CN102016071A - 对治疗性化合物敏感性降低的乙型肝炎变异株、变异株的检测及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于以下方面的诊断试剂盒和材料：1)预测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者对用核苷/核苷酸类似物或其组合治疗的长期反应；2)检测对抗体检测的反应性降低的HBV变异株；3)检测在前核心/核心区负面影响肝病进程的HBV变异株；4)鉴定HBV基因型。

Description

对治疗性化合物敏感性降低的乙型肝炎变异株、变异株的检测及其用途

                相关申请的交叉引用

本申请要求保护2008年4月5日提交的美国临时申请顺序号61/042,721的权益，该申请通过引用其整体结合到本文中。

发明背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染是影响世界范围大约20亿人口的严重的全球性健康问题。大约4亿受HBV感染的人是长期携带者。每年约1百万人死于各种HBV疾病，例如慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)(世界卫生组织(World Health Organization)，2000)。这种疾病在西方国家相对较少，主要在成人期得病。然而，该疾病在亚洲和非洲国家实际上是流行病，其中大多数慢性HBV感染是在围产期或儿童期获得的。

乙型肝炎病毒(HBV)是一种约3200个碱基的小DNA病毒，具有广泛的序列变异性。目前已确定的有8种基因型(A～H)。

这种病毒可引起虚弱性疾病症状。急性感染可能导致肝衰竭，但这种情况极少见。在出生时或在婴儿期受到感染的人，90％以上的乙型肝炎感染会发展成慢性形式。在25-40％患者中，慢性感染最终导致肝硬化和肝癌。据估计，HBV引起全球30％的肝硬化和50％的HCC(Perz等，2006)。这个沉重的负担使得开发有效用于降低HCC风险的抗病毒疗法的需求变得十分突出(Liaw等，2004)。监测患者对这类疗法的反应也因此十分重要。

HBV主要是垂直传播，病毒由受感染的母亲传给出生时的婴儿。婴儿也可通过与受感染的父母和兄弟姐妹紧密接触而被感染。HBV也可通过性接触或与受感染血液接触而水平传播。

该病毒通过RNA中间体复制，并利用在其复制策略中缺乏校正能力的反转录。HBV基因组部分是双链，在4个重叠可读框中编码包膜、前核心(precore)/核心、反转录酶/聚合酶和X基因。

包膜蛋白抗原称为HBsAg(乙型肝炎表面抗原)，它构成病毒的外表层。核心蛋白抗原称为HBcAg(乙型肝炎核心抗原)，它构成包裹HBVDNA的病毒核心。前核心蛋白抗原称为HBeAg(乙型肝炎e抗原)，其功能不详。X蛋白抗原称为HBxAg(乙型肝炎x抗原)，其确切功能也不详。

聚合酶基因与包膜基因重叠。因此，影响聚合酶基因的催化结构域的突变也可影响包膜蛋白的蛋白质序列，反之亦然。

慢性乙型肝炎感染的现行治疗包括干扰素和核苷/核苷酸类似物。遗憾的是，用干扰素治疗有许多副作用，且只有少数患者对治疗起反应。

核苷或核苷酸类似物是经化学方法改造的核苷酸，被开发用作在病毒复制期间抑制病毒DNA合成的取代结构单元。目前已获准(在美国)用于慢性乙型肝炎治疗的核苷和核苷酸类似物为：拉米夫定(lamivudine)(3TC或LMV)、替比夫定(telbivudine)(L-dT)、恩替卡韦(entecavir)(ETV)、阿德福韦(adefovir)(ADV)和替诺福韦(tenofovir)。

虽然这些化合物在抑制HBV DNA合成方面已见成效，但是它们需要长期治疗，而且在长期治疗中，存在出现抗药性突变型HBV毒株的可能。在用LMV长期治疗的患者中，赋以普遍抗药性的突变为rtM204I/V+/-rtL180M(Allen等，1998)以及其它突变。在一些患者中，在长期治疗时出现在HBV DNA聚合酶基因的B、C和D结构域上携带突变的抗药性病毒毒株。因此与LMV治疗而无抗药性病毒的患者相比，这些患者具有较高的发生HCC的风险。

另外，在乙型肝炎e抗原(HBeAg)血清转化的过程中，因免疫压力下的选择所致出现前核心和核心启动子突变体。这些前核心突变体意味着会引起更严重的HBV感染。核心启动子突变体，在引起前核心mRNA转录和HBeAg产生降低的同时提高病毒复制，同样与HCC的发生有关。

Kazim等人(2006)报道了核心启动子和YMDD基序突变与在进行长期LMV疗法的患者中的病毒突破(viral breakthrough)有关。同样，在接种HBV疫苗的儿童中，在肝移植后接受抗HBV免疫球蛋白疗法的患者中，在具有隐伏感染的患者中(Weber，2005)以及在用LMV治疗的患者中(Torresi等，2002)，发现了编码表面抗原的基因变异体。

HBV疫苗的保护是基于针对HBV表面抗原(HBsAg)的主要抗原表位的抗体的诱导。对于患有乙型肝炎相关的末期肝病并已进行肝移植的患者，通过给予从已接种疫苗的受治疗者中得到的乙型肝炎免疫球蛋白，来针对复发性HBV感染提供预防。此外，免疫逃逸HBV突变体的出现即使在有足够抗体效价的情况下也导致病毒持续感染。

因此，开发有效的抗病毒疗法需要用于监测抗药性HBV毒株出现的方法以及开发检测和鉴定这些抗药性病毒的测定法，以使得临床医生可以在出现抗药性时及时改用不同的治疗方案。

多项研究指出全球不同基因型的发生率(Lindh，M，Anderson AS，Gusdal A.Genotypes，nt 1858 variants，and geographic origin of hepatitis B virus--large-scale analysis using a new genotyping method(乙型肝炎病毒的基因型、nt 1858变异株和地理起源--采用新的基因型分型方法进行大规模分析).J Infect Dis 1997；175：1285-1293；Chan HLY，Tsui SKW，Tse C-H，Ng EYT，Au TCC，Yuen L，Bartholomeusz A，Leung K-S，Lee K-H，Locarnini S，Sung JJY.Epidemiological and virological characteristics of 2 subgroups of hepatitis B virus genotype C(乙型肝炎病毒C基因型2亚型的流行病学和病毒学特征).J Infect Dis 2005；191：2022-2032；以及Yuen M-F，Sablon E，Yuan H-J，Wong DK-H，Hui C-K，Wong BC-Y，Chan AO-O，Lai CL.Significance of hepatitis B genotype in acute exacerbation，HBeAg seroconversion，cirrhosis-related complications，and hepatocellular carcinoma(乙型肝炎基因型在急性加重、HBeAg血清转化、肝硬化相关并发症和肝细胞癌中的重要性).Hepatology 2003；37：562-567)以及不同基因型对疾病并发症(例如肝硬化、HCC的发生)的诱因(Kuang SY，Jackson PE，Wang J-B，Lu P-X，Munoz A，Qian G-S，Kensler TW，Groopman JD.Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development(血浆中乙型肝炎病毒的特定突变预示肝癌的发生).Proc Natl Acad Sci，USA 2004；101：3575-3580；以及Yuen MF，Sablon E，Wong DKH，Yuan H-J，Wong BC-Y，Chan AOO，Lai CL.Role of hepatitis B virus genotypes in chronic hepatitis B exacerbation(乙型肝炎病毒基因型在慢性乙型肝炎恶化中的作用).Clin Infect Dis 2003；37：593-597)以及对治疗的反应(Kao JH，Chen PJ，Lai MY，Chen DS.Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B(乙型肝炎基因型与慢性乙型肝炎患者的临床结果相关联).Gastroenterology 2000；118：554-559；118：554-559；以及Buti M，Cotrina M，Valdes A，Jardi R，Rodriguez-Frias F，Esteban R.Is hepatitis B virus subtype testing useful in predicting virological response and resistance to lamivudine(乙型肝炎病毒亚型测定可用于预测病毒学应答和拉米夫定抗药性吗)？J Hepatol 2002；36：445-446)。

为了辅助治疗乙型肝炎患者，开发了基于反向斑点印迹(RDB)等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交技术的各种测试条(test trip)以鉴定基因型(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV，Belgium)或突变(INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV，Belgium；以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV，Belgium)。因为对于在分析过程中的所有变异株，RDB-ASO原理需要相同的杂交和洗涤条件，所以所有正常和突变体探针可能需要相似的解链温度(Tm)(Saiki RK，Walsh PS，Levenson CH，Erlich HA.Genetic analysis of amplified DNA with an immobilised sequence-specific oligonucleotide probe(用固定化序列特异性寡核苷酸探针进行的扩增DNA的遗传学分析).Proc Natl Acad Sci，USA.1989；86：6230-6234)。这就给在一个RDB条带上测试＞20个突变/基因型提出了限制。目前需要3个单独的测试条来评价8种基因型和12个突变(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV，Belgium；INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV，Belgium；以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV，Belgium)。其他研究小组设计了寡核苷酸微阵列/芯片，但均应用相同的RDB-ASO原理(H，Cho M，Hco J，Kim H，Jun H，Shin W，Cho B，Park H，Kim C.Oligonucleotide chip for detection of lamivudine-resistant Hepatitis B Virus(用于检测拉米夫定抗性乙型肝炎病毒的寡核苷酸芯片).J Clin Microbiol 2004；42：4181-4188；Mao H，Wang H，Zhang D，Mao H，Zhao J，Shi J，Cui Z.Study of hepatitis B virus gene mutations with enzymatic colorimetry-based DNA microarray(用基于酶比色法的DNA微阵列进行乙型肝炎病毒基因突变的研究).Clin Biochem 2006；39：67-73；Song Y，Dai E，Wang J，Liu H，Zhai J，Chen C，Du Z，Guo Z，Yang R.Genotyping of hepatitis B virus(HBV)by oligonucleotides microarray(通过寡核苷酸微阵列进行的乙型肝炎病毒(HBV)的基因型分型).Mol Cell Probes.2006年1月在线发表；以及Li ZG，Chen LY，Huang J，Qiao P，Qiu JM，Wang SQ.Quantification of therelative levels of wild-type and lamivudine-resistant mutant virus in serum of HBV-infected patients using microarray(使用微阵列定量测定HBV感染患者血清中野生型和拉米夫定抗性突变体病毒的相对水平).J Viral Hepatitis 2005，12：168-175)。可检出突变的最大数目为20。

发明概述

本发明提供用于以下方面的材料与方法：1)预测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者对治疗的长期反应；2)检测对抗体检测的反应性降低的前核心/核心区中的HBV变异株；3)检测负面影响肝病进程的HBV变异株；和4)鉴定HBV基因型。

有利的是，本发明提供用于同时分析所有或大部分目标HBV变异株的综合性HBV阵列。在一个实施方案中，这包括8种HBV基因型、5个前核心突变、2个核心启动子突变及23个S基因突变和45个rt聚合酶基因突变。采用这种测定法有利于快速容易和准确地检测患者血清样品中病毒的突变体和基因型。在一个实施方案中，无需仪器通过肉眼便可容易地观察到结果。

在一个实施方案中，本发明涉及对核苷/核苷酸类似物的敏感性降低的乙型肝炎病毒变异株的鉴定。本发明还涉及对免疫试剂(例如抗病毒表面组分的抗体)的反应性降低的病毒变异株。本发明还涉及影响肝病进程的HBV变异株的鉴定。这些变异株包括HBV的基因型和在前核心/核心区、S基因和rt聚合酶基因上具有突变的变异株。本发明进一步提供检测和监测这类变异株的测定法以及用于监测抗病毒治疗方案的测定法。

有利的是，在一个实施方案中，本发明提供监测HBV变异株出现的测定法，所述HBV变异株对LMV、其它核苷/核苷酸类似物或其组合以及其它抗HBV药剂或其组合具有抗药性或者对LMV、其它核苷/核苷酸类似物或其组合以及其它抗HBV药剂或其组合的敏感性降低。这些HBV变异株的鉴定可用来指导医生改变或更换治疗方案。

本发明还使得对抗体反应性降低的HBV毒株的鉴定成为可能。这包括逃避宿主的免疫应答或逃逸免疫测定法检测的HBV突变体。

本发明还提供鉴定HBV的基因型的测定法。例如，患者的HBV的基因型可能影响肝病的进程和严重程度。

在一个实施方案中，本发明通过鉴定特定的病毒标记物，提供用于检测目标HBV变异株的试剂盒、材料和方法。

附图简述

本专利的文件包括至少一张彩色制图。需要时支付必要费用后，由专利商标局(Patent and Trademark Office)提供带有彩色图的本专利复印件。

图1是采用颜色检测方法的阵列照片。对于每组，正常引物在上，突变体引物在正常引物之下。

图2是肉眼可见的阵列的斑点排列的一个实例。

图3是显示检出各种突变的HBV阵列。

发明详述

本发明提供用于以下方面的材料与方法：1)预测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者对治疗的长期反应；2)检测对抗体检测的反应性降低的前核心/核心区中的HBV变异株；3)检测负面影响肝病进程的HBV变异株；和4)鉴定HBV基因型。

在一个实施方案中，本发明总的来讲涉及在体外和体内对核苷/核苷酸类似物的敏感性降低的乙型肝炎病毒变异株。本发明还涉及对免疫试剂(例如抗病毒表面组分的抗体)的反应性降低的病毒变异株。本发明还涉及影响肝病进程的HBV变异株的鉴定。这些变异株包括HBV的基因型和在前核心/核心区上具有突变的变异株。本发明还包括检测和监测这类变异株的测定法以及用于监测抗病毒治疗方案的测定法。

有利的是，在一个实施方案中，本发明提供监测HBV变异株出现的测定法，所述HBV变异株对LMV、其它核苷/核苷酸类似物或其组合以及其它抗HBV药剂或其组合具有抗药性或者对LMV、其它核苷/核苷酸类似物或其组合以及其它抗HBV药剂或其组合的敏感性降低。这些HBV变异株的鉴定可用来指导医生改变或更换治疗方案。

本发明还使得对抗体反应性降低的HBV毒株的鉴定成为可能，所述HBV毒株例如逃避宿主的免疫应答或避开免疫测定法检测的突变体。

本发明还提供鉴定HBV的基因型的测定法。患者的HBV的基因型可影响肝病的进程和严重程度。

有利的是，本发明提供用于同时分析所有或大部分目标HBV变异株的综合性HBV阵列。在一个实施方案中，这包括8种HBV基因型、5个前核心突变、2个核心启动子突变及23个S基因突变和45个rt聚合酶基因突变。采用这种测定法有利于快速容易和准确地检测患者血清样品中病毒的突变体和基因型。在一个实施方案中，无需仪器通过肉眼便可容易地观察到结果。

可以采用用于检测病毒标记物的多种方法中的任一种实施本发明。这些方法包括例如ARMS(扩增受阻突变系统)PCR、PCR或ARMS-PCR与RFLP(限制性片段长度多态性)联用、PCR加上杂交(例如反向斑点印迹)和等位基因特异性引物延伸亦在其中。

本发明提供的试剂盒通常可装有以下的一种或多种：载玻片(glass slide)(即HBV阵列)和用于覆盖样品的盖玻片；反应物例如缓冲剂、dNTP和聚合酶。试剂盒还可包括用于肉眼检测的试剂，例如链霉抗生物素-辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶；以及用于显色的底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑氯化物(NBT)。

在一个实施方案中，本发明提供用于针对以下方面检测病毒标记物的材料、试剂盒和方法：对用LMV或其它核苷/核苷酸类似物或其组合治疗的长期反应、免疫逃逸和基因型分型。可通过例如提取和扩增得自样品的HBV核酸，并对扩增产物直接测序以确定这类病毒标记物是否存在于样品中，来实施所述方法。

在另一个实施方案中，本发明提供能够检测病毒标记物和用于基因型分型的材料、试剂盒和寡核苷酸组(panel of oligonucleotide)。在该实施方案中，所述方法可以通过例如使得自HBV核酸的扩增产物与同HBV基因组序列互补的包括标记物的成组的寡核苷酸反应，然后确定所述寡核苷酸是否与该核酸杂交或延伸。

术语突变以其最广意义使用，以包括任何氨基酸取代或缺失。

与不能响应治疗和/或对抗体的反应性降低有关的突变

本发明提供用于测定从患者生物样品中提取的HBV是否对LMV、ADV以及对其它核苷/核苷酸类似物或者其它抗HBV药剂或其组合的敏感性降低的方法。在一个实施方案中，该方法包括从HBV中分离出DNA或RNA，并筛选出在编码HBV聚合酶的基因中导致DNA聚合酶中至少一个氨基酸取代、缺失或添加的突变。进一步的实施方案包括鉴定核心或前核心区中的突变。在具体的实施方案中，这些突变与病毒复制发生变化、HBeAg表达和/或HBeAg突变有关。

HBV聚合酶的氨基酸位置的编号与Stuyver等人(2001)提出的命名法一致，使得YMDD的甲硫氨酸M是HBV聚合酶的第204个氨基酸。蛋白质序列中某一特定突变用“XaaNXbb”表示，其中Xaa为突变之前的氨基酸，N为残基编号，Xbb为突变氨基酸。在“XaaNXbb”之前的“rt”是指“反转录酶”。“s”是指“包膜蛋白”。

本发明发现，突变rtL80I、rtL82M、rtF166L和rtQ215S与不能长期响应LMV高度相关。

此外，突变rtL80I和rtQ215S与不能长期响应ADV相关。

而且，以下核苷酸改变：A1752G/T、T1753C、T1754C、A1762T、G1764A、C1856T、T1858C、C1862T、G1896A、G1898A和G1899A表示与LMV治疗失败相关的前核心/核心区中的点突变。在HBV中，自唯一的EcoRI位点开始编号(Galibert等，1979)。

在包膜蛋白中在sQ101、sL104、sC107、sS/T114、sT115、sT116、sC121、sK/R122、sT123、sC124、sI/T126、sQ129、sG130、sN/T131、sF/Y134、sP135、sS136、sC137、sC138、sC139、sT/S140、sK141、sP142、sN146、sC147、sT148、sP153、sS154、sS155、sA157、sF/L158、sA/G159、sW163、sS167和sA/D168上的突变单独或组合地改变HBsAg的抗原性，导致从疫苗诱导的免疫逃逸或免疫球蛋白疗法的失败或免疫测定法中的检测失败。

本发明还提供结合并检测HBV核酸标记物的寡核苷酸探针。如上所述，在一个实施方案中，用于预测HBV携带者对用核苷酸/核苷类似物或与其它抗HBV药剂的组合进行治疗的长期反应的病毒标记物，存在于HBV聚合酶特定位置的特定氨基酸上。在一个实施方案中，预测HBV携带者对用核苷酸/核苷类似物及其组合疗法治疗的长期反应的病毒标记物为：单独或与其它突变(例如rtM204I/V/S+/-rtL180M)组合的rtL80I、rtL82M、rtF166L和rtQ215S。

本发明还提供测定病毒标记物的方法，所述病毒标记物预测抗HBsAg的失败、疫苗逃逸和免疫球蛋白疗法逃逸。在一个实施方案中，所述方法包括从生物样品中分离出核酸，筛选出编码S基因的序列中的突变，其中在一个实施方案中，存在的突变选自sQ101、sL104、sC107、sS/T114、sT115、sT116、sC121、sK/R122、sT123、sC124、sI/T126、sQ129、sG130、sN/T131、sF/Y134、sP135、sS136、sC137、sC138、sC139、sT/S140、sK141、sP142、sN146、sC147、sT148、sP153、sS154、sS155、sA157、sF/L158、sA/G159、sW163、sS167和sA/D168。

涉及肝病严重程度的突变

本发明提供的其它重要诊断标记物为在HBV核心启动子和前核心/核心区中A1752G/T、T1753C、T1754C、A1762T、G1764A、C1856T、T1858C、C1862T、G1896A、G1898A和G1899A上的突变。这些突变涉及肝病进程的严重程度。

Sato等人(1995)报道了暴发型肝炎或严重急性肝炎中核心启动子突变和/或前核心突变的相关性。我们在LMV治疗患者的HBV中观察到的前核心/核心突变的组合为：

A1752G、G1896A、rtL180M、rtM204I

T1753C、A1762T、G1764A、C1856T、T1858C、G1898A、G1899A

T1753C、A1762T、G1764A、G1896A、G1899A、rtL180M、rtM204V

T1753C、T1754C、A1762T、G1764A、C1856T、T1858C

T1753C、A1762T、G1764A、T1858C、rtM204I

A1762T、G1764A、T1858C、rtL180M、rtM204V

C1856T、T1858C、G1898A、rtL180M、rtM204V

C1862T、G1896A、G1899A、rtM204I

A1752G、T1858C、rtL180M、rtM204V。

核心启动子和前核心区中的突变涉及病毒复制增加、HBeAg表达降低和HBxAg发生突变。

HBV基因型的检测

本发明还包括测定生物样品中HBV的基因型的方法。

基因型A可通过以下核苷酸来界定：T451和T586。

基因型B可通过以下核苷酸来界定：A321、T324和G408。

基因型C可通过以下核苷酸来界定：A491和G633。

基因型D可通过以下核苷酸来界定：T289、A290和T867。

基因型E可通过以下核苷酸来界定：C705、C706、T837、C840和C843。

基因型F可通过以下核苷酸来界定：A628、T837和A838。

基因型G可通过以下核苷酸来界定：T306、T936和G939

基因型H可通过以下核苷酸来界定：T493、A494、A838、A840、G841和C842。

对于每个基因型，跨过上述所有碱基的两个寡核苷酸可能是必要的并足以用于适当的鉴定。HBV的基因型分型是重要的，因为例如HBV基因型影响肝病的进程和严重程度。

在一个实施方案中，采用等位基因特异性列阵引物延伸(allele-specific arrayed primer extension，AS-APEX)方法(Chan等，2004)。将寡核苷酸引物在经处理的载玻片上列阵，当寡核苷酸和模板精确匹配时，才会发生链合成或延伸。像在RDB-ASO杂交中的一样，为除去不稳定的复合物不需要严格洗涤，我们的研究表明，对可以同时进行分析的突变数目没有限制(载玻片的大小除外)。

下列实施例说明用于实施本发明的方法。这些实施例不得解释为是限制性的。所有百分比按重量计，所有溶剂混合物比例按体积计，除非另有说明。对本领域技术人员显而易见的是，实施例包括使用已知来源(例如化学品供应商)的市售材料和试剂，其有关详情不再赘述。

实施例1-病毒核酸的直接测序

一般来讲，得自生物样品的HBV核酸需要提取和纯化，然后扩增，测序，然后产生检测标记物存在的序列。

可通过例如K蛋白酶消化，随后通过苯酚、苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，来实现HBV DNA提取。或者，可以采用任何应用例如硅胶膜技术的市售试剂盒。

可通过例如聚合酶链式反应(PCR；Saiki等，1988)进行扩增。

可通过双脱氧核苷酸链终止法(亦称为Sanger反应)或通过Sanger反应的改进方式即具有荧光双脱氧核苷酸的循环测序反应来完成测序。虽然直接测序可检测所有的突变、新的突变和已知的突变，但是其灵敏度是一个缺点。一小群抗药性突变体需要达到HBV准种库总量的20％后，才可被检测出来。

实施例2-通过寡核苷酸探针检测

通过寡核苷酸方法检测变异株或突变体比直接测序灵敏得多。可以鉴定出低至HBV总群体5％的小群变异株，即使在突变体出现早期，在临床抗药性表现出来之前。

通过使用一组寡核苷酸高灵敏度地同时检测大量突变或序列变异，该方法可供预测对其它类别的核苷/核苷酸类似物的抗药性。

1.反向斑点印迹杂交

可以将寡核苷酸探针(其设计以针对以下方面来检测病毒标记物：对抗HBV疗法的长期反应、免疫逃逸和用于基因型分型)列阵于膜或优选载玻片上，然后与扩增和标记的HBV核酸杂交。杂交后，将膜或载玻片在高严格性条件下洗涤。然后使杂交反应的结果可视化。

在这种情况下，诊断性核苷酸优选位于寡核苷酸的中间部分。

可以在不对称PCR反应或链特异性降解中产生与寡核苷酸互补的标记的HBV靶标。

与互补HBV核酸连接的标记物可以是生物素，其中可视化需要与链霉抗生物素-辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶形成复合物，以及与底物例如4-氯-3-萘酚或BICP-NBT显色。或者，可以使用荧光标记，并通过使用激光扫描仪获取信号。还可随信号检测的相应方法而使用放射性标记或化学发光标记。

2.等位基因特异性列阵引物延伸

采用综合性HBV阵列用于同时分析所有或大部分已知的目标HBV变异株。在一个实施方案中，HBV变异株包括8种HBV基因型、5个前核心突变、2个核心启动子突变、23个S基因突变和45个聚合酶基因突变。该方法可供检测患者血清样品的病毒突变体和基因型。

在该方法中，诊断性核苷酸可位于寡核苷酸的3’端。通过不对称PCR反应产生互补的单链HBV靶标。

将寡核苷酸组列阵于载玻片上，然后与反应物中的HBV靶标进行杂交，所述反应物包括：缓冲剂、热稳定聚合酶和dNTP(其中之一是标记的，优选生物素-dUTP或加荧光标签的dUTP的形式)。在杂交反应期间，当寡核苷酸在3’端与其HBV靶标精确匹配时，便进行引物延伸。在杂交/延伸反应以除去未掺入的dNTP后，洗涤载玻片。然后通过检测掺入新合成链的标记核苷酸来得到信号。

对于每个待查询的核苷酸位置，需要至少两种寡核苷酸引物，一种寡核苷酸引物用于正常序列，另一种寡核苷酸引物用于突变序列。在一个核苷酸位置上的多个核苷酸突变可能需要相同数目的突变寡核苷酸。引物在5’端通过共价键与固体表面(在此实例中为载玻片)连接，3’端是游离的，以便在与HBV靶序列中的诊断性碱基或超过诊断性碱基最多两个碱基互补的碱基上杂交并终止。

通过不对称扩增或通过链特异性降解，接着通过纯化或浓缩，来制备与所述寡核苷酸互补的HBV靶标。

杂交/延伸反应糅合了杂交的识别性作用与聚合酶的碱基配对特异性。将含有HBV靶DNA、缓冲剂、dATP、dGTP、dCTP、生物素-dUTP或加荧光标签的dUTP及热稳定聚合酶的溶液覆盖在已列阵的寡核苷酸引物上。只要寡核苷酸引物的3’碱基与靶标精确匹配，便进行延伸；标记的dUTP被掺入延伸链中。寡核苷酸/靶标错配将得到阴性结果。

通过洗涤终止反应，信号获取取可按照延伸反应中所使用的标记进行。

在一个实施方案中，从100名无关患者中获取样品，通过现有的商用试剂盒测定所述无关患者的HBV突变。用现有技术和本发明的技术从46个样品得到一致的结果。11个样品的结果不一致，将含有rt-聚合酶HBV基因的这些样品的DNA片段克隆至质粒中，测序以证实阵列分析的结果。通过本发明的阵列分析发现43个样品产生额外的突变。通过测序同样证实了这些额外突变的存在。这就表明本发明的阵列在检测出现的突变体方面更灵敏。

在一个实施方案中，在治疗开始前及在2-5年随访期间，采集得自正接受抗病毒疗法的22名HBV患者的血清样品，使用HBV阵列进行测定。结果表明，所述阵列可检测＜70个拷贝/ml HBV DNA样品中的突变。在现有商用试剂盒之前3-7个月，便能够检出赋予抗药性的突变。因此，本发明使医生能够在较早时间检出抗药性，并且在适当时，在发生明显的生化复发前使用备选药物。

在一名患者中，在他的‘未经治疗(naive)’血清样品(在抗病毒疗法开始前取样)中注意到LMV抗性突变78T的存在。在治疗后14个月，检出其它LMV抗性HBV突变体毒株180M、200V和204V。因此用该阵列，可预测患者对某些抗病毒剂的最终耐药性，使得可以在疗法开始时使用备选药物。

3.用于肉眼观察阵列结果的阵列方法

该方法适用于反向斑点印迹和等位基因特异性引物延伸格式两者。精选的标记为生物素。在反向斑点印迹法中，使用生物素-dUTP或生物素标记的引物以扩增HBV靶标。在延伸方法中，使用生物素-dUTP用于玻璃阵列上的原位链延伸。

在该实施方案中，使用自动打印机(robotic printer)；将每个寡核苷酸在紧密聚类(tight cluster)中打印6次(3x2)以产生寡核苷酸的局部沉积或斑点，使斑点足够大，彼此间隔得足够远，使得无需借助显微镜或精细放大仪就能检出各个斑点。

斑点排列可呈由行和列组成的网格形式，优选在正常寡核苷酸之下打印突变体寡核苷酸。

本发明还提供寡核苷酸的有序阵列，其中不同的寡核苷酸占据不同的位置，使得每一个都可通过其在阵列上的坐标或位置来寻址。

在杂交或杂交/延伸反应后，洗涤阵列，除去未结合靶标或未掺入的核苷酸。将链霉抗生物素缀合的碱性磷酸酶的溶液覆盖在阵列上。碱性磷酸酶通过链霉抗生物素在杂交的靶标或新的合成链上与生物素络合。洗去过量的碱性磷酸酶，然后使阵列与底物例如BCIP-NBT一起孵育，在碱性磷酸酶的催化作用下产生蓝紫色沉淀。通过洗涤停止有色沉淀后，使阵列干燥。为了记录结果，阵列可用数码相机拍照，或者用平板式桌面扫描仪进行扫描。

应当理解的是，本文所述实施例和实施方案仅用于说明目的，根据本发明所作的各种修改或变动可由本领域技术人员提出，并且包括在本申请的精神和范围内。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有数据和图表，均通过引用其整体予以结合到与本申请的明确教导一致的程度。

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Claims (14)

1.一种用于测定从患者生物样品中提取的HBV是否对LMV、ADV和/或对其它核苷/核苷酸类似物、干扰素或其它抗HBV药剂或其组合的敏感性下降的方法，其中所述方法包括从所述HBV中分离出DNA或RNA，同时在编码HBV聚合酶的基因中筛选出多种突变，其中所述方法能够同时检出所述DNA聚合酶的多个氨基酸取代、缺失和/或添加，且其中所述方法可同时检出HBV DNA聚合酶中的多种突变，包括选自以下的多种突变：rtL80I、rtL82M、rtF166L、rtQ215S和rtM204I/V/S+/-rtL180M。

2.一种用于测定从患者生物样品中提取的HBV是否对LMV、ADV和对其它核苷/核苷酸类似物、干扰素和/或其它抗HBV药剂或其组合的敏感性下降的方法，其中所述方法包括从所述HBV中分离出DNA或RNA，同时在影响病毒复制和/或改变HBeAg表达和/或使HBxAg突变的核心启动子和/或前核心区中筛选出多种突变，其中所述方法能够同时检出多种突变，且其中所述方法可同时检出核心启动子和/或前核心区中的多种突变，包括选自以下的多种突变：A1752G/T、T1753C、T1754C、C1856T、C1862T、G1898A和G1899A。

3.一种用于测定HBV对抗体的反应性例如疫苗逃逸、免疫球蛋白疗法逃逸或抗HBV血清学检测逃逸或其组合是否降低的方法，其中所述方法包括从所述HBV中分离出DNA或RNA，同时在编码HBV包膜蛋白的基因中筛选出多种突变，其中所述方法能够同时检出所述包膜蛋白的多个氨基酸取代、缺失或添加，且其中所述方法可同时检出HBV包膜蛋白中的多种突变，包括选自以下的多种突变：sQ101、sL104、sC107、sS/T114、sT115、sT116、sC121、sK/R122、sT123、sC124、sI/T126、sQ129、sG130、sN/T131、sF/Y134、sP135、sS136、sC137、sC138、sC139、sT/S140、sK141、sP142、sN146、sC147、sT148、sP153、sS154、sS155、sA157、sF/L158、sA/G159、sW163、sS167和sA/D168。

4.一种用于测定HBV的基因型的方法，其中所述方法包括从所述HBV中分离出DNA或RNA，同时筛选出HBV基因组特定位置上的多个基因型特异性核苷酸，其中所述方法能够同时检出多个核苷酸，且其中所述核苷酸包括选自以下基因型的多个核苷酸：基因型A：T451和T586；基因型B：A321、T324和G408；基因型C：A491和G633；基因型D：T289、A290和T867；基因型E：C705、C706、T837、C840和C843；基因型F：A628、T837和A838；基因型G：T306、T936和G939；以及基因型H：T493、A494、A838、A840、G841和C842。

5.权利要求1的方法，其中所述HBV DNA聚合酶中的突变包括rtL80I、rtL82M、rtF166L、rtQ215S和rtM204I/V/S+/-rtL180M。

6.权利要求2的方法，其中所述核心启动子和/或前核心区中的突变包括A1752G/T、T1753C、T1754C、C1856T、C1862T、G1898A和G1899A。

7.权利要求3的方法，其中所述HBV包膜蛋白中的突变包括sQ101、sL104、sC107、sS/T114、sT115、sT116、sC121、sK/R122、sT123、sC124、sI/T126、sQ129、sG130、sN/T131、sF/Y134、sP135、sS136、sC137、sC138、sC139、sT/S140、sK141、sP142、sN146、sC147、sT148、sP153、sS154、sS155、sA157、sF/L158、sA/G159、sW163、sS167和sA/D168。

8.权利要求4的方法，其中所述核苷酸和/或位置包括基因型A：T451和T586；基因型B：A321、T324和G408；基因型C：A491和G633；基因型D：T289、A290和T867；基因型E：C705、C706、T837、C840和C843；基因型F：A628、T837和A838；基因型G：T306、T936和G939；以及基因型H：T493、A494、A838、A840、G841和C842。

9.一种用于检测HBV变异株的突变和/或基因型的方法，其中所述方法包括从所述HBV中分离出DNA或RNA，并筛选出突变DNA或RNA，其中所述方法能够同时检出DNA或RNA的多个突变和/或基因型，且其中可用肉眼观察结果。

10.权利要求9的方法，所述方法使用：

a)寡核苷酸阵列，用于分析含有可变序列的靶序列；和

b)具有足够大小和间距的斑点的阵列，可供肉眼观测各个斑点；

且其中所述方法包括：

a)在允许杂交的条件下，使可能含有突变的样品核酸与阵列接触；

b)在含有生物素标记的核苷酸和酶的反应物中，使在其3’端具有精确匹配的每个寡核苷酸延伸；和

c)通过比色反应检测延伸的每个寡核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中所述酶是反转录酶或DNA聚合酶。

12.权利要求10的方法，其中所述比色反应由链霉抗生物素碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化。

13.权利要求10的方法，其中在比色反应中的所述底物是BCIP/NBT或4-氯-1-萘酚。

14.一种用于检测HBV变异株的突变和/或基因型的试剂盒，其中所述试剂盒包含具有用于检测所述HBV变异株的突变和/或基因型的核苷酸序列的载玻片。

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