CN1393567A - 乙型肝炎病毒耐药检测寡核苷酸基因芯片的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物工程类检测产品及其用途。具体说是一种新型乙型肝炎病毒耐药检测寡核苷酸基因芯片。根据乙型肝炎病毒拉米呋啶耐药性相关突变主要位于乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因的L526，A546，M550和V553等氨基酸位点，设计寡核苷酸探针，长度为15－18，探针3’端进行NH3－(PEG)4－修饰。以醛基化载玻片为支持物制成寡核苷酸基因芯片。该基因芯片能有效分辨人工构建突变体中的点突变，也能检测HBV临床标本中DNA突变，是一种用于HBV耐药检测的新型生物工程类检测产品。

Description

乙型肝炎病毒耐药检测寡核苷酸基因芯片的制备及用途

乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康和生命的病毒性传染病。目前虽有预防用的HBV疫苗，但全球近亿HBV感染者的治疗是医学界面临的一个难题(Zoulim F.et al.AntiviralRes.1999，44：1-30)。除了干扰素可选用外，最近发现治疗HIV的核苷类药物拉米呋啶(Lamivudine)对HBV具有很强的抑制作用，并很快开发为治疗HBV慢性感染病人的药物，投入临床应用。随着拉米呋啶在临床上的广泛应用，发现易出现拉米呋啶抗性现象，给HBV治疗带来影响。最近研究发现，拉米呋啶作用于HBV的靶蛋白——HBV多聚酶基因的点突变与HBV的拉米呋啶抗性密切相关，并发现了这些与HBV拉米呋啶抗性相关的点突变(Zoulim F，etal.J.Hepatology，1998，29：151-168)。HBV拉米呋啶抗性的快速检测对临床药物的合理应用，选择最佳治疗方案以及降低病人治疗费用等具有重要意义。

寡核苷酸基因芯片(Oligochip)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术(Hacia J.Naturegenetics(Supl)，1999，21(1)：42-47)。寡核苷酸基因芯片的一个主要用途是基因突变的快速和高通量检测，已成功应用于HIVRT基因，结核杆菌利福平(Rifapin)抗性相关基因，肿瘤p53基因以及药物代谢相关细胞色素酶p450基因等的突变分析，是一种发展前景好的基因突变大规模检测新生物技术。

本发明的目的是，设计一种HBV耐药检测的寡核苷酸基因芯片，为建立合理高效的HBV治疗方案，指导临床合理用药提供快速高效的检测手段。

本发明的主要内容是：1、HBV耐药检测寡核苷酸芯片制备  根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点，设计了28条寡核苷酸探针(见表1)。探针对应序列为HBV DNA聚合酶基因反义链，长度为15-18nt。设计探针时使其Tm值尽可能接近，但优先考虑探针长度，即探针长度位于15-18nt，以17为主。探针合成时在其3’端接氨基和间隔臂(spacer)等特定修饰，一方面利于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面，同时增加固定于载体表面探针的自由度和与靶序列的可接近性(accessibility)。探针纯化与定量后，用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上，制成HBV耐药寡核苷酸芯片。芯片上每个探针重复2次，以验证检测结果的重复性。芯片上探针微阵列(microarray)中第1，5列探针对应HBV DNA野生型序列；其他探针对应于各种可能的突变型DNA序列。微阵列中

                                  表1

            氨基酸编号                            探针序列(5’→3’)        长度       Tm       GC％       分子量

            (碱基)1                             TGAGCCAGGAGAAAC             15        50.28     53.3       4697.082                L526         TGAGCCATGAGAAAC             15        47.86     46.7       4672.073                (1 base)     TGAGCCAAGAGAAAC             15        47.09     46.7       4681.084                             TGAGCCACGAGAAAC             15        51.02     53.3       4657.065                             CTGAGCCAGGAGAAAC            16        52.12     56.3       4986.276                L526         CTGAGCTAGGAGAAA             15        43.12     46.7       4712.097                (3 base)     CTGAGCGAGGAGAAA             15        50.81     53.3       4737.108                             CTGAGCAAGGAGAAA             15        47.42     46.7       4721.109                             CTGAAAGCCAAACAATG           17        53.51     41.2       5258.4710               A546         CTGAAAACCAAACAATG           17        50.33     35.3       5242.4711               (2 base)     CTGAAACCCAAACAATG           17        53.10     41.2       5218.4512                            CTGAAATCCAAACAATG           17        50.18     35.3       5233.4613                            CATCATCCATATAACTGA          18        46.53     33.3       5488.6314               M550         CATCATCCACATAACTG           17        47.52     41.2       5160.4115               (1 base)     CATCATCCAGATAACTG           17        46.61     41.2       5200.4216                            CATCATCCAAATAACTG           17        46.97     35.3       5184.4317                            ACATCATCCATATAACT           17        41.33     29.4       5159.4218               M550         ACATCATCAATATAACT           17        38.33     23.5       5183.4419               (3 base)     ACATCATCTATATAACT           17        34.35     23.5       5174.4320                            ACATCATCGATATAACT           17        41.60     29.4       5199.4421                            CAATACCACATCATCCA           17        51.44     41.2       5129.4022               V553         CAATACCAGATCATCCA           17        50.20     41.2       5169.4223               (1 base)     CAATACCATATCATCCA           17        47.19     35.3       5144.4124                            CAATACCAAATCATCCA           17        50.41     35.3       5153.4225                            CAATACCACATCATCCA           17        51.14     41.2       5129.4026               V553         CAATACAACATCATCCA           17        48.13     35.3       5153.4227               (3 base)     CAATACTACATCATCCA           17        44.02     35.3       5144.4128                            CAATACGACATCATCCA           17        51.37     41.2       5169.42探针后标示的碱基对应该探针出现荧光信号时所判读的碱基。

2、HBV DNA聚合酶基因突变体构建克隆了833号HBV病人血清中HBV DNA聚合酶基因，测序证实为HBV DNA野生型(即未发生突变)。以该DNA为模板，用PCR法构建了下列4种突变体(见表2)。

3、HBV耐药检测寡核苷酸芯片检测HBV野生型和突变体DNA用HBV耐药寡核苷酸芯片对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现，对于HBV833野生型质粒，仅在芯片第1，5列探针出现荧光信号，而且重复性好。说明HBV耐药核苷酸芯片能有效检测出野生型DNA序列。当用HBV耐药寡核苷酸芯片检测突变体HBV833 Mutantl时，根据杂交信号可发现HBV耐药寡核苷酸芯片检测的结果与表2所示序列相一致。分析HBV耐

                                 表2氨基酸位点                526            546          550         553HBV 833 DNA seq           CTG            GCT          ATG         GTG/AA(widetype)             L              A            M           VHBVg33-Mutant 1           CTG            GTT          GTG         ATGHBV833-Mutant 2           CTG            GAT          ATT         GTTHBV833-Mutant 3           CTG            GGT          ATC         GTCHBV833-Mutant 4           ATG            GTT          GTG         ATG药寡核苷酸芯片与HBV 833 Mutant3和Mutant4杂交结果，同样发现HBV耐药寡核苷酸芯片检测结果与相应突变体DNA序列一致。表明HBV耐药寡核苷酸芯片不仅可检测出野生型序列，而且可有效地分辨出单碱基突变，可应用于HBV耐药基因突变检测。

4、HBV耐药寡核苷酸芯片检测HBV临床样本用HBV耐药寡核苷酸芯片检测HBV阳性血清20份。不对称PCR法对HBV DNA进行荧光标记，HBV DNA标记产物与HBV耐药寡核苷酸芯片杂交，根据杂交信号判定DNA序列，并与DNA测序结果比较。结果发现，HBV耐药寡核苷酸芯片检测结果与DNA测序结果相吻合。实验发现，中国人HBV在526位出现高频率的CTG→TTG突变。此外HBV耐药寡核苷酸芯片检测HBV样本时，有的探针组(4个一组)不出现任何信号；经与DNA测序结果比较发现，探针对应的靶序列附近出现碱基突变，说明在设计探针时要考虑DNA热点突变周围核酸序列的保守程度。

总之，本发明中我们据HBV拉米呋啶耐药基因热点突变，设计了一种HBV耐药寡核苷酸芯片。该芯片的特点是，能同时测定多个耐药突变，而且随着新的HBV耐药突变位点不断发现，可以把检测HBV耐药相关所有突变的探针放到一张芯片上，真正实现一种芯片能测定HBV各种可能耐药突变的快速和高通量的策略。HBV耐药寡核苷酸芯片的制备与初步应用为HBV耐药突变提供了一种新型检测手段，对预测HBV药物治疗效果，指导临床合理用药等具有重要的应用价值。结合附图说明本发明的具体实施方法如下：

图1为HBV耐药寡核苷酸基因芯片示意图。图2为HBV耐药寡核苷酸基因芯片上探针排列顺序。图3为HBV耐药寡核苷酸基因芯片上基因探针设计时对应的突变热点。图4为HBV耐药寡核苷酸基因芯片检测人工构建DNA突变体时的杂交信号。图5为HBV耐药寡核苷酸基因芯片检测HBV临床血清样本时的杂交信号。

实施例本实施例的技术要点如下：1.HBV耐药寡核苷酸芯片探针的设计和合成根据文献报导的HBV Lam抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526，A546，M550和V553等氨基酸位点^[4-7]，设计了如下寡核苷酸探针(表1)。探针合成时在其3’端进行特殊修饰，即连接4个PEG的C3氨基连接臂。合成后用反向柱纯化，紫外定量。2.HBV耐药寡核苷酸芯片制备寡核苷酸探针以3×SSC溶解到浓度为15μm.用Pixysys5500型基因芯片点样仪将寡核苷酸探针点到经醛基化处理的载玻片上。寡核苷酸探针在玻片上的排列如图1。寡核苷酸芯片制备完毕后晾干，放载玻片盒上室温放置备用。3.检测样品处理与不对称PCR荧光标记DNA取HBV阳性病人血清50ul，加入10μl LysisBuffer，煮沸15min，12000rpm离心10min，取上清5μl，加入如下反应体系中：PCR Mix20μl，5’端Cy3标记的P1(5’TGTATTCCCATCCCATCATC3’)(1μg/μl)0.2μl，P2(5’ACATATCCCATGAAGTTAAGG3’)(0.1μg/μl)0.2μl，Taq Polymerase(5u/μl)0.2μl。94℃5min；[94℃ 30 Sec，55℃ 30Sec，72℃ 30Sec]30 cycles；72℃ 10min。4.HBV耐药寡核苷酸芯片检测突变过程(1)寡核苷酸基因芯片处理Oligochip先用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，空气凉干。用NaBH₄溶液[100ml含20％乙醇的PBS溶液中加入1.3gNaBH₄]作用10min，封闭玻片表面的醛基。0.2％SDS清洗1次，水清洗1次，晾干后用于预杂交和杂交。(2)预杂交，杂交和杂交后处理芯片先用5ul预杂交液(5×SSC，0.2％SDS，100μg/ml鲑精DNA)室温预杂交30分钟。然后取出2μl PCR样品用预杂交液稀释到10μl进行杂交。预杂交和杂交时，按2μl/cm²将预杂交液，杂交液转移到盖玻片上，利用盖玻片与玻片之间的毛细现象将溶液均匀平铺在玻片上，将玻片置于加有5μl3×SSC溶液的杂交盒中。杂交温度为探针的Tm-10℃左右，杂交时间为1-3小时。芯片杂交完成后用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)；洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)各清洗5分钟。(3)扫描和结果判定扫描仪为ScanArray300。荧光素Cy3，Cy5的激发波长为530nm，检测波长为585nm，650nm。扫描分辨率为10mm；设定Laser强度及PMT均设为80％。扫描1-2次。5.HBV Lam抗性相关基因突变体构建在拟突变位点的上下游设计引物P1(5’TGTATTCCCATCCCATCATC3’)和P2(5’ACATATCCCATGAAGTTAAGG3’)在拟突变位点设计突变引物mutP1(5’GGTTTTCAGTTATGTGGATGATATG3’)和mutP2(5’CATATCATCCACATAACTGAAAACC3’)，其中，下划线核苷酸碱基为突变位点，mutP1和mutP2互补。构建突变体时，取5μl HBV裂解上清，分别用P1和mutP2，mutP1和P3进行PCR扩增。纯化PCR产物，各取1μl混合作为P1和P3 PCR反应的模板，PCR产物经纯化后克隆到T-载体，DNA测序证实所引入的点突变。6.HBV耐药寡核苷酸芯片检测特性分析对人工构建的HBV Lamivudine抗性相关突变体，取1μl(1μg/μl)，按3中方法对突变体质粒进行荧光标记，用HBV耐药寡核苷酸芯片进行检测，并与DNA测序结果进行比较。7.HBV临床标本检测取HBV感染病人血清(其中包括临床上Lamivudine耐药病人血清)，按方法3和4对其进行荧光标记并用HBV耐药寡核苷酸芯片进行检测，与DNA测序结果进行比较。8.DNA测序送交测序样品为PCR产物和连接到T载体的细菌克隆(1ml菌液)。DNA测序由宝生物大连有限公司进行。

Claims (2)

1.一种乙型肝炎病毒耐药检测寡核苷酸基因芯片。其特征在于，根据乙型肝炎病毒拉米呋啶耐药性相关突变主要位于乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因的L526，A546，M550和V553等氨基酸位点，设计检测突变的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针与HBV拉米呋啶耐药相关基因突变位点互补，长度为15-18，3’端进行NH3-(PEG)4-修饰。基因芯片支持物为醛基化载玻片。该寡核苷酸基因芯片能有效检测HBV耐药基因突变。

2.权利要求1中的寡核苷酸基因芯片在HBV耐药临床检测中的用途。

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