1-21位核苷酸分子所示和/或序列表中SEQIDNO.8第1-21位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(7)181V型的探针序列如序列表中SEQIDNO.34所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，181V型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.3第1-22位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(8)204V型的探针序列如序列表中SEQIDNO.36所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，204V型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.2第1-22位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(9)C型的探针序列如序列表中SEQIDNO.37所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，C型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.15第1-20位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(10)D型的探针序列如序列表中SEQIDNO.38所示，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，D型的探针序列可与序列表中SEQIDNO.16第1-20位核苷酸分子所示的标签序列结合。

除以上的探针外，还包括两个内对照探针和三个质控探针。

两个内对照探针序列：

(11)IC1的探针序列如序列表中SEQIDNO.41所示的序列，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，IC1的探针序列可与序列表中SEQIDNO.11第1-20位核苷酸分子所示的标签序列结合；

(12)IC2的探针如序列表中SEQIDNO.35所示的序列，杂交液与基因芯片上的探针进行杂交时，IC2的探针序列可与序列表中SEQIDNO.12第1-22位核苷酸分子所示的标签序列结合。

三个质控探针序列：

(13)HBV-PB-PC如序列表中SEQIDNO.39所示的序列；

(14)HBV-PB-NC1如序列表中SEQIDNO.40所示的序列；

(15)HBV-PB-QC如序列表中SEQIDNO.42所示的序列。

4、杂交试剂

杂交缓冲液的主要成分为：Denhardt’s、SDS和SSC。

5、阳性对照和阴性对照

阳性对照是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的3种乙型肝炎病毒DNA片段的质粒；阴性对照是1×TE。

二、检测方法和检测结果

1、方法

待检血清样本：用无菌注射针头抽取被检者静脉血2ml，室温放置不要超过4小时，1600g离心20分钟，吸取血清转入另一无菌离心管中备用。待检血清样本须在低于4℃的环境下运送到检测实验室，并置于-70℃或-20℃冷冻保存。

用三组引物分别对待测样品血清进行多重PCR扩增，并将三组引物扩增的产物进行混合。

多重不对称PCR扩增程序为：37℃600秒(1个循环)→96℃600秒(1个循环)→94℃25秒，72℃1秒，56℃20秒(RAMP0.2℃/s)，72℃45秒(RAMP0.2℃/s)(40个循环)→12℃HOLD(1个循环)。其中RAMP是升降温速率，72→56℃以每秒0.2℃降温，56→72℃以每秒0.2℃升温。

将杂交缓冲液与上述多重不对称PCR的混合产物进行混合，得到杂交液。

将杂交液与基因芯片进行杂交。对芯片进行扫描和数据分析得到检测结果。

2、检测结果

阳性对照和阴性对照的结果如图14、图15。

如图16所示，基因芯片上对应着7种突变型和3种基因型的检测位点，如果待测样品在某一基因型和突变型的检测位点变亮，则说明此待测样品中含有该突变型或基因型。

实施例2、乙型肝炎病毒DNA的灵敏度检测

以经过测序确认过的含7种突变型和3种基因型序列特征的乙型肝炎病毒DNA片段的质粒(浓度约为10³IU/ml)为模板，使用本发明的试剂进行检测，检测结果参见附图1-图10。

从图1-图10的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒可以检测到浓度约为10³IU/ml的常见7种突变型和3种基因型乙型肝炎病毒DNA模板，可以满足临床的需求。

实施例3、乙型肝炎病毒DNA的特异性检测

经购买的含试剂盒检测范围外的与乙型肝炎病毒无关的基因组DNA(人类基因组DNA、鲱鱼精DNA和大肠杆菌DNA)为模板，浓度约为10ng/μl，使用本发明的试剂盒进行检测，检测结果参见附图11-图13。

从图11-图13的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒对本试剂盒检测范围外的浓度为10ng/μl的与乙型肝炎病毒无关的DNA模板检测结果为阴性，说明试剂盒的特异性良好。

实施例4、临床血清样品的检测

使用本发明的方法和试剂盒，对66例经DNA序列测序确认的临床血清样本进行检测，其中46例含乙型肝炎病毒DNA，20例不含乙型肝炎病毒DNA。

从表2中的结果显示，46例乙型肝炎病毒DNA阳性的样本用本发明的试剂盒检测，耐药检测结果与测序检测结果的符合率为93.5％，分型检测结果与测序检测结果的符合率为100％；20例不含乙型肝炎病毒DNA的样本用本发明的试剂盒检测，结果均为阴性，特异性100％。

表2、66例临床标本的结果比较

Claims (10)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的试剂盒，该试剂盒包括如下三组引物：

(1)用于检测乙型肝炎病毒6种突变型的第一组引物，包括：

所述乙型肝炎病毒6种突变型为180M型、181T型、181V型、204I-ATC型、204V型和236T型；

a、用于检测180M型的引物为：SEQIDNO.4中第23-42位核苷酸分子所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

b、用于检测181T型的引物为：SEQIDNO.5中第22-41位核苷酸分子所示的和SEQIDNO.8中第22-42位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

c、用于检测181V型的引物为：SEQIDNO.3中第23-42位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

d、用于检测204I-ATC型的引物为：SEQIDNO.1中第24-47位核苷酸分子所示和SEQIDNO.6中第24-47位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

e、用于检测204V型的引物为：SEQIDNO.2中第23-45位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

f、用于检测236T型的引物为：SEQIDNO.7中第23-48位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

(2)用于检测乙型肝炎病毒的3种基因型的第二组引物，包括：

所述乙型肝炎病毒的3种基因型为HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型；

g、用于检测HBV/B型的引物为：SEQIDNO.13中第22-44位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.17所示的和SEQIDNO.18所示的引物；

h、用于检测HBV/C型的引物为：SEQIDNO.15中第21-39位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.19所示的引物；

i、用于检测HBV/D型的引物为：SEQIDNO.16中第21-39位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.20所示的引物；

(3)用于检测乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三组引物，包括：

j、用于检测1896A型的引物为：SEQIDNO.22中第25-43位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQIDNO.24所示的、SEQIDNO.25所示的和SEQIDNO.26所示的引物；

k、用于检测204I-ATT型的引物为：SEQIDNO.21中第24-42位核苷酸分子所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.27所示的引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述正向引物序列的5’端均连接有标签序列，每种突变型和基因型所对应的标签序列各不相同；各标签序列为与引物扩增模板序列不配对的寡核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物如下：

用于检测180M型的引物为：SEQIDNO.4所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测181T型的引物为：SEQIDNO.5所示的正向引物、SEQIDNO.8所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测181V型的引物为：SEQIDNO.3所示的正向引物和用于与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测204I-ATC型的引物为：SEQIDNO.1所示的正向引物、SEQIDNO.6所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测204V型的引物为：SEQIDNO.2所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测236T型的引物为：SEQIDNO.7所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

用于检测HBV/B型的引物为：SEQIDNO.13所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.17所示的引物、与正向引物配对的SEQIDNO.18中所示的引物；

用于检测HBV/C型的引物为：SEQIDNO.15所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.19所示的引物；

用于检测HBV/D型的引物为：SEQIDNO.16所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.20所示的引物；

用于检测1896A型的引物为：SEQIDNO.22所示的正向引物、与正向引物配对的SEQIDNO.24所示的引物、与正向引物配对的SEQIDNO.25所示的引物和与正向引物配对的SEQIDNO.26所示的引物；

用于检测204I-ATT型的引物为：SEQIDNO.21所示的正向引物和与正向引物配对的SEQIDNO.27所示的引物。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括连接有探针的基因芯片，所述探针与所述标签序列一一对应和特异结合；

所述探针的序列如下：

(1)用于检测1896A型的探针的序列如SEQIDNO.28所示；

(2)用于检测204I型的探针的序列如SEQIDNO.29所示；

(3)用于检测180M型的探针的序列如SEQIDNO.31所示；

(4)用于检测236T型的探针的序列如SEQIDNO.32所示；

(5)用于检测181T型的探针的序列如SEQIDNO.33所示；

(6)用于检测181V型的探针的序列如SEQIDNO.34所示；

(7)用于检测204V型的探针的序列如SEQIDNO.36所示；

(8)用于检测B型的探针的序列如SEQIDNO.30所示；

(9)用于检测C型的探针的序列如SEQIDNO.37所示；

(10)用于检测D型的探针的序列如SEQIDNO.38所示。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：

所述用于检测乙型肝炎病毒6种突变型的第一组引物还包括：用于放大整体信号的SEQIDNO.10所示的引物；

所述用于检测乙型肝炎病毒的3种基因型的第二组引物还包括：用于放大整体信号的SEQIDNO.10所示的引物和放大B基因型信号的SEQIDNO.14所示的引物；

所述用于检测乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三组引物还包括：用于放大1896A型信号的SEQIDNO.23所示的引物。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的第一组引物中还包括两对内对照的引物：

(1)扩增内对照IC1的引物：正向引物如SEQIDNO.11所示；与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

(2)扩增内对照IC2的引物：正向引物如SEQIDNO.12所示；与正向引物配对的SEQIDNO.9所示的引物；

所述内对照IC1的探针如SEQIDNO.41所示；所述内对照IC2的探针如SEQIDNO.35所示。

7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于：所述探针还包括三个质控探针：

(1)HBV-PB-PC，如SEQIDNO.39所示；

(2)HBV-PB-NC1，如SEQIDNO.40所示；

(3)HBV-PB-QC，如SEQIDNO.42所示。

8.根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括使用说明书，所述使用说明书上记载如下内容：

使用权利要求1-7任一所述的三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型。

9.权利要求1-8任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的产品中的应用；

所述乙型肝炎病毒7种突变型为180M型、181T型、181V型、204I型、204V型、236T型和1896A型；所述乙型肝炎病毒3种基因型为HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型。

10.一种用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型的方法，包括如下步骤：

使用权利要求1-8任一所述的三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型；

所述方法为非疾病诊断或治疗方法；

或，权利要求1-8任一所述的试剂盒或权利要求9所述方法在鉴定乙型肝炎病毒的耐药性中的应用。