FI105279B - Polynukleotideja ja menetelmiä jotka ovat hyödyllisiä hepatitis C-viruksen seulomisessa - Google Patents

Polynukleotideja ja menetelmiä jotka ovat hyödyllisiä hepatitis C-viruksen seulomisessa Download PDF

Info

Publication number
FI105279B
FI105279B FI915443A FI915443A FI105279B FI 105279 B FI105279 B FI 105279B FI 915443 A FI915443 A FI 915443A FI 915443 A FI915443 A FI 915443A FI 105279 B FI105279 B FI 105279B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sequence
hcv
polynucleotide
sequences
region
Prior art date
Application number
FI915443A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI915443A0 (fi
Inventor
Michael S Urdea
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Amy J Weiner
Jang Han
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of FI915443A0 publication Critical patent/FI915443A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI105279B publication Critical patent/FI105279B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

105279
POLYNUKLEOTIDEJA JA MENETELMIÄ JOTKA OVAT HYÖDYLLISIÄ HEPATITIS C-VIRUKSEN SEULOMISESSA
5 Keksintö koskee materiaaleja ja metodologiaa non-A, non-B-hepatitisviruksen (NANBV) levinneisyyden selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee non-A, non-B-hepatitiksen (NANBV), hepatitis C-viruksen (HCV) etiologista ainetta ja polynukleo- _ 9 tideja ja niiden analogeja, jotka ovat hyödyllisiä analyyseissä 10 HCV:n havaitsemiseksi biologisissa näytteissä.
*
Selityksessä viitataan seuraaviin julkaisuihin Barr et ai. (1986), Biotechniques £:428.
Beaucage et ai. (1981), Tetrahedron Letters 22:1859 15 Botstein (1979), Gene £:17.
Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 327-374.
20 Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast Saccha-romyces, Vol.l, s.445, Cold Spring Harbor Press.
Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.
Brown et al. (1979), Methods in Enzymology 68:109 Byrne et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:4165 25 Castle et al. (1986), Virology 119:10 Chang et al. (1977), Nature 198:1056.
Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294.
Choo et al. (1989), Science 244:359
Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.
• · · * : 30 Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.
• · ·
Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.
Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110.
— 1 1 j — * * Cousens et al. (1987), Gene 61:265.
De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.
• ’ ·...' 35 Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.
• · ·
Feinstone et al. (1981), J. Inf. Dis. 144:588 Feinstone et al. (1983) Infection and Immunology 41:816 • · *···. Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J.
Med. 311:185.
• · · — :...* 40 105279
Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.)
Fiers et al. (1978), Nature 273:113.
Gerety, R.J. et ai. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., toiro., Grune 5 and Stratton, Inc., 1984) ss. 23-47.
Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. £.:4057.
9
Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.
Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.
Grych et al. (1985), Nature 316:74.
10 Gubler and Hoffman (1983), Gene 25.:263.
Hahn et al. (1988), Virology 162:167 Han (1987), biochemistry 26:1617
Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS.
15 Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 2.:149.
Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 25.: 1929.
Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.
Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.
Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.
20 Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. £:247.
Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss. 49-78.
Immun. Rev. (1982) 62:185.
25 Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.
Kenneth et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.
Kuo et al. (1989), Science 211:362 • · ! V Kyte and Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157:105-132.
Landegren at al. (1988), Science 244:229
"X 30 Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY
: MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
• · · · ·:··· Matthews and Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1.
METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).
Mittlin (1989), Clinical Chem. ££:1819.
• # ;35 Laemmli (1970), Nature 227. 680.
Lee et al. (1988), Science 239: 1288.
' Loh et al. (1989), Science 243:217.
Mackow et al. (1987), Virology 159:217 « · • « 3 105279
Mayer and Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).
Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology £5.:499.
MacNamara et al. (1984), Science 226;1325.
5 Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. £:309.
Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.
Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis.
Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND
? FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Praenkel-Conrat and Wagner, 10 painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 375-440.
Murakawa et al. (1988), DNA 2:287.
Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.
Narang et al. (1979), Methods in Enzymology 68:90.
15 Neurath et al. (1984), Science 224:392.
Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Imrounopathol. 21:397-406. Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.
Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.
Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.
20 Peleg (1969), Nature 221:193 .
Pferrerkorn and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat& Wagner, toim., Plenum, N.Y.) ss. 171-230.
Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.
25 Rice et al. (1985), Science 229:726.
Rice et al. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE
. . AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, • · * • f painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), •*| ss. 279-328.
30 Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND : FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press) . Rosenberg et al. (1984), Nature 312:7 Sadler et al. (1980), Gene £, 279.
35 Saiki et al. (1985), Science £££.:1350.
« ·
Saiki et al. (1986), Nature 111:163.
* . Saiki et al. (1988), Science 112.:487.
Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21:5463.
» · · * · • · * , 105279 4
Scharf et ai. (1986), J. Virol. ££.:1153.
Schlesinger et ai. (1986), J. Virol. ££:1153.
Schreier, M., et ai. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.
Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, 5 SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).
Shimatake et al. (1981), Nature 292:128.
Steimer et al. (1986), J.Virol. ££:9.
Stollar (1980), julkaisussa THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, toim., Academic Press, N.Y.), ss. 584-622.
10 Sumiyoshi et al. (1987), Virology 161:497.
Taylor et al. (1976), Biochera. Biophys. Acta 442:324.
Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1£:4350.
Tsu and Herzenberg (1980), julkaisussa SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) ss. 373-391.
15 Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 1££:1225.
Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.
Valenzuela, P., et al. (1984), julkaisussa HEPATITIS B (Millman, I., et al., toim.. Plenum Press) ss. 225-236.
Warner (1984), DNA £:401.
20 Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology, Vol. 154, RECOMBINANT DNA, Part E.
Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F.
Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.
25
Viitataan myös seuraaviin patentteihin: US-patentit Not 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; * 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632, 4,493,890, 4,683,202, 4,458,066 "I ja 4,868,105.
• · ···1: 30
• · 1 V
: Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva *' ' tauti tai tautiperhe, jonka uskotaan olevan viruksen aiheuttama • ·· · ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheuttamista maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka aiheuttavat :1/.:;35 tunnetut hepatitisvirukset, s.o. hepatitis-A-virus (HAV), hepatitis-B-virus (HBV) ja deltahepatitisvirus (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein-Barr-viruksen (EBV) aiheuttamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiir- 1 1 • · · 5 105279
J
topotilaissa. Tarttuminen ihmisestä simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että ΝΆΝΒΗ:n syy on tarttuva infektioaiheuttaja tai -aiheuttajat.
5 Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että r voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja satunnaisesti esiintyvä (yhteisön hankkima * community acquired) tyyppi. Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa 10 NANBH:n on tuntematon.
On olemassa lukumäärä NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi selontekoja Prince (1983), Feinstone ja Hoofnagle (1984) ja Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikkelia.
15 Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä ehdokkaista edustaisi NANBV:n etiologista aiheuttajaa.
Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kantajien ja NANBV:n saastuttaman veren tai verituotteiden seulomiseksi 20 tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:lla verensiirron saaneista potilaista ja NANBH:n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääongelma tässä taudissa on sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioiksi (25-55 25 %) .
Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai • · ··· verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin väli- • · · .:. tyksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä _ : .·. 30 NANBV:hen liittyvien nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-• · · · aineiden havaitsemiseksi.
• · • · * · · ·
Menetelmät spesifisten polynukleotidien havaitsemiseksi hybridisaatioanalyyseillä ovat tunnettuja alalla. Katso ·: 35 esimerkiksi Matthews and Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169.-1: Landegren et ai. (1988), Science 242:229: ja Mittlin (1989), Clinical Chem. 25.:1819. US-patentti 4,868,105, myönnetty 09.09.1989 ja EP-julkaisu 225,807 (julkaistu 16.06.1987).
• · · • 9 · 9 · 9 * * « 105279
Hakija on keksinyt uuden viruksen, hepatitis-C-viruksen (HCV), jonka on osoitettu olevan pääasiallinen veren kautta syntyneen NANBV:n (BB-NANBH) etiologinen aiheuttaja. Hakijan alkuperäinen työ sisältäen prototyyppi-HCV-eristeen, CDC/HCV1 s (myös kutsutaan HCVl:ksi), osittaisen genomisekvenssin, on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216 (julkaistu 31.05.1989) ja PCT-julkaisussa No. WO 89/04669 (julkaistu 01.06.1989).
Näiden patenttihakemusten ja myös minkä tahansa vastaavan kansallisen hakemuksen sisältö liitetään tähän viitteeksi. ίο Nämä hakemukset opettavat mm. yhdistelmä-DNA-menetelmiä HCV-sekvenssien kloonaamiseksi, HCV:n koetindiagnostisia tekniikoita, HCV: n vastaisia vasta-aineita ja menetelmiä uusien HCV-sekvenssien eristämiseksi.
is Tämä keksintö perustuu osittain HCV-sekvensseihin, joita on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216 ja PCT-julkaisussa No. WO 89/04669 ja myös muihin HCV-sekvensseihin, joita tässä kuvataan. Menetelmiä spesifisten polynukleotidien eristämiseksi ja/tai havaitsemiseksi hybridisaatiolla ei olisi voitu käyt-20 tää HCV:n seulomiseen ennenkuin keksijät olivat keksineet HCV:n.
Keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 mukainen poly-nukleotidi, joka voi hybridisoitua analyytin polynukleotidi-25 säikeen HCV-sekvenssiin, jolloin polynukleotidi käsittää /1' ainakin kahdeksan nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta tai sen • · · • ;*· komplementin.
• · · · • · .···, 30 Toinen keksinnön kohde on menetelmä HCV-sekvenssin osoit- « · · * tamiseksi analyyttisäikeessä, jonka epäillään sisältävän HCV- ... polynukleotidin, missä HCV-polynukleotidi käsittää valitun • · * kohdealueen, menetelmän käsittäessä sen, että analyyttisäie • · *··* tuodaan kosketukseen polynukleotidin kanssa joka käsittää 35 ainakin kahdeksan nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on • · peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplemen- • · · tin, analyyttisäie inkuboidaan polynukleotidin kanssa ’···* spesifisten, polynukleotidin ja analyyttisäikeen välisten • · * • ·« t · 7 105279 hybrididupleksien muodostamiseksi, ja spesifiset hybridi-dupleksit todetaan.
Keksinnön vielä muu kohde on menetelmä HCV-vapaan veren s valmistamiseksi, käsittäen sen, että: (a) otetaan analyyttinukleiinihappoja verinäytteestä, minkä epäillään sisältävän HCV:n kohdesekvenssin; (b) otetaan oligomeeriä, mikä kykenee hybridisoitumaan HCV-sekvenssiin analyytin polynukleotidisäikeessä, missä oligo- lo meeri muodostuu HCV:n kohdistuvasta sekvenssistä, mikä on komplementaarinen ainakin kahdeksalle nukleotidille, mitkä ovat läsnä HCV:n RNA:n säilyvässä HCV:n nukleotidisekvens-sissä; (c) annetaan (a):n reagoida (b):n kanssa olosuhteissa, mitkä is sallivat polynukleotididupleksin muodostumisen kohdistuvan sekvenssin ja kohdesekvenssin välille, jos sellainen on olemassa; (d) osoitetaan dupleksi, mikä on muodostunut kohdassa (c), jos sellainen on olemassa; ja 20 (e) säilytetään veri, josta komplekseja ei havaittu vaiheessa (d) .
Kuvio 1 esittää HCV:n cDNA:n sekvenssiä kloonissa 12f ja siihen kooditettuja aminohappoja.
25
Kuvio 2 esittää HCV:n cDNArn sekvenssiä kloonissa k9-l ja Ψ siihen kooditettuja aminohappoja.
• · • · · f f · i·· ·
Kuvio 3 esittää HCV:n cDNA:n sekvenssiä kloonissa 15e ja 30 siihen kooditettuja aminohappoja.
- · · · % · ... Kuvio 4 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa • · **". 13i ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka • · ’··* menevät päällekkäin kloonin 12f kanssa.
f« t : · : 35
9 I
Kuvio 5 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa • « « 26j ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka • « menevät päällekkäin kloonin 13i kanssa.
9 9 9 • I · • · e 105279
Kuvio 6 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA59a ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonien 26j ja K9-1 kanssa.
5 Kuvio 7 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA84a ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CA59a kanssa.
Kuvio 8 esittää HCVm cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 10 CA156e ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CA84a kanssa.
Kuvio 9 esittää HCV:n cDNAtn nukleotidisekvenssiä kloonissa CA167b ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka 15 menevät päällekkäin kloonin CA156e kanssa.
Kuvio 10 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA216a ja siihen kooditettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CA167b kanssa.
20
Kuvio 11 esittää HCV:n cDNAtn nukleotidisekvenssiä kloonissa CA290a ja siihen kooditettuja aminohappoja ja päällekkäisyyttä kloonin CA216a kanssa.
25 Kuvio 12 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa ag30a ja päällekkäin menemistä kloonin CA290a kanssa.
• · ··· Kuvio 13 esittää HCV:n cDNAtn nukleotidisekvenssiä kloonissa • · 1 CA205a ja päällekkäin menemistä HCV:n cDNAtn sekvenssin kanssa « ' · .·. 30 kloonissa CA290a.
• « · ··» · * · ... Kuvio 14 esittää HCV:n cDNAtn nukleotidisekvenssiä kloonissa • · 1 18g ja päällekkäin menemistä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonissa ag30a.
35 • · · v : Kuvio 15 esittää HCV:n cDNAtn nukleotidisekvenssiä kloonissa 16 jh, siihen kooditettuja aminohappoja ja nukleotidien päällekkäisyyttä HCV:n cDNAtn sekvenssin kanssa kloonissa 15e.
9 105279
Kuvio 16 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 6k, siihen kooditettuja aminohappoja ja nukleotidien päällekkäisyyttä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonissa 16jh.
5 Kuvio 17 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa pl31jh, siihen kooditettuja aminohappoja ja nukleotidien päällekkäisyyttä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonissa 6k.
Kuvio 18 esittää kootun HCV:n cDNA-sekvenssin, joka on peräisin 10 tässä kuvatuista ja kootusta HCV:n cDNA-sekvenssistä, joka on esitetty EP-julkaisussa No. 318,216. Kloonit, joista sekvenssi on peräisin, ovat 5'-klooni 32, bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (jota kutsutaan myös nimellä k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 15 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a ja 16jh. Kuviossa kolme vaakasuoraa katkoviivaa sekvenssin päällä merkitsee oletetun initiaat-torimetioniinikodonin asemaa. Kuviossa on myös esitetty yhdistelmä-HCV:n cDNA:ssa kooditetun oletetun polyproteiinin 20 aminohapposekvenssi. HCVl:n kloonatuissa cDNA:oissa olevia heterogeenisyyksiä merkitsevät aminohapot, jotka on merkitty yllä suuren ORF.*n oletetun kooditetun sekvenssin päällä; sulut merkitsevät, että heterogeenisyys havaittiin kloonissa olevassa HCV:n cDNA:n 5'- tai 3'-päässä tai sen lähellä.
25
Kuvio 19 esittää sieppaus- ja leimakoettimien sekvenssejä HCV:n |'·/· RNA:n osoittamiseksi biologisissa näytteissä.
9 9 9 9 9 9 9 9 .:· Kuvio 20 esittää kaaviomaista kohdakkaisuutta flaviviruspolypro- • ··· : .*. 30 teiinissa ja oletetussa HCV-polyproteiinissa, mikä on kooditettu HCV-genomin pääasialliseen ORF:ään. Kuviossa on merkitty myös « · .... mahdolliset flaviviruspolypeptidien, mitkä on lohkaistu • · · flaviviruspolyproteiinista, toiminnot. Lisäksi on merkitty HCV-polypeptidien, ΝΑΝΒ^,.,ιη ja C100:n suhteelliset sijainnit • * * *; * 35 oletetun HCV-polyproteiinin suhteen.
• · · 9 9 9 9 • * * 10 105279
Kuvio 22 esittää HCV:n cDNA-insertin kloonissa 81 kaksisäikeisen nukleotidisekvenssin ja siihen kooditetun polypeptidin oletetun aminohapposekvenssin.
5 Kuvio 23 esittää HCV:n cDNA-sekvenssin kloonissa 36, segmentin mikä menee päällekkäin kloonin 81 NANBV:n cDNA:n kanssa ja polypeptidisekvenssin, mikä on kooditettu klooniin 36.
Kuvio 24 esittää HCV: n cDNA-sekvenssin kloonissa 37b, segmentin 10 mikä menee päällekkäin kloonin 35 kanssa ja siihen kooditetun polypeptidin.
Kuvio 25 esittää HCV:n cPCR-analyysin autoradiografit RNA: sta, joka on peräisin NANBH:ta sairastavien simpanssien maksanäytteis-15 tä (Kuvio 25A) ja italialaisista potilaista, joilla on NANBH (Kuvio 25B).
Kuviot 26A ja 26B ovat graafisia kuvaajia, mitkä esittävät ajallista suhdetta maksavaurion esiintymisen, HCV:n RNA:n 20 läsnäolon ja anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon välillä kahdella simpanssilla, joilla oli NANBH.
Kuvio 27 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssin kloonissa CA84a, aminohapot, mitkä on kooditettu siihen ja sekvenssit 25 mitkä menevät päällekkäin kloonin CA59a kanssa.
; 'S Kuvio 28 esittää HCV:n cDNA-sekvenssin kloonissa 40b, segmentin ·:1 mikä menee päällekkäin kloonin 37b kanssa ja siihen kooditetun «Il ··· polypeptidin.
• · 1 · : 30 • · · · r
Kuvio 29 on autoradiografi, mikä esittää HCV-genoraien suunnilleen « » ...# 300, 30 ja 3 CID:n leimattuja, monistettuja tuotteita.
• · ·
Kuvio 32 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 35 40a.
• · · • · · * I 1 · · • · · I I · ' · · « 1 · • · • · · • · 1 u 105279
Kuvio 33 on autoradiografi, mikä esittää monistettuja tuotteita, jotka lähtevät alukkeista, jotka ovat peräisin HCV-genorain säilyviltä alueilta.
5 Kuvio 34 esittää HCV:n cDNA-sekvenssin kloonissa 35, segmentin t mikä menee päällekkäin kloonin 36 kanssa ja siihen kooditetun polypeptidin.
»
Kuvio 37 on kaavio, mikä esittää sellaisten koettimien ja 10 alukkeiden suhteen, mitkä ovat peräisin 5'-alueelta HCVsn RNA;sta, josta HCV:n cDNAst klooneissa ag30a ja k9-l ovat peräisin.
Kuvio 38 on autoradiografi monistetuista tuotteista, jotka 15 jatkuvat alukkeiden sarjoista, jotka ovat peräisin ag30a:sta ja k9-l:stä.
Kuvio 39 esittää ihmisen eristeiden 23 ja 27 ja HCVlsn kohdakkaiset nukleotidisekvenssit. Homologisia sekvenssejä on 20 merkitty symbolilla (1) . Ei-homologiset sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla.
Kuvio 40 esittää ihmisen eristeiden 23 ja 27 ja HCVlzn kohdakkaiset aminohapposekvenssit. Homologisia sekvenssejä on 25 merkitty symbolilla (1) . Ei-homologiset sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla.
« • ·
Kuvio 41 esittää puoli sävykopiota autoradiografi s ta, joka on ··· saatu Northern blot-menetelmällä RNA: sta, mikä on eristetty • · · : 30 BB-NANBV-infektoituneen simpanssin maksasta, jolloin koettimena käytettiin BB-NANBV:n cDNA: ta kloonista 81.
• «« • · · » · ·
Kuvio 43 esittää puolisävykopiota autoradiografista, joka on . . saatu nukleiinihapoista, mitkä on uutettu NANBV-partikkeleista, « · 1 35 jotka on siepattu infektoituneesta plasmasta anti-NANB5.M :11a '·1 ' ja käyttäen koettimena 32P-leimattua NANBV:n cDNA:ta kloonista ·:··: 81.
« · · • · • · « • · • ·« 12 105279
Kuvio 44 esittää autoradiografien kopioita filttereistä, jotka sisältävät eristettyjä NANBV-nukleiinihappoja, koettimena oli 3ZP-leimattuja plus- ja miinussäikeisiä DNA-koettimia, jotka olivat peräisin NANBV:n cDNA:sta kloonissa 81.
5
Kuvio 46 esittää ihmisen eristeen 23 nukleotidien yhteensopivaa sekvenssiä, muunnossekvenssit on esitetty sekvenssilinjan alapuolella. Aminohapot, mitkä on kooditettu yhteensopivaan sekvenssiin, on myös esitetty.
10
Kuvio 48 on graafinen kuvaaja, mikä esittää EnvL- ja EnvR-alukkeiden suhteen roalliflaviviruksen polyproteiiniin ja oletettuun HCV-polyproteiiniin.
15 Kuvio 49 esittää eristeiden Thorn, EC1, HCT #18 ja HCV1 yhdistetyn kohdakkaisten nukleotidisekvenssien vertailun.
Kuvio 50 esittää vertailun EC10:n nukleotidisekvenssin ja HCVltn sekvenssin yhdistelmän välillä; EClO-sekvenssi on pisteiden 20 yläpuolisella viivalla ja HCV1-sekvenssi on pisteiden alapuolisella viivalla.
Kuvio 51 esittää aminohapposekvenssien 117-308 vertailun (HCVl:n suhteen), mitkä sekvenssit on kooditettu ihmisen eristeiden 25 HCT #18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCVl:n yhdistelmäsekvenssien "EnvL"-alueilla.
·· Kuvio 52 esittää aminohapposekvenssien 330-360 vertailun (HCVl:n * « · .:· suhteen), mitkä sekvenssit on kooditettu ihmisen eristeiden : .·. 30 HCT #18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCVl:n yhdistelmäsekvenssien • · · "EnvR"-alueilla.
« « • « · • # ·
Kuvio 53 esittää yksittäisten alukkeiden nukleotidisekvenssit alukeseoksessa 5'-3.
:./ 35 v Termi "hepatitis-C-virus" (HCV) on varattu alalla tähän asti ...··! tuntemattomalle NANBV.1n etiologiselle aiheuttajalle. HCV:n prototyyppi eri s te on identifioitu US-patenttihakerauksessa 122,714
I i i K
• »V • · • · · I ♦ · • · » 13 105279 (ks. myös EP-julkaisu 318,216). Termi HCV sisältää myös saman viruslajin uudet eristeet. Tämän terminologian jatkona kutsutaan HCV: n aiheuttamaa tautia, mitä aikaisemmin kutsuttiin veriperäiseksi NANB-hepatitikseksi (BB-NANBH), hepatitis C:ksi. 5 Termejä NANBH ja hepatitis C voidaan käyttää tässä keskenään vaihdellen.
HCV on viruslaji, jonka patogeeniset kannat aiheuttavat BB-NANBH :n. Saattaa myös olla heikennettyjä kantoja tai puutteel-10 lisiä häiritseviä partikkeleita, jotka ovat siitä peräisin. Kuten esitetään alla, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että RNA:ta sisältävillä viruksilla on suhteellisen korkeat spontaanien mutaatioiden nopeudet, s.o. on raportoitu suuruusluokkaa 10'3 - 10‘4 nukleotidia kohti olevista nopeuksista 15 (Fields & Knipe (1986)). Siksi koska genotyypin heterogeenisyys ja fluidisuus ovat olennainen osa RNA-viruksia, on HCV-lajien joukossa monia kantoja/eristeitä, jotka voivat olla virulentteja tai avirulentteja. Tässä kuvatut koostumukset ja menetelmät tekevät mahdolliseksi eri HCV-kantojen tai eristeiden 20 lisääntymisen, määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen.
Useita erilaisia HCV:n kantoja/eristeitä on identifioitu. (Ks. alla) . Yksi sellainen kanta tai eriste, mikä on prototyyppi, on nimetty CDC/HCVl:ksi (jota myös kutsutaan HCVltksi). Tieto 25 yhdestä kannasta tai eristeestä, kuten osittainen genomisek-venssi, on riittävä salliakseen alan ammattilaisten käyttää . .: standardeja tekniikoita uusien kantojen/eristeiden eristämiseen 9 ja sen identifioimiseen, ovatko sellaiset uudet kannat/eristeet HCV:tä. Esimerkiksi useita erilaisia kantoja/eristeitä kuvataan : 30 alla. Nämä kannat, joita saadaan lukuisista ihmisen seerumeista ··· « (ja erilaisilta maantieteellisiltä alueilta), eristettiin käyttäen tietoa HCVl:n genomisekvenssistä.
· .·, ; Käyttäen EP-julkaisussa 318,216 ja alla kuvattua tekniikkaa < «t !./ 35 on päätelty HCVl:n genomi-RNAsn genomirakenne ja nukleotidisek- venssi. Genomi näyttää olevan yksisäikeistä RNA:ta sisältäen n. 10000 nukleotidia. Genomi on positiivissäikeistä ja sillä on jatkuva translationaalinen avoin luentakehys (ORF), mikä • »· • · f · Φ » · 1 4 4 « « I 4 · • · 14 105279 koodittaa noin 3000 aminohapon polyproteiinia. ORF:ssä rakenneproteiini (t) näyttävät olevan kooditettuja suunnilleen N-pään alueen ensimmäisessä neljänneksessä, pääosan polyproteii-nista ollessa vastuussa ei-rakenneproteiineista. Verrattuna 5 kaikkiin tunnettuihin virussekvensseihin, pientä mutta merkittävää kolineaarista homologiaa havaitaan flavivirusperheen ei-rakenneproteiinien kanssa ja pestiviruksien kanssa (joita pidetään myös osana Flavivirus-perhettä).
10 Flaviviruspolyproteiinin (käyttäen keltakuumevirusta esimerkkinä) ja oletettujen polyproteiinien, jotka on kooditettu HCV:n genomin pää-ORF:ssä mahdollisten alueiden kaaviollinen kohdakkaisuus on esitetty kuviossa 20. Kuviossa on merkitty HCV-polyproteiinin mahdolliset alueet. Flaviviruksen polyproteiini sisältää, 15 aminopäästä karboksipäähän, ydinkaseliproteiinin (C), matriisiproteiinin (M), kuoriproteiinin (E) ja ei-raken-neproteiinit (NS) 1, 2 (a+b), 3, 4 (a+b) ja 5. Perustuen HCV1:n nukleotidisekvenssissä kooditettuihin oletettuihin aminohappoihin, pieni alue HCV-polyproteiinin äärimmäisessä N-päässä 20 näyttää samanlaiselta sekä kooltaan että emäksisten tähteiden korkealta pitoisuudelta ydinkapseliproteiinille (C), mikä on löydetty flaviviruspolyproteiinien N-päästä. HCV:n ja keltakuumeviruksen (YFV) ei-rakenneproteiineilla 2, 3, 4 ja 5 (NS2-5) näyttää olevan saman kokoiset ja hydropaattisuudeltaan 25 samanlaiset vastaosat, vaikka aminohapposekvensseissä onkin poikkeavuuksia. Kuitenkin HCV:n se alue, mikä vastaisi YFV- • ·': polyproteiinin alueita, mikä sisältää M-# E- ja NS1-proteiinia, • · ei eroa vain sekvenssiltä, vaan myös näyttää olevan melko ·#« .:. erilainen sekä kooltaan että hydropaattisuudeltaan. Täten, vaikka :**.1·. 30 tiettyihin HCV-genomin alueisiin voidaan viitata tässä • · · ***tj esimerkiksi NSl:nä tai NS2:na, tulisi pitää mielessä, että nämä • · merkitykset ovat spekulatiivisia; HCV-perheen ja flaviviruksien « « · välillä voi olla huomattavia eroja, joille ei ole vielä annettu arvoa.
• · \v: 35 v : HCV:n eri kantojen, eristeiden ja alatyyppien odotetaan sisältävän vaihteluita aminohapoissa ja nukleiinihapoissa ,···. verrattuna HCVl:een. Monien eristeiden odotetaan osoittavan • · · • · • · · » i · ♦ 1» 15 105279 suurta (s.o. suurempaa kuin 40 %) horoologiaa kokonaisarainohap-posekvenssissä verrattuna HCVl:een. Kuitenkin voidaan myös havaita muita sitä vähäisemmän homologian HCV-eristeitä. Nämä voitaisiin määrittää HCV-kantoina eri kriteereiden mukaan, kuten 5 ORF:nä, jossa on noin 9000 nukleotidia - noin 12000 nukleotidia, koodittaen polyproteiinia, joka on kooltaan samanlainen kuin HCV1, kooditettuna polyproteiinina, jolla on samanlainen hydrofobinen ja antigeeninen luonne kuin HCV1 :llä, ja yhteisllneaaristen peptidisekvenssien läsnäolona, jotka säilyvät HCVl:n kanssa. 10 Lisäksi uskotaan, että genomi olisi positiivissäikeistä RNA: ta.
Kaikki HCV-eristeet koodittavat ainakin yhtä epitooppia, joka on imrounologisesti identifioitavissa (s.o. immunologisesti ristireagoiva) sen epitoopin kanssa, mikä on kooditettu tässä 15 kuvatuissa HCV:n cDNA:oissa. Mielellään epitooppi sisältyy tässä kuvattuun aminohapposekvenssiin ja on ainutkertainen HCV:lle, kun sitä verrataan aikaisemmin tunnettuihin patogeeneihin. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää sen immunologisella reaktiivisuudella HCV:n vastaisten vasta-aineiden kanssa ja 20 immunologisen reaktivisuuden puuttumisena tunnettujen patogeenien vasta-aineiden kanssa.
HCV-kannat ja eristeet ovat kehitysopillisesti sukulaisia. Siksi odotetaan, että genomien kokonaishomologia nukleotiditasolla 25 on todennäköisesti noin 40 % tai enemmän, todennäköisesti noin 50 % tai enemmän, todennäköisesti noin 60 % tai enemmän ja vielä « * *' todennäköisemmin noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä f · · on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sekvenssejä. Tulisi panna merkille, että kuten esitetään alla, HCV-genomi s sa » · : 30 on vaihtelevia ja hypervaihtelevia alueita; tästä syystä näillä :··; olueilla odotetaan homologian olevan merkittävästi vähemmän kuin kokonaisgenomissa. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin * · ja CDC/CH1 cDNA-sekvenssin välinen vastaavuus voidaan määrittää ,·, : alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkiksi ne voidaan määrittää « · · !..* 35 vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sekvenssi- \ tietoa ja tässä kuvattuja HCV;n cDNA-sekvenssejä. Ne voidaan · myös määrittää hybridisoimalla polynukleotideja olosuhteissa, jotka muodostavat stabiileja duplekseja homologisten alueiden lii f · • · * i · • · « ♦ * I * * f · ie 105279 välille (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen S,-pätkimistä), mitä seuraa pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pätkittyjen fragmenttien koon määritys.
5 HCV-kantojen kehitykseen liittyvän suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tai eristeet tunnistaa niiden polypeptiditasolla. Yleisesti HCV-kantojen tai eristeiden odotetaan olevan ainakin 40 % homologisia, enemmän kuin noin 50 % homologisia, 10 todennäköisesti enemmän kuin noin 70 % homologisia ja vielä todennäköisemmin enemmän kuin noin 80 % homologisia ja jotkut voivat olla enemmän kuin noin 90 % homologisia polypeptidi-tasolla. Tekniikat aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. Esimerkiksi aminohapposekvenssi 15 voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä annettuihin sekvensseihin. Vaihtoehtoisesti oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan määrittää (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta), siinä kooditettu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita 20 voidaan verrata.
Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta sekvenssistä viittaa polynukleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta ainakin noin 6 nukleotidin sekvenssistä, mieluummin 25 ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin 10-12 nukleotidin ja vieläkin mieluummin ainakin noin 15-20 nukleotidin sekvenssistä, mikä vastaa merkityn nukleotidi sekvenssin aluetta.
• · · • ·1 "Vastaaminen" merkitsee homologista tai komplementaarista annetulle sekvenssille. Mieluummin alueen sekvenssi, josta ,.1·1 30 polynukleotidi on peräisin, on homologinen tai komplementaarinen j.: j sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. Mieluummin ·:··: johdettu sekvenssi on homologinen tai komplementaarinen :1·1; sekvenssille, mikä on ainutkertainen kaikille tai suurelle osalle HCV-eristeistä. Olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille .·. :35 tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan * · · ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan
I I I
*. verrata tietopankkien, esimerkiksi Genebank'in sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattoroassa isännässä • · • · f • I · • · • · • » t · t · · t « « „ 105279 tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja hepatitiksen aiheuttajia, esimerkiksi HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviridae-perheen jäseniin.
5 Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden sekvenssien välillä voidaan määrittää myös hydridisäätiön avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybridisaatiotekniikat nukle-iinihapposekvenssienkomplementaarisuudenmäärittämiseksi ovat tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan alla. Katso myös 10 esimerkiksi julkaisua Maniatis et ai. (1982) . Lisäksi hybridissä-tiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimattomuus voidaan määrittää tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi pätkimisen nukleaasilla, kuten SI :llä, joka spesifisesti katkoo yksisäikeisiä alueita dupleksipolynukleotideissa. Alueet, joista 15 tyypillisiä DNA-sekvenssejä voidaan "johtaa", sisältävät, mutteivät ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jotka koodittavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei-transkriptoituja ja/tai ei-transloituja alueita.
20 Johdettu polynukleotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidisekvenssistä, mutta se voidaan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai DNA:n repiikoiraisen tai käänteisen transkription tai transkription. Lisäksi niiden alueiden yhdistelmiä, jotka 25 vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään alalla vastaavan aiottua käyttöä.
• · ! 1.· Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee polynukleotidia, joka on peräisin genomista, cDNA:sta, se on 30 semiynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka alkuperänsä : tai manipulaationsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin poly- • 1 · · ;··· nukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy luonnossa; ' .'Γ. (2) on liitetty polynukleotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty luonnossa tai (3) se ei esiinny luonnossa.
. .35 14«
• « I
Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa \ ’ pituisten nukleotidien, joko ribonukleotidien tai deoksiri- bonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi viittaa vain * 1 · • « * · • 9 18 105279 molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikeisen DNA .-n ja RNA:n. Se sisältää myös tunnetut modifioidut tyypit, esimerkiksi leimat, jotka tunnetaan alalla, roetylaation, "hännästäni! s en”, yhden tai useamman luonnossa 5 esiintyvän nukleotidin substituution analogilla, nukleotidien väliset muunnokset, kuten esimerkiksi ne, joissa on varauksettomia liittymiä (esim. metyylifosfonaatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisia liittymiä (esim. fosforotioaatit, fosforoditioaatit jne.) ne jotka 10 sisältävät vastikepuoliskoja, kuten esimerkiksi proteiinit (sisältäen esimerkiksi nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipeptidit, poly-L-lysiinin jne.), ne joissa on välikerrostajia (esim. akridiini, psoraleeni jne.), ne jotka sisältävät kelaattoreita (esim. metallit, radioaktiiviset 15 metallit, boori, hapettavat metallit jne.), ne jotka sisältävät alkyloivia aineita, ne joissa on muunnettuja liitoksia (esim. alfa-anoraeeriset nukleiinihapot jne.) ja myös polynukleotidien raodifioiraattomat muodot.
20 Tässä käytettynä nukleiinihapon "sense-säie” sisältää sekvenssin, jolla on sekvenssihomologiaa mRNA:n sekvenssin kanssa. "Antisense-säie" sisältää sekvenssin, joka on "sense-säikeelle" komplementaarinen.
25 Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodittaa viruspolypeptidejä. Esimerkit positiivisen * I säikeen RNA-viruksista sisältävät Togaviridae, Coronaviridae, • · ·
Retroviridae, Picornaviridae, ja Caliciviridae. Mukaan sisältyvät * 1 1 30 myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin * · : Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986).
* · : Tässä käytettynä "aluke" viittaa oligoraeeriin, mikä kykenee toimimaan polynukleotidisäikeen synteesin aloituspisteenä, kun :\:35 se asetetaan sopiviin olosuhteisiin. Aluke on täysin tai • · olennaisesti komplementaarinen kopioitavan polynukleotidisäikeen • . alueelle. Täten hybridi säätiöön johtavissa olosuhteissa aluke • ’ liittyy analyyttisäikeen komplementaariseen alueeseen. Lisäämällä • 9 _ · · • · · f • t · • · • « „ 105279 sopivia reagoivia aineita (esim. polyineraasi, nukleotiditrifos-fataasit ja sen kaltaiset) aluke ulottuu polymerointiaineen takia muodostamaan analyyttisäikeen kopion. Aluke voi olla yksisäikeinen tai vaihtoehtoisesti se voi olla osittain 5 kaksisäikeinen.
Termit "analyyttipolynukleotidi" ja "analyyttisäie" viittaavat yksi- tai kaksisäikeiseen nukleiinihapporoolekyyliin, jonka epäillään sisältävän kohdesekvenssin ja jota voi olla läsnä 10 biologisessa näytteessä.
Tässä käytettynä termi "oligomeeri" viittaa alukkeisiin ja koettimiin. Termi oligomeeri ei merkitse molekyylin kokoa. Kuitenkin tyypilliset oligomeerit eivät ole suurempia kuin 1000 15 nukleotidia, tyypillisemmin ne eivät ole suurempia kuin 500 nukleotidia, vielä tyypillisemmin ne eivät ole suurempia kuin 250 nukleotidia; ne voivat olla alle 100 nukleotidin kokoisia, ja ne voivat olla alle 75 nukleotidin kokoisia ja myös ne voivat olla alle 50 nukleotidia pituudeltaan.
20 Tässä käytettynä "koetin" viittaa rakenteeseen, mikä käsittää polynukleotidin, joka muodostaa hybridirakenteen kohdesekvenssin kanssa johtuen ainakin yhden sekvenssin komplementaarisuudesta koettimessa kohdealueen sekvenssin kanssa. Koettlmien 25 polynukleotidialueet voivat muodostua DNA:sta ja/tai RNA:sta ja/tai synteettisistä nukleotidianalogeista. Koettimiin . . sisältyvät "sieppauskoettimet" ja "leimakoettimet". Koetin ei • · · * mieluummin sisällä sekvenssiä, mikä on komplementaarinen • · · sekvenssille/sekvensseille, joita käytetään alottamaan ...: 30 polymeraasiketjureaktio (PCR).
v # ·*♦ • · · ·»· · *:··: Tässä käytettynä termi "kohdealue" viittaa nukleiinihapon ’ :T: alueeseen, joka on araplifioitava ja/tai osoitettava. Termi "kohdesekvenssl" viittaa sekvenssiin, jonka kanssa koetin tai ;'. :35 aluke muodostaa stabiilin hybridin halutuissa olosuhteissa.
• · 9 · m * · · Tässä käytettynä termi "sieppauskoetin" viittaa polynukleotidiin, joka muodostuu yksisäikeisestä polynukleotidista, mikä on • · « · · f · • ♦ 105279 20 kytketty sidospartneriin. Yksisäikeinen polynukleotidi muodostuu kohdistuvasta polynukleotidisekvenssistä, mikä on komplementaarinen kohdealueen kohdesekvenssille, mikä tulee osoittaa analyyttipolynukleotidissa. Tämä komplementaarinen alue on 5 riittävän pitkä ja komplementaarinen kohdesekvenssille aikaansaadakseen niin stabiilin dupleksin, joka on riittävä imraobilisoimaan analyyttipolynukleotidin kiinteälle pinnalle (sidospartnereiden kautta). Sidospartneri on spesifinen toiselle sidospartnerille; toinen sidospartneri voidaan sitoa kiinteän 10 kantajan pinnalle tai se voidaan liittää epäsuorasti muiden rakenteiden tai sidospartnereiden kautta kiinteälle kantajalle.
Termi "kohdistuva polynukleotidisekvenssi" viittaa tässä käytettynä polynukleotidisekvenssiin, mikä muodostuu nuk-15 leotidelsta, mitkä ovat komplementaarisia kohdenukleotidisekvenssille; sekvenssi on riittävän pitkä ja komplementaarinen kohdesekvenssin kanssa muodostaakseen dupleksin, mikä on riittävän stabiili aiottuun tarkoitukseen.
20 Termi "sidospartneri" tässä käytettynä viittaa molekyyliin, mikä kykenee sitomaan ligandimolekyylin suurella spesifisyydellä, kuten esimerkiksi antigeeni ja sille spesifinen vasta-aine. Yleisesti täytyy spesifisten sidospartnereiden sitoutua riittävällä affiniteetilla analyyttikopion/komplementaarisen 25 säiedupleksin immobilisoimiseksi (sieppauskoettimien tapauksessa) eristysolosuhteissa. Spesifiset sidospartnerit ovat alalla • * [ tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi biotiinin ja avidiinin •j* tai streptavidiinin, IgG:n ja proteiini A:n, lukuisat tunnetut ·· reseptori-ligandiparit ja kömpiementaariset polynukleotidisäi- • t · : ;*j)0 keet. Komplementaaristen polynukleotidi-sidospartnereiden IM · ....: tapauksessa ovat partnerit normaalisti ainakin noin 15 emästä pitkiä ja ne voivat olla ainakin 40 emästä pitkiä; lisäksi niiden # · -
Gs- ja Cs-pitoisuus on ainakin noin 40 % ja jopa noin 60 %.
. . Polynukleotidit voivat muodostua DNA: sta, RNA:sta tai synteet-
t I I
'; *35 tisistä nukleotidianalogeista.
• · · ·;·· Termi "kytketty" tässä käytettynä viittaa kovalenttisilla sidoksilla kiinnittymiseen tai vahvoihin ei-kovalenttisiin • · 21 105279 keskinäisiin vaikutuksiin (esim. hydrofobiset vaikutukset, vetysidokset jne.). Kovalenttiset sidokset voivat olla esimerkiksi esteri-, eetteri-, fosfoesteri-, amidi-, peptidi-, imidi-, hiili-rikkisidoksia, hiili-fosforisidoksia ja sen 5 kaltaisia.
Termi "kantaja" viittaa mihin tahansa kiinteään tai puolikiin-teään pintaan, jolle haluttu sidospartneri voidaan ankkuroida. Sopivat kantajat sisältävät lasin, muovin, metallin, polymeeri-10 geelit ja sen kaltaiset ja niillä voi olla alustojen, kuoppien, kastettavien tikkujen, kalvojen ja sen kaltaisten muoto.
Tässä käytettynä termi "leima" viittaa mihin tahansa atomiin tai puoliskoon, mitä voidaan käyttää antamaan havaittavan 15 (mieluummin määrällisesti määritettävän) signaalin ja mikä voidaan kiinnittää polynukleotidiin tai polypeptidiin.
Tässä käytettynä termi "leimakoetin" viittaa oligomeeriin, mikä muodostuu kohdistuvasta polynukleotidisekvenssistä, mikä on 20 komplementaarinen analyyttipolynukleotidissa olevalle osoitettavalle kohdesekvenssille. Tämä komplementaarinen alue on riittävän pitkä ja komplementaarinen kohdesekvenssille aikaansaadakseen dupleksin, mikä muodostuu "leimakoettimesta" ja leimalla osoitettavasta "kohdesekvenssistä". Oligomeeri 25 kytketään leimaan joko suoraan tai epäsuorasti ligandiroolekyylien sarjan kautta suurella spesifisyydellä toisilleen. Ligan-dimolekyylien sarjoja, joilla on korkea spesifisyys, kuvataan yllä ja ne sisältävät myös roultimeerejä.
• · · * • · · ·1", 30 Termi "multimeeri" tässä käytettynä viittaa lineaarisiin tai * 1 1 · *’1 ! haarautuneesiin polymeereihin, joissa on sama toistuva ... yksisäikeinen polynukleotidiyksikkö tai erilaisia yksisäikeisiä • i i « '·' ' polynukleotidiyksiköitä. Ainakin yhdellä yksiköistä on sekvenssi, pituus ja koostumus, mikä sallii sen hybridisoituraisen • · 35 spesifisesti ensimmäisen yksisäikeisen kiinnostavan nuk- v : leotidisekvenssin kanssa, tyypillisesti analyytin tai oligoraeerin kanssa (esim. leimakoetin), mikä on sidottu analyyttiin.
,··. Sellaisen spesifisyyden ja stabiilisuuden aikaansaamiseksi on • · · · · · • 1
« » I
22 105279 tämä yksikkö normaalisti ainakin noin 15 nukleotidia pitkä, tyypillisesti ei enempää kuin noin 50 nukelotidia pitkä ja mieluummin noin 30 nukleotidia pitkä; lisäksi Gs- ja Cs-pitoisuus on normaalisti ainakin noin 40 % ja enimmillään noin 60 %. 5 Sellaisten yksikköjen lisäksi multimeeri sisältää monia yksiköitä, jotka kykenevät hybridisoitumaan spesifisesti ja stabiilisti toiseen yksisäikeiseen kiinnostavaan nukleotidiin, tyypillisesti leimattuun polynukelotidiin tai muuhun raul-timeeriin. Nämä yksiköt ovat yleensä noin samaa kokoa ja 10 koostumusta kuin yllä keskustellut multimeerit. Kun multimeeri on tarkoitettu hybridisoitavaksi toiseen multimeeriin, ensimmäinen ja toinen oligonukleotidiyksikkö ovat heterogeenisiä (erilaisia), eivätkä hybridisoidu toistensa kanssa valitun analyysin olosuhteissa. Täten multimeerit voivat olla 15 leimakoettimia tai ne voivat olla ligandeja, mitkä kytkevät leiman koettimeen.
Tässä käytettynä termi "virus-RNA", mikä sisältää HCV:n RNA:n, viittaa RNAshan viruksen genomista, sen fragmenteista, sen 20 transkripteista ja siitä peräisin olevista rautanttisekvensseistä.
Tässä käytettynä "biologinen näyte" viittaa kudos- tai nestenäytteeseen, joka on eristetty yksilöstä, sisältäen, muttei niihin rajoittuen esimerkiksi plasman, seerumin, selkä-25 ydinnesteen, imunesteen, ihon, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, kyyneleet, syljen,
• I
. '/· maidon, verisolut, kasvaimet, elimet ja myös la vitro ·:· soluviljelyosien näytteet (sisältäen, mutta ei niihin rajoittuen, ··· kuntoon laitetun viljelyväliaineen, joka on tulosta solujen • · · · : .·. 30 kasvusta solujen viljelyväliaineessa, oietut virusinfektoidut • · · · solut, yhdistelmäsolut ja solukomponentit) .
« · • · · • · · • · · ’ Tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytetään, ellei toisin ole mainittu, kemian, molekyylibiologian, mikrobiologian, • · · 35 yhdistelmä-DNA-tekniikan ja immunologian tavanomaisia teknii-*·' ' koita, jotka ovat alalla käytössä. Sellaisia tekniikoita
selvitetään täysin kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi seuraavia: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY
• · 23 105279 MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N. Glover toim. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Haines & S.J. Higgins toim. 1984); sarja, METHODS INENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.), erityisesti Voi. 5 154 ja Voi. 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.).
Kaikki patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään tähän mukaan * viitteeksi.
10 Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee mahdolliseksi HCV:n identifiointi BB-NANBV:n etiologisena aiheuttajana ja nukleotidisekvenssien perheen varaaminen, jotka on eristetty cDNA-kirjastoista, jotka sisältävät HCVsn cDNA-sekvenssejä. Nämä cDNA-kirjastot johdettiin infektoituneen 15 simpanssin plasmassa olevista nukleiinihapposekvensseistä. Yhden näistä kirjastoista, "c"-kirjaston (ATCC No. 40394) rakenne on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216.
Ylläkuvattuja HCV:n cDNA-sekvenssejä, ja myös tässä kuvattua, 20 käyttämällä voidaan rakentaa oligomeerejä, jotka ovat reagensseja, jotka ovat hyödyllisiä viruspolynukleotidien osoittamiseen biologisista näytteistä. Esimerkiksi sekvensseistä on mahdollista syntetisoida DNA-oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, jotka ovat hyödyllisiä 25 hybridisaatiokoettiraina HCV:n RNA:n osoittamiseksi esimerkiksi luovutetussa veressä, verifraktioissa, sellaisten kohteiden seerumissa, joiden epäillään kantavan virusta tai soluviljely- * · ·)· järjestelmissä, joissa virus replikoituu. Lisäksi tässä kuvatut M» uudet oligomeerit tekevät mahdolliseksi HCV-genomin lisäkarak- * ·”·. 30 terisoinnin. Näistä sekvensseistä peräisin olevia polynuk- « 9 "jj leotidikoettimia voidaan käyttää cDNA-kir jastoissa läsnä olevien • 9 sekvenssien monistamiseen ja/tai cDNA-kirjastojen seulomiseen • · · '·’ ’ päällekkäisten lisä-cDNA-sekvenssien varalta, joita vuorostaan voidaan käyttää saamaan päällekkäisiä sekvenssejä. Kuten 9 t 35 merkitään alla ja EP-julkaisussa 318,216, HCV:n genomi näyttää V : olevan RNA:ta, mikä muodostuu etupäässä suuresta avoimesta luentakehyksestä (ORP), joka koodittaa suurta polyproteiinia.
* « IM « 9 • · « · · f • · • · • M 1 · 9 9» 9 « 24 105279
Edellisen lisäksi tieto, joka annetaan alla, sallii lisä-HCV-kantojen tai -eristeiden identifioinnin. Lisä-HCV-kantojen tai eristeiden eristäminen ja määrittäminen voidaan suorittaa käyttäen alan ammattilaisille tuttuja tekniikoita, esimerkiksi 5 eristämällä nukleiiinihapot ruumiinosista, jotka sisältävät viruspartikkeleita ja/tai virus-RNA: ta, luoden cDNA-kir jastoja käyttäen alla kuvattuja oligomeerejä, seulomalla kirjastoja niiden kloonien varalta, jotka sisältävät alla kuvattavia HCV:n cDNA-sekvenssejä ja vertaamalla HCVrn cDNA:oita, jotka on kuvattu 10 EP-julkaisussa 318,216 ja alla. Kannat tai eristeet, jotka sopivat HCV:n parametreihin, kuten on kuvattu määritysosassa yllä, ovat helposti identifioitavissa. Muut HCV-kantojen identifioimismenetelmät ovat ilmeisiä alan ammattilaisille perustuen tässä annettuun tietoon.
15 HCV:n cDNA-sekvenssien eristäminen
Keksinnön oligomeerit sisältävät alueita, jotka muodostavat hybrididupleksirakenteita HCV-polynukleotidien kohteena olevien 20 sekvenssien kanssa. Oligomeerien HCV-polynukleotidien hybridisoituvat alueet voidaan vahvistaa tässä annetuista ja EP-julkaisussa 318,216 kuvatuista HCV:n cDNA-sekvensseistä.
HCV1:stä tuleva yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, prototyyppi HCV, on esitetty kuviossa 18. Thdistelmäsekvenssi perustuu 25 sekvenssitietoon, mikä on peräisin lukuisista HCV:n cDNA-klooneista, mitkä eristettiin lukuisista HCV:n cDNA-kirjastoista,
!V sisältäen "c"-kirjaston, joka oli läsnä lambda gtll:ssä (ATCC
/y No. 40394) ja ihmisen seerumista. HCV:n cDNA-kloonit eristettiin ·;· menetelmillä, mitkä on kuvattu EP- julkaisussa 318, 216. Lyhyesti : 30 pääosa klooneista, mitkä eristettiin, sisälsivät sekvenssejä * · · m "1 ....: HCV: n cDNA: n "c" -kirjastosta, mikä rakennettiin käyttäen varastoitua seerumia simpanssista, jolla oli krooninen HCV- » · · infektio ja mikä sisälsi korkean virustiitterin, s.o. ainakin . . 106 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ral). Varastoitua seerumia « · m 35 käytettiin viruspartikkeleiden eristämiseen; näistä partikkeleis- « · » X 1 ta eristettyjä nukleiinihappoja käytettiin mallina rakennettaessa *:·1: cDNA-kirjastoja virusgenomille. Lähtöklooni, 5-1-1, saatiin seulomalla "c"-kirjastoa seerumilla infektoituneista yksilöistä.
* · * I · • · • « 1 • · ! 25 105279 Lähtökloonin eristämisen jälkeen loput sekvenssistä saatiin seulomalla synteettisillä polynukleotidikoettimilla, joiden sekvenssit olivat peräisin 5' -alueelta ja 3' -alueelta tunnetusta HCV:n cDNA-sekvenssistä/sekvensseistä.
5 , Kuvaus menetelmistä cDNA-sekvenssi en saamiseksi on enimmäkseen historiallisesti kiinnostavaa. Tulokseksi saadut sekvenssit (ja niiden komplementit) annetaan tässä ja sekvenssejä tai mitä tahansa niiden osaa voitaisiin valmistaa käyttäen synteettisiä 10 menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmää saaden osittaisia sekvenssejä käyttäen menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin ne, joita on kuvattu EP-julkaisussa 318,216.
Ollqomeerikoettimet 1a -alukkeet 15 Käyttäen pohjana HCV-genomia (kuten kuvataan kuviossa 18) ja/tai mielellään HCV-genoroin säilyviä alueita voidaan valmistaa oligomeerejä, jotka ovat suunnilleen 8 nukleotidia tai enemmän pitkiä, jotka hybridisoituvat HCV:n RNAsn tai sen komplementin 20 positiivisten säikeiden kanssa ja myös HCV:n cDNA-.n kanssa. Nämä oligomeerit voivat toimia koettimina sellaisten polynuk-leotidien osoittamisessa (sisältäen eristämisen ja/tai leimaamisen), jotka sisältävät HCV:n nukleotidisekvenssejä ja/tai alukkeina kohteena olevien HCV-sekvenssien transkriptiota ja/tai 25 replikaatiota varten. Oligomeerit sisältävät kohteena olevan polynukleotidisekvenssin, mikä muodostuu nukleotideista, mitkä « ! ’.·1 ovat komplementaarisia kohteena olevalle HCV:n nukleotidisek- t|{‘ venssille muodostaakseen dupleksin, millä on riittävästi ·:· stabiilisuutta aiottuun tarkoitukseen. Esimerkiksi, jos tarkoitus • M1 : 30 on eristää, immobiiisaation kautta, analyytti, mikä sisältää • 1 · 1 kohteena olevan HCV-sekvenssin, oligomeerit sisältäisivät polynukleotidialueen, mikä on riittävän pitkä ja komplemen- f · » taarinen kohteena olevalle HCV-sekvenssille aikaansaadakseen . . riittävästi dupleksistabiilisuutta analyytin immobilisoiraiseksi i i « 35 kiinteälle pinnalle oligomeereihin sitoutumisensa kautta · » * eristysolosuhteissa. Esimerkiksi myös jos oligomeerien on ·:·: toimittava alukkeina kohteena olevien HCV-sekvenssien transkriptiota ja/tai replikaatiota varten analyyttipolynuk- a « « ·
f I I
105279 leotidissa, oligoraeerit sisältäisivät polynukleotidialueen, mikä olisi riittävän pitkä ja komplementaarinen kohteena olevalle HCV-sekvenssille salliakseen polyraerointiaineen jatkaa replikointia alukkeista, jotka ovat stabiilissa dupleksirauodossa kohdesek-5 venssin kanssa, polymerointiolosuhteissa. Esimerkiksi myös jos oligoraeerejä on käytettävä leimakoettimina tai niiden tulee sitoutua multiraeereihin, kohdistuva polynukleotidialue olisi riittävän pitkä ja komplementaarinen muodostaakseen stabiileja hybrididupleksirakenteita leimakoettiraien ja/tai multimeerien 10 kanssa salliakseen dupleksin osoittamisen. Oligomeerit voivat sisältää vähintään noin 4 viereistä nukleotidia, mitkä ovat komplementaarisia kohteena oleville HCV-sekvensseille; tavallisesti oligomeerit sisältävät vähintään noin 8 viereistä nukleotidia, jotka ovat komplementaarisia kohteena olevalle 15 HCV-sekvenssille ja mieluummin ne sisältävät minimissään noin 14 viereistä nukleotidia, jotka ovat komplementaarisia kohteena olevalle HCV-sekvenssille.
Sopivat HCV-nukleotidia kohteena pitävät sekvenssit voivat 20 muodostua nukleotideista, jotka ovat komplementaarisia nukleotideja valittuna seuraavista HCV:n cDNA-nukleotideista, jotka on esitetty kuviossa 18, (nnx - nny merkitsee noin nukleotidinumerosta x noin nukleotidinumeroon y): nn_340 “ nn-330; nn-330 ~ nn-320' nn-320 " nn-310; 25 nn-310 ” nn-300; nn-300 " nn-290; nn-290 ” nn-280? , .f nn-280 " nn-270; nn-270 " nn-260' nn-260 “ nn-250; • nn-250 ” nn-240' nn-240 “ nn-230' nn-230 " nn-220; ..T nn-220 “ nn-210? nn-210 “ nn-200? nn-200 " nn-l90? nn-190 ‘ nn-180; nn-180 ~ nn-170; nn-170 ’ nn-160? I.:': 30 nn-160 * nn-150; nn-l50 ‘ nn-l40? nn-140 * nn-l30; *:··: nn-130 ' nn-120; nn-120 " nn-110; nn-110 " nn-l00; nn-100 ” nn-90? nn-90 “ nn-80? nn-80 ’ nn-70? nn_70 ~ nn-60; nn-60 ~ nn-50; nn-50 ' nn-40; . . nn-40 ’ nn-30; nn-30 ” nn-20? nn-20 “ nn-10; '{'} 35 nn-10 * nnl? nnl ' nn10; nn10 ' nn20; nn20 ' nn30; :7: nn30 - nn40' nn40 · nn50' nn50 " nn60; nn60 ' nn70; nn70 ' nn80; nn80 “ nn90' nn9C ’ nn100f nn100 “ nn110; .···; nn110 " nn120' nn120 " nnl30' nn 130 “ nnl40? nni40 " nnl50' nn150 " nn160' nn160 " nn170? nni70 “ nnl80; nn180 “ nn190; nn190 ~ nn200; nn200 “ nn2io; nn2io - nn220»* nn220 * nn230»' 27 105279 nn230 " nn240; nn240 " nn250' nn250 ” nn260? nn260 " nn270; nn270 ~ nn280; nn280 “ nn290? nn290 " nn300' nn300 " nn310? nn310 " nn320? nn320 ” nn330? nn330 ” nn340' nn340 " nn350f 5 nn350 " nn360' nn360 " nn370; nn370 " nn380? nn380 " nn390' nn390 " nn400; nn400 " nn410; nn410 “ nn420; nn420 ” nn430? nn430 ” nn440; nn440 ” nn450' nn450 " nn460; nn460 " nn470? nn470 “ nn480' nn480 _ nn490' nn490 " nn500' 10 nn5Qo " nn5l0; nn510 " nn520; nn520 ” nn530; nn530 " nn540' nn540 ’ nn550; nn550 “ nn560; nn560 “ nn570' nn570 “ nn580; nn580 " nn590? nn590 " nn600? nn600 “ nn610' nn610 ” nn620; nn620 " nn630' nn630 ” nn640J nn640 " nn650? 15 nn650 ” nn660; nn660 " nn670; nn670. " nn680f nn680 " nn690; nn690 ” nn700; nn700 " nn710; nn710 ” nn720; nn720 " nn730? nn730 ’ nn740' nn740 " nn750? nn750 ” nn760; nn760 “ nn770' nn770 ” nn780? nn780 " nn790? nn790 “ nn800' 20 nng00 - nngi0; nngi0 - nng20? nnQ20 ” nn830' nn830 ” nn840' nn840 “ nn850; nn850 " nn860? nn860 ” nn870; nn870 ~ nn880? nn880 ” nn890? nn890 ” nn900? nn900 " nn910f nn910 ” nn920? nn920 ” nn930? nn930 ” nn940; nn940 ” nn950; 25 nn95Q ” nn960; nn960 " nn970; nn970 “ nn980' nn980 " nn990? nn990 ” nn1000? nn1000 " nn1010' nn1010 nn1020' nn1020 “ nn1030? nn1030 “ nn1040? nn1040 " nn1050; nnlQ50 ' nn1060; nn1060 " nn1070; .:. nn1070 “ nn1080? nn1080 ” nn1090; nn1090 ” nn1100; 3° nnHOO " nn1110? nn1110 " nn1120; nn1120 ' nn1130; nn1130 ' nn1140? nnll40 ' nn1150; nn1150 ’ nn 1160' !..* nnl 160 " nn1170; nnU70 ” nnll80; nn1180 ~ nn1190; nnl190 ~ nnl200; nni200 " nnl210; nn1210 ” nn1220; nn1220 " nn12 30' nnl230 " nn1240? nn1240 ' nn1250; 35 nn125Q - nn126Q; nn126Q - nn127o; nni270 " nn1280; nn1280 - nn1290» nn1290 " nn1300* nn1300 " nn1310' • · · • · • · • · · • · • · · • · 28 105279 nn1310 “ nn1320; nn1320 ’ nnl330? nn1330 " nn1340? nn1340 " nn1350J nn1350 " nnl360; nn1360 " nnl370; nn1370 " nnl380; nnl380 “ nn1390? nn1390 “ nn1400? nn1400 " nn1410; nn1410 ' nn1420; nn1420 " nn1430; 5 nn1430 ’ nn1440; nn1440 " nn1450; nnl450 " nn1460; nn1460 “ nnl470; nn1470 “ nn1480? nnl480 " nn1490? nn1490 “ nn1500? nn1500 “ nn1510; nn1510 " nn1520; nn1520 1 nn1530' nn1530 ~ nn1540? nn1540 “ nn1550; nn1550 “ nn1560' nn1560 - nn1570; nn1570 " nn1580? 10 nn1580 “ nn1590; nn1590 " nn1600; nn1600 " nnl610; nn1610 ' nnl620; nn1620 " nnl630; nnl630 ” nn1640; nn1640 ~ nfll650? nn1650 “ nnl660? nn1660 “ nn1670; nn1670 " nnl680; nn1680 " nnl690; nn1690 ” nn1700; nn1700 " nn17l0; nn1710 " nn1720; nn1720 " nn1730? 15 nn1730 ’ nn1740' nn1740 " nnl750; nn1750 " nnl760; nn1760 ” nn1770' nn1770 ' nn1780; nn1780 " nn1790; nn1790 ’ nn1800; nn1800 " nn1810? nn1810 ' nnl820; nn1820 ” nnl8301 nn1830 " nnl840? nn1840 " nnl850f nn1850 " nnl860; nn1860 “ nnl870; nnl870 “ nnl880; 20 nni880 " nn1890; nn1890 “ nn1900; nnl900 “ nnl910; nn1910 ” nn1920; nn1920 " nnl930; nnl930 " nn1940; nn1940 ” nnl950? nn1950 “ nnl960; nn1960 ” nnl970; nn1970 “ nnl980; nn1980 “ nn1990; nnl990 “ nn2000; nn2000 “ nn2010? nn2010 “ nn2020; nn2020 ' nn2030; 25 nn2Q30 - nn2Q4(); nn2Q40 - n«2050? nn2050 " nn2060? nn2060 ’ nn2070; nn2070 " nn2080? nn2080 “ nn2090? nn2090 " nn2l00; nn2l00 ” nn21l0; nn2110 " nn2l20; ' nn2l20 " nn2130; nn2130 “ nn2140? nn2140 " nn2150i nn2150 - nn2l60; nn2160 " nn2170; nn2170 " nn2l80? 30 nn2180 “ nn2190' nn2190 " nn2200; nn2200 " nn2210' nn2210 “ nn2220; nn2220 " nn2230; nn2230 ' nn2240? nn2240 " nn2250; nn2250 " nn2260; nn2260 ’ nn2270; s-:-: nn2270 " nn2280; nn2280 “ nn2290; nn2290 “ nn2300; nn2300 ' nn23l0; nn2310 ' nn2320? nn2320 ' nn2330; e.t . 35 nn2330 ' nn2340; nn2340 ' nn2350; nn2350 " nn2360; :. 'i rm2360 " nn2370? nn2370 " nn2380»‘ nn2380 “ nn23901 • · # « · » · t · • « · • a j 29 105279 nn2390 ” nn2400' nn2400 " nn24lOf nn2410 “ nn2420' nn2420 " nn2430' nn2430 " nn2440? nn2440 “ nn2450? nn2450 " nn2460? nn2460 ’ nn2470' nn2470 ” nn2480? nn2480 “ nn24907 nn2490 ’ nn2500? nn2500 " nn2510; 5 nn25l0 “ nn2520; nn2520 " nn2530; nn2530 " nn2540; nn2540 ’ nn2550; nn2550 " nn2560; nn2560 " nn2570; nn2570 " nn2580' nn2580 “ nn2590; nn2590 " nn2600; nn2600 * nn2610' nn2610 “ nn2620; nn2620 “ nn2630; nn2630 " nn2640; nn2640 " nn2650? nn2650 " nn2660? 10 nn2660 “ nn2670; nn2670 " nn2680; nn2680 “ nn2690; nn2690 ’ nn2700; nn2700 " nn2710; nn2710 " nn2720' nn2720 “ nn2730' nn2730 " nn2740? nn2740 " nn2750; nn2750 “ nn2760; nn2760 " nn2770' nn2770 “ nn2780? nn2780 " nn2790; nn2790 " nn2800; nn2800 ” nn2810'
15 nn28i0 “ nn2820f nn2820 " nn2830' nn2830 ” nn2840J
nn2840 ~ nn2850' nn2850 " nn2860; nn2860 ” nn2870'* nn2870 “ nn2880' nn2880 " nn2890; nn2890 " nn2900; nn2900 “ nn2910' nn2910 " nn2920' nn2920 ” nn2930? nn2930 " nn2940; nn2940 " nn2950; nn2950 " nn2960; 2° nn2960 ’ nn2970' nn2970 “ nn2980? nn2980 “ nn29907 nn2990 ~ nn3000' nn3000 " nn3010? nn3010 " nn3020?
nn3020 " nn3030' nn3030 “ nn3040? nn3040 “ nn3050J
nn3050 “ nn3060; nn3060 “ nn3070? nn3070 " nn3080; nn3080 ’ nn30907 nn3090 " nn3100; nn3100 “ nn31107 25 nn3110 " nn3120' nn3l20 " nn3130; nn3130 " nn3140; nn3140 ” nn3150' nn3l50 " nn3160? nn3160 " nn3170? nn3170 “ nn3180? nn3l80 " nn3190'* nn3190 " nn3200? .:. nn3200 " nn3210; nn3210 “ nn3220? nn3220 " nn3230; .:. nn3230 " nn3240? nn3240 " nn3250? nn3250 “ nn3260; : 3° ""3260 ’ nn3270; nn3270 " nn3280; nn3280 " nn3290; nn3290 ~ nn3300; nn3300 - nn3310; nn3310 ' nn3320? j..] nn3320 " nn3330; nn3330 “ nn3340; nn3340 " nn3350; nn3350 ’ nn3360; nn3360 _ nn3370; nn3370 ” nn3380; nn3380 " nn3390? nn3390 * nn3400; nn3400 " nn3410; \*·| 35 nn341Q - nn3420? nn3420 “ nn3430; nn3430 " nn3440? .·:· nn3440 “ nn3450· nn3450 - nn3460»‘ nn3460 " nn3470? « · · • · • *
« * I
* *4 • · 30 1 0 5 2 7 9 nn3470 " nn3480; nn3480 ' nn3490; nn3490 " nn3500; nn3500 " nn3510; nn3510 - nn3520; nn3520 " nn3530? nn3530 * nn3540; nn3540 " nn3550? nn3550 " nn3560? nn3560 “ nn3570? nn3570 " nn3580? nn3580 " nn3590? 5 nn3590 “ nn3600; nn3600 " nn3610? nn3610 “ nn3620? nn3620 “ nn3630? nn3630 " nn3640; nn3640 ’ nn3650; nn3650 “ nn3660; nn3660 " nn3670? nn3670 ' nn3680; nn3680 “ nn3690; nn3690 " nn3700; nn3700 " nn3710? nn3710 “ nn3720? nn3720 " nn3730? nn3730 ' nn3740; iO nn3740 " nn3750? nn3750 " nn3760; nn3760 “ nn3770; nn3770 _ nn3780; nn3780 " nn3790? nn3790 " nn3800; nn3800 “ nn3810? nn3810 " nn3820? nn3820 “ nn3830? nn3830 “ nn3840; nn3840 “ nn3850? nn3850 “ nn3860; nn3860 " nn3870; nn3870 ” nn3880? nn3880 “ nn3890; 15 nn3890 ’ nn3900? nn3900 " nn3910? nn3910 " nn3920; nn3920 “ nn3930; nn3930 “ nn3940? nn3940 “ nn3950? nn3950 “ nn3960? nn3960 ” nn3970? nn3970 ” nn3980? nn3980 ” nn3990? nn3990 " nn4000? nn4000 ” nn4010? nn4010 “ nn4020; nn4020 “ nn4030? nn4030 “ nn4040; 20 nn4040 “ nn4050; nn4050 " nn4060? nn4060 ” nn4070? nn4070 “ nn4080; nn4080 “ nn4090? nn4090 “ nn4100? nn4100 “ nn4110; nn4110 ' nn4120; nn4120 " nn4l30? nn4130 “ nn4140' nn4140 " nn4150; nn4150 " nn4160; nn4160 " nn4170? nn4170 ~ nn4180? nn4l80 " nn4190; 25 nn4190 “ nn4200; nn4200 “ nn4210; nn4210 " nn4220? nn4220 “ nn4230? nn4230 “ "”4240'' nn4240 " nn4250? nn4250 " nn4260? nn4260 “ nn4270? nn4270 " nn4280? ·:· nn4280 " nn4290; nn4290 “ nn4300; nn4300 ” nn4310; .:. nn4 310 " nn4320; nn4320 “ nn4330? nn4330 “ nn4340? !’.·. 30 nn4340 " nn4350' nn4350 " nn4360; nn4360 " nn4370f nn4370 " nn4380? nn4380 " nn4390; nn4390 ’ nn4400; nn4400 " nn4410; nn4410 ‘ nn4420; nn4420 " nn4430; nn4430 " nn4440; nn4440 ~ nn4450; nn4450 “ nn4460? nn4460 “ nn4470; nn4470 " nn4480; nn4480 " nn4490; : 35 nn449o ~ nn4500; nn4500 " nn4510; nn4510 ” nn4520; nn4520 * ηη4530» nn4530 ’ ηη4540ί nn4540 “ nn4550? „ 105279 nn4550 " nn4560? nn4560 " nn4570? nn4570 " nn4580'
nn4580 “ nn4590? nn4590 " nn4600; nn4600 “ nn4610J
nn4610 " nn4620; nn4620 " nn4630? nn4630 " nn4640? nn4640 ” nn4650; nn4650 " nn4660; nn4660 ” nn4670; 5 nn4670 “ nn4680' nn4680 ” nn4690? nn4690 ” nn4700; nn4700 ' nn4710? nn4710 “ nn4720; nn4720 “ nn4730; nn4730 " nn4740? nn4740 " nn4750; nn4750 " nn4760; nn4760 - nn4770' nn4770 ” nn4780' nn4780 " nn4790? nn4790 “ nn4800; nn4800 " nn4810; nn4810 ” nn4820' 10 nn4Q2o ” nn4830' nn4830 " nn4840? nn4840 ” nn4850? nn4850 ” nn4860? nn4860 ' nn4870? nn4870 " nn4880; nn4880 “ nn4890; nn4890 " nn4900' nn4900 " nn4910; nn4910 “ nn4920; nn4920 ’ nn4930' nn4930 “ nn4940? nn4940 " nn4950; nn4950 ' nn4960? nn4960 " nn4970? 15 nn4970 ” nn4980; nn4980 ’ nn4990; nn4990 " nn5000; nn5000 “ nn5010? nn5010 " nn5020; nn5020 ’ nn5030? nn5030 " nn5040? nn5040 " nn5050; nn5050 ' nn5060; nn5060 " nn5070? nn5070 " nn5080? nn5080 " nn5090; nn5090 " nn5100? nn5100 " nn5110; nn5110 " nn5120? 20 nn5120 - nn5i3o; nn5130 ” nn5140? nn5140 “ nn5150; nn5150 “ nn5160? nn5160 “ nn5170? nn5170 " nn5180; nn5180 " nn5190? nn5190 “ nn5200? nn5200 ” nn5210? nn5210 " nn5220; nn5220 " nn5230; nn5230 ” nn5240; nn5240 " nn5250; nn5250 " nn5260; nn5260 “ nn5270; 25 nn5270 " nn5280? nn5280 “ nn5290? nn5290 " nn5300; nn5300 ’ nn5310; nn5310 “ nn5320? nn5320 " nn5330? nn5330 “ nn5340; nn5340 “ nn5350? nn5350 “ nn5360? ' .1. nn5360 ’ nn5370; nn5370 “ nn5380? nn5?80 " nn5390? ·1! nn5390 " nn5400' nn5400 _ nn5410; nn5410 " nn5420? ...: 30 nn5420 " nn5430? nn5430 " nn5440; nn5440 ' nn5450; :.:: nn5450 ' nn5460? nn5460 " nn5470; nn5470 ” nn5480; ·:·1: nn5480 " nn5490? nn5490 " nn5500; nn5500 " nn5510; :T: nn5510 ‘ nn5520? nn5520 " nn5530' nn5530 " nn5540? nn5540 ’ nn5550; nn5550 ” nnS560; nn5560 " nn5570; .·. : 35 nn557Q - nn558Q; nn558Q - nn559Q; nn559Q - nn5600? nn5600 nn5610' nn5610 “ nn5620? nn5620 “ nn5630» • · · • « 9 9 1 • · 1 « t · 1 32 105279 nn5630 “ nn5640? nn5640 “ nn5650; nn5650 ” nn5660; nn5660 “ nn5670; nn5670 “ nn5680; nn5680 " nn5690? nn5690 “ nn5700? nn5700 “ nn5710; nn5710 " nn5720'* nn5720 " nn5730? nn5730 “ nn5740; nn5740 " nn5750; 5 nn5750 " nn5760; nn5760 “ nn5770; nn5770 ” nn5780; nn5780 “ nn5790; nn5790 " nn5800; nn5800 " nn5810? nn5810 " nn5820; nn5820 ” nn5830; nn5830 “ nn58407 nn5840 “ nn5850? nn5850 “ nn5860' nn5860 * nn5870? nn5870 “ nn5880' nn5880 “ nn5890? nn5890 " nn5900; 10 nn5900 “ nn5910? nn5910 “ nn5920; nn5920 " nn5930' nn5930 “ nn5940? nn5940 “ nn5950; nn5950 " nn5960? nn5960 ” nn5970? nn5970 " nn5980; nn5980 ’ nn5990' nn5990 " nn6000; nn6000 “ nn6010; nn6010 " nn6020; nn6020 " nn6030' nn6030 " nn6040; nn6040 “ nn6050; 15 nn6050 " nn6060? nn6060 ” nn6070; nn6070 “ nn6080; nn6080 ~ nn6090' nn6090 “ nn6l00; nn6100 " nn61l0? nn6110 " nn6120? nn6120 " nn6l30? nn6130 " nn6140; nn6140 " nn6150; nn6150 “ nn6l60? nn6160 “ nn61707 nn6170 ’ nn6180? nn6l80 “ nn6l90? nn6190 " nn6200? 20 nn5200 _ nn6210' nn6210 “ nn6220; nn6220 “ nn6230? nn6230 " nn6240' nn6240 ~ nn6250? nn6250 " nn6260? nn6260 ” nn6270? nn6270 ’ nn6280; nn6280 " nn6290' nn6290 ' nn6300? nn6300 " nn6310; nn6310 " nn6320? nn6320 " nn6330? nn6330 “ nn6340; nn6340 “ nn6350? 25 nn6350 ~ nn6360; nn6360 “ nn6370? nn6370 " nn6380? nn6380 " nn6390; nn6390 _ nn6400? nn6400 ‘ nn6410; nn6410 ‘ nn6420; nn6420 “ nn6430? nn6430 " nn6440? nn6440 " nn6450; nn6450 " nn6460? nn6460 " nn6470? .:. nn6470 " nn6480? nn6480 ’ nn6490? nn6490 “ nn6500; ;··; 30 nng500 - nn651Q; nn651Q - nng520; nn652Q - nn653Q; *” / nn6530 “ nn6540? nn6540 " nn6550; nn6550 " nn6560; 1./ nn6560 ‘ nn6570? nn6570 " nn6580; nn6580 " nn6590; : nn6590 " nn6600; nn6600 “ nn6610; nn6610 ’ nn6620; nn6620 " nn6630; nn6630 ' nn6640; nn6640 “ nn6650; :/.: 35 nn6650 ’ nn6660; nn6660 ' nn6670; nn6670 " nn6680? .*:·*. nn6680 “ nn6690? nn6690 " nn6700»* nn6700 “ nn6710? ♦ • »· 33 105279 nn6710 " nn6720? nn6720 “ nn67307 nn6730 " nn67407 nn6740 ’ nn67507 nn6750 ' nn6760; nn6760 " nn67707 nn6770 ’ nn6780? nn6780 " nn67907 nn6790 " nn6800; nn6800 ' nn$8107 nn6810 “ nn6820? nn6820 " nn6830? 5 nn6830 " nn6840? nn6840 " nn6850; nn6850 _ nn6860; nn6860 “ nn6870; nn6870 " nn6880; nn6880 " nn6890; nn6890 " nn6900; nn6900 ” nn6910; nn6910 " nn6920? nn6920 ' nn6930; nn6930 " nn69407 nn6940 “ nft6950? - nn6950 " nn69607 nn6960 “ nn6970; nn6970 " nn6980; 10 nn6980 - nn6990; nn6990 ’ nn7000; nn7000 " nn7010; nn7010 “ nn70207 nn7020 ” nn70307 nn7030 " nn7040; nn7040 " nn7050? nn7050 ” nn7060; nn7060 " nn7070? nn7070 “ nn7080? nn7080 " nn7090; nn7090 ’ nn7100? nn7100 ’ nn7110; nn7110 - nn71207 nn7120 " nn71307 15 nn7130 " nn71407 nn7140 " nn71507 nn7150 " nn71607 nn7160 " nn71707 nn7170 " nn71807 nn7180 “ nn71907 nn7190 " nn72007 nn7200 " nn7210; nn7210 ” nn7220; nn7220 " nn72307 nn7230 " nn72407 nn7240 ” nn72507 nn7250 " nn7260; nn7260 " nn72707 nn7270 “ nn72807 20 nn7280 ' nn72907 nn7290 ” nn73007 nn7300 " nn7310; nn7310 " nn73207 nn7320 " nn7330; nn7330 " nn73407 nn7340 ’ nn7350; nn7350 ’ nn73607 nn7360 " nn73707 nn7370 " nn73807 nn7380 ’ nn73907 nn7390 ' nn74007 nn7400 “ nn74107 nn7410 ” nn74207 nn7420 " nn74307 25 nn?430 - nn744Q' nn7440 " nn74507 nn7450 " nn7460; nn7460 ” nn74707 nn7470 ” nn74807 nn7480 " nn7490? nn7490 “ nn75007 nn7500 ” nn75107 nn7510 ” nn75207 .11' nn7520 “ nn75307 nn7530 “ nn75407 nn7540 ” nn75507 .:. nn7550 “ nn7560? nn7560 “ nn7570; nn7570 ” nn75807 : .·. 30 nn7560 " nn7590; nn7590 " nn7600; nn7600 “ nn76107 ....: nn7610 " nn7620? nn7620 ” nn7630; nn7630 " nn7640? .*:·. nn7640 " nn76507 nn7650 “ nn7660; nn7660 “ nn7670; nn7670 " nn76807 nn7680 " nn7690? nn7690 _ nn77007 nn77O0 “ nn77107 nn7710 “ ηη77207 ΠΠ7720 ” nn77307 35 nn7730 " nn77407 nn7740 “ nn77507 nn7750 ~ nn77607 nn7760 " nn7770» nn7770 ” nn7780' nn7780 “ nn7790» • · • · • * • · · ψ 3, 105279 nn7790 ” nn7800' nn7800 ” nn7810? nn78l0 “ nn7820; nn7820 “ nn7830? nn7830 “ nn7840; nn7840 " nn7850? nn7850 “ nn7860; nn7860 “ nn7870? nn7870 " nn7880; nn7880 “ nn7890? nn7890 “ nn7900; nn7900 " nn7910f 5 nn79io " nn7920? nn7920 “ nn7930; nn7930 " nn7940; nn7940 " nn7950? nn7950 “ nn7960? nn7960 * nn7970? nn7970 " nn7980? nn7980 " nn7990' nn7990 ” nn8000' nn8000 " nn8010' nn8010 “ nn8020; nn8020 " nn8030; nn8030 " nn8040; nn8040 “ nn8050; nn8050 " nn8060; 10 nngo60 " nn8070; nn8070 " nn8080' nn8080 " nn8090? nn8090 " nn8100; nn8100 “ nn8110; nn8110 ” nn8120? nn8120 " nn8130? nn8130 “ nn8140? nn8140 " nn8150? nn8150 " nn8160' nn8160 “ nn8170' nn8170 “ nn8180? nn8180 “ nn8190' nn8190 " nn8200? nn8200 " nn8210' 15 nn8210 “ nn8220; nn8220 “ nn8230? nn8230 “ nn8240' nn8240 “ nn8250? nn8250 “ nn8260; nn8260 " nn8270? nn8270 " nn8280; nn8280 “ nn8290' nn8290 " nn8300? nn8300 " nn8310' nn8310 “ nn8320; nn8320 _ nn8330; nn8330 “ nn8340? nn8340 ” nn8350; nn8350 " nn8360; 20 nn8360 " nn8370? nn8370 " nn8380' nn8380 “ nn8390; nn8390 " nn8400' nn8400 “ nn8410; nn8410 “ nn8420? nn8420 " nn8430' nn8430 " nn8440? nn8440 _ nn8450; nn8450 “ nn8460? nn8460 " nn8470? nn8470 “ nn8480' nn8480 ” nn8490? nn8490 ” nn8500; nn8500 " nn8510' 25 nn851Q - ηηβ520; nn052O - nn053O; nnQ530 - nn054O; nn8540 * nn8550? nn8550 " nn8560; nn8560 " nn8570; nn8570 “ nn8580; nn8580 " nn8590? nn8590 " nn8600; .il' nn8600 " nn8610; nn8610 " nn8620; nn8620 " nn8630? /:· nn8630 " nn8640' nn8640 “ nn8650? nn8650 ” nn8660? : 30 nn8660 " nn8670; nn8670 " nn8680? nn8680 _ nn8690; nn8690 * nn8700; nn8700 nn8710; nn8710 ’ nn8720; nn8720 “ nn8730; nn8 7 30 " nn8740; nn8740 " nn8750? nn8750 ” nn8760' nn8760 " nn8770; nn8770 ~ nn8780; nn8780 _ nn8790; nn8790 " nn8800? nn8800 " nn8810; : 35 nn08io - nn082O; nn082o - nn083O; nn8830 ' nn8840; nn8840 ~ nn8850» nn8850 " nn8860' nn8860 “ nn8870? • · « · 105279 35 nn8870 " nn8880? nn8880 ’ nn8890? nn8890 ” nn8900? nn8900 * nn8910; nn8910 ” nn8920; nn8920 ’ nn8930? nn8930 “ nn8940? nn8940 " nn8950? nn8950 ” nn8960? 5 nn8960 “ nn8970' nn8970 " nn8980; nn8980 ” nn8990; nn8990 " nn9000? nn9000 " nn9010; nn9010 ~ nn9020' nn9020 " nn9030; nn9030 " nn9040; nn9040 " nn9050f nn9050 ’ nn9060’ 10
Oligomeerin ei kuitenkaan tarvitse muodostua vain sekvenssistä, mikä on komplementaarinen kohteena olevalle HCV-sekvenssille. Se voi sisältää lisäksi nukleotidisekvenssejä tai muita puolia, mitkä ovat sopivia tarkoitukseen, mihin oligomeerejä käytetään. 15 Esimerkiksi jos oligomeerejä käytetään alukkeina HCV-sekvenssien monistamiseen PCR:n kautta, ne voivat sisältää sekvenssejä, mitkä dupleksissa muodostavat restriktioentsyymin paikkoja, mitkä helpottavat monistettujen sekvenssien kloonaamista. Esimerkiksi myös jos oligomeerejä tulee käyttää "sieppauskoet-20 timina" hybridisaatioanalyyseissä (kuvataan alla), ne voisivat sisältää lisäksi sidospartnerin, mikä kytkeytyy oligoraeeriin, mikä sisältää nukleotidisekvenssin, mikä on komplementaarinen kohteena olevalle HCV-sekvenssille. Muut puolikastyypit tai sekvenssit, mitkä ovat hyödyllisiä, joista oligomeerit voivat 25 muodostua tai joihin ne voivat kytkeytyä, ovat ne, jotka tiedetään alalla olevan sopivia eri tarkoituksiin, sisältäen nukleotidikoettimien leimauksen.
• 4 · Ψ · · · : Oligoraeerien valmistus tapahtuu tavoilla, jotka tunnetaan alalla, • · « · 30 sisältäen esimerkiksi menetelmät, mitkä sisältävät katkomisen, • m transkriptoiraisen tai kemialliset synteesit. Genorain kohteena • · · olevat sekvenssit ja/tai alueet, jotka valitaan sellaisiksi, . . joille kohdistuvat oligomeerien polynukleotidit ovat korap- • » · / lementaarisia, riippuvat tarkoituksesta. Esimerkiksi jos • « « '35 tähdätään HCV:n läsnäolon seulomiseen biologisissa näytteissä (esim. veri), parhaina pidettyjä oligomeerejä käytettäisiin koettiraina ja/tai alukkeina ja ne hybridisoituisivat HCV-genorain säilyviin alueisiin. Joitakin HCV-genomin säilyvistä alueista, • · * · 36 105279 joihin oligomeerit voivat sitoutua, kuvataan tässä, esimerkiksi alueet, mitkä sisältävät nukleotidinumerot noin 5-päästä noin 200:een tai noin 4000:sta noin 5000teen tai noin 8000:sta noin 9040 :een, kuten esitetään kuviossa 18 tai mieluummin nukleotidit 5 -318 - 174, 4056 - 4448 ja 4378 - 4902. Muut genomin alueet, mitkä ovat säilyviä, varmistetaan helposti vertaamalla eri HCV:n eristeiden nukleotidisekvenssejä, sisältäen prototyyppi HCV:n, HCVltn. Menetelmät vertailujen suorittamiseksi genotyyppien välillä säilyvien ja ei-säilyvien alueiden määrittämiseksi ovat 10 tunnettuja alalla ja esimerkkejä näistä menetelmistä esitetään tässä.
Perushybridisaatioanalyysissä yksisäikeinen analyyttinuk-leiinihappo (joko DNA tai RNA) hybridisoidaan nukleiinihap-15 pokoettimeen ja tuloksena olevat dupleksit osoitetaan. HCV-polynukleotidejä varten olevien koettimien (joko luonnollisten tai johdettujen) pituudet ovat sellaisia, että ne sallivat ainutkertaisten virussekvenssien osoittamisen hybridisäätiön avulla. Kun 6-8 nukleotidia voi olla toimiva pituus, pidetään 20 10-12 nukleotidin sekvenssejä parempana ja noin 20 nukleotidia näyttää olevan optimi. Mieluummin nämä sekvenssit ovat peräisin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koettimet voidaan valmistaa käyttäen rutiiniraenetelmiä, sisältäen automatisoidut oligonukleotidin synteettiset menetelmät. Hyödyllisten koettimien 25 joukossa ovat esimerkiksi ne, jotka ovat peräisin äskettäin eristetyistä klooneista, jotka on annettu tässä ja myös eri oligomeerit, jotka ovat hyödyllisiä cDNA-kirjastoja tutkittaessa, ja joita on kuvattu alla. Minkä tahansa HCV-genomin ainutker-täisen osan komplementti on myös tyydyttävä. Käytettäväksi i · * ** ;30 koettimina on täydellinen komplementaarisuus toivottavaa, vaikka ^ ‘ se voi olla tarpeetonta, kun fragmentin pituus kasvaa.
• · * • w
Sellaisten koettimien käyttämiseksi aineina HCV-polynukleotidien :.*·ί osoittamiseen (esimerkiksi seulottaessa saastunutta verta), :/::35 biologista analysoitavaa näytettä, kuten verta tai seerumia, voidaan käsitellä haluttaessa sen sisältämien nukleiinihappojen ... uuttamiseksi. Näytteestä tuloksena oleville nukleiinihapoille » « voidaan suorittaa geelielektroforeesi tai jokin muu koon mukaan • · i I 105279 erotteleva tekniikka; vaihtoehtoisesti nukleiinihapponäyte voidaan pisteblotata ilman kokoerottelua. Hybrididupleksien muodostamiseksi koettimen kohteena olevan sekvenssin kanssa täytyy analyyttinukleiinihapon kohteena olevan alueen olla 5 yksisäikeisessä muodossa. Kun sekvenssi on luonnostaan läsnä yksisäikeisessä muodossa, ei vaadita denaturointia. Kuitenkin kun sekvenssi on läsnä kaksisäikeisessä muodossa, sekvenssi denaturoidaan. Penaturointi voidaan suorittaa eri tekniikoilla, mitkä tunnetaan alalla. Denaturoinnin jälkeen inkuboidaan 10 analyyttinukleiinihappoa ja koetinta olosuhteissa, mitkä edistävät stabiilin hybridin muodostumista kohdesekvenssistä koettiroessa oletetun kohteena olevan analyytin sekvenssin kanssa ja tuloksena olevat dupleksit, mitkä sisältävät koettimet, osoitetaan.
15
Tuloksena olevan dupleksin, jos sellainen on, osoittaminen voidaan suorittaa käyttämällä leimattuja koettimia; vaihtoehtoisesti koetin voi olla leimaamaton, mutta se voidaan osoittaa ligandin, mikä on leimattu, spesifisenä sitoutumisena, 20 joko suoraan tai epäsuorasti. Sopivia leimoja ja menetelmiä koettimien ja ligandien leimaamiseksi tunnetaan alalla ja ne sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka voidaan liittää tunnetuilla menetelmillä (esimerkiksi nicktranslaatio tai kinasointi), biotiinin, fluoresoivat ryhmä, kemilumenisoivat 25 ryhmät (esim. dioksetaanit, erityisesti liipasoidut diok-setaanit), entsyymit, vasta-aineet ja sen kaltaiset.
• • · ·
Niiden koettimien alue, mitä käytetään sitoutumaan analyyttiin, : voidaan tehdä täysin komplementaarisiksi HCV-genomille. Siksi 30 tavallisesti hyvin tiukat olosuhteet ovat toivottavia väärien : i : positiivisten estämiseksi. Kuitenkin hyvin tiukkoja olosuhteita tulisi käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia sellaiselle virusgenorain alueelle, jossa ei ole heterogeenisyyt- • · tä. Hybridi säätiön tiukkuuden määrittävät lukuisat hybridi säätiön • ,35 aikaiset ja pesumenettelyn aikaiset tekijät, mukaanlukien lämpö-| ‘ tila, ionivahvuus, ajan pituus ja formamidin pitoisuus. Näitä *.·.* tekijöitä on hahmotellut esimerkiksi Maniatis, T. (1982).
« · • V « • · · 3β 105279 Tämän peruskaavion vaihteluja, mitkä ovat alalla tunnettuja, siältäen ne, mitkä helpottavat osoitettavien dupleksien erottamista ulkoisesta materiaalista ja/tai mitkä vahvistavat signaalin leimatusta puoliskosta, voidaan myös käyttää. Lukuisia 5 näistä vaihteluista on tarkasteltu esimerkiksi julkaisussa: Matthews and Kricka (1988), Analytical Biochemistry Landegren et ai. (1988), Science 242:229: ja Mittlin (1989), Clinical Chem. 15.:1819. Nämä ja seuraavat julkaisut, mitkä kuvaavat analyysimenettelyjä liitetään tässä viitteiksi. 10 Koettimet, mitkä ovat sopivia HCV:n osoittamiseksi näissä analyyseissä, muodostuvat sekvensseistä, mitkä hybridi soi tuvat kohteena olevien HCV:n polynukleotidisekvenssien kanssa muodostaakseen duplekseja analyyttisäikeen kanssa, missä dupleksit ovat riittävän stabiileja osoitettavaksi määritellyssä 15 analyysijärjestelmässä.
Sopiva vaihtelu on esimerkiksi se, mikä on kuvattu US-patentissa 4,868, 105, mikä on myönnetty 09.09.1989 ja EP-julkaisussa 225,807 (julkaistu 16.06.1987). Nämä julkaisut kuvaavat liuosfaasissa 20 tapahtuvan nukleiiinihappohybridisaatioanalyysin, missä analyyttinukleiinihappo hybridisoidaan laimakoetinsarjaan ja sieppauskoetinsarjaan. Koetin-analyyttikompleksi kytketään hybridisoimalla kiinteällä kantajalla olevaan sieppauskoettimeen, mikä on komplementaarinen sieppauskoetinsarjalle. Tämä sallii 25 analyyttinukleiinihapon poistamisen liuoksesta kiinteän faasin kompleksina. Se, että analyytti on kiinteän faasin kompleksin muodossa, helpottaa sitä seuraavia analyysin erotusvaiheita.
*]·. Leimauskoetinsarja on komplementaarinen leimatulle koettimelle, Γ" mikä on sitoutunut hybridi säätiön kautta kiinteän faasin/analyy- *** *30 tin kompleksiin.
*♦· • · ·
Yleisesti odotetaan, että HCV-genomia on läsnä infektoituneiden yksilöiden seerumissa suhteellisen alhaisina tasoina, s.o. tasolla noin 102-103 simpanssin infektoivaa annosta (CID) ml:aa v :35 kohti. Tämä taso voi vaatia, että hybridisaatioanalyysissä käytetään araplifikaatiotekniikkaa. Sellaiset tekniikat ovat ... alalla tunnettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporation * in "Bio-Bridge"-järjestelmä käyttää terminaalista deoksinukleotidi- « · # * · 39 105279 transferaasia raodifioiraattoraien 31 -poly-dT-häntien lisäämiseksi DNA-koettimeen. Poly- dT-häntäinen koetin hybridisoidaan kohdenukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimodifioituun poly-A:han. PCT-hakemus 84/03250 ja EP-julkaisu 124221 kuvaavat DNA-5 hybridisaatioanalyysiä, jossa: (1) analyytti lämpökäsitellään yksisäikeiseksi DNA-koettiraeksi, joka on komplementaarinen entsyyraileimatulle oligonukleotidille; ja (2) tuloksena oleva hännällinen dupleksi hybridisoidaan entsyymileimattuun oligonukleotidiin. EP-julkaisu 204510 kuvaa DNA-hybridisaatio-10 analyysiä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jolla on häntä, kuten poly-dT-häntä, amplifikaatiosäie, jossa on sekvenssi, joka hybridisoituu koettimen häntään, kuten poly-A-sekvenssi, ja joka voi sitoa useita leimattuja säikeitä. Hybridisaatioanalyysin tyyppi, mikä on kuvattu EP-julkaisussa 15 317,077 (julkaistu 24.05.1989), minkä tulisi havaita sekvenssejä tasolla noin 106 sekvenssiä/ml, käyttää nukleiinihappomul-timeerejä, mitkäs sitoutuvat yksisäikeiseen analyyttinukleiinihap-poon ja mitkä sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin oligonukleotideihin. Erityisen haluttavaan tekniikkaan voi 20 liittyä seerumissa kohteena olevien HCV-sekvenssien amplifiointi suunnilleen 10000-kertaisesti (s.o. suunnilleen 106 sek-venssiin/ml) osana hybridi saa ti omenetelraää. Amplifiointi voidaan tehdä esimerkiksi polymeraasiketjureaktiotekniikalla (PCR), jonka ovat esittäneet Saiki et ai. (1986), Mullis US-patentissa 25 4,683, 195 ja Mullis et ai. US-patentissa 4,683,202. Amplifikaatio voidaan tehdä ennen HCV-kohdesekvenssin puhdistusta tai mieluummin sen jälkeen. Esimerkiksi araplifikaatiota voidaan * käyttää niiden analyysimenetelmien yhteydessä, mitkä on kuvattu • · :.· * US-patentissa 4,868, 105 tai jos vielä lisäamplifikaatiota *:··:30 tarvitaan, hybridisaatiojärjestelmien yhteydessä, joita on kuvattu EP-julkaisussa 317,077.
* .·. : Parhaana pidetyt menetelmät HCV-sekvenssien osoittamiseksi s · · .*:·] analyyttipolynukleotidisäikeessä perustuvat hybridisaation • · · 35 osoitusmenetelmiin, joita on kuvattu US-patentissa 4,868,105 ja EP-julkaisussa 317,077. Nämä menetelmät ovat liuoksessa tapahtuvia sandwich-hybridisaatioanalyysejä, mitkä käyttävät .·*. sekä sieppaus- että leiraakoettiraia, mitkä hybridisoituvat • « • · · • · 40 1 0 5 2 7 9 kohdesekvensseihinanalyyttinukleiinihapossa. Näitä analyysejä käytettäessä seulomaan biologisia näytteitä HCV:n suhteen sitoutuisivat käytetyt koettimet HCV-genorain säilyviin alueisiin. Sieppaus- ja leiraakoettiraet voivat olla toistensa välissä 5 sitoutumisessaan kohdesekvensseihin. Vaihtoehtoisesti parhaassa muodossa ovat sieppaus- ja leimakoettimet sarjoissa, eivätkä yhden sarjan koettimet mene toisen sarjan koettiraien väliin. Jälkimmäisessä muodossa monien sieppauskoettimien sarjat mieluummin hybridisoituvat kaikkein säilyvimpiin genorain 10 alueisiin, kun taas monien leimakoettimien sarjat voivat hybridisoitua alueisiin, joissa on jonkin verran poikkeavuutta. Esimerkiksi käyttäen kuviossa 18 esitettyä prototyppi HCVlsn cDNA-sekvenssiä, voitaisiin käyttää koettimia, mitkä hybridi soi -tuvat sekvensseihin nukleotidialueella noin -318 - noin 174 15 ja/tai nukleotideihin alueella n. 4378 - n. 4902 ja/tai nukleotideihin alueella n. 4056 - n. 4448. Parhaina pidetyt koettimet hybridisoituisivat sekvensseihin HCV-genorain 5'-alueella, koska kuten esitetään alla, tämä alue näyttää olevan erittäin säilyvä. Täten parhaina pidetyt koettimet voivat 20 hybridisoitua esimerkiksi nukleotideihin n. -318 - n. 174, kuten esitetään kuviossa 18. Voitaisiin käyttää koettimia, mitkä hybridi soi tuvat joko positiiviseen säikeeseen säilyvillä alueilla ja/tai sen komplementtiin riippuen tarkoituksesta, esimerkiksi osoittaa virusgenomisekvenssejä tai osoittaa HCV:n cDNA-25 sekvenssejä, mitkä ovat tulosta PCR-monistuksesta tai osoittaa replikatiivisia välituotteita positiiviselle HCV:n RNA-säikeelle.
• · · H£YjJ2_ENA.-n_la_SiiM_peräisin_olgylefl_polvnukleotidien osoittaminen käyttäen HCV/cPCR-menetelmää 30 »
Erityisen hyödyllinen menetelmä HCV:n RNA.-n tai HCV.-n RNA:sta t · · peräisin olevien polynukleotidien osoittamiseksi on HCV/cPCR- . . menetelmä, mikä on tämän hakemuksen kohde ja mikä käyttää • · · *,/ polyraeraasiketjureaktiotekniikkaa (PCR), minkä on kuvannut Saiki *•‘.’35 et ai. (1986), Mullis US-patentissa 4,683, 195 ja Mullis et ·:1: ai. US-patentissa 4,683,202. HCV/cPCR-menetelmä käyttää alukkeita ja koettimia, jotka ovat peräisin tiedosta, mikä annetaan tässä koskien HCV-genorain luonnetta.
• · a • · « 105279 41
Yleisesti PCR-tekniikassa valmistetaan lyhyitä oligonukleotidi-alukkeita, mitkä sopivat halutun sekvenssin vastakkaisiin päihin. Alukkeiden välissä olevaa sekvenssiä ei tarvitse tuntea. Polynukleotidinäyte uutetaan ja denaturoidaan, mieluummin lämmön 5 avulla ja hybridi soidaan oligonukleotidialukkeiden kanssa, joita on läsnä molaarisesti ylimäärin. Polymerointia katalysoidaan mallineesta ja alukkeesta riippuvalla polymeraasilla deoksinuk-leotiditrifosfaattien tai nukleotidianalogien (dNTP) läsnäollessa. Tästä on tuloksen kaksi "pitkää tuotetta", mitkä sisältävät 10 vastaavat alukkeet niiden 51-päissä, kovalenttisesti sidottuna vasta syntetisoituihin alkuperäisten säikeiden komplementteihin. Replikoitu DNA denaturoidaan taas, hybridisoidaan oligonukleotidialukkeiden kanssa, palautetaan polymerointiolosuhteisiin ja toinen replikointisykli aloitetaan. Toinen sykli antaa kaksi 15 alkuperäistä säiettä, pitkät tuotteet syklistä 1 ja kaksi "lyhyttä tuotetta", mitkä on replikoitu pitkistä tuotteista. Lyhyet tuotteet sisältävät sekvenssejä (sense- tai antisense-säikeitä), mitkä ovat peräisin kohdesekvensseistä, 5'- ja 3'-päissä kyljittäin alukesekvenssien kanssa. Kussakin lisäsyklissä 20 lyhyiden tuotteiden lukumäärä replikoituu eksponentiaalisesti. Täten tämä menetelmä antaa erityisen kohdesekvenssin monistumisen.
Menetelmässä varustetaan näyte, minkä epäillään sisältävän HCV;n 25 RNA:ta tai sen fragmentin. Näyte tavallisesti otetaan yksilöstä, jolla epäillään olevan NANBH; kuitenkin muutkin näytelähteet ovat sisällytettyjä, esim. in vitro-iärlestelmlen väliaine tai ·: solut, joissa virus on replikoitunut. Näytteen täytyy kuitenkin • ;’· sisältää kohdenukleiilnihapposekvenssejä.
!!!.: 30 • ·
Sitten näyte saatetaan olosuhteisiin, mitkä sallivat HCV:n RNA:n • t · käänteistranskription HCV:n cDNA:ksi. Olosuhteet RNA:n * . . käänteistranskriptoimiseksi ovat alan ammattilaisille tunnettuja • · · ja niitä kuvaa esimerkiksi Maniatis et ai. (1982) ja julkaisu • · · *·| ’ 35 Methods in Enzyraology. Käänteistranskription parhaana pidetty ·:·: menetelmä käyttää eri lähteistä peräisin olevaa käänteistrans- ·"'· kriptaasia, sisältäen yhdistelraäraolekyylit ja jotka on eristetty esimerkiksi retroviruksista, mieluummin linnun royeloblastoosivi- • · 1 · · ! 105279 i 42 ruksesta (AMV) ja transkriptiolle sopivia olosuhteita. Käänteis-transkription HCV:n cDNA-tuote on RNA:DNA-hybridissä, mikä on tulos ensimmäisestä käänteistranskription kierroksesta; sen jälkeen DNA:DNA-hybridissä, mikä on tulos kahdesta tai useammasta 5 transkription kierroksesta.
Käänteistranskriptiosta tuloksena oleva HCV:n cDNA saatetaan sitten PCR:ään kohdesekvenssin monistamiseksi. Tämän suorittamiseksi HCV:n cDNA denaturoidaan ja erotetut säikeet 10 hybridi soidaan alukkeiden kanssa, mitkä tulevat kohdesekvenssin sivulle.
Säikeiden erottaminen voidaan tehdä millä tahansa sopivalla denaturointimenetelmällä, sisältäen fysikaalisen, kemiallisen 15 tai entsymaattisen välineen, mitkä ovat tunnettuja alan ammattilaisille. Parhaana pidettyyn menetelmään, mikä on fysikaalinen, liittyy nukleiinihapon kuumennus, kunnes se on täysin (>99 %) denaturoitu. Tyypilliseen kuumennusdenaturointiin liittyy lämpötilat alueella noin 80°C - n. 105°C, ajoiksi 20 alueella noin 1 -10 minuuttia.
HCV:n cDNA:n alukkeilla hybridisoinnin jälkeen kohde-HCV-sekvenssit replikoidaan polymerointivälineillä, mitkä käyttävät alukeoligonukleotidia replikaattiketjun synteesin aloittamiseksi. 25 Alukkeet valitaan niin, että ne ovat komplementaarisia HCV-genomin sekvensseille. Oligomeerialukkeet, mitkä ovat komplementaarisia HCV:n cDNA:n sense- tai antisensesäikeen alueille, ...V voidaan suunnitella kuviossa 18 annetun yhdistelmä-cDNA-sekvens- ·.: · sin HCV:n cDNA-sekvensseistä.
·:**? 30 jT; Alukkeet valitaan niin, että niiden suhteelliset asemat dupleksisekvenssiä pitkin ovat sellaiset, että yhdestä alukkeesta .·. : syntetisoitu pidentymätuote, kun se on erotettu mallineestaan • · · .··.·’ (komplementista), toimii mallineena toisen alukkeen pidentymälle < · · 35 antaakseen määritellyn pituisen replikaattiketjun.
• ·
Aluke on mieluummin yksisäikeinen amplifikoinnin maksimitehon .· ·. takia, mutta se voi vaihtoehtoisesti olla kaksisäikeinenkin.
* · · • · «· 105279 43
Jos se on kaksisäikeinen, aluketta käsitellään ensin sen säikeiden erottamiseksi, ennenkuin sitä käytetään pidentymä tuotteiden valmistukseen. Aluke on mieluummin oligodeoksiribonuk-leotidi. Alukkeen täytyy olla riittävän pitkä pidentymä tuotteiden 5 synteesin aloittamiseksi polymerointiaineen läsnäollessa. Aluk-keiden tarkat pituudet riippuvat monista tekijöistä, sisältäen lämpötilan ja alukkeen lähteen ja menetelmän käytön. Esimerkiksi kohdesekvenssin monimutkaisuudesta riippuen sisältää oligonuk-leotidialuke tyypillisesti noin 15-45 nukleotidia, vaikka se 10 voi sisältää useampia tai harvempia nukleotideja. Lyhyet alukemolekyylit vaativat yleensä viileäraraät lämpötilat muodostaakseen riittävän stabiileja hybridikomplekseja mallineen kanssa.
15 Tässä käytetyt alukkeet valitaan olemaan "olennaisen" komplementaarisia kunkin spesifisen amplifioitavan sekvenssin eri säikeil-le. Siksi alukkeiden ei tarvitse heijastaa mallineen tarkkaa sekvenssiä, vaan niiden täytyy olla riittävän koralementaarisia hybridisoituakseen selektiivisesti niiden vastaaviin säikeisiin. 20 Esimerkiksi ei-komplementaarinen nukleotidifragmentti voi kiinnittyä alukkeen 5'-päähän lopun alukesekvenssistä ollessa komplementaarinen säikeelle. Vaihtoehtoisesti ei-komplementaarisia emäksiä tai pitempiä sekvenssejä voidaan sirotella alukkeeseen väliin, edellyttäen, että alukkeella on riittävästi 25 kömpiementaarisuutta yhden amplifioitavan säikeen sekvenssin kanssa hybridisoituaksen sen kanssa ja siten muodostaakseen dupleksirakenteen, mitä voidaan jatkaa polymerointivälineillä. Alukkeiden ei-komplementaariset nukleotidisekvenssit voivat sisältää restriktioentsyymien paikkoja. Restriktioensyymipaikan ·:·’· 30 lisääminen kohdesekvenssin päihin olisi erityisen avuliasta kohdesekvenssin kloonaamiseksi.
• 1 · · Ymmärretään, että tässä käytettynä "aluke" voi viitata useampaan · · '?./ kuin yhteen alukkeeseen, erityisesti siinä tapauksessa, missä 9 · · '.35 on jonkin verran epäselvyyttä tiedossa, mikä koskee monistettavan kohdealueen päätesekvenssejä. Tästä syystä "aluke" sisältää kokoelman alukeoligonukleotideja, mitkä sisältävät sekvenssejä, ·'· mitkä edustavat mahdollisia vaihteluita sekvensenssissä tai « 1 • · • · 1 · v · · • · 1
• V
105279 44 sisältävät nukleotideja, mitkä sallivat tyypillisen emäspariutu-roisen. Yksi alukeoligonukleotideista tässä kokoelmassa on homologinen kohdesekvenssin pään kanssa. Erityinen tapaus on esitetty esimerkeissä, missä 44-meerin ja 45-meerin oligomeeri-5 sarjoja käytettiin aloittamaan HCV-genomin potentiaalisesti vaihtelevan alueen monistaminen.
Oletetaan, että on lukuisia HCV:n kantoja tai eristeitä, joissa on sekvenssejä, mitkä poikkeavat HCV1: stä, pro to tyyppi kanna s ta. 10 Siksi on suositeltavaa varianttikantojen osoittamiseksi rakentaa alukkeita, mitkä hybridi soi tuvat HCV-genomin säilyviin alueisiin. Säilyvät alueet voidaan määrittää vertaamalla useiden HCV-kantojen/eristeiden nukleotidi- tai aminohapposekvenssejä. Näyttää olevan ainakin kolme säilyvien aminohappojen aluetta 15 HCV-genomissa, joita kuvataan alla, joista alukkeet voivat olla r peräisin. Tällaisia alueita uskotaan olevan. Alla esimerkeissä kuvatut alukkeet on johdettu siitä, minkä uskotaan olevan HCVsn säilyviä alueita, perustuen sekvenssihomologiaan Flaviviruksien alueiden kanssa.
20
Oligonukleotidialukkeita voidaan valmistaa millä tahansa sopivalla menetelmällä. Alalla tunnetaan menetelmiä valmistaa erityisen sekvenssin oligonukleotideja ja ne sisältävät esimerkiksi sopivien sekvenssien kloonaamisen ja restriktion 25 ja suoran kemiallisen synteesin. Kemialliset synteesimenetelmät voivat sisältää esimerkiksi fosfotriesterimenetelmän, jonka on kuvanneet Narang et ai. (1979), fosfodiesterimenetelmän, minkä on esittänyt Beaucage et ai. (1981) ja kiinteän kantajan jti’i menetelmän US-patentissa 4,458,066.
30
Alukkeet voivat olla leimattuja haluttaessa liittämällä välineitä, mitkä ovat osoitettavissa spektroskooppisilla, . valokemiallisilla, biokemiallisilla, immunokemiallisilla tai kemiallisilla välineillä.
0 0 · « · · \ 35 *i"i Oligonukleotidialukkeiden roallineriippuvaa pidentymistä katalysoi polyraeroiintiaine sopivien määrien neljää deoksiribonukleotldi-trifosfaattia (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) tai analogeja läsnäol- • · f 11 · » · · • «· • · 105279 45 lessa reaktioväliaineessa, mikä muodostuu sopivista suoloista, metallikationeista ja pH-puskurijärjestelmästä. Sopivia polymerointiaineita ovat entsyymit, joiden tiedetään katalysoivan aluke- ja terapiaattiriippuvaa DNA-synteesiä. Tunnetut DNA-5 polymeraasit sisältävät esimerkiksi E. Coli-DNA-polymeraasl I:n tai sen Klenow-fragmentin, T4-DNA-polymeraasin ja Taq-DNA-polymeraasin. Reaktio-olosuhteet DNA-synteesin katalysoimiseksi näillä DNA-polymeraaseilla ovat alalla tunnettuja.
10 Synteesituotteet ovat dupleksimolekyylejä, mitkä muodostuvat mallinesäikeistä ja alukkeen pidentymäsäikeistä, mitkä sisältävät kohdesekvenssin. Nämä tuotteet toimivat vuorostaan mallineena toiselle replikointikierrokselle. Toisella replikointikierroksel-la ensimmäisen syklin alukkeen pidentymäsäie liitetään komplemen-15 taarialukkeeseensa; synteesi antaa "lyhyen" tuotteen, mikä sidotaan sekä 5'- että 3'-päissä alukesekvensseillä tai niiden komplementeilla. Toistuvat denaturointi-, alukkeen liitos- ja pidentymissyklit antavat tuloksena alukkeiden määrittämän kohdealueen eksponentiaalisen kerääntymisen. Riittävästi syklejä 20 suoritetaan, jotta saadaan haluttu määrä polynukleotidia, mikä sisältää nukleiinihapon kohdealueen. Haluttu määrä voi vaihdella ja sen määrittää toiminto, mitä varten tuotepolynukleotidi on.
PCR-menetelmä voidaan suorittaa lukuisissa ajallisissa . 25 sekvensseissä. Esimerkiksi se voidaan suorittaa askelittain, missä jokaisen askelen jälkeen lisätään uusia reagensseja ja ··; tavalla, missä kalkki reagenssit lisätään samanaikaisesti tai ··· ···1 osittaisvaiheittaisella tavalla, missä tuoreita reagensseja • · * lisätään annetun määrän askeleita jälkeen.
*:·'.:30 :T: Parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suoritetaan PCR-reaktio automaattisena prosessina, mikä käyttää lämpöstabiilia entsyymiä. Tässä prosessissa reaktioseosta kierrätetään denaturointialueen, • · .·;·. alukkeen liittämisalueen ja reaktioalueen läpi. Voidaan käyttää « « ’ 35 konetta, mikä sopii erityisesti käytettäväksi lämpöstabiilin ' entsyymin kanssa, mikä käyttää lämpökierrätystä ilman nesteenkä- • I · sittelyjärjestelmää, koska entsyymiä ei tarvitse lisätä joka • · « · f ♦ 1 · • · · • · · • · 105279 46 syklissä. Tämän tyyppinen kone on kaupallisesti saatavilla Perkin Elmer Cetus Corpslta.
PCR:llä tapahtuvan monistuksen jälkeen osoitetaan kohdepolynuk-5 leotidit hybridisoimalla koetinpolynukleotidin kanssa, mikä muodostaa stabiilin hybridin kohdesekvenssin kanssa hybridisoin-ti- ja pesuolosuhteissa, mitkä ovat tiukoista kohtalaisen tiukkiin. Jos odotetaan, että koettiraet ovat täysin komplementaarisia (s.o. n. 99% tai enemmän) kohdesekvenssin kanssa, 10 käytetään tiukkoja olosuhteita. Jos odotetaan jonkin verran epäsopivuutta, esimerkiksi jos varianttikantoja odotetaan sillä tuloksella, että koetin ei ole täysin komplementaarinen, voidaan hybridi säätiön tiukkuutta vähentää. Kuitenkin valitaan sellaiset olosuhteet, mitkä säätävät ei-spesifistä/satunnaista sitouturais-15 ta. Olosuhteet, mitkä vaikuttavat hybridisaatioon ja mitkä valitsevat ei-spesifisen sitoutumisen pois, ovat alalla tunnettuja ja niitä kuvaa esimerkiksi Maniatis et ai. (1982). Yleensä alempi suolapitoisuus ja korkeampi lämpötila lisäävät sitoutumisen tiukkuutta. Esimerkiksi tavallisesti ajatellaan, 20 että tiukkoja olosuhteita ovat inkubointi liuoksissa, mitkä sisältävät suunnilleen 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, noin 65°C
inkubointi/pesulämpötila ja kohtuullisen tiukkoja olosuhteita ovat inkubointi liuoksissa, mitkä sisältävät suunnilleen 1-2 X SSC, 0,1 % SDS ja noin 50-65°C inkubointi/pesulämpötila. ,,,25 Alhaisen tiukkuuden olosuhteet ovat 2 x SSC ja noin 30-50eC.
Koettimet HCV-kohdesekvensseille voidaan johtaa HCV:n cDNA- • · · ;··; sekvenssistä, mikä on esitetty kuviossa 18 tai uusista HCV- '·· · eristeistä. HCV-koettimet voivat olla mitä tahansa sopivaa *·**· 30 pituutta, mikä ulottuu kohdealueelle, mutta mikä sulkee pois
• M
v 1 alukkeet ja mikä. sallii spesifisen hybridi säätiön kohdealueeseen.
Jos tulee olla täydellinen kompleroentaarisuus, s.o. jos kanta sisältää sekvenssin, mikä on identtinen koettimen sekvenssin • · kanssa, koska dupleksi on suhteellisen stabiili jopa tiukoissa * .35 olosuhteissa, koettimet voivat olla lyhyitä, s.o. alueella noin • < · I · ’<t1 10-30 emäsparia. Jos odotetaan jonkin verran epäsopivuutta *·;1 koettimessa, s.o. jos epäillään, että koetin hybridisoituu varianttialueelle, koetin voi olla pituudeltaan suurempi, koska • · » « 105279 47 pituus näyttää tasapainottavan joidenkin epäsopivuuksien vaikutusta. Esimerkki tästä löydetään esimerkeistä, missä koetin suunniteltiin sitoutumaan potentiaalisiin HCVl:n variantteihin. Tässä tapauksessa alukkeet suunniteltiin sitoutumaan HCV:n 5 cDNAshan, mikä on peräisin hypoteettiselta HCV:n genoroin säilyvältä alueelta ja kohdealue oli sellainen, mikä potentiaalisesti sisälsi vaihteluita (perustuen Flavivirusmalliin) . HCV-kohdesekvenssien osoittamiseen käytetty koetin sisälsi ’ suunnilleen 268 emäsparia.
10
Koetinnukleiinihappo, jolla on kohdesekvenssille komplementaarinen sekvenssi, voidaan syntetisoida käyttäen samanalaisia tekniikoita kuin on kuvattu yllä alukesekvenssien syntetisoi-miseen. Haluttaessa koetin voi olla leimattu. Sopivia leimoja 15 on kuvattu yllä.
Joissakin tapauksissa voi olla haluttavaa määrittää koettimella osoitettavan PCR-tuotteen pituus. Tämä voi olla erityisen totta, jos epäillään, että variantti-HCV-kannat voivat sisältää häviäroiä 20 kohdealueella tai jos toivotaan varmistettavan PCR-tuotteen pituus. Sellaisissa tapauksissa on toivottavaa suorittaa tuotteille kokoanalyysi ja myös hybridisointi koettimen kanssa. Nukleiinihappojen koon määritysmenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi geelielektroforeesin, sedimentoinnin 25 gradienteissa ja geeliekskluusiokromatografiän.
Kohdesekvenssin läsnäolo biologisessa näytteessä osoitetaan • · · •••j määrittämällä onko muodostunut hybridi HCV-polynukleotidikoet- • « « m ‘ tiraen ja nukleiinihapon, jolle on tehty PCR-monistustekniikka, 1 :"’:30 välillä. Menetelmät hybridien osoittamiseksi, mitkä ovat • · · ·,· ' muodostuneet koettimen ja nukleiinihapposekvenssin välille, ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi mukavuuden vuoksi leimaamaton 1 näyte voidaan siirtää kiinteälle matriisille, mihin se sitoutuu • · ja sidottu näyte saatetaan olosuhteisiin, mitkä sallivat 1 .35 spesifisen hybridi soi tumi sen laimatun koettimen kanssa; kiinteä matriisi tutkitaan sitten leimatun koettimen läsnäolon varalta.
* · ·
Vaihtoehtoisesti, jos näyte on leimattu, leimaamaton koetin sidotaan matriisiin ja sopiville hybridisaatio-olosuhteille • · • « · • · · • · 105279 48 altistuksen jälkeen matriisi tutkitaan leiman läsnäolon varalta. Muita sopivia hybridisaatioanalyysejä kuvataan yllä.
Variantti-HCV-sekvenssien määrittäminen käyttäen PCR:ää 5
Variantti-HCV-kantojen identifioimiseksi ja samalla koettimien tekemiseksi noille varianteille käytetään ylläkuvattua HCV/cPCR-menetelmää HCV-genorain varianttialueiden monistamiseksi niin, että näiden varianttikohdealueiden nukleotidisekvenssit voidaan 10 määrittää. Yleisesti HCV: n variantti tyyppejä voitaisiin odottaa esiintyvän eri maantieteellisissä paikoissa kuin missä HCV1-kanta on vallitseva, esimerkiksi Japanissa, Afrikassa jne; tai eri imettäväisiäjeissa, mitkä ovat myös viruksen infektoimia. Variantti-HCV voi myös syntyä kulkiessaan kudosviljelyjärjestel-15 missä tai ne voivat olla tulosta spontaaneista tai aiheutetuista mutaatioista.
Varianttikohdealueen monistamiseksi tehdään alukkeita menemään rinnan epäillyn alueen kanssa ja mieluummin ne ovat koroplemen-20 taarisia säilyville alueille. Alukkeita kahdelle HCV:n alueelle, mitkä ovat todennäköisesti säilyviä, perustuen Flavivirusmalliin, kuvataan esimerkeissä. Näitä alukkeita ja koettimia voidaan tehdä käyttäen kuviossa 18 annettua HCV1 -kannan sekvenssitietoa.
25 Kohdealueiden nukleotidisekvenssien analyysi voi olla PCR-raonistettujen tuotteiden suora analyysi. Prosessin PCR-monistettujen tuotteiden suoraksi sekvenssianalyysiksi on kuvannut Saiki et ai. (1988).
• · · • · · • · · · * 30 Vaihtoehtoisesti monistetut kohdesekvenssit voidaan kloonata • · · *.* : ennen sekvenssianalyysiä. Menetelmän suoraksi kloonaamiseksi ja entsymaattisesti monistettujen genomisekvenssien sek-!/·· venssianalyysiksi on kuvannut Scharf (1986) . Menetelmässä PCR- tekniikassa käytettyjä alukkeita modifioidaan lähellä niiden ] . 35 5'-päitä tuottamaan sopivia restriktiopaikkoja kloonattavaksi suoraan esimerkiksi Ml3-sekventointivektoriin. Monistuksen • · jälkeen PCR-tuotteet lohkaistaan sopivilla restriktioentsyymeil-lä. Restriktiofragmentit kiinnitetään M13-vektoriin ja 105279 49 transformoidaan esimerkiksi JM 103-isäntään, levytetään ja tulokseksi saadut plakit seulotaan hybridisoimalla leimatulla oligonukleotidikoettimella. Muita menetelmiä kloonaamiseksi ja sekvenssianalyysiksi tunnetaan alalla.
5
Ylelsalukkeita Flavlviruksia 1a HCV:tä varten
Tutkimukset HCV:n genomin luonteesta käyttäen koettimia, mitkä ovat peräisin HCV:n cDNA:sta ja myös HCV:n cDNA:han sisältyvästä 10 sekvenssitiedosta ehdottavat, että HCV on F1 avityyppinen virus. Näitä tutkimuksia on kuvattu EP-julkaisussa 318,216, missä hakijana on sama kuin tässäkin ja mikä liitetään tähän kokonaisuudessaan. HCV:n cDNA-klooneista peräisin olevien HCV:n cDNA-sekvenssien vertailu lukuisien Plaviviruksien tunnettuihin 15 sekvensseihin osoittaa, että HCV sisältää sekvenssejä, mitkä ovat homologisia Flaviviruksien säilyvien alueiden kanssa. Nämä säilyvät sekvenssit voivat sallia alukkeiden luomisen, mitkä voivat olla yleisiä käytössään Flaviviruksien kohdealueiden monistamista ja HCV:tä varten. Nämä sekvenssit ovat 16-meerejä 20 tai pienempiä sekvenssejä esimerkeissä kuvattujen alukkeiden 3'-päistä. Näiden lajien identifiointi suoritetaan sitten käyttäen koetinta, mikä on spesifinen lajille. Lukuisien Flaviviruksien genomit ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi Japanilaisen enkefaliittiviruksen (Sumioshi et ai. ,·,·,25 (1987)), keltakuumeviruksen (Rice et ai. (1985)), Dengue tyypin 2 viruksen (Hahn et ai. (1988)), Dengue tyypin 4 viruksen (Mackow (1987)), ja Länsi-Niilin viruksen (Castle et ai. (1986)). HCV:n • · 1 ;··; RNA:n identifiointi suoritetaan käyttäen koetinta, mikä on • · · : spesifinen HCV: lie, minkä sekvenssin voivat määrittää HCV:n :1‘:30 cDNA-sekvenssit, mitkä on annettu tässä.
• · « * « · • · «
Vaihtoehtoisesti sellaisten koetinsarjojen käyttö, mitkä on 7 tarkoitettu ottamaan lukuun kodonidegeneraation ja siksi sisältää • · yhteisiä sekvenssejä Flaviruksille ja HCV: lie, kuten on ’ .35 määritetty vertaamalla HCV-aminohapposekvenssejä Flaviviruksien ' / tunnettuihin sekvensseihin, sallii näiden virusten yleisen ·...1 osoitusjärjestelmän.
• · · • ·
M
105279 50
Haluttujen DNA-sekvenssien rakentaminen
Synteettisiä oligonukleotideja voidaan valmistaa käyttäen automatisoituja oligonukleotidisyntetisoijia, kuten Warner (1984) 5 kuvaa. Haluttaessa synteettiset säikeet voidaan leimata 32P:llä käsittelemällä polynukleotidikinaasilla 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardeja reaktio-olosuhteita.
DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cDNA-10 kirjastoista, voidaan muokata tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoinnin, jota on kuvannut Zoller (1982). Lyhyesti muokattava DNA pakataan faagiin yksisäikeisenä sekvenssinä ja se muutetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi DNA-polymeraasilla käyttäen alukkeena synteettistä 15 oligonukleotidia, joka on komplementaarinen DNA:n muokattavalle osalle ja jossa on haluttu modifikaatio sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tuloksena oleva kaksisäikeinen DNA transformoidaan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeriä. Transformoidun bakteerin viljelmät, jotka sisältävät faagin kunkin säikeen replikaatio-20 tuotteita, pinnoitetaan agariin plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutaatiosekvenssi ja jäljellä olevassa 50 %:ssa on alkuperäinen sekvenssi. Plakkien replikaatit hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koettimiin lämpötiloissa ja olosuhteissa, jotka ...25 sallivat hybridisaation oikean säikeen kanssa, mutta ei modifioiraattoman sekvenssin kanssa. Sekvenssit, jotka on tunnistettu hybridisaation avulla, otetaan talteen ja kloonataan.
• · · * t » • « · : Koesarjat HCV-perälsten polvnukleotidien seulomiseksi : * 30 • · · ; Oligomeerit, jotka ovat koettimia ja/tai alukkeita näytteiden amplifioimiseksi ja/tai seulomiseksi HCV:n varalta, voidaan pakata koesarjoihin. HCV:n seulomiseksi tarkoitetut koesarjat :T: sisältävät oligomeeriset koetin-DNA:t. HCV-sekvenssien >t‘. 35 amplif ioimiseksi tarkoitetut koesarjat voivat sisältää • · oligomeerialukkeet, joita käytetään amplifioimisessa. Koesarjat • » " sisältävät tavallisesti koettimet tai alukkeet ennalta mitatussa tai ennalta määrätyssä määrässä ja myös muut sopivasti pakatut < · » 105279 51 reagenssit ja materiaalit erilisissä sopivissa säiliöissä, joita tarvitaan erityisiin hybridi sointi- ja/tai araplif iointimenet-telyihin. Esimerkiksi koesarja voi sisältää standardeja, puskureita, kantajia, entsyymejä, alustoja, leimakoettimia, 5 sidospartnereita ja/tai ohjeita kokeen suorittamiseksi.
Esimerkit
Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu vain kuvaaraistarkoituksessa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön 5 piiriä.
Päällekkäin menevien HCV:n cDNA-kloonlen 13i. 261, CA59a. CA84a. CA156e 1a CA167b eristäminen 1a sekvenssi 10 Kloonit 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e ja CA167b eristettiin lambda-gtll-kirjastosta, joka sisältää HCV:n cDNA:ta (ATCC No. 40394), jonka valmistus on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 (julkaistu 31.05.1989) ja julkaisussa WO 89/04669 (julkaistu 01.06.1989). Kirjaston seulonta tapahtui koettimilla, jolta 15 kuvataan alla, käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut Huynh (1985). Frekvenssi, jolla positiivisia klooneja ilmestyi vastaavien koettimien kanssa on noin 1:50000.
Kloonin 131 eristäminen suoritettiin käyttäen synteettistä 20 koetinta, joka oli peräisin kloonin 12f sekvenssistä. Koettimen ... sekvenssi oli: 5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG G AC AGG 3' .
* · • · « • i ·
Kloonin 26j eristäminen suoritettiin käyttäen koetinta, joka 25 oli peräisin kloonin K9-1 5'-alueelta. Koettimen sekvenssi oli: 5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3·.
• a • · ·
Kloonin 12f ja kloonin k9-l (jota kutsutaan myös K9-l:ksi) \ ' eristysraenettelyt on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja niiden 30 sekvenssit on esitetty kuvioissa 1 ja vastaavasti 2. Kloonien 13i ja 26j HCV:n cDNA-sekvenssit on esitetty kuvioissa 4 ja vastaavasti 5. Niissä on esitetty myös niihin kooditetut 52 105279 aminohapot ja myös kloonin 131 päällekkäisyys kloonin 12f kanssa ja kloonin 26j päällekkäisyys kloonin 131 kanssa. Näiden kloonien sekvenssit varmistivat kloonin K9-1 sekvenssin. Klooni K9-1 oli eristetty eri HCV.-n cDNA-kirjastosta (Ks. EP-218,316).
5
Klooni CA59a eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 26j 5'-alueeseen. Tämän koettimen sekvenssi olit 5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.
10 Kloonin CA59a sekvenssistä peräisin olevaa koetinta käytettiin eristämään klooni CA84a. Tätä eristystä varten käytetyn koettimen sekvenssi oli: 5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3’.
15 Klooni CA156e eristettiin käyttäen koetinta, joka oli peräisin kloonin CA84a sekvenssistä. Koettimen sekvenssi olit 5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.
Klooni CA167b eristettiin käyttäen koetinta, joka oli peräisin 20 kloonin CA156e sekvenssistä. Koettimen sekvenssi oli: 5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.
HCV:n cDNAsoiden nukleotidisekvenssit klooneissa CA59a, CA84a, CA156e ja CA167b on esitetty vastaavasti kuvioissa 6, 7, 8 ja • ‘• 25 9. Niissä koodi tetut aminohapot ja myös päällekkäisyys relevanttien kloonien kanssa on myös esitetty kuvioissa.
• • · · HCV:n cDNA-kirlaston "oi" luominen • · · • · · · 30 HCV:n cDNA-kirjasto, "pi"-kirjasto, rakennettiin samasta erästä V ’ infektoitunutta simpanssin plasmaa, mitä käytettiin HCV:n cDNA:n lambda-gtll-kirjaston rakentamiseen (ATCC No. 40394), mitä • · kuvattiin EP-julkaisussa No. 318,216 ja käyttäen olennaisesti :T: samoja tekniikoita. Kuitenkin pi-kirjaston rakentaminen käytti 35 alukepidennysmenetelmää, jossa käänteistranskriptaasin aluke ... perustui kloonin CA59A sekvenssiin. Alukkeen sekvenssi oli: 5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'.
• · • · • · · 1 · • · « * ·« • · 105279 53
Kloonin pi 14a eristäminen 1a sekvenssi HCV: n cDNA-kirjaston "pi", jota kuvattiin yllä, seulonta koettimella, jota käytettiin eristämään klooni CA167b (Ks. yllä) 5 antoi tuloksena kloonin pil4a. Klooni sisältää noin 800 cDNA:n emäsparia, jotka menevät päällekkäin kloonien CA167b, CA156e, CA84a ja CA59a kanssa, jotka eristettiin HCV:n lambda-gt 11 cDNA-kirjastosta (ATCC No. 40394). Lisäksi pil4a sisältää myös noin ’ 250 emäsparia DNA:ta, jotka ovat ylävirtaan HCV:n cDNA:sta 10 kloonissa CA167b.
Kloonien CA216a. CA290a la ao30a eristäminen la sekvenssi
Perustuen kloonin CA167b sekvenssiin tehtiin synteettinen koetin, 15 jolla oli seuraava sekvenssi: 5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'.
Ylläolevaa koetinta käytettiin seulomaan kirjastoa, mistä oli tuloksena klooni CA216a, jonka HCV-sekvenssit on esitetty 20 kuviossa 10.
Tehtiin toinen koetin, käyttäen kloonin CA216a sekvenssiä, jolla oli seuraava sekvenssi: 5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3 1.
25
Lambda-gtll-kirjaston (ATCC No. 40394) seulonta tällä koettimella antoi kloonin CA290a, siinä olevien HCV-sekvenssien ollessa J***# esitettyjä kuviossa 11.
» ·
»M B
• «Ml [t,m 30 Rinnakkaisessa lähestymisessä tehtiin alukepidennys-cDNA-kirjasto » · · *·' 1 käyttäen nukleiinihappoa, joka oli uutettu samasta infek- tiokykyisestä plasmasta, mitä käytettiin alkuperäisessä ylläkuvatussa lambda-gtll-cDNA-kirjastossa. Käytetty aluke • · · v r perustui kloonien CA216a ja CA290a sekvenssiin: 35 5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'.
« · » · · • · f « ”1 cDNA-kirjasto tehtiin käyttäen menetelmiä, jotka olivat ·’...· samanlaisia kuin ne, joita kuvattiin aikaisemmin kirjastoja • « 105279 54 varten kloonien pi14a ja k9-l eristämiseen. Tämän kirjaston seulomiseen käytetty koetin perustui kloonin CA290a sekvenssiin: 5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'.
5 Klooni ag30a eristettiin uudesta kirjastosta ylläolevalla koettimella ja se sisälsi noin 670 HCV-sekvenssin emäsparia. Katso kuvio 12. Osa tästä sekvenssistä menee päällekkäin kloonien CA216a ja CA290a HCV-sekvenssin kanssa. Kloonin ag30a sekvenssin noin 300 emäsparia on kuitenkin ylävirtaan kloonista CA290a 10 saadusta sekvenssistä. Sekvenssissä, joka ei mene päällekkäin, on aloituskodoni (*) ja lopetuskodoneita, jotka voivat merkitä HCV:n ORP:n alkua. Kuviossa 12 ovat myös merkittyinä oletetut pienet kooditetut peptidit (#), joilla voi olla osa translaation säätelyssä ja myös oletettu ensimmäinen oletetun polypeptidin 15 aminohappo (/) ja siihen kooditetut alavirran aminohapot.
Kloonin CA205a eristäminen 1a sekvenssi
Klooni CA205a eristettiin alkuperäisestä lambda gtll -kirjastosta 20 (ATCC No. 40394) käyttäen synteettistä koetinta, joka oli peräisin HCV-sekvenssistä kloonissa CA290a (kuvio 11). Koettimen sekvenssi oli: 5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.
.·. 25 HCV:n cDNA:n sekvenssi CA205a:ssa, esitettynä kuviossa 13, menee päällekkäin molempien kloonien ag30a ja CA290a cDNA-sekvenssien kanssa. Sekvenssin päällekkäisyys CA290a:n sekvenssin kanssa • · · ;··; on esitetty pisteviivalla sekvenssin päällä (kuvio esittää myös · oletetut aminohapot, jotka on kooditettu tässä fragmentissa) .
30 • · · : Kuten havaitaan HCV:n cDNA-sekvensseistä klooneissa CA205a ja ag30a, oletettu HCV-polyproteiini näyttää alkavan ATG- :*·.· aloituskodoni s ta; HCV-sekvenssit molemmissa klooneissa sisältävät • · kehyksessä olevan vierekkäisen kaksoislopetuskodonin (TGATAG) • _ 35 42 nukleotidia ylävirtaan tästä ATG:stä. HCV:n ORF näyttää alkavan näiden lopetuskodonien jälkeen ja ulottuvan ainakin « · · *...’ 8907 nukleotidin matkan (katso kuviossa 18 esitetty yhdistelmä- HCV:n cDNA) .
• · • t m 105279
Kloonin I8q eristäminen 1a sekvenssi
Perustuen kloonin ag30a sekvenssiin (ks. kuvio 12) alkuperäisestä lambda gtll-kirjastosta (ATCC No. 40394) saatuun päällekkäin 5 menevän kloonin sekvenssiin, tehtiin synteettinen koetin, jolla oli seuraava sekvenssi: 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
* Alkuperäisen lambda gtll-HCV:n cDNA-kirjaston seulominen 10 koettiraella antoi kloonin 18g, jonka HCV:n cDNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 14. Kuviossa ovat esitettynä päällekkäisyys kloonin ag30a kanssa ja HCV:n cDNA:ssa kooditetut oletetut polypeptidit.
15 cDNA-sekvenssi kloonissa 18g (C18g tai 18g) menee päällekkäin kloonien ag30a ja CA205a sekvenssien kanssa, joita kuvattiin yllä. C18g:n sekvenssi sisältää lopetuskodonialueen, joka havaittiin kloonissa ag30a. Näistä lopetuskodoneista ylävirtaan olevan polynukleotidin alue oletettavasti edustaa osaa HCV- 20 genomin 5'-alueesta, mikä voi sisältää lyhyitä ORF:iä ja mikä voidaan vahvistaa suoralla puhdistetun HCV-genomin sekven- toimisella. Näillä oletetuilla pienillä kooditetuilla peptideillä voi olla säätävä osa translaatiossa. HCV-genomin C18g:n edustamasta alueesta ylävirtaan oleva alue voidaan eristää 25 sekvenssianalyysiä varten käyttäen olennaisesti EP-julkaisussa • « 318,216 kuvattua tekniikkaa cDNA-sekvenssien eristämiseksi kloonissa 12f olevasta HCV:n cDNA-sekvenssistä ylävirtaan. j“’ Olennaisesti syntetisoidaan pieniä käänteistranskriptaasin • 1 c *“ 1 oligonukleotidialukkeita, jotka perustuvat C18g:n sekvenssiin 30 ja niitä käytetään sitoutumaan vastaavaan sekvenssiin HCV:n « · · genomi-RNA:ssa. Alukesekvenssit ovat läheisiä tunnetulle C18g:n 5'-päälle, mutta riittävästi alavirtaan salliakseen koetin- • · sekvenssien suunnittelun ylävirtaan alukesekvensseistä.
:Tr Tunnettuja vakiomenetelraiä alukkeilla varustamiseksi ja fi’,; 35 kloonaamiseksi käytetään. Tulokseksi saatuja cDNA-kirjastoja • · seulotaan sekvensseillä ylävirtaan alukepaikoista (pääteltynä C18g-.n selvitetystä sekvenssistä). HCV:n genomi-RNA saadaan joko plasma- tai maksanäytteistä yksilöistä, joilla on NANBH.
• · • · · • »1 ec 105279 56
Koska HCV näyttää olevan Flavityyppinen virus, genomin 5' -päätä voidaan muuntaa "cap"-rakenteella. On tunnettua, että Flaviviruksien genomit sisältävät 5'-pään "cap"-rakenteita. (Keltakuumevirus, Rice et ai. (1988); Dengue-virus, Hahn et 5 ai. (1988); Japanilainen enkefaliittivirus (1987)).
Kloonien eristäminen ia sekvenssi beta-HCVin cDNA-klrlastoista
Klooneja, jotka sisälsivät cDNA:ta, joka edusti HCV-genomin 10 3'-pään aluetta, eristettiin cDNA-kirjastosta, joka oli rakennettu alkuperäisestä infektoivasta simpanssin plasmava-rastosta, jota oli käytetty HCV:n cDNA:n lambda-gtll-kirjaston luomiseen (ATCC No. 40394), joka on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216. DNA-kir jaston luomiseksi varustettiin plasmasta saatu 15 RNA "hännällä" poly-rA:n kanssa käyttäen poly-(rA)-polymeraasia ja cDNA syntetisoitiin käyttäen oligo(dT) 12.18:a alukkeena käänteistranskriptaasia varten. Tulokseksi saatu RNA:cDNA-hybridi pilkottiin RNAasi H:11a ja muutettiin kaksisäikeiseksi HCV:n cDNA:ksi. Tulokseksi saatu HCV:n cDNA kloonattiin lambda-gtl0:een 20 käyttäen olennaisesti tekniikkaa, jonka on kuvannut Huynh (1985), mistä saatiin beta- (tai b-) HCV:n cDNA-kirjasto. Käytetyt menettelytavat olivat seuraavia.
Plasman näyte (12 ml) käsiteltiin proteinaasi K:11a ja sitä 25 uutettiin samalla tilavuudella fenolia, joka oli kyllästetty 0,05M Tris-HCl:llä, pH 7,5, 0,05 % (v/v) betaroerkaptoetanolilla, 0,18 % (w/v) hydroksikinoliinilla, 1 mM EDTA:lla. Tulokseksi saatua vesifaasia uutettiin uudelleen fenoliseoksella, mitä • · · ·· ’ seurasi 3 uutosta 1:1-seoksella, joka sisälsi fenolia ja * ’30 kloroformi:isoarayylialkoholia (24:1), mitä seurasi 2 uutosta : kloroformin ja isoamyylialkoholin (1:1) seoksella. Sen jälkeen kun vesifaasi oli säädetty 200 mM:ksi NaCl:n suhteen, saostettiin vesifaasin nukleiinihapot yli yön -20°C:ssa 2,5 tilavuudella kylmää absoluuttista etanolia. Saostumat kerättiin linkoamalla ’ . 35 10000 kierroksella 40 minuutin ajan, pestiin 70 %:lla etanolilla, ... joka sisälsi 20 mM NaCl:a ja 100 %:lla kylmällä etanolilla, • · kuivattiin 5 minuuttia dessikkaattorissa ja liuotettiin veteen.
• · • · 1 · • » · • · · • « 105279 57
Infektoivasta simpanssin plasmavarastosta olevat eristetyt nukleiinihapot varustettiin poly-rA-hännällä käyttäen poly-A-polymeraasiaihmisenistukkaribonukleaasi-inhibiittorin (HPRI) läsnäollessa (ostettiin Amersham Corp:lta) käyttäen MS2:n RNA:ta 5 kantajana. Eristettyjä nukleiiinihappoja, joita oli yhtä paljon kuin 2 ml:ssa plasmaa, inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi TMNsää (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCL2, 250 mM NaCl, 2,5 mM MnCl2, 2 mM ditiotreitolia (DTT)), 40 mikromolaarista alfa-i32PJ ATPjtä, 20 yksikköä HPRIstä (Amersham Corp.) ja noin 9-10 10 yksikköä RNaasivapaata poly-A-polymeraasia (BRL). Inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa ja reaktiot pysäytettiin EDTAtlla (lopullinen pitoisuus noin 250 mM) . Liuosta uutettiin yhtäläisellä tilavuudella fenoli-kloroformia ja samalla tilavuudella kloroformia ja nukleiinihappoja saostettiin yli yön -20°C:ssa 15 2,5 tilavuudella etanolia 200 mM NaCl:a läsnäollessa.
Kloonin b5a eristäminen
Beta-HCV:n cDNA-kir jastoa seulottiin hybridi säätiöllä käyttäen 20 synteettistä koetinta, jolla oli sekvenssi, joka perustui HCV?n cDNA-sekvenssiin kloonissa 15e. Kloonin I5e eristäminen on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja sen sekvenssi on esitetty kuviossa 3. Synteettisen koettimen sekvenssi oli s 5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.
25
Kirjaston seulominen antoi kloonin beta-5a (b5a), joka sisältää HCV:n cDNA-alueen, joka on suunnilleen 1000 emäsparia. Tämän • · · ”·; cDNAsn 5’-alue menee päällekkäin kloonien 35f, 19g, 26g ja 15e 11· : kanssa (kloonit on kuvattu edellä) . Alue poly-A-sekvenssin 3'- • * 30 pään ja sen 3'-sekvenssin, joka menee päällekkäin kloonin 15e __ « * · V : kanssa, välissä sisältää suunnilleen 200 emäsparia. Tämä klooni sallii HCV-genomin 3’-pään sekvenssin alueen identifioimisen.
! I I
I I I
• · · s
b5a:n sekvenssi sisältyy HCV:n cDNA-sekvenssiin kloonissa 16jh ‘.35 (kuvataan alla). Lisäksi sekvenssi on läsnä myös CC34a:ssa, mikä on eristetty alkuperäisestä lambda-gtll-kirjastosta (ATCC
• * '··* No. 40394) . (Alkuperäiseen larabda-gtl 1-kirjastoon viitataan tässä "C"-kirjastona) .
· • ♦ · • S8 105279
Sellaisten kloonien sekvenssin eristäminen, jotka on luotu HCV-genomin 3'-alueen PCR-ampllflkaatlolla
On luotu monia cDNA-klooneja, jotka sisältävät nukleoti-5 disekvenssejä, jotka ovat peräisin HCV-genomin 3'-alueelta. Tämä tehtiin ampli£ioimalla genorain kohdealuetta polyrae-raasiketjureaktiotekniikalla, jota on kuvannut Saiki et ai.
(1986) ja Saiki et ai. (1988), mitä muunnettiin kuten kuvataan alla. HCV:n RNA, joka amplifioitiin, saatiin alkuperäisestä 10 infektoivasta simpanssin plasma varastosta, jota käytettiin HCV: n cDNA:n larabda-gtll-kirjaston luomiseen (ATCC No. 40394), mitä kuvataan EP-julkaisussa 318,216. HCV:n RNA:n eristäminen tehtiin kuten kuvataan yllä. Eristetty RNA varustettiin hännällä 3'-päässä ATP;llä E. colin poly-A-polymeraasillaf kuten kuvaa Sippel 15 (1973), paitsi että simpanssin seerumista eristetyt nuk- leiiinihapot korvasivat nukleiiinihapposubstraatin. Hännällä varustettu RNA käänteiskopioitiin sitten cDNA:ksi kään-teistranskriptaasilla käyttäen oligo dT-alukesovitinta olennaisesti kuten kuvaa Hän (1987), paitsi että alukesovittimen 20 sekvenssin komponentit olivat:
Stufferi Hat! SP6 promoottori Aluke AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T,5
Tulokseksi saadulle cDNA:lle tehtiin amplifikointi PCRsllä 25 käyttäen kahta aluketta: ALuke. Sekvenssi
JH32 (30-meeri) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
• · ·
:**: JHl 1 (20-meeri) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
• · * » · * · · · 30 JH32-aluke sisälsi 20 nukleotidisekvenssiä, jotka kykenivät • ·· V ; hybridi soi tumaan cDNA:n kohdealueen 5’-päähän, arvioidun T^n ollessa 66° C. JH11 oli peräisin oligo dT-alukesovittiraen osasta; täten se oli spesifinen cDNA:n 3'-päälle ΤΛ:η ollessa 64*C. Molemmat alukkeet oli suunniteltu niin, että niillä oli j . 35 restriktioentsyymin, NotI, tunnistuspaikka 5'-päässä käytettäväksi sitä seuraavassa amplifioidun HCV:n cDNA:n kloonaamisessa.
• · • · • I · « • · · • *
* < I
• · *
• M
• « 105279 59 PCR-reaktio suoritettiin suspendoimalla cDNA ja alukkeet 100 μl:aan reaktioseosta, joka sisälsi neljää deoksinukleo-siditrifosfaattia, puskurisuoloja ja metalli-ioneja ja lämpöstabiilia DNA-polymeraasia, joka oli eristetty Thermus 5 acruaticuksesta (Taq-polymeraasi), jotka ovat Perkin Elmer Cetus-yhtiön PCR-välinesarjassa (N801-0043 tai N801-0055). PCR-reaktio suoritettiin 35 syklin ajan Perkin Elmer Cetus-yhtiön DNA:n lämpösyklerissä (DNA thermal cycler). Kukin jakso käsitti 1,5 minuutin denaturoimisvaiheen 94°C:ssa, lämpökäsittelyvaiheen 10 60°C:ssa 2 minuutin ajan ja alukkeen pidennysvaiheen 72°C:ssa 3 minuutin ajan. PCR-tuotteille tehtiin Southern-blot-analyysi käyttäen 30 nukleotidin koetinta, JH34, jonka sekvenssi perustui kloonin 15e 3'-pään sekvenssiin. JH34:n sekvenssi on: 5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.
15 HCV:n cDNA-koettimella osoitettujen PCR-tuotteiden kokoalue ulottui noin 50:stä noin 400:aan emäspariin.
Amplifioidun HCV: n cDNA:n kloonaamiseksi lohkaistiin PCR-tuotteet
NotI:llä ja valittiin koon mukaan polyakryyliamidigeelielektrofo- 20 reesilla. Suuremmat kuin 300 eraäsparin DNA:t kloonattiin pUC18S:n
NotI-paikkaan. Vektori pUC18S on rakennettu sisällyttämällä
NotI-polylinkkeri, joka on kloonattu pUC18:n EcoRI- ja Sali- paikkojen väliin. Kloonit seulottiin HCVsn cDNA:n suhteen käyttäen JH34-koetinta. Saatiin ja sekventoitiin lukumäärä 25 positiivisia klooneja. HCV:n cDNA-insertin nukleotidisekvenssi yhdessä näistä klooneista, 16 jh, ja aminohapot, jotka on ,i. koodi tettu siinä, on esitetty kuviossa 15. Nukleotidien ·"1. heterogeenisyys, mikä havaittiin HCV:n cDNAsn sekvenssissä * · · [“J kloonissa 16jh verrattuna toiseen tämän alueen klooniin on • · ... 30 merkitty kuvioon.
• « · I 1 ·
Kloonin 6k eristys 1a sekvenssi • i • · · · 1 · «·· ? Perustuen kloonin 16jh ja kloonin b5a sekvenssiin (ks. yllä) f 35 tehtiin synteettinen koetin, jolla oli seuraava sekvenssi: I I t • « 5' TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3' • 1 « 4 · • · • 1 1 · t • · « « 105279 60
Alkuperäisen larobda-gtll cDNA-kirjaston (kuvattu EP-julkaisussa 318,216) seulominen koettimella antoi tuloksena klooneja suunnilleen 1: 106 taajuudella; yhtä näistä kutsuttiin 6k:ksi (myös kutsuttu C6k:ksi), minkä HCV:n cDNA-sekvenssi on esitetty 5 kuviossa 16. Kuviossa on myös esitetty päällekkäisyys kloonin 16 jh kanssa ja oletetut polypeptidit, mitkä on kooditettu HCVsn cDNA.-ssa. HCV.-n cDNA:n sekvenssitieto kloonissa 6k saatiin vain yhdestä säikeestä. Tieto tämän kloonin talletuksesta on annettu alla, missä klooni on lueteltu Lambda gtll C6k:na. Vahvistus 10 C6k-sekvenssistä osana ORF:ää, mikä koodittaa HCVl-polypeptidiä, on saatu sekventoimalla muita päällekkäisiä klooneja.
Kloonin pl3!1h eristys 1a sekvenssi 15 Eristettiin klooni, mikä sisältää sekvenssin HCV-genomin 3'-alueelta ja mikä sisältää kehyksessä olevan pysäytyskodonin, olennaisesti kuten kuvattiin yllä niiden kloonien eristämiseksi, mitkä oli luotu genorain 3'-alueen PCR-monistamisella, paitsi että HCV1:n RNA muutettiin cDNA:ksi käyttäen oligonukleotidia 20 5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA T15 3' cDNA monistettiin sitten PCR-reaktiolla käyttäen alukkeitas 25 5' TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAG ACA T 3' 3a :**: 5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3’ • t · « t » ··· '
MIU
30 Monistuksen jälkeen PCR-tuotteet saostettiin spermiinillä, pilkottiin NotI:llä ja uutettiin fenolilla. Puhdistetut tuotteet kloonattiin pUC 18S:n NotI-paikkaan ja HCV-positiiviset kloonit valittiin käyttäen oligonukleotidia: • · • t · • · » 35 5' CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3'.
• · f « « m f · · • 1 · i · « 61 105279 HCV:n cDNA yhdessä kloonissa, mitä merkittiin pl31jh:na, on esitetty kuviossa 17. Tämä klooni sisältää kehyksessä olevan pysäytyskodonin HCV-genoraiin sisältyvää suurta ORFtää varten.
5 Klooni 5klooni 32:n eristys 1a sekvenssi
Eristettiin klooni, mikä sisälsi sekvenssin HCV-genomin 5'-alueelta, ylävirtaan sekvenssistä kloonissa bll4a ja nuk-leotidisekvenssi määritettiin muunnoksella menetelmää niiden 10 kloonien eristämiseksi ja sekventoiroiseksi, mitkä oli luotu genomin 3'-alueen PCR-monistuksella, kuvattuna US-patenttihakemuksessa 456,637, mikä liitetään tähän viitteeksi. Yleisesti genomin kohdealue monistettiin PCR-tekniikalla, minkä on kuvannut Saiki et ai. (1986) ja Saiki et ai. (1988). HCV.-n RNA, mikä 15 monistettiin, saatiin uuttamalla ihmisseeruraia (US-kliininen eriste HCV27) käyttäen kylmää guanidiinitiosyanaattimenetelmää, minkä on kuvannut Hahn et ai. (1987). Uutettu RNA muutettiin yksisäikeiseksi cDNA:ksi käänteistranskriptaasilla käyttäen aluketta JH94, mikä on komplementaarinen nukleotideille -250 -20 -223 HCV:n genomissa (ks. kuvio 18). JH94:n sekvenssi on: 5' CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3'.
Yksisäikeisen HCV:n cDNA:n muuttaminen kaksisäikeiseksi 25 suoritettiin hännästämällä DNA suunnilleen 20 - 50 daltonin tähteillä käyttäen terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (Sambrook et ai. (1989), MOLECULAR CLONING) ja replikoimalla hännällinen molekyyli käyttäen seuraavaa oligo-dT-alukesovitinta, mikä sisältää NotI-paikan ja sp6-promoottorin: 30 stufferi NotI SP,6. promoottori Muke AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15
Tulokseksi saatu cDNA monistettiin PCR:llä käyttäen kahta 35 aluketta, JH94 (kuvattu yllä) ja JH11, millä on seuraava sekvenssi: 62 105279
Aluke SfiJsvgilSal
JH11 (20-meeri) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
PCR-reaktio suoritettiin suspendoiraalla cDNA ja alukkeet 100 5 μl:aan reaktioseosta, mikä sisälsi neljää deoksinukleosiditrifos-faattia, puskurisuoloja ja metalli-ioneja ja lämpöstabiilia DNA-polymeraasia, mikä oli eristetty Thermus acruaticuksesta (Taq-polymeraasi), mitkä ovat Perkin Elmer Cetuksen PCR-välinesarjassa (N801-0043 tai N801-0055). PCR-reaktiota 10 suoritettiin 35 sykliä Perkin Elmer Cetus NDA-lämpösyklerissä. Kukin sykli käsitti 1,5 minuutin denaturointivaiheen 94eC:ssa, lämpökäsittelyvaiheen 60°C:ssa 2 minuuttia ja alukepiden-tyraävaiheen 72°C:ssa 3 minuuttia.
15 PCR-tuotteet pilkottiin NotI:llä ja kloonattiin pUC18S;ään. Kloonit, mitkä sisälsivät HCV-nukleotidisekvenssejä, saatiin seulomalla koettimella Alex90, mikä on peräisin HCVl-genorain nukleotideista -312 - -283 ja millä on sekvenssi: 20 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTC AGG AAC TAC 3' HCV:n cDNA:t eristetyissä klooneissa sekventoitiin dideoksiket-junlopetusmenetelmällä (Sanger et ai. (1977)). HCV:n cDNA:n sekvenssi yhdessä eristetyistä klooneista, kloonissa 5’-klooni32, 25 ulottuu nukleotidien -224 - -341 alueelle kuviossa 18.
.1·' HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssin analyysi osoitti, että HCVsn ·;· RNA-säikeen replikaatti sisältää GC-rikkaan alueen, mikä voi ···1 • kyetä muodostamaan stabiilin tukkapinnirakenteen: ♦ · · · 30
• · G-T A
σ= ;; λ A C-C-C-C-C-G C-C-G' 5' i \ i i i i y » \ .·. : « - 1 · 1 1 » ! ; •.·: i , i i i ( < 1 · _ , T-G-G-G-G-G-C-G-A-C 3 .
• · · ··1 ’ 35 ·:··: Rakenteessa katkoviivat merkitsevät mahdollisia vetysidoksia komplementaaristen nukleotidien välillä.
< I I
• · • « « ♦ » · tl· • «« • · j 105279 ί 63 ΐ
Tutkimus tietokonetietopankissa, Genebank'ssa, paljasti, että homologisia sekvenssejä ei ollut läsnä missään tunnetuissa virussekvensseissä. Täten tämä sekvenssi voi olla ainutkertainen HCV-genorain 5’-päälle.
5
Tukkapinnirakenne.voi toimia tunnistussignaalina transkrip-taasille ja/tai se voi tukea RNA:n stabiilisuutta 5'-päässä.
Kootut HCV:n cDNA-sekvenssit 10 HCV:n cDNA-sekvenssi on koottu sarjasta päällekkäin meneviä klooneja, jotka ovat peräisin eri HCV:n cDNA-kirjastoista, joita kuvataan tässä ja EP-julkaisussa 318, 216. Kloonit, joista kuvio 18 on peräisin ovat 5'-32, bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, 15 CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (myös kutsuttu k9-l:ksi), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16 jh, C6k japl31jh. Menetelmistä näiden kloonien eristämiseksi ja myös niiden sekvensseistä keskustellaan tässä 20 ja EP-julkaisussa 318,216, mikä liitetään tähän viitteeksi. Kuviossa 18 kolme täplää sekvenssin päällä merkitsee oletetun aloittavan metioniinikodonin paikkaa.
Klooni bll4a menee päällekkäin kloonien 18g, ag30a ja CA205a 25 kanssa, paitsi että klooni bll4a sisältää ylimääräiset kaksi ',· nukleotidia ylävirtaan kloonin 18g sekvenssistä (s.o. 5'-CA).
;:· Nämä kaksi ylimääräistä nukleotidia on sisällytetty kuviossa ··· 18 esitettyyn HCV:n genomin sekvenssiin.
« · t · • · » · 9 « · · M1 · 30 Olisi huomattava, etä vaikka useat yllä kuvatuista klooneista • · on saatu kirjastoista, jotka ovat muita kuin alkuperäinen HCV:n cDNA:n lambda-gtl1-C-kirjasto (ATCC No. 40394), nämä kloonit . . sisältävät HCV:n cDNA-sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin • · t alkuperäisen kirjaston HCV:n cDNA-sekvenssien kanssa. Täten • · ' 35 olennaisesti kaikki HCV-sekvenssit voidaan johtaa alkuperäisestä ·:··: lambda-gtll-C-kirjastosta (ATCC No. 40394), jota käytettiin ensimmäisen HCV:n cDNA-kloonin (5-1-1) eristämiseen. Kloonin
I 1 I
· I f · · • · · 105279 64 5-1-1 eristäminen on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216, mikä liitetään tähän viitteeksi.
Pääasiallisen HCV-polyproteiinin, mikä on kooditettu HCVl:n 5 cDNA:n kokoomassa, oletettu sekvenssi on myös esitetty. Ensimmäinen aminohappo sekvenssissä on suuren ORF:n oletettu initiattorimetioniini. Varianttiaminohapot, mitkä johtuvat klooniheterogeenisyyksistä, on merkitty sekvenssin päälle. Koska lambda gtll-kirjasto luotiin seerumista, mikä saatiin yhdestä 10 yksilöstä (ks. EP-julkaisu 318,216), tulokset ehdottavat, että variantteja virussekvenssejä (sekä nukleotidi että aminohappo) on läsnä tuossa yksilössä.
Kokooma-HCV:n cDNA-sekvenssien tutkimus osoittaa, että suuren 15 ORF.-n rinnalla on lukuisia ORFjeja ylävirtaan siitä, mikä koodittaa polyproteiinia ja sen sekvenssin sisällä, mikä koodittaa polyproteiinia on suuri lukumäärä pienempiä ORFieja kahdessa muussa translaatiokehyksessä. HCV-polyproteiinista ylävirtaan olevat ORF:t on esitetty juuri alla olevassa 20 taulukossa.
Taulukko ORF:t ylävirtaan siltä, mikä koodittaa suurta HCV- _ _polyproteiinia 25 1 aignaUEftbVB Aminohapposekvenssi
·:· -310 1 MNHSPVRNYCLHAESV
• t ·
··· -329 3 MGATLHHESLPCEELLSSRRKRLAMALV
» # « ·
: -246 2 MSWQPPGPPLPGEP
30 -127 1 MPGDLGVPPQDC
• · « • 1 · • · ·
Luentakehys, 0RF:ien asema ja koko alavirtaan sekvenssistä, . . mikä koodittaa oletettua polyproteiinin initiaattori-MET:iä * 1 1 on esitetty alla olevassa taulukossa. Pääasiallinen polyproteiini • · · ’·1 ‘ 35 on se, mikä on transloitu luentakehyksestä 2.
• i »· · « # • » 9 • · · • · 1 • · · • · a 105279
Taulukko ORF;t, mitkä ovat alavirtaan oletettua initiaattorl-MET:lä koodittavasta sekvenssistä 5 Luentakehyg Eaka_(aroihohappoa) Asema (sittäsparial 1 168 696 1 105 2343 1 119 5615 2 3025 -42 10 3 160 5 3 111 1667 3 148 6893
Ylläolevan lisäksi sen sekvenssin tutkiminen, mikä on 15 komplementaarinen HCV:n RNA:n genomisäikeelle, paljastaa, että se sisältää useita pieniä ORF:eja. Eräs näistä ORFseista, mikä on komplementaarinen nukleotideille -341 - +837 HCV:n RNA-sekvenssissä, koodittaa 385 aminohapon polypeptidiä.
20 5' -alueiden sekvenssien, mitkä on saatu HCV-erlsteistä eri maantieteellisistä palkoista, vertailu
Verrattiin nukleotidisekvenssejä HCV-eristelden 5'-alueilta 25 USA:sta (HCV18, HCV27), Italiasta (HCVI1, HCVI24) ja Koreasta (HCVK1).
HCV:n cDNA:n eristäminen tapahtui olennaisesti kuin kuvattiin yllä 5'-klooni32:n eristämiseksi seuraavin poikkeuksin. Uutettu 30 RNA käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi käyttäen alukkeina joko JH11:tta tai rl6:tta, mitkä ovat komplementaarisia HCV-nukleotideille -90 - -73 ja vastaavasti 366 - 383. Näiden alukkeiden sekvenssit ovat seuraavia: 35 Aluke Sekvenssi JH51 5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3' rl6 5' CAC GTA AGG GTA TCG ATG 3' 105279 66 HCV: n dsDNA:n monistus tehtiin PCR-menetelraällä käyttäen JH93 :a ja JH52:ta 5'- ja vastaavasti 3'-alukkeina. HCV-sekvenssi JH93:Ssa on peräisin HCV-nukleotideista -317 - -296, JH52?n HCV-nukleotideista -93 - -117; nukleotidiluvut on merkitty 5 suluissa sekvenssien alla. JH52:ssa alleviivattu dinukleotidi on mutatoitu luomaan NotI-paikan. Näiden alukkeiden sekvenssit ovat seuraavia.
(Alukel Stufferi Not? HCV-sekvenssi 10 (JH93) 5' TTC GCGGCCGC ACTCCATGAATCACTCCCC 3' (-317) (-296) (JH52) 5' AGTCTT GCGG££GC ACGCCCAAATC 3’ (-93) (-117) 15 Monistuksen jälkeen PCR-tuotteet lohkaistiin Notlsllä ja kloonattiin pUC18S:ään. HCV:n cDNA:t sekventoitiin joko suoralla sekventoiraisella PCR:llä monistuksen jälkeen tai vaihtoehtoisesti kloonatut HCV:n cDNA:t sekventoitiin alukepidennyksellä ja dideoksimenetelmällä. Alukepidentäminen ja dideoksimenetelmä 20 sekventoimiseksi suoritettiin, kuten kuvattiin yllä 5'-klooni32:n sekvenssiä varten.
PCR-menetelmä suoraa sekventointia varten käytti Alex90:ä (ks. yllä sekvenssiä) 5'-alukkeena ja r25:ttä 3'-alukkeena. Alex90 25 on peräisin HCV-nukleotideista -312 - -283 ja r25 on peräisin nukleotideista 365 - 342 (ks. kuvio 18). r25:n sekvenssi on: • · · 5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3'.
♦ · • · 1 • · · ··· · ·:··· 30 HCV27:n, HCVK1:n, HCVIl:n, HCVI24:n ja HCV18:n 5’-alueiden sekvenssien vertailu prototyyppi HCV:n, HCVl:n, sekvenssin kanssa osoitti seuraavaa. Tutkittu 5'-alue on erittäin säilyvä 5 HCV- . eristeen joukossa. Sekvenssi näytti olevan identtinen • · · I.,' lukuunottamatta yhtä nukleotidiä, mikä oli hävinnyt asemassa 35 171 HCVI24: ssä ja epäselvyyttä neljässä nukleotidissa asemissa *:··: -222 - -219 eristeessä HCVK1.
• · • 1 » · • « „ 105279
Korkean tason sekvenssin säilyminen tällä alueella voi heijastaa tämän alueen osaa virusreplikoinnissa ja/tai transkriptiossa ja/tai translaatiossa.
5 Eri yksilöistä peräisin olevien HCV-eristeiden sekvenssivaih^ telut HCV. n eristeitä, mitkä sisältävät sekvenssejä, mitkä poikkeavat CDC/HCV1:stä, identifioitiin ihmisyksilöistä, joista jotkut 10 olivat serologisesti positiivisia anti-C100-3-vasta-aineille (EC 10 oli vasta-ainenegatiivinen). Näiden uusien eristeiden identifiointi suoritettiin kloonaamalla ja sekventoiraalla HCV-genomin segmenttejä, mitkä oli monistettu PCR-tekniikalla käyttäen CDC/HCVlsn sekvenssejä. Monistus suoritettiin 15 olennaisesti perustuen HCV/cPCR-menetelmään. Menetelmä käyttää alukkeita ja koettimia, mitkä perustuivat tässä kuvattuihin HCV:n cDNA-sekvensseihin. Ensimmäinen vaihe menetelmässä on cDNA:n synteesi joko HCV-genoraiin tai sen replikatiiviseen välituotteeseen käyttäen käänteistranskriptaasia. HCV:n cDNA:n 20 synteesin jälkeen ja ennen monistamista näytteessä oleva RNA rikotaan alalla tunnetuilla tekniikoilla. HCV:n cDNA:n tarkoitettu segmentti monistetaan sitten käyttämällä sopivia alukkeita. Monistetut sekvenssit kloonataan ja monistetut sekvenssit sisältävät kloonit osoitetaan koettiraella, mikä 25 on komplementaarinen alukkeiden välissä olevalle sekvenssille, . / mutta mikä ei mene päällekkäin alukkeiden kanssa.
• · · HCV-eristeet. mitkä on eristetty USA:n ihmisistä • · • · * • · « • · « · ....· 30 Verinäytteet, mitä käytettiin HCV-virionien lähteenä, saatiin USA:n Punaiselta Ristiltä Charlotte, North Carolina ja Kansasin • · · * kunnallisesta verikeskuksesta, Kansas City, Missouri. Näytteet » . seulottiin HCV C100-antigeenien vasta-aineiden varalta käyttäen * * · I..' ELISA-analyysiä, mitä on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja sille • · · \ ’ 35 tehtiin lisä- Western-blottausanalyysi käyttäen polyklonaalista vuohen anti-ihmis HRP:tä anti-HCV-vasta-aineiden mittaamiseksi. Kaksi näytettä #23 ja #27 Amerikan Punaiselta Ristiltä ja » · · • * « · « «« 105279 68
Kansasin kunnalliselta verikeskukselta vastaavasti määritettiin HCV-positiivisiksi näillä analyyseillä.
Näiden näytteiden seerumissa läsnä olevat viruspartikkelit 5 eristettiin ultralinkouksella olosuhteissa, joita on kuvannut Bradley et ai. (1985). RNA uutettiin partikkeleista pilkkomalla proteinaasi K:11a ja SDS:llä loppupitoisuuksilla 10 μ9/πι1 proteinaasi K:ta ja 0,1 % SDS:ää; pilkkomista suoritettiin 1 tunti 37°C:ssa. Virus-RNA puhdistettiin edelleen uuttamalla 10 kloroformi-fenolilla, kuten kuvataan EP-julkaisussa 318,216.
RNA-valmisteessa oleva HCV-RNA käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi olennaisesti kuin on kuvattu EP-julkaisussa 318,216, paitsi että oligonukleotidia JHC 7, mikä vastaa cDNA-sekvenssiä 1958-15 1939 ja millä on seuraava sekvenssi, käytettiin alukkeena käänteistranskriptaasireaktiota varten.
JHC 7: CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG.
20 Sen jälkeen, kun molemmat cDNA:n säikeet oli syntetisoitu, tuloksena oleva cDNA monistettiin sitten PCR-menetelmällä olennaisesti kuin kuvattiin yllä niiden kloonien eristämiseksi, mitkä luotiin PCR-roonistuksella, paitsi että käytetyt oligonukleotidialukkeet, s.o. JHC 6 ja ALX 80, olivat tarkoitetut 25 monistamaan 1080 nukleotidin segmenttiä HCV-genomista CDC/HCVl:n nukleotideista 673 - 1751. Alukkeet ovat lisäksi suunniteltuja liittämään PCR-tuotteen Notl-restriktiopaikka 3' -päässä ja 5' -pään tylppä pää. Alukkeiden sekvenssit ovat: • · • · « · ·:··: 30 ALX 80: TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG; ja JHC 6: ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA.
• · · «
; ALX 80 vastaa CDC/HCV1-sekvenssin nukleotideja 673-701; JHC
6 vastaa HCVl:n nukleotideja 1752-1738 (lisäksi siinä on 12 35 ylimääräistä nukleotidia, mitkä koodittavat Notl-paikkaa). Nukleotidien merkintä JHC 6:ssa, s.o. aleneva luku, merkitsee järjestystä anti-sensesäikeessä.
• · · • · • · • · · 105279 69
Yllämainituilla alukkeilla PCR-raonistuksen jälkeen tylpän pään pääte muutettiin Notl-paikaksi seuraavasti. 15 dG:n homopolyraee-rihäntä kiinnitettiin PCR-tuotteeseen käyttäen terminaalista deoksinukleotiditransferaasia ja tuotteille tehtiin taas monistus 5 PCR:llä käyttäen alukkeita JHC 6 ja JHC 13. Jälkimmäinen aluke, JHC 13, minkä sekvenssi seuraa, on tarkoitettu sisältämään Notl-paikan SP6-faagipromoottorin lisäksi. (SP6-promoottori on kuvattu julkaisussa GENETIC ENGINEERING, toim. J. Setlow (1988)).
10 JHC 13: AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA
GAA CCC CCC CCC CCC CCC.
Monistetun HCV.-n cDNA:n kloonaamiseksi PCR-tuotteet lohkaistiin NotI: llä, saostettiin spermisidillä vapaiden oligonukleotidien 15 poistamiseksi (Hoopes et ai. (1981)) ja kloonattiin pUC18S:n Notl-paikkaan (ks. osa IV.A.34). HCV:n cDNArt kolmessa kloonissa, mitkä olivat peräisin kustakin HCV-eristeestä, sekvenssianaly-soitiin. Analyysi tehtiin olennaisesti menetelmällä, minkä on kuvannut Chen ja Seeburg (1985).
20
Yhtenevät sekvenssit klooneista, mitkä ovat peräisin HCV:stä näytteissä 23 ja 27 on esitetty kuvioissa 46 ja vastaavasti 47. Vaihtelevat sekvenssit on myös esitetty näissä kuvioissa, ja myös aminohapot, mitkä on kooditettu yhteneviin sekvensseihin. 25
Kuviot 39 ja 40 esittävät kohdakkaisten positiivissäikeisten nukleotidisekvenssien vertailua (Kuvio 39) ja oletettujen • · · ··· aminohapposekvenssien vertailua (Kuvio 40) näytteistä 23, 27 • · · · : ja HCV1. HCVlsn aminohapposekvenssi kuviossa 39 edustaa 30 arainohappolukuja 129-467 HCV-polyproteiinissa, mitä koodittaa • * .... suuri ORP HCV*.n genomi-RNA:ssa. Kuvioiden 46 ja 47 tutkimus • · ♦ ' osoittaa, että kolmen eristetyn kloonin sekvenssessä on vaihteluja. Sekvenssivaihtelut nukleotidi tasolla ja aminohap- • · · potasolla on annettu välittömästi alla olevassa taulukossa.
: 35 Taulukossa polypeptidit, mitä on merkitty Sillä ja NSl-.llä, ·:· edustavat aminohappolukuja 130 - "380 ja vastaavasti 380 - "470.
.··. Numerointi on tehty oletetusta initiaattorimetioniinista.
Terminologia S ja NS1 perustuu niiden sekvenssien asemaan, mitkä 105279 70 koodittavat polypeptidejä, käyttäen Flavivirusmallia. Kuten keskusteltiin yllä, kuitenkin viimeisimmät todisteet ehdottavat, että ei ole täyttä korrelaatiota HCV:n ja Flaviviruksien välillä viruspolypeptidialueiden suhteen erityisesti oletetuilla E/NS1-5 alueilla. Todellakin HCV-polypeptideissä ja niiden kooditusa-lueissa voi olla olennaisia poikkeamia Flavivirusmallista.
Taulukko
Sekvensslhomologla 10
Kooditettava nukleotidi Kooditettu aminohappo Koko- S NS1 Koko- S NS1 nais % % % nais % % % 15 HCV1/HCV23 93 95 91 92 95 87 HCV1/HCV27 . 89 93 84 89 95 82 HCV23/HCV27 89 93 85 90 93 84
Vaikka äskettäin eristetyissä HCV-sekvensseissä onkin vaihteluja, 20 kloonatut sekvenssit näytteistä 23 ja 27 (joita kutsutaan HCV23.*ksi ja HCV27:ksi) sisältävät kumpikin 1019 nukleotidia, mikä merkitsee ettei häviämä- tai lisäysmutantteja ole valittujen kloonien tällä alueella. Kuvioiden 39 ja 40 sekvenssit osoittavat myös, etteivät eristetyt sekvenssit ole järjestyneitä uudelleen 25 tällä alueella.
.v HCV1 :n ja muiden HCV-eri s teiden yhtäläisten sekvenssien vertailu ·:* on annettu taulukossa yllä. Sekvenssivaihtelut simpanssin : eristeen HCVl:n ja ihmisistä peräisin olevien HCV:n eristeiden • * · · ....: 30 välillä ovat suunilleen samat kuin ne, mitä nähdään ihmisestä tulevien HCV:iden välillä.
. . On kiinnostavaa, että sekvenssivaihtelut kahdella oletetulla • · · *;,/* alueella eivät ole yhtäläisiä. Sekvenssi oletetulla alueella t I > '·’ ’ 35 S näyttää olevan suhteellisen vakio ja sattumanvaraisesti koko ·:··: alueelle hajaantunut. Tälle vastakohtana oletetulla NSl-alueella on korkeamman asteen vaihtelevuutta kuin kokonaissekvenssi ja vaihtelu näyttää olevan erittäin vaihtelevassa 28 aminohapon • · • · · „ 105279 taskussa, mikä sijaitsee noin 70 aminohappoa alavirtaan oletetun polyproteiinin oletetusta N-päästä.
Vaikka voidaankin väittää, että osoitetut vaihtelut tulivat 5 monistusprosessin aikana, on epätodennäköistä, että kaikki vaihtelut ovat tästä peräisin. On arvioitu, että Taq-polyraeraasi tuo virheitä sekvenssiin suunnilleen yhden DNA-roallineen 10 kiloemästä kohti syklin aikana (Saiki et ai. (1988)). Tähän arvioon perustuen jopa 7 virhettä voi tulla 1019 kiloemäksen 10 DNA-fragmentin PCR-monistuksen aikana. Kuitenkin kolme HCV23:n ja HCV27:n alikloonia antoivat 29 ja vastaavasti 14 vaihtelua. Seuraava ehdottaa, että nämä vaihtelut ovat luonnostaan esiintyviä. Noin 60 % emäsmuutoksista ovat hiljaisia mutaatioita, mitkä eivät muuta aminohapposekvenssiä. Taq-polymeraasin PCR-15 monistuksen aikana aiheuttamien vaihteluiden odottaisi esiintyvän sattumanvaraisesti; kuitenkin tulokset osoittavat, että variant-tisekvenssit ovat ryhmittyneet ainakin yhdelle spesifiselle alueelle. Lisäksi yhtenevä sekvenssi johdettiin sekventoimalla monia eri klooneja, mitkä ovat peräisin PCR-monistetuista 20 tuotteista.
HCV-eristeet ihmisistä Italiassa 1a USAtssa
Eri eristeissä läsnäolevan HCV:n segmenttejä monistettiin 25 HCV/cPCR-menetelraällä. Nämä segmentit ulottuvat alueelle ”0,6 ke - ”1,6 ke alavirtaan oletetun HCV-polyproteiinin metioniinia koodittavasta lähtökodonista. Eristeet ovat biologisista näytteistä, mitkä on saatu HCV-infektoituneista yksilöistä.
: Erityisemmin eriste HCT #18 on ihmisen plasmasta USA-laisesta :··; 30 yksilöstä, EC1 ja EC10 ovat italialaisen potilaan maksabiopsiasta ja Th on amerikkalaisen potilaan perifeerisen veren mononuk-leosyyttifraktiosta. Verrattavia HCV:n RNA-segmenttejä on ,·, ; eristetty simpanssista.
• M • « < i « • I I 1 35 RNA uutettiin ihmisen plasmanäytteistä käyttäen fenoli:klorofor-mi:isoarayylialkoholiuutosta. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopputilavuuteen 1,0 ml TENB/proteinaasi K/SDS-liuoksella (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, • · • i 1 t · • · · a · 105279 72 1 rag/ml protelnaasl K:ta ja 0,5 % SDS), mikä sisälsi 10 - 40 μ9/ια1 polyadenyylihappoa ja jota inkuboitiin 37°C:ssa 60 minuuttia. Tämän proteinaasi K-pilkkoraisen jälkeen tulokseksi saaduista plasmafraktioista poistettiin proteiini uuttamalla 5 TE-kyllästetyllä (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 raM EDTA) fenolilla, pH 6,5. Fenolifaasi erotettiin linkoamalla ja se uutettiin uudelleen TENB:llä, mikä sisälsi 0,1 % SDS:ää. Tulokseksi saadut vesifaasit kustakin uutoksesta yhdistettiin ja niitä uutettiin kahdesti yhtäläisellä määrällä fenoliAloroforrai/isoamyylialkoho-10 lia (1;1(99:1)] ja sitten kahdesti samalla tilavuudella 99:1-seosta kloroformista ja isoamyylialkoholista. Seuraten faasierotusta linkoamalla vesifaasi saatettiin 0,2 M Na-asetaatin loppupitoisuuteen ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Saostetut nukleiinihapot otettiin talteen 15 ultralinkouksella SW 41-roottorilla 38 K, 60 minuutin ajan 4°C:ssa tai mikrolingossa 10 minuuttia 10 K, 4°C:ssa.
RNA:n mikä oli uutettu maksabiopsisasta, toimitti tri F. Bonino, Ospedale di S. Giovanni Battista, Torino, Italia.
20
Mononukleosyyttifraktio saatiin sedimentoiroalla yksilön verinäytettä Ficoll-Paque®: 11a (Pharmacia Corp.) käyttäen valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA uutettiin fraktiosta käyttäen guanidiinitiosyanaattimenettelyä, mikä on kuvattu EP-julkaisussa 25 318,216 (ks. myös Choo et ai. (1989)).
• HCV:n cDNA:n synteesi näytteistä suoritettiin käyttäen • « · käänteistranskriptaasia ja alukkeita, mitkä olivat peräisin !"·. kloonista 156e ja kloonista K9-1. Näillä alukkeilla, mitkä ovat • · · . 30 anti-sensejä genomi-RNA:n suhteen, on seuraavat sekvenssit: • 1 • · · * 156el6B: 5' CGA CAA GAA AGA CAG A3', ja K91/16B: 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3’.
• · • · · • · · i f I i v : 35 Seuraten etanolisaostusta seostettu RNA tai nukleiinihappofraktio kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen DEPC-käsiteltyyn tislattuun ,.··, veteen. Nukleiinihappojen sekundäärirakenteet katkottiin • « kuumentamalla 65°C:ssa 10 minuuttia ja näytteet jäähdytettiin • 1 » • · · ·
• M
105279 73 välittömästi jäillä. cDNA syntetisoitiin käyttäen 1-3 μ9 kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNA:sta), mitä oli uutettu 10 -100 μlJsta plasmaa. Synteesi käytti käänteistranskriptaasia ja se tehtiin 25 μ1:η reaktiona käyttäen 5 protokollaa, minkä on määrittänyt valmistaja BRL. Kaikki cDNA-synteesin reaktioseokset sisälsivät 23 yksikköä RNAasi-inhibiittoria, RNASIli” (Fisher/Promega). cDNA-synteesiä seuraten reaktioseoksia laimennettiin vedellä, keitettiin 10 minuuttia s ja jäähdytettiin nopeasti jäillä.
10
Kullekin näytesarjalle tehtiin kaksi kierrosta PCR-roonistusta. Reaktion alukkeet valittiin monistamaan alueita, mitä merkittiin "EnvL":llä ja "EnvR":llä. EnvL-alueet sisälsivät nukleotidit 669-1243 ja oletetut aminohapot 117 - 308; EnvR-alue sisälsi 15 nukleotidit 1215-1629 ja se koodittaa oletettuja aminohappoja 300 - 408 (oletetut aminohapot on numeroitu aloittaen oletetusta metioniinialoittajakodonista) . Näiden alueiden suhde HCV:n cDNA:ssa kooditettuun oletettuun polyproteiiniin ja polypep-tideihin, mitkä on kooditettu Flavivirusmallissa, on esitetty 20 kuviossa 48.
Alukkeet PCR-reaktioiden ensimmäistä kierrosta varten johdettiin HCV:n cDNA-sekvensseistä joko kloonissa ag30a, kloonissa 156e tai kloonissa k9-l. Alukkeet, mitä käytettiin EnvL-alueen 25 monistamiseen, olivat 156el6B (esitetty yllä) ja ag30al6A sense-säiettä varten; EnvR-alueen monistus käytti aluketta K91/16B ... (esitetty yllä) ja 156el6a sense-säiettä varten. Sense-säikeiden I:. alukkeiden sekvenssit ovat seuraavat.
s
• I I I
. . \ • 9 · j 30 EnvLiää varten ag30al6A: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' ja I,/ EnvR:ää varten 156el6A: 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 31
I I I
• · · PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan ohjeiden • · mukaan (Cetus-Perkin Elmer), paitsi että lisättiin 1 μg RNAasi I « 4
· 35 A:ta. Reaktiot suoritettiin 100 μΐ-.n lopputilavuudessa. PCRsää suoritettiin 30 sykliä, käyttäen ohjeena 94°C (1 min), 37°C
• « .o-, (2 min) ja 72°C (3 min) 7 minuutin pidentymällä 72°C:ssa * 1 *” viimeisessä syklissä. Näytteet uutettiin sitten fenoli:klorofor- · • t 1 • 1 105279 74 millä, seostettiin etanolilla kaksi kertaa, suspendoitiin uudelleen 10 raM Tris-HCl:llä ja konsentroitiin käyttäen Centricon-30-suodatusta (Amicon). Tämä menettely poistaa tehokkaasti oligonukleotidit, jotka ovat kooltaan alle 30 5 nukleotidia; täten ensimmäisen PCR-monistuksen kierroksen alukkeet poistetaan.
Centricon-30:llä konsentroiduille näytteille tehtiin sitten toinen kierros PCR-monistusta käyttäen koettimia, jotka oli 10 rakennettu klooneista 202a ja 156e EnvL-alueelle ja klooneista 156e ja 59a EnvR-alueelle. EnvL-alueen monistusalukkeilla on seuraavat sekvenssit.
202aEnv41a: 5' CTT GAA TTC GCA ATT TGG GTA AGG TCA TCG ATA
15 CCC TTA CG 3' ja
156e38B' : 5' CTT GAA TTC GAT AGA GCA ATT GCA ACC TTG CGT
CGT CC 3' RNAroiden, mitkä ovat peräisin ihmisistä, EnvR-alueiden 20 monistamiseksi olevilla alukkeilla on seuraavat sekvenssit.
156e38A' : 5' CTT GAA TTC GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT
CTA TC 3' ja
59aEnv39C: 5’ CTT GAA TTC CAG CCG GTG TTG AGG CTA TCA TTG
25 CAG TTC 3' PCR-monistusta tehtiin 35 syklin ajan käyttäen ohjeena 94°C #.;j1 (1 min), 60°C (1 min), ja 72°C (2 min) 7 minuutin pidennyksellä • :1r 72°C:ssa viimeisessä syklissä. Näytteet uutettiin sitten • 1 » · 30 fenoli :kloroformilla, saostettiin kaksi kertaa ja pilkottiin
EcoRI: 11a. PCR-reaktiotuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet elektroforeesilla 6 % polyakryyliaraidigeeleillä. Suunnilleen . . odotetun PCR-tuotteen arvioitua kokoa oleva DNA elektroeluoitiin • · · • · · λ.’ geeleiltä ja alikloonattiin joko pGEM-4-plasmidivektoriin tai « · 1 35 lambda gtll-vektoriin. Odotetut tuotekoot EnvL s lie ja EnvR: lie ensimmäisen monistuskierroksen jälkeen ovat 615 emäsparia ja vastaavasti 683 emäsparia; toisen monistuskierroksen jälkeen odotetut tuotekoot EnvL:ää ja EnvR:ää varten ovat 414 emäsparia • · · • · · • «· • « 75 105279 ja vastaavasti 575 eraäsparia. Plasraideja, mitkä sisälsivät monistetut tuotteet, käytettiin isäntäsolujen transformoinein; pGEM-4-plasmidia käytettiin DH5-alfan ja lambda gtll käytettiin C600 delta-HFL:n transformoimiseen. Transformoitujen solujen 5 kloonit joko hybridisoitiin sopiviin HCV-koettimiin (kuvataan alla) tai ne, missä oli oikean kokoisia inserttejä, valittiin. Insertit sitten kloonattiin M13:een ja sekventoitiin.
Kaikkia HCV/cPCR-tuotteita varten olevat koettimet käsittivät 10 3ZP-leiraattuja HCVsn cDNA:n osia, mitkä oli valmistettu PCR-monistamalla kloonin 216 aluetta (käyttäen CA216al6A- ja 216al6B-alukkeita) ja kloonin 84 aluetta (käyttäen CA84al6A:ta ja CA84al6B:tä tai CA84al6C:tä alukkeena); 3ZP tuotiin PCR-tuotteisiin nicktranslaation avulla. Koettimet ensimmäistä ja 15 toista EnvL-monistuksen kierrosta varten olivat 84:stä (s.o. CA84al6A ja CA84al6B), toista EnvL-monistuksen kierrosta varten ne olivat CA84al6A ja CA84al6C. Nämä koettimet eivät menneet päällekkäin HCV/cPCR-reaktioissa käytettyjen alukkeiden kanssa. Näiden koettiraien PCR-raonistusta varten olevien alukkeiden 20 sekvenssi on seuraavassa taulukossa.
Taulukko
Aluke Klooni Sekvenssi 25 CA216al6A 216 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3' CA216al6B 216 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3' CA84al6A 84 51 AAG GTT GCA ATT GCT C 3' ··1 ··· CA84al6B 84 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3' ♦ ··» : CA84al6C 84 5' TAA CGG GTC ACC GCA T 3' • « · e 30
Sekvenssitietoa EnvL-alueella olevista varianteista saatiin 3 kloonista HCT #18: sta, 2 kloonista TH: sta, 3 kloonista EC1: stä . . ja HCV1-klooneista, mitä on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja « · · yllä. Kunkin eristeen, jotka ovat peräisin näistä klooneista • 1 t V ' 35 yhdistelmänukleotidisekvenssin vertailu on esitetty kuviossa ·;·: 49. Kuviossa kukin sekvenssi on esitetty 5' - 3' suunnassa sense- säikeelle EnvL-alueelle ja sekvenssit on pantu kohdakkain.
« I · .:. Pystyviivat ja isot kirjaimet merkitsevät sekvenssihomologiaa • « • ·
I t I
m 1 105279 76 ja viivan puuttuminen ja pienet kirjaimet merkitsevät homologian puuttumista. Viivoilla esitetyt sekvenssit ovat seuraavat: viiva 1, Thorn; viiva 2, EC1; viiva 3, HCT; viiva 4, HCV1.
5 Sekvenssitietoa EnvR-alueella olevista varianteista saatiin kahdesta EC10-kloonista ja HCV1-klooneista, mitä on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja yllä. Kaksi EClO-kloonia erosivat vain yhdellä nukleotidilla. EC10:n (klooni 2) nukleotidisekvenssien ja HCV1-sekvenssien yhdistelmän vertailu on esitetty 10 kuviossa 50; kukin sekvenssi on esitetty 5' - 3' suunnassa sense-säikeelle EnvR-alueelle ja sekvenssit on pantu kohdakkain. Kaksoispisteet sekvenssien välillä merkitsevät sekvenssihomolo-giaa.
15 EnvL-alueella (aminohapot #117-308) ja EnvR-alueella (aminohapot #300-438) kooditettu jen aminohapposekvenssien vertailu kutakin eristettä varten on esitetty kuviossa 51 ja vastaavasti kuviossa 52. Kuvioihin sisältyvät yllä kuvattujen eristeiden JH23 ja JH27 sekvenssit. Myös merkittyinä ovat japanilaisesta eristeestä 20 olevat sekvenssit; nämä sekvenssit toimitti tri T. Miyamura, Japanista. Kuvioissa on alueen aminohapposekvenssi annettu kokonaisuudesaan HCVl:lle ja ei-homologiset aminohapot eri eristeissä on merkitty.
25 Kuten nähdään kuviosta 51, on siinä oleva EnvL-alue kaikkiaan noin 93 % homologinen HCVl:n ja muiden eristeiden välillä. HCT18:11a, Thslla ja EClrllä on noin 97 % homologia HCVl:n ··· kanssa; JH23:lla ja JH27:llä on noin 96 % ja vastaavasti noin • · · · : .·. 95 % homologia HCVl:n kanssa. Kuvio 52 esittää, että homologiat 30 EnvR-alueella ovat huomattavasti vähäisempiä kuin EnvL-alueella; • · t..·. lisäksi eräs alialue näyttää olevan hypermuuttuva (s. o.
« · · ' aminohapoista 383-405). Tämä tieto on esitetty yhteenvetona juuri alla olevassa taulukossa.
• « t • · · •
• f I
f a « m • • t · • · • · e m • · 1 · • · · a · w m 105279 77
Taulukko
EnvR-alueen homologia Eriste Homologia HCVl:n kanssa % AA330-AA438 AA383-AA4Q5 5 JH23 (USA) 83 57 JH27 (USA) 80 39
Japanilainen 73 48 EC10 (Italia) 84 48 10 Positiivisen la negatiivisen säikeen 51 -HCV:n RNA; n osoittaminen seerumissa HCV27:nRNA, eristettynä seerumista, analysoitiin positiivisen ja negatiivisen säikeen läsnäolon suhteen käyttäen PCR-15 menetelmää. PCR-menetelmä suoritettiin olennaisesti kuten on kuvattu yllä, lukuunottamatta seuraavaa. Uutettu HCV27:n RNA käänteistranskriptoitiin yksisäikeiseksi cDNA:ksi käyttäen alukkeena joko Alex9Ö:tä tai JH52:ta (ks. yllä sekvenssien osalta). Alex90:n sekvenssi sopii HCV:n RNA:n positiivisen 20 säikeen nukleotidien -312 - -283 sekvenssiin, kun taas JH52 sopii negatiivisen säikeen nukleotideihin -117 - -93. Tulokseksi saadut yksisäikeiset HCV:n cDNA:t monistettiin yksittäin PCR:llä käyttäen Alex90:tä ja JH52:ta. Monistettujen tuotteiden osoittaminen suoritettiin Southern-blottauksen avulla käyttäen 25 Alex90:tä koettimena. Alex89 sopii HCV:n RNA:n nukleotidinuraeroi-hin -203 - -175. Alex89:n sekvenssi on: M» ·:· 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3' .
MM
• » • · · • f · • M · ..·· 30 Analyysi merkitsi, että tällä menetelmällä molempien RNA-säikeiden monistettujen tuotteiden signaalit olivat voimakkuudeltaan yhtäläiset. Nämä tulokset ehdottavat, että HCV:n RNA 5'-. . alueella voi olla kaksisäikeistä RNA:ta.
• · e • # · • · « f · \ 1 35 Koettimet HCV:n sandwlch-hvbridisaatiota varten »III· • · Tämä esimerkki antaa esimerkin leima- ja sieppauskoettimien sarjasta, mikä on hyödyllinen osoittamaan HCV:n RNA:n • · ·
» I I
• M k · 105279 78 biologisissa näytteissä käyttäen olennaisesti analyysiä, mikä on kuvattu US-patentissa 4,868, 105. Menetelmä on liuosfaasissa tapahtuva sandwich-hybridisatioanalyysi, mikä käyttää sekä sieppaus- että leimakoettiraia, mitkä hybridi soi tuvat kohdesek-5 vensseihin analyyttinukleiinihapossa. Biologisten näytteiden seulomisessa HCV:n varalta käytetyt koettimet sitoutuvat HCV-genomin säilyviin alueisiin ja HCV:n sitoutumisalueet valitaan niiden ainutkertaisuuden takia HCV-genomille. Alueet, mitkä sitoutuvat sieppauskoettimen sidospartneriin tai leimakoettimen 10 osa, mikä sitoutuu leimausosaan (tai monistusmultimeeriin, jos käytetään EP-julkaisussa 317,077 kuvattua menetelmää), valitaan niin että ne eivät sitoudu mihinkään tunnetuista tietopankkien tai HCV:n sekvensseistä ja millä on sopiva Gs- ja Cs-pitoisuus salliakseen stabiilin dupleksin muodostumisen niiden kompleraent-15 tien välille valituissa olosuhteissa. Sieppaus- ja leimakoettimet ovat sarjoissa ja yhden sarjan koettimet eivät mene muiden sarjojen koettimien väliin. Nämä koettimet muodostuvat sarjoista, mitkä ovat komplementaarisia seuraaville nukleotidi sekvensseille kuviossa 18 esitetyn prototyyppi-HCV:n cDNA:n kooditussäikeessä.
20
Koetintvyppi Koetinnumero Nukleotidlnuroerolden komplementti Sieppaus 42.XT1.1 -318 - -289 25 Sieppaus 42.XT1.2 -285 - -256
Sieppaus 42.XT1.3 -252 - -223 .·. . Sieppaus 42.XT1.4 -219 - -190 ‘ Leima 42.LLA2C.5 -186 - -157 "! Leima 42.LLA2C.6 -153 - -124 • c > “•I 30 Leima 42.LLA2C.7 -120 - -91 • · ··· * Leima 42.LLA2C.8 -87 - -58
Leima 42.LLA2C.9 -54 - -25 • · · ; Leima 42.LLA2C.10 -21-9
Leima 42.LLA2C.il 13 - 42 35 Leima 42.LLA2C.12 46 - 75 • · :T: Leima 42.LLA2C.13 79 - 108
Leima 42.LLA2C.14 112 - 141
Leima 42.LLA2C.15 145 - 174 * « · · • i · 105279 79
Saria 2
Koetintyyppi Koetlnnumero NukleoUdlnuroerolden komplementti Sieppaus 42.16.XT1 4378 -4407 5 Sieppaus 42.17.XT1 4411 - 4440
Sieppaus 42.18.XT1 4444 - 4473
Sieppaus 42.19.XT1 4477 - 4506
Sieppaus 42.20.XT1 4510 - 4539
Leima 42.21.LLA2C 4543 - 4572 10 Leima 42.22.LLA2C 4576 - 4605
Leima 42.23.LLA2C 4609 - 4638
Leima 42.24.LLA2C 4642 - 4671
Leima 42.25.LLA2C 4675 - 4704
Leima 42.26.LLA2C 4708 - 4737 15 Leima 42.27.LLA2C 4771 - 4770
Leima 42.28.LLA2C 4774 - 4803
Leima 42.29.LLA2C 4807 - 4836
Leima 42.30.LLA2C 4840 - 4869
Leima 42.31.LLA2C 4873 - 4902 20
SaEja.J.
Koetintyyppi Koetinnuroero Nukleotidinuroeroiden komplementti
Sieppaus 42.32.XT1 4056 -4085 25 Sieppaus 42.33.XT1 4089 - 4085
Sieppaus 42.34.XT1 4122 - 4151
Sieppaus 42.35.XT1 4155 - 4184 ’ .1 Leima 42.36.LLA2C 4188 - 4217 • · a "I Leima 42.37.LLA2C 4221 - 4250 • t · ;··: 30 Leima 42.38.LLA2C 4254 - 4283 !·· Leima 42.39.LLA2C 4287 - 4316
Leima 42.40.LLA2C 4230 - 4349 ; Leima 42.41.LLA2C 4353 - 4382
Leima 42.42.LLA2C 4386 - 4415 :/.:35 Leima 42.43.LLA2C 4419 - 4448 • · · • « · « 1 · • · • »· « · » · • • a • a · • » • · · • 1 105279 80
Ylläolevissa sarjoissa kukin sieppauskoetin sisältää HCV-sekvensseille komplementaaristen sekvenssien lisäksi seuraavan sekvenssin alavirtaan HCV-sekvenssistä (s.o. 3'-päässä): 5 5' CTT CTT.TGG AGA AAG TGG TG 3'
Kullekin sieppauskoettimelle yhteinen sekvenssi on komplementaarinen sidospartnereissa olevalle sekvenssille niin, että hybridisaation jälkeen voidaan dupleksi siepata kiinnittämällä 10 kiintofaasiin.
Myös kussakin sarjassa kukin leimakoetin sisältää HCV-sekvenseille komplementaaristen sekvenssien lisäksi seuraavan sekvenssin alavirtaan HCV-sekvenssistä: 15 5' TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC 3'.
Jos käytetään EP-julkaisussa 317,077 kuvattua menetelmää, kullekin leimakoettimelle yhteinen sekvenssi on komplementaarinen 20 sekvenssille multimeerissä, salliakseen hybrididupleksin muodostuksen tuon multimeerin kanssa.
Ylläolevien sarjojen koettimien sekvenssit on esitetty kuviossa 19.
25 HCV-polynukleotidisekvenssien osoittaminen käyttäen PCR-monistusta • · « · ·
Yleisessä menetelmässä HCV:n RNA:n monistamiseksi cPCR:llä »·· 30 oletetaan, että RNA-säie on virioni tai mRNA-säie, mikä on • · · ··· | "sense"-säie. On kuitenkin mahdollista, että voidaan osoittaa j 1 myös replikatiivisia välimuotoja, mitkä olisivat "anti-sense"; v 1 tässä tapauksessa aluke olisi "sense". RNA-sense-säie, mikä sisältää kohdealueen, hybridi soidaan antisense-alukkeen kanssa, 35 mikä muodostaa alun kohteen sisältävän replikatiivisen säikeen synteesille. RNA-mallineen cDNA syntetisoidaan aluke- ja >aj>; mallineriippuvalla käänteistranskriptaasilla. cDNA tuloksena • · ... olevassa RNA:cDNA-hybridissä vapautetaan denaturoimalla ja « · • »· k · • « • · 1 « · · 105279 81 käsittelemällä RNAasilla. Alukkeet sulatetaan cDNA:han ja niitä pidennetään aluke- ja mallineriippuvalla DNA-polymeraasilla. Tuotteet denaturoidaan, liitetään uudelleen alukkeisiin ja suoritetaan synteesin toinen kierros. Suoritetaan lukuisia 5 syklejä, kunnes kohdealueen sisältävää monistettua tuotetta on haluttu määrä, mikä on ainakin osoitettavissa oleva taso.
Monistettujen HCV-nukleliinihapposekvenssien. mitkä ovat peräisin_HCV-nukleiilnihapposekvensseistä_maksa- ia 10 plasmanäyttelssä simpansseista, joilla on NANBH. osoittaminen HCV-nukleiinihappoja, mitkä olivat läsnä simpanssien, joilla oli NANBH, mikä ei ollut simpanssien hallinnassa, maksasta ja plasmasta, monistettiin käyttäen olennaisesti polymeraasiket-15 jureaktiotekniikkaa (PCR), minkä on kuvannut Saiki et ai. (1986). Alukeoligonukleotidit olivat peräisin HCV:n cDNA-sekvenssseistä kloonissa 81 (Kuvio 22) tai klooneissa 36 (Kuvio 23) ja 37b (Kuvio 24). Monistetut sekvenssit osoitettiin geelielektroforee-silla ja muunnetulla Southern-blottausmenetelmällä käyttäen 20 koettimina sopivaa cDNA-oligomeeriä tai nicktransloitua cDNA-sekvenssiä, missä oli sekvenssi kahden alukkeen välistä, mutta ei sisältänyt alukkeita.
RNA-näytteitä sisältäen monistus järjestelmällä tutkittavia HCV-25 sekvenssejä eristettiin kolmen NANBH: ta sairastavan simpanssin raaksabiopsiasta ja kahdesta kontrollisimpanssista. Poly A* RNA- • · ; fraktion eristys tehtiin guanidiinitiosyanaattimenettelyllä, » · .)· minkä on kuvannut Maniatis et ai. (1982).
• · · v · c ·'". 30 Monistusjärjestelmällä tutkittavat RNA-näytteet eristettiin • * · kahden NANBH:ta sairastavan simpanssin plasmasta ja yhdestä • · ... kontrollisimpanssista ja myös kontrollisimpanssien plasmojen • « · '·" ’ varastosta. Yhdellä infektoituneella simpanssilla oli tiitteri, mikä oli yhtä suuri tai suurempi kuin 106 CID/ml ja yhdellä 35 infektoituneella simpanssilla oli tiitteri yhtä suuri tai : suurempi kuin 105 CID/ml.
» · • | I · • · • * 105279 82
Nukleiinihapot uutettiin plasmasta seuraavasti. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopputilavuuteen 1,0 ml TENB/proteinaasi K/SDS-liuoksella (0,05 H Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 H NaCl, 1 rag/ml Proteinaasi K ja 0,5 % SDS), 5 sisältäen 10 μς/πιΐ polyadenyylihappoa ja sitä inkuboitiin 37°C:ssa 60 minuuttia. Tämän proteinaasi K-pilkkomisen jälkeen poistettiin tulokseksi saaduista plasroafraktioista proteiinit uuttamalla TE:llä (10,0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 raM EDTA) kyllästetyllä fenolilla. Fenolifaasi erotettiin linkoamalla 10 ja sitä uutettiin uudelleen TENB:llä, mikä sisälsi 0,1 % SDS. Kustakin uuttamisesta tulokseksi saadut vesifaasit yhdistettiin ja niitä uutettiin kahdesti yhtäläisellä tilavuudella fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia [1:1(99:1)] ja sitten kahdesti samalla tilavuudella 99:1-seosta kloroformista ja 15 isoamyylialkoholista. Seuraten faasierotusta linkoamalla vesifaasi saatettiin 0,2 M Na-asetaatin loppupitoisuuteen ja nukleiinihapot seostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Saostetut nukleiinihapot otettiin talteen ultralinkouksella SW 41-roottorilla 38 K 60 minuutin ajan 4°C:ssa.
20
Edellisen lisäksi uutettiin korkean tiitterin simpanssin plasmaa ja varastoitua kontrolliplasmaa vuoron perään 50 μ9:1ΐ3 poly A-kantajaa Chomcyzski and Sacchi (1987) menetelmän mukaisesti. Tämä menettely käyttää hapanta guanidiinitiosyanaattiuuttaraista. 25 RNA otettiin talteen linkoamalla 10000 kierr/min 10 minuuttia 4°C:ssa Eppendorf-raikrolingossa.
« * · ··· Kahdessa tilanteessa, ennen cDNA:n synteesiä PCR-reaktiossa, nukleiinihapot, mitkä uutettiin plasmasta proteinaasi • · « · : .·, 30 K/SDS/fenoli-menetelmällä, puhdistettiin edelleen sitomalla • · · S- ja S Elutip-R-pylvääseen ja eluoimalla siitä. Seurattu • · ...^ menettely oli valmistajan ohjeiden mukainen.
• · · PCR-reaktiota varten mallineena käytetty cDNA, mikä oli peräisin
III
35 nukleiinihapoista (joko kokonaisnukleiinihapoista tai RNA:sta),
• · I
v : valmistettiin, kuten kuvattiin yllä. Seuraten etanolisaostusta ....: saostetut nukleiinihapot kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen .···. DEPC-käsiteltyyn tislattuun veteen. Nukleiinihappojen sekundääri- * « « • · t · t 105279 83 rakenteet katkottiin kuumentamalla 65öC:ssa 10 minuuttia ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäillä. cDNA syntetisoitiin käyttäen 1-3 μ? simpanssin kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNA:sta), mitä oli uutettu 10 -100 μl:sta 5 plasmaa. Synteesi käytti käänteistranskriptaasia ja se tehtiin 25 μΐ:n reaktiona käyttäen protokollaa, minkä on määrittänyt valmistaja BRL. cDNA-synteesin alukkeet olivat niitä, mitä käytettiin myös PCR-reaktiossa, mitä kuvataan alla. Kaikki cDNA-synteesin reaktioseokset sisälsivät 23 yksikköä RNAasi-10 inhibiittoria, RNASIN™ (Fisher/Promega) . cDNA-synteesiä seuraten reaktioseoksia laimennettiin vedellä, keitettiin 10 minuuttia ja jäähdytettiin nopeasti jäillä.
PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan ohjeiden 15 mukaan (Cetus-Perkin-Elmer) paitsi, että lisättiin 1 μ9 RNAasi A:ta. Reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 100 μΐ. PCR:ää suoritettiin 35 sykliä käyttäen ohjeena 37°C (2 min), 72°C (3 min) ja 94°C (1 min).
20 cDNA-synteesin ja PCR-reaktioiden alukkeet olivat peräisin HCV:n cDNA-sekvensseistä joko kloonissa 81, kloonissa 36 tai kloonissa 37b. (HCV:n cDNA-sekvenssit klooneissa 81, 36 ja 37b on esitetty vastaavasti kuvioissa 22, 23 ja 24). Kloonista 81 peräisin olevien kahden.16-meerisen alukkeen sekvenssit olivat: 25 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' ja 5' GAT AAC CTC TGC CTG A3'.
« « • · · « * ·
Kloonista 36 peräisin olevan alukkeen sekvenssi oli: • · · * : 30 . 5’ GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.
V · * · l • · • « · • « ·
Kloonista 37b peräisin olevan alukkeen sekvenssi oli: :.'·ί 35 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.
· « « * · • · * • · • * · i 1 105279 84 PCR-reaktioissa alukeparit muodostuivat joko kahdesta 16-meeristä, mitkä olivat peräisin kloonista 81 tai 16-meeristä, mikä oli peräisin kloonista 36 ja 16-meeristä kloonista 37b.
5 PCR-reaktiotuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet alkaalisella geelielektroforeesilla, mitä seurasi Southern-blottaus ja osoittamalla monistetut HCV-cDNA-sekvenssit 32P-leimatulla sisäisellä oligonukleotidikoettimella, mikä oli peräisin HCV:n cDNA:n alueelta, mikä ei mene päällekkäin 10 alukkeiden kanssa. PCR-reaktioseoksia uutettiin fenoli/klorofor- milla ja nukleiinihapot saostettiin vesifaasista suolalla ja etanolilla. Saostuneet nukleiinihapot kerättiin linkoamalla ja liuotettiin tislattuun veteen. Näyte-erille suoritettiin elektroforeesi 1,8 % alkaalisilla agaroosigeeleillä. Yk- 15 sisäikeista DNA:ta, pituudeltaan 60, 108 ja 161 nukleotidia, elektroforesoitiin samalla geeleillä molekyylipainomarkkereina. Elektroforeesin jälkeen DNA: t geeliltä siirrettiin Biorad Probe™-paperille. Esihybridisoinnin ja hybridisoinnin ja pesun olosuhteet olivat valmistajan (Biorad) määrittelemät.
20
Koettimet monistettujen HCV.1n cDNA-sekvenssien hybridisaatio- osoittamiseksi olivat seuraavat. Kun PCR-alukkeiden pari oli johdettu kloonista 81, oli koetin 108-meeri sekvenssillä, mikä vastasi sitä, mikä sijaitsee alueella kahden alukkeen välissä.
25 Kun PCR-alukkeiden pari oli peräisin klooneista 36 ja 37b, koetin oli nicktransloitu HCV:n cDNA-insertti, mikä oli peräisin ; ’.· kloonista 35, minkä nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa *:1 34. Alukkeet olivat peräisin klooni 37b:n insertin nukleotideista »·« ·; 155-170 ja kloonin 36 insertin 206-268. HCV:n cDNA-insertin lt«« : 30 3'-pää kloonissa 35 menee päällekkäin kloonin 36 insertin nukleotidien 1-186 kanssa; ja kloonin 35 insertin 5'-pää menee • 1 .... päällekkäin kloonissa 37b olevan insertin nukleotidien 207-269 kanssa. (Vrt. kuvioita 23, 34 ja 24.) Täten cDNA-insertti kloonissa 35 ulottuu osalle alueesta klooneista 36 ja 37b 35 peräisin olevien alukkeiden sekvenssien välissä ja on hyödyllinen v koettimena monistettuja sekvenssejä varten, mitkä sisältävät ·:·: nämä alukkeet.
»· • · 85 105279
Maksanäytteiden RNA: n analyysi suoritettiin ylläolevan proseduurin mukaan käyttäen molempia alukkeiden ja koettimien sarjoja. RNA kolmen NANBH-simpanssin maksasta antoi positiivisia hybridisaatiotuloksia odotetun kokoisille (161 ja 586 nukleotidia 5 vastaavasti klooneja 81 ja 36 ja 37b varten) monistussek-vensseille, kun taas kontrollisirapanssit antoivat negatiivisia hybridisaatiotuloksia. Samat tulokset saatiin, kun koe toistettiin kolme kertaa.
10 Plasman RNA:n ja nukleiinihappojen analyysi suoritettiin myös ylläolevan menettelyn mukaan käyttäen kloonista 81 peräisin olevia alukkeita ja koetinta. Plasmat olivat kahdesta NANBH-simpanssista, kontrollisimpanssista ja kontrollisimpanssien varastoidusta plasmasta. NANBH-plasmoista molemmat sisälsivät 15 nukleiinihappoja/RNA: ta, mikä antoi positiivisia tuloksia PCR-monistetussa analyysissä, kun taas molemmat kontrolliplasmat antoivat negatiivisia tuloksia. Nämä tulokset on saatu toistuvasti useita kertoja.
20 Viallisia viruksia on tiedetty esiintyvän RNA-viruksissa. Käyttämällä PCR-teknologiaa on mahdollista suunnitella alukkeita monistamaan HCV-genomin sekvenssejä. Monistettujen tuotteiden analyysillä odotetaan kyettävän identifioimaan sekä virusgenomin vialliset versiot että villi tyyppi set viruslajit. Niinpä käyttäen 25 alukkeita, mitkä perustuvat tunnettuun HCV-sekvenssiin, voidaan ennustaa tarkasti PCR-tuotteen odotettu koko. Mitkä tahansa '·: suuremmat lajit, mitä havaitaan geelielektroforeesilla ja hybridisaatioanalyysillä, voisivat edustaa potentiaalisia
Ml .:. varianttigenomeja. Vaihtoehtoisesti mikä tahansa pienempi laji, 30 mikä havaitaan tällä tavalla, saattaisi edustaa viallisia I » · aineita. Näiden tyyppien analyysit olisivat hyödyllisiä 9 9 ... vahvistamaan tunnetun HCV-sekvenssin tarkan alkuperän, onko • · · ♦ v ’ se todella villityyppinen virussekvenssi tai viallinen genomi.
Näiden analyysien tekniikat ja menetelmät ovat alalla hyvin :. : 35 tunnettuja ja niitä on kuvattu aikaisemmin. Tämä metodologia V : tekee mahdolliseksi sen, että alan ammattilainen saa niihin liittyviä (villityyppisiä tai viallisia) virusgenomin muotoja.
• 9 • 9 • 9 9 9 9 105279 86
Sellaisten_sekvenssien_siepatuissa_partikkeleissa osoittaminen, mitkä PCRrllä monistettuna hvbrldisoituvat HCV:n cDNAihan. mikä on peräisin kloonista 81 5 Siepatuissa partikkeleissa oleva RNA saatiin, kuten kuvataan alla. Sen sekvenssin analyysi, mikä hybridisoituu kloonista 81 peräisin olevaan HCV:n cDNA:han, suoritettiin käyttäen PCR-monistusmenettelyä, mikä on kuvattu yllä, lukuunottamatta sitä, että hybridisointikoetin oli kinasoitu oligonukleotidi, mikä 10 oli peräisin kloonin 81 cDNA-sekvenssistä. Tulokset osoittivat, että monistetut sekvenssit hybridisoituivat HCV: n cDNA-koettimen kanssa.
Partikkelit siepattiin HCV-infektoituneesta simpanssin plasmasta 15 käyttäen polystyreenipallosia, mitkä oli päällystetty iraraunopuh-distetulla vasta-aineella, mikä on suunnattu kloonissa 5-1-1 kooditettua polypeptidiä vastaan. Menettely imunopuhdistetun vasta-ainetuotteen tuottamiseksi on kuvattu EP-julkaisussa 318,216, minkä omistaa tämän hakija ja mikä liitetään tähän 20 viitteeksi. Lyhyesti HCV-polypeptidi, mikä on kooditettu kloonissa 5-1-1, ekspressoitiin fuusiopolypeptidinä superoksidi-dismutaasin (SOD) kanssa. Tämä suoritettiin alikloonaamalla kloonin 5-1-1 cDNA-insertti ekspressiovektoriin pSODcfl (Steimer et ai (1986)) . DNA: ta, mikä oli eristetty pSODcfl:stä käsiteltiin 25 BamHI:lla ja EcoRI:llä ja seuraava linkkeri liitettiin lineaariseen DNA:hän, mikä oli luotu restriktioentsyymeillä: • t • · ·:· 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA 3’ • · · • <s 1 * · # ♦ : 30 Kloonaamisen jälkeen insertin sisältävä plasmidi eristettiin.
• · · ·
Insertin sisältävä plasmidi pätkittiin EcoRI:llä. HCV:n cDNA-insertti kloonissa 5-1-1 pätkittiin EcoRI:lla ja liitettiin • · tähän EcoRI-linearisoituun plasmidi-DNA:hän. DNA-seosta . . käytettiin transformoimaan E. Coli-kantaa D1210 (Sadler et ai.
• « « 35 (1980)). Yhdistelmät 5-1-1 :n cDNA:n kanssa oikeassa orientaatios- « 4 4 *·1 1 sa ORF:n ekspressoimiseksi identifioitiin restriktiokartoituksel- ·:1·: la ja nukleotidisekventiolla. Yhdistelmäbakteeri yhdestä kloonista saatettiin ilmentämään SOD-NANBj.,.,-polypeptidiä * • · I I • · · • · · 105279 kasvattamalla bakteeria IPTG:n läsnäollessa. Fuuslopolypeptidi puhdistettiin yhdistelmä-E. Colista solu-uutteiden differen-tiaaliuutolla urealla, mitä seurasi kromatografia anionin- ja kationinvaihtopylväissä. Puhdistettu SOD-NANBj^.,-polypeptidi 5 kiinnitettiin nitroselluloosakalvolle. HCV-infektoituneen seerumin näytteissä oleva vasta-aine absorboitui matriisiin sitoutuneeseen polypeptidiin. Pesun jälkeen ei-spesifisesti sitoutuneiden materiaalien ja sitoutumattomien materiaalien poistamiseksi sitoutunut vasta-aine vapautettiin sitoutuneesta 10 polypeptidistä.
cPCR-menetelmä HCV:n RNA:n osoittamiseksi maksassa ia seerumissa NANBH:ta sairastavista yksilöistä 15 PCR-analyysin muunnetun muodon, s.o. cPCR-analyysin luotettavuus ja käyttökelpoisuus HCV-infektion osoittamiseen määritettiin suorittamalla analyysi kokona!smaksa-RNA:sta ja seerumista yksilöistä, joilla oli infektio. cPCR-analyysissä oletettu virus-RNA näytteessä käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi käänteistrans-20 kriptaasilla; tulokseksi saadun cDNA:n segmentti monistettiin sitten käyttäen Saiki et ai. (1986) kuvaaman PCR-tekniikan muunnettua versiota. cPCR-tekniikkaa varten olevat alukkeet ovat peräisin HCV:n RNA:sta, mikä voidaan identifioida tässä saatujen HCV:n cDNA:oiden perheen avulla. Monistettu tuote, 25 mikä vastaa HCV-RNA:ta, osoitetaan käyttäen koetlnta, mikä on peräisin tässä annettujen HCV:n cDNAroiden perheestä.
• • · ··· Näissä tutkimuksissa käytetty cPCR/HCV-analyysi suoritettiin
• M
··· käyttäen seuraavia menetelmiä RNA:n valmistamiseksi, RNA:n • · · o : 30 käänteistranskriptoimiseksi cDNA:ksi, cDNA:n spesifisten IM ( segmenttien monistamiseksi PCR:llä ja PCR-tuotteiden analysoimi- * » ·.· seksi.
· · 3 i · · RNA uutettiin maksasta käyttäen guanidiini-isotiosyanaat-
I I I
35 timenetelmää kokonais-RNA:n valmistamiseksi, minkä on kuvannut
• M
: Maniatis et ai. (1982).
» · • # · • · • « « · * · 1 · • « · • »· 105279 88
Totaali RNA:n eristämiseksi plasmasta plasma laimennettiin 5-10-kertaiseksi TENB:llä (0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) ja inkuboitiin proteinaasi K/SDS-liuoksessa (0,5 % SDS, 1 mg/ml proteinaasi K, 20 pg/ml Poly A-kantaja) 60-90 5 minuuttia 37°C:ssa. Näytteet uutettiin kerran fenolilla (pH
6,5), tulokseksi saatu orgaaninen faasi uutettiin uudelleen kerran TENB:llä, mikä sisälsi 0,1 % SDS ja molempien uutoksien vesifaasit yhdistettiin ja uutettiin kahdesti yhtäläisellä tilavuudella fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia [1:1(99:1)). 10 Tulokseksi saatuja vesifaaseja uutettiin yhtäläisellä tilavuudella kloroformi/isoamyylialkoholia (99:1) kahdesti ja etanolisaostettiin käyttäen 0,2 M natriumasetaattia, pH 6,5, ja 2,5 tilavuutta 100 % etanolia; seostamista tehtiin yli yön 20° C:ssa.
15 PCR-reaktiota varten mallineena käytettyä cDNA:ta valmistettiin käyttäen vastaavien cDNA:oiden valmistukseen käytettyjä merkittyjä näytteitä. Kutakin RNA-näytettä (sisältäen joko 2 μ9 lämpödenaturoitua simpanssin maksan totaali-RNA:ta, RNA:ta 20 2 mikrolitrasta plasmaa tai 10 % RNArsta, mikä oli uutettu 10 mm x 4 mm lieriömäisestä ihmisen maksabiopsiasta) inkuboitiin 25 μΐ reaktiossa, mikä sisälsi 1 μΜ kutakin aluketta, 1 mM kutakin deoksiribonukleotiditrifosfaattia (dNTP), 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 5 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitolia (DTT), 73 mM KC1, 40 25 yksikköä RNAasi-inhibiittoria (RNASIN) ja 5 yksikköä AMV- käänteistranskriptaasia. Inkubointia tapahtui 60 minuuttia 37°C:ssa. cDNA-synteesin jälkeen reaktiot laimennettiin 50 pl:lla .·:* deionisoitua vettä (DIW), niitä keitettiin 10 minuuttia ja ··· jäähdytettiin jäillä.
IMI
: 30 • · · • Il · HCV:n cDNA-segmentin monistus suoritettiin käyttäen kahta • · ..... synteettistä oligomeerin 16-meeristä aluketta, joiden sekvenssit • · · olivat peräisin HCV:n cDNA:sta klooneissa 36 (anti-sense) ja 37b (sense). Kloonista 36 olevan alukkeen sekvenssi oli: • · · ·· " 35
« · I
V : 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3' •
Kloonista 37b olevan alukkeen sekvenssi oli: • Il « • · • * I . I « · 89 105279 5! ACA ΑΤΑ CGT GTG TCA C 3'.
Alukkeita käytettiin lopputilavuudessa 1 μΜ kustakin. Sen HCV:n cDNA-segmentin monistamiseksi, mikä on kyljittäin alukkeiden 5 kanssa, cDNA-näytteitä inkuboitiin 0,1 μ?:η kanssa RNAasi Asta ja PCR-reagenssien kanssa Perkin Elmer Cetus kitistä (N801-0043 tai N801-0055) valmistajan ohjeiden mukaan. PCR-reaktiota suoritettiin joko 30 sykliä tai 60 sykliä Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler-laitteessa. Kukin sykli käsitti 1 minuutin 10 denaturointi vaiheen 94°C:ssa, lämpökäsittely vaiheen 2 minuuttia 37°C: ssa ja pidennysvaiheen 3 minuuttia 72°C:ssa. Pidennysvaihe oli kuitenkin viimeisessä syklissä (30. tai 60.) 7 minuuttia 3 minuutin sijasta. Monistuksen jälkeen näytteitä uutettiin yhtäläisellä määrällä fenoli:kloroformia (1:1), mitä seurasi 15 uuttaminen yhtäläläisellä määrällä kloroformia ja sitten näytteet saostettiin etanolilla, mikä sisälsi 0,2 M natriumasetaattia.
cPCR-tuotteet analysoitiin seuraavasti. Tuotteille tehtiin elektroforeesi 1,8 % alkaalisella agaroosigeelillä Murakawa 20 et ai. (1988) mukaan ja se siirrettiin Zeta™ Probe-paperille (BioRad Corp.) blottaaraalla geelejä yli yön 0,4 M NaOH:ssa. Täplät neutraloitiin 2 x SSC (1 x SSC sisältää 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitraattia), esihybridisoitiin 0,3 M NaCl:ssa, 15 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,8, 15 mM EDTA, 1,0 % 25 SDS, 0,5 % rasvattomassa maidossa (Carnation Co.) ja 0,5 mg/ml äänirikottua, denaturoitua lohen sperman DNA:ta. HCV:n cDNA- • · ; fragmenttien suhteen analysoitavat täplät hybridisoitiin 32P- leimattuun koettimeen, mikä oli luotu nicktransloimalla HCV:n cDNA-inserttisekvenssi kloonissa 35, kuvattu EP-julkaisussa Υ'Ι' 30 318, 216. Hybridi säätiön jälkeen täplät pestiin 0,1 x SSC:llä ί*: I (1 x SSC sisältää 0,15 M NaCl, 0,01 M natriumsitraatti) 65eC:ssa, kuivattiin ja autoradiografoitiin. Odotettu tuotekoko oli 586 ϊ ♦ f · '·’ ' nukleotidia pitkä; tuote, mikä hybridisoitui koettimen kanssa ja jakaantui geeleihin tällä kokoalueella, arvioitiin positiivi- « c 35 seksi virus-RNA:n suhteen.
• · « * t *
Kontrollina cPCR-alukkeet, mitkä olivat tarkoitetut monistamaan • · ...# alfa-1-antitrypsiinin mRNA:ta, suoritettiin todistamaan RNA:n • · « • f · • ·.· * • w 105279 90 läsnäolo kussakin analysoidussa näytteessä. Alfa-l-antitryp-siinigeenin kooditusalueen on kuvannut Rosenberg et ai. (1984) . Synteettisiä oligoraeeri-16-raeerialukkeita, mitkä olivat suunniteltuja monistamaan 365 nukleotidin fragmentti alfa-1-5 antitrypsiinigeenin kooditusalueelta, johdettiin nukleotideista 22-37 (sense) ja nukleotideista 372-387 (antisense). PCR-tuotteet osoitettiin käyttäen 32P-nicktranslaoitua koetinta, mikä on cDNA/PCR-alukkeiden välissä, mutta ei sisällä niitä.
10 Johtuen PCR-reaktion äärimmäisestä herkkyydestä ajettiin kaikki näytteet ainakin kolme kertaa. Kaikki väärät positiiviset signaalit eliminoitiin, kun seuraavia varokeinoja noudatettiin: 1) eliminoitiin aerosolit käyttäen ruuvi suljettuja putkia, missä oli kumiset O-rengastiivisteet; 2) pipetoitiin Ranin Microman™:in 15 positiivisen syrjäytymisen pipetoijilla, missä oli kertakäyttöiset männät/kapillaarit; ja 3) valittiin oligonukleotidisek-venssit cDNA:lle ja PCR-alukkeille kahdesta ei-vierekkäisestä cDNA-kloonista.
20 HCV: n RNA: n osoittaminen maksanävttelssä cPCR-menetelmällä cPCR-menetelmä suoritettiin totaali-RNA:lie, mikä oli eristetty kolmen simpanssin maksoista, mitkä simpanssit oli kokeellisesti infektoitu NANBH-aineella ja italialaisten potilaitten, joilla 25 oli diagnosoitu olevan krooninen NANBH, maksabiopsioista.
• ' . Kuvio 25A esittää cPCR-analyysit tulokset käyttäen 1 mikrogrammaa ··· kutakin totaalimaksa-RNA:n valmistetta. RNA eristettiin NANBH:n • t · .:. kroonisen vaiheen simpanssien maksanäytteistä (910) (kaista • · «· : .·, 30 1), kahdesta simpanssista infektion akuutissa vaiheessa (1028 i i » ja 508) (kaistat 2 ja vastaavasti 3) . PCR suoritettiin näytteille » · ...m kaistoilla 1-3 30 sykliä ja täplän, mikä sisälsi nuo kaistat, «Il ’ autoradiogramraia kehitettiin 5 tuntia. cDNA:ta 1 μg:sta totaali- RNA:ta akuutisti infektoituneesta eläimestä 1028 (kaista 4 ja 4 · a '· 35 kolmesta infektoituraattomasta simpanssista (kaistat 5-7), · « v : monistettiin 60 sykliä ja autoradiogrammeja, mitkä sisälsivät nuo kaistat, kehitettiin 7 päivää. 32P-leimattu Mspl-pilkottu .···. pBR322 DNA toimi merkkiaineena kaikissa autoradiogrammeissa.
• i · 105279 91
Voidaan nähdä tuloksista, että cDNA, mikä vastaa HCV:n cDNA:ta, havaittiin vain näytteissä, mitkä tulivat simpansseista, joilla oli NANBH, joko krooninen tai akuutti (kaistat 1, 3 ja 4). cPCR-tuotteet näillä kaistoilla jakaantuivat 527 ja 622 nukleotidin 5 merkkiainefragmenttien (ei esitetty) väliin.
Kuvio 25B esittää cPCR-analyysin tulokset käyttäen 10 % RNAssta, mikä oli uutettu 10 mm x 4 mm maksabiopsialieriöistä 15 kroonisesta NANB-potilaasta (kaistat 1-15), yhtä potilasta, 10 millä oli kryptogeeninen maksasairaus (kaista 16) ja yhtä kontrollinäytettä potilaasta, jolla oli krooninen hepatitis-B (kaista 17). Monistusta PCRsllä tehtiin 30 sykliä ja täplien autoradiogramroia kehitettiin 4 päivää, paitsi että kaistaa 1 kehitettiin 15 tuntia. Kuten nähdään tuloksista, oli 9/15 (60 15 %) ihmisnäytteistä positiivisia HCVsn RNA:n suhteen (kaistat 1, 2, 4, 6, 7, 10-13). Yksi potilas, jolla oli diagnosoitu kryptogeeninenn maksasairaus (kaista 16) ja yksi potilas, jolla oli krooninen HBV-infektio (kaista 17) olivat toistuvasti negatiivisia cPCR-analyysissä.
20 HCV/cPCR-analvvsin ihmisen maksabiopsioista 1a RIA:n seerumista YgxtallvL.kftyttäen Clflflt.3-poiypeptldiä SOD/HCV C100-3-polypeptidi (kutsutaan myös C100:ksi) on 25 yhdistelmäfuusiopolypeptidi, mikä sisältää 363 virusaminohappoa. Polypeptidi on hyödyllinen osoitettaessa HCVtn vasta-aineita . (ks. Kuo et ai. (1989)). C100:n valmistusmenetelmä on kuvattu ··* EP-julkaisussa 318,216.
«M
• · • · I · : .·„ 30 Suoritettiin radioimmunologinen analyysi käyttäen C100:aa ^ ι·« « seerumille, mikä oli kerätty samoista 17 ihmispotilaasta, joiden ...t roaksanäytteille suoritettiin HCV/cPCR-analyysi, kuten kuvattiin ·» · · · * yllä. Seerumi kerättiin samana päivänä kuin maksabiopsiat. Analyysi suoritettiin olennaisesti kuten kuvattiin EP-julkaisussa * * * ’·” 35 318,216, minkä tämän hakija omistaa ja mikä liitetään tähän : viitteeksi. Lyhyesti päällystettiin mikrotiitterilevyt (Immulon 2, Removeawell liuskat) 0,1 μg:lla puhdistettua C100:aa.
.··. Päällystettyjä levyjä inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa seeruminäyt- * • · • » « , * 105279 92 teiden (100 μΐ 1:100-laimennosta) tai sopivien kontrollien kanssa. Inkuboinnin jälkeen sitoutumaton materiaali poistettiin, levyt pestiin ja ihmisvasta-aine-C100-kompleksit osoitettiin inkuboimalla 12SI-leimatun lampaan anti-ihmisimmunoglobuliinin 5 kanssa. Sitoutumaton leimattu vasta-aine poistettiin imulla ja levyt pestiin. Määritettiin radioaktiivisuus yksittäisissä kuopissa.
RIA:n tulokset osoittivat, että 67 % näistä näytteistä oli 10 positiivisia anti-C100-vasta-aineille. Seerumi potilaasta, jolla oli diagnosoitu kryptogeeninen maksasairaus oli positiivinen anti-C- 100-vasta-aineille, vaikka virus-RNA:n tasot olivat ei-havaittavia potilaan maksassa tässä näytteessä. Korrelaatiotaso anti-C100-vasta-aineiden läsnäolon ja HCV:n cDNAtn välillä oli 15 70 %; kahdella potilaalla, jotka olivat negatiivisia vasta- aineille RIA:lla, oli merkittäviä HCV:n cDNA-tasoja maksoissaan (tietoa ei esitetty).
Tulokset merkitsevät, että virus on usein läsnä potilaiden, 20 joilla on kiertäviä anti-C100-vasta-aineita, maksassa ja vahvistaa väitteet, että anti-C100-vasta-aineiden läsnäolo heijastaa tarkasti HCV:lie altistumista. Edelleen, yhdessä otettuna, nämä tulokset merkitsevät, että tämän tyypin HCV on vastuullinen ainakin 75 % tämän tutkimuksen potilaista ja että 25 HCV:n pääasiallinen kanta Italiassa näyttää olevan tiukasti sukulainen HCV:n kannalle, mikä on vallitseva USA:ssa.
, · » ' Seerumin HCV/cPCR-analvvsl: Virus-RNA;n osoittaminen akuutin ·" vaiheen infektiossa simpansseissa « V · :**: 30 • 1 1 l Ajallista suhdetta maksavaurioiden esiintymisen, HCV:n RNA:n läsnäolon ja anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon välillä • ·· 90 * tarkkailtiin seerumissa kahdesta kokeellisesti infektoidusta simpanssista, joilla oli NANBH (numerot 771 ja 910). Maksavaurio 35 määritettiin alaniiniarainotransferaasitasoilla (ALT); HCV:n v ·1 RNA: n läsnäolo määritettiin HCV: n cPCR-analyysillä, mikä kuvattiin yllä; anti-HCV-vasta-aineet osoitetun käyttäen C100:n RIA:ä.
• 9 • · • · V · · • - « »3 105279 HCV/cPCR-analyysi suoritettiin RNA:lie, mikä oli uutettu 1 μ1:8ίβ simpanssin plasmaa. Seerumia otettiin simpanssista 771 infektion jälkeisinä päivinä 25, 32, 70 ja 88; cPCR:a suoritettiin 30 sykliä ja autoradiogrammia kehitettiin 18 päivää. Seerumia 5 otettiin simpanssista 910 infektion jälkeisinä päivinä 11, 28 ja 67; cPCR:a suoritettiin 60 sykliä ja autoradiogrammia kehitettiin 5 päivää.
Analyysien tulokset on esitetty kuviossa 26A simpanssille 771 10 ja kuviossa 26B simpanssille 910. Kuvioiden 26A ja 26B
vertailusta näkyy, että aikainen, hyvin määritelty piikki ALT-arvoissa akuutin hepatitiksen aikana korreloi virus-RNA:n läsnäolon kanssa infektoidussa yksilössä.
15 Tieto merkitsee myös, että HCV:n RNA:n läsnäolo, mikä merkitsee virusinfektion tilaa, edeltää anti-HCV-vasta-aineiden läsnäoloa. Simpanssilla 771 (kuvio 26A) oli selvästi määritelty akuutti transfuusion jälkeinen NANBH:n jakso 28 päivän kohdalla, mille oli tunnusomaista ALT-tasojen lähtöpiikki. HCVsn RNA osoitettiin 20 seerumissa, mikä oli kerätty 25. päivänä ja 32. päivänä.
Kuitenkaan tämän akuutin faasin aikana ei anti-HCV-vasta-aineita ollut läsnä. Tälle vastakohtana 70. päivänä HCV:n RNA oli alle kokeellisen osoitustason ja anti-HCV-vasta-aineet olivat kasvussa. 88. päivänä ei HCV:n RNA:ta voitu osoittaa, kun taas 25 anti-HCV-vasta-aineet olivat lisääntyneet merkittävästi 70. päivän arvon yli.
• · .:. Tulokset, mitkä saatiin simpanssin 910 seerumista olivat ··· .j. kuvioltaan jotakuinkin samanlaiset, vaikka aikaa, minä infektio e 30 indusoi HCV-vasta-aineita, ei voitu osoittaa taudin akuutin • · · j vaiheen aikana, mikä kesti ainakin 67 päivää; anti-HCV-vasta- ... aineet, mitkä osoitettiin RIA:lla 11. päivänä, johtui eläimen • · · 910 passiivisesta iramunisoimisesta vasta-aineilla plasmasta, mitä käytettiin eläimeen istuttamiseksi. Anti-HCV-vasta-aineita • « 35 havaittiin simpanssin 910 seerumissa myöhemmän, kroonisen 4 11 v : infektion faasin aikana (tietoa ei esitetty).
t • « I I « • 9 a I · • ♦ • · • I · « • » · • · * · a a « 9
• I I
• # • · 105279 94
Tulisi huomata, että alhaiset ALT-arvot plasmassa yksilöistä, joilla on krooninen NANBH, eivät välttämättä korreloi heikon virustuotannon kanssa. Simpanssista 910 kahdesta kolmeen ja puoleen vuoden aikana istutuksen jälkeen otettujen 17 eri 5 plasmanäytteen varastoa tarkkailtiin ALT-tasojen ja HCV:n RNA:n suhteen. Näytteiden ALT-arvot eivät ylittäneet 45 roU/ml; joka tapauksessa titraustutkimukset merkitsivät korkeita HCV:n tiittereitä (106 CID/ml). Suoritettiin cPCR:a 30 sykliä ja autoradiogrämmiä kehitettiin 15 tuntia; cPCR-analyysi osoitti 10 selvästi, että läsnä oli virus-RNA:ta (tietoa ei esitetty).
Seerumin HCV/cPCR-analvvsi; vlrus-RNA;n osoittaminen ihmisen akuutin faasin Infektiossa 15 Plasmaa leikkauspotilaasta kerättiin aikaisen akuutin vaiheen NANBH:n aikana HCV:n RNA:n ja anti-HCV-vasta-aineiden tutkimiseksi käyttäen HCV/cPCR-analyysiä ja vastaavasti C100-RIAraa. HCV/cPCR-analyysi suoritettiin käyttäen 1 μΐ plasmaa potilaasta ja neljästä ihmiskontrollista, joilla oli tunnettu 20 syntyperä; cPCRrää suoritettiin 30 sykliä ja hybridisoinnin ja pesun jälkeen autoradiogrammia kehitettiin 8 tuntia.
Tulokset osoittivat, että leikkauspotilaasta akuutin infek- tiovaiheen aikana kerätty seerumi sisälsi korkean tason virus- 25 RNA:ta ja että anti-HCV-vasta-aineita ei voitu osoittaa C100- RIArlla (tietoa ei esitetty). (Akuutin vaiheen plasmassa -;· leikkauspotilaasta tiedettiin olevan korkea NANBH:n infektoivan • · · ··. aineen korkea tiitteri [106,5 CID/ml, määritettynä Peinstone et I · · · : ;\ ai. (1981); Feinstone et ai. (1983) menetelmällä) . Tulisi huomata • · · · 30 kuitenkin, että tämä potilas muuttui serologisesti sisältämään
• V
anti-HCV-vasta-aineita C100-RIA:lla mitattuna suunnilleen 9 • « ·
I · I
kuukautta infektion jälkeen. Sukupuultaan tunnetun ihmisen ver-. . tailuplasmat olivat negatiivisia sekä HCV/cPCR-analyysissä että :·1'· C100-RIA: SSa.
• a · t i · V ' 35 * « i · • · • I I · · « · • 1 · · • · · • · 105279 95 HCV/cPCR-analvvsin herkkyys HCV/cPCR-analyysien herkkyys määritettiin analysoimalla kymmenkertaisia sarjalaimennoksia tunnetun tiitterin plasraavaras-5 tosta. Simpanssin plasmalla oli tiitteri "3 x 105 CID/ml ja RNA: ta uutettiin plasman 1 μ1:η kymmenkertaisista laimennoksista. cPCR:ää suoritettiin 30 sykliä ja hybridi säätiön ja pesun jälkeen autoradiograramia kehitettiin 15 tuntia. cPCR-tuotteet, mitkä ovat tulosta HCV-genorain "300, "30, ja "3 CID:n erien 10 monistamisesta on esitetty vastaavasti kaistoilla 1-3 kuviossa 29. Kaistojen 1 ja 2 näytteet olivat osoitettavissa autoradio-grammeissa, joita oli kehitetty 2 tuntia.
Koska keskimääräisen HCV:n tiitterin infektoituneissa yksilöissä 15 uskotaan olevan plasmassa suunnilleen 100 ja 10000 CID/ml välillä, tämä tieto ehdottaa, että HCV/cPCR-analyysi saattaa olla kliinisesti käyttökelpoinen.
HCV/cPCR-analyysi HCV; n varianttikantola varten 20
Suunniteltiin alukkeita, jotka muodostuivat oligomeerin 44-meerien sarjasta ja oligomeerin 45-meerien sarjasta, monistamaan HCV; n kantoja, mitkä ovat samanlaisia tai identtisiä HCV-eristeen kanssa, mistä cDNA-sekvenssi kuviossa 18 on peräisin. Näiden 25 alukkeiden suunnittelun alla oleva lähtökohta on keksintömme, että HCV on Flavityyppinen virus. Plaviviruksien perheen ·; jäsenillä on, verratuna HCV:hen, kaksi pääasiallista aminohap- • t · .:. posekvenssien säilyvää sarjaa, TATPPG ja QRRGR, näiden virusten : .· oletetulla NS3-alueella. Voidaan nähdä lukuisia muita pienempiä « * 30 sarjoja, esimerkiksi GDD oletetulla NS5-alueella. Muut sarjat » · » ... voidaan määrittää vertaamalla tunnettuja aminohapposekvenssejä • · · ’·’ ' HCV:n sekvenssin kanssa. Tämä tieto pääteltiin useiden
Flaviviruksien jäsenten sekvensseistä, mitä on kuvattu, sisältäen :.‘*i japanilaisen enkefaliittiviruksen (Sumiyoshi et ai. (1987)), • I t : 35 keltakuumeviruksen (Rice et ai. (1985)), Dengue tyypin 2 viruksen (Hahn et ai. (1988)), Dengue tyypin 4 viruksen (Mackow (1987)), .···. ja Länsi-Niilin viruksen. Säilyvät aminohapposekvenssit ja • ? « 9 I 105279 96 kodonien käyttö ovat annetut välittömästi alla olevassa taulukossa.
Säilyvät aminohapposekvenssit (ah.1 Flavlviruksilla 1a HCVillä 5 Ens,..„ah;n no aku
Virua 1 Δ IL L S.
H CV 1348 5’ ACC GCC ACC CCT CCG GCC 3’
Keltakuume 1805 ACA GCC ACA CCG CCT GGG
Länsi-Niili 1818 ACG GCA ACG CCA CCC GGG
10 Dengue-4 1788 ACC GCA ACC CCT CCC GGA
JEV 1957 ACA GCG ACC CCG CCT GGA
HCV:n sense-aluke (44-meeri)= 5’ ACC GCC ACC CCX CC 3’ (X = A, T, C tai G) 15
Ens. ah: n no ah.
YimjL Q R R Q. R
HCV 1486 5’ CAA CGT CGG GGC AGG 3’
Keltakuume 1946 CAA AGG AGG GGG CGC
20 Länsi-Niili 1959 CAG CGG AGA GGA CGC
Dengue-4 1929 CAG AGA AGA GGG CGA
JEV 1820 CAA CGG AGG GGC AGA
HCV:n antisense-aluke ·;. (45-meeri)= 3’ GTX GCA GCC CCG TCC 5’ ·:· 25 (X = T tai C) • · · · Ψ o • · • 1 c «f· · HUOM: Alukesekvenssi valittiin minimoimaan nukleotidi virheiden lukumäärää alukesekvenssin 3' -päässä ja maksimoimaan nukleotidien lukumäärää kunkin alukkeen 3' -päässä, mikä sopii tarkasti mihin ... . 30 tahansa mahdolliseen nukleotidisekvenssiin tai sen kompleraent- • · · tiin, koodittaen yllä merkittyjä aminohappoja.
44-meeriset tai 45-meeriset oligomeerialukkeet oli suunniteltu ’.["'I niin, että näitä aminohappoja koodittavat sekvenssit liittyivät .···. 35 alukkeen sisälle. Lisäksi ne sisältävät virheitä kunkin alukkeen 105279 97 3'-päässä ja ne on johdettu kahdelta erilaiselta HCV-genomin alueelta, mitkä ovat läsnä kloonissa 40b (ks. kuvio 28) ja mitkä on johdettu alueelta, mikä koodittaa HCV:n oletettua NS3:a. Sarjoissa olevien oligonukleotidialukkeiden kaavat ovat: 5 5' GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC GCC ACC CCX CC 3' missä X on A, T, G tai C; ja 10 5' TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT GCC CCG ACT YTG 3' missä Y on T tai C.
15 HCV/cPCR-analyysi suoritettiin käyttäen näitä alukkeita HCVsn RNA:n monistamiseksi simpanssin 910 plasmassa. Analyysimenetelmä oli olennaisesti, kuten kuvattiin ylläolevassa osassa, paitsi että oligomeerialukkeiden 44-meerien ja 45-meerien sarjat 20 korvattiin alukkeilla, mitkä olivat peräisin kloonista 36 ja kloonista 37b. Lisäksi monistetun HCV:n cDNA:n osoittaminen tehtiin hybridi soimalla koettimella, mikä oli peräisin kloonista 40a, minkä sekvenssi on esitetty kuviossa 32.
25 Koetin valmistettiin monistamalla kloonin 40a segmentti käyttäen PCR-menetelmää, mikä on kuvattu yllä ja 18-meerisiä alukkeita, mitkä sisälsivät seuraavat sekvenssit: * • · · « ···» : 5' GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3' ja 30 5' GAG CGT GAT TGT CTC AAT 3'.
• · 1 ·· • · · • · ·
Monistuksen jälkeen koetinvalmiste leimattiin 32P:llä nick- . . translaatiolla.
• · • · ·
• V
* « < \ ' 35 Kuvio 33 esittää Southern-blottauksen autoradiografia, missä koetin oli peräisin kloonista 40a. 3zP-leimatut Mspl-pätkityn pBR322:n fragmentit toimivat merkkiaineina (kaista 1). Näitä .;. alukkeita käyttäen monistuksesta tuloksena olevan PCR-tuotteen » · 105279 98 ennustettu koko oli 490 nukleotidia (nt). Kaksoisreaktiot on esitetty kaistoilla 2 ja 3.
HCV:n 5'-alueen varianttien analyysi 5
Flavivirusmalliin perustuen HCV:n cDNA:n 5'-alue, mikä on kyljittäin niiden alueiden kanssa, mitä edustavat kloonien ag30a ja k9-l alueet, koodittaa oletetun kuori- ja/tai matriisiproteiini(e)n (E/M) segmenttiä. Seerumia, mikä oli saatu 10 simpanssista, mistä HCV:n cDNA-kirjasto oli koottu, analysoitiin HCV/cPCR:llä sen määrittämiseksi, onko kohdealueen sisällä läsnä variantteja.
HCV/cPCR-analyysi suoritettiin olennaisesti kuten kuvataan yllä 15 kloonin 5'-32 eristämiseksi, lukuunottamatta käytettyjä alukkeita ja koettimia. Kuvio 37 esittää alukkeiden ja koettimien suhteen (ja kloonien, mistä ne ovat peräisin) HCV;n cDNA:n kohdealueeseen. Yksi PCR-alukesarja, ag30al6A ja K91Envl6B, oli peräisin klooneista ag30a ja k9-l, mitkä ovat ylävirtaan ja 20 vastaavasti alavirtaan kohdesekvenssistä. Alukkeita ag30al6A ja K91Envl6B käyttäen saadun PCR-tuotteen odotettu koko on 1,145 ke perustuen HCV:n cDNA:n vahvistettuun sekvenssiin. Käytettiin myös kahta muuta PCR-alukkeiden sarjaa kattaen alueen, mikä monistettiin käyttäen ag30al6A:ta ja K91Envl6B:tä ja mennen 25 päällekkäin toistensa kanssa, HCV:n RNA:n PCR-monistamiseksi seerumissa. Täten tässä tapauksessa PCR-reaktiot suoritettiin ..: käyttäen yhtä alukkeiden ag30al6A ja CA156el6B sarjaa ja toisena alukkeiden sarjana CA156el6A:ta ja K91Envl6B:tä. Näiden parien odotetut PCR-tuotteiden koot olivat 615 nukleotidia (nt) ja ·;··: 30 vastaavasti 683 nt. Välittömästi alla oleva taulukko luettelee alukkeen, kloonin mistä se on peräsin ja alukesekvenssin.
,·. : Taulukko f · ·
Aluke klctosl Sekvenssi I I « *\ ‘ 35 ag30al6A ag30a 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' ·:··: K91Envl6B k9-l 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3' i’": CA156el6B 156 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3' CA156el6A 156 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3' • « • · • · · f I i t · 105279 99 CA216al6A 216 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3' CA216al6B 216 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3' CA84al6A 84 5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3' CA84al6B 84 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3' 5
Kaikkien HCV/cPCR-tuotteiden koettiraet muodostuivat 3ZP-leiraatuista HCV:n cDNAsn osista, jotka oli valmistettu PCR-monistamalla kloonin 216 aluetta (käyttäen CA216al6A:ta ja 216al6B: tä alukkeina) ja kloonin 84 aluetta (käyttäen CA84al6A: ta 10 ja CA84al6B:tä alukkeina); 3ZP tuotiin PCR-tuotteisiin nick translaatiolla. Koettimet eivät menneet päällekkäin HCV/cPCR-reaktioissa käytettyjen alukkeiden kanssa.
Kuvio 38 esittää Southern blottauksen autoradiografin, missä 15 HCV/cPCR-tuotteet hybridisoitiin 3ZP-leimattujen koettimien kanssa. HCV/cPCR-tuote, mikä ulottui alukkeista ag30al6A ja K91Envl6B (kaista 1), oli suunnilleen 1,1 ke; mitään muita PCR-tuotteita ei havaittu 15 tunnin kehittämisen aikana. HCV-tuotteet, mitkä ulottuivat alukesarjoista ag30al6A/CA156el6B 20 (kaista 2) ja CA156el6A/K91Envl6B (kaista 3) olivat suunnilleen 625 nt ja vastaavasti suunnilleen 700 nt. PCR-tuotteiden koko määritettiin vertaamalla fragmenttien, mitkä olivat tulosta pBR322:n pätkimisestä Mspl:llä ja PhiX 174, mikä oli pätkitty HaeIII:lla (kaista 5), suhteellisia jakaantumisia.
25
Yllä oleva tutkimus osoittaa insertiot ja häviämät, mitkä ovat ·;1 niinkin pieniä kuin suunnilleen 20 nt - 50 nt ja DNA:n uudelleen ··· 1 ··· järjestymiset, mitkä muuttavat kohde-DNA:n kokoa. Tulokset • Ml : .·. kuviossa 38 vahvistavat, että on vain yksi pääasiallinen cDNA:n 30 laji, mikä on peräisin simpanssin seerumin HCV:n E/M-alueelta.
· · • · · • ·
Monistus HCV;n cDNA-sekvenssien monistamiseksi kävttäeil
H
. . PCR:ää 1a alukkeita. mitkä ovat peräisin Flaviviruksififl genomi sekvenssi en säilyviltä alueilta : 35
Havaintomme, että HCV on Flaviviruksen kaltainen virus, sallii .··'. strategian tunnistamattomien HCV:n cDNA-sekvenssien kloonaamisek- si käyttäen PCR-tekniikkaa ja alukkeiden käytön, mitkä ovat • · 105279 100 peräisin alueilta, mitkä koodittavat säilyviä aminohapposekvenssejä Flaviviruksissa. Yleisesti, yksi alukkeista on johdettu määritellystä HCV:n genomisekvenssistä ja toinen aluke, mikä on kyljittäin sekventoimattoman HCV-polynukleotidin alueen 5 kanssa, on peräisin flaviviruksen säilyvältä alueelta. Flaviviruksien genomien tiedetään sisältävän säilyviä alueita NS1 - ja E-polypeptidien sisällä, mitkä alueet ovat kooditettuja flaviviruksen genomin 5' -alueella. Täten cDNA-sekvenssien, mitkä ovat peräisin oletetuilta vertailukelpoisilta HCV-genoroin 10 alueilta, suunnitellaan ylävirran puolen alukkeita, mitkä ovat peräisin säilyvistä sekvensseistä näiden flaviviruspolypeptidien alueella. Alavirran puolen alukkeet ovat peräisin HCV:n cDNA:n tunnetun osan ylävirran puolen päästä.
15 Koodin degeneraation takia on todennäköistä, että flaviviruskoet-timien ja vastaavan HCV:n genomisekvenssin välillä on epäsopivia kohtia. Siksi käytetään strategiaa, mikä on samanlainen kuin se, minkä on kuvannut Lee (1988). Leen menettely käyttää sekaoligonukleotidialukkeita, mitkä ovat komplementaarisia 20 aminohapposekvenssin käänteistranslaatiotuotteille; sekvenssit seka-alukkeissa ottavat huomioon jokaisen kodonidegeneraation säilyvää aminohapposekvenssiä varten.
Kolme sarjaa alukeseoksia luotiin perustuen aminohappohomolo-25 gioihin, joita havaittiin useissa flaviviruksissa, sisältäen Dengue-2,4 (D-2,4), japanilaisen enkefaliittiviruksen (JEV), ·'; keltakuumeen (YF) ja Länsi-Niilin viruksen (WN). Alukeseos, • · f ···' mikä on peräisin kaikkein eniten ylävirtaan olevasta säilyvästä « · i.i : sekvenssistä (5' -1 > perustuu aminohapposekvenssiin gly-trp-gly, 9 30 mikä on osa säilyvästä sekvenssistä asp-arg-gly-trp-gly-aspN, :T: mikä on löydetty D-2:n, JEV:n, YF:n ja WN:n E-proteiinista.
Seuraava alukesarja (5'-2) perustuu alavirran säilyvään sekvenssiin E-proteiinissa, phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly- • · ,*·.·. asp-ser-tyr-ileu ja se johdetaan phe-gly-asp:sta; säilyvä * , 35 sekvenssi on läsnä D-2:ssa, JEV:ssä, YF:ssä ja WN:ssä. Kolmas alukesarja (5'-3) perustuu aminohapposekvenssiin arg-ser-cys, mikä on osa säilyvää sekvenssiä cys-cys-arg-ser-cys D-2:n, D-4sn, JEVsn, YF:n ja WN:n NS1-proteiinissa. Yksittäiset alukkeet, • · · • » 105279 101 mitkä muodostavat seoksen 5'-3:ssa, on esitetty kuviossa 53. Säilyvältä alueelta johdettujen vaihtelevien sekvenssien lisäksi kukin aluke kussakin seoksessa sisältää myös vakion alueen 5' -päässä, mikä sisältää sekvenssin, mikä koodittaa rekstrik-5 tioentsyymien Hindlll, Mbol ja EcoRI, paikkoja.
Alavirran puolen aluke ssc5h20A on peräisin nukleotidisekvenssis-tä kloonissa 5h, mikä sisältää HCV:n cDNA:ta, minkä sekvenssit menevät päällekkäin kloonien 14i ja 11b sekvenssien kanssa. 10 Sekvenssi ssc5h20A:ssa on·.
5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3'.
Voidaan käyttää myös vaihtoehtoista aluketta ssc5h34A. Tämä 15 aluke on peräisin kloonin 5h sekvenssistä ja sisältää lisäksi nukleotideja 5'-päässä, mitkä luovat restriktioentsyymin paikan helpottaen täten kloonaamista. ssc5h34A-.n sekvenssi on*.
5’ GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3' 20 PCR-reaktio, minkä kuvasi alunperin Saiki et ai. (1986) suoritetaan olennaisesti, kuten on kuvannut Lee at ai. (1988), lukuunottamatta että cDNA.-n malline on RNA:ta, mikä on eristetty HCV-infektoituneen simpanssin maksasta tai viruspartikkeleista, 25 mitkä on eristetty HCV-infektoidun simpanssin seerumista. Lisäksi liittäraisolosuhteet ovat vähemmän ankaria ensimmäisellä ·*; monistuskierroksella (0,6 M NaCl ja 25eC), koska se alukkeen »· * ··*'· osa, mikä liittyy HCV-sekvenssiin on vain 9 nukleotidia pitkä ί ja siinä voi olla osumattomia kohtia. Lisäksi jos käytetään m 30 ssc5h34A-.ta, lisäsekvenssit, mitkä eivät ole peräisin HCV- ··· ί,ί ' genomista, pyrkivät destabiloimaan aluke-mallinehybridin. Ensim mäisen monistuskierroksen jälkeen voivat liittämisolosuhteet olla tiukempia (0,066 M NaCl ja 32® C - 37°C), koska monistetut • · sekvenssit sisältävät nyt alueita, mitkä ovat komplementaarisia $ , 35 alukkeille tai niiden kahdentumia. Lisäksi kymmenen ensimmäistä
IMU
raonistuskierrosta suoritetaan Klenowin entsyymillä I sopivissa ’.··* PCR-olosuhteissa tuolle entsyymille. Näiden syklien tultua I ( i • « » 9 lit 9 9 9 9 1 • < · • · 105279 102 suoritetuiksi näytteitä uutetaan ja käytetään Taq-polymeraasia koesarjan ohjeiden mukaan, niinkuin Cetus/Perkin-Elmer antaa.
Monistuksen jälkeen monistetut HCV:n cDNA-sekvenssit osoitetaan 5 hybridisaatiolla käyttäen koetinta, mikä on peräisin kloonista 5h. Tämä koetin on peräisin sekvensseistä ylävirtaan niistä, joita käytettiin alukkeen johtamiseen, eivätkä ne mene päällekkäin kloonista 5h johdettujen alukkeiden sekvenssien kanssa. Koettimen sekvensi on: 10 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 31.
Teollinen käyttökelpoisuus 15 Tässä kuvatut menetelmät ja myös oligomeerit, sekä koettimet että alukkeet, mitkä ovat peräisin HCV:n cDNA:sta ja niitä sisältävät koesarjat, ovat hyödyllisiä tarkkaan, suhteellisen yksinkertaiseen ja taloudelliseen HCV:n läsnäolon määrittelyyn 20 biologisissa näytteissä, erityisemmin veressä, mitä voidaan käyttää verensiirtoihin ja yksilöissä, joilla epäillään olevan HCV-infektio. Lisäksi nämä menetelmät ja oligomeerit voivat olla hyödyllisiä aikaisemman vaiheen HCV-infektion osoittamiseen kuin immunologiset analyysit, jotka perustuvat yhdistelmä-HCV-25 polypeptideihin. Myös monistetun polynukleotidin hybridisaatio-analyysi osoittaa HCV:n RNA:n satunnaisissa näytteissä, mitkä . ovat anti-HCV-vasta-aineen suhteen negatiivisia. Täten tässä • · kuvattuja koettimia ja alukkeita voidaan käyttää monistetuissa • ti .:. hybridisaatioanalyyseissä, sellaisten immunologisten analyysien !"1. 30 yhteydessä, mitkä perustuvat HCV-polypeptideihin, identifioimaan • · · täydellisemmin infektiot, mitkä aiheutuvat HCV:stä ja HCV- • · ... infektoituneet biologiset näytteet, sisältäen veren.
• · ·
I I I
Tässä annettu tieto sallii alukkeiden ja/tai koettimien *. 'i 35 suunnittelun, mitkä ovat peräisin HCV-genomin säilyviltä • « « V : alueilta. Näiden alukkeiden ja koettimien varaaminen tekee saatavaksi yleisen menetelmän, mikä osoittaa variantti-HCV-kannat .···. ja mikä on käyttökelpoinen seulottaessa verta ja verituotteita.
» · « · « « • · 1
« w • · P
· · « · · 105279 103
Jos menetelmässä käytetyt alukkeet ovat peräisin HCV-genomin säilyviltä alueilta, menetelmän tulisi auttaa HCV:n varianttikan-tojen osoittamisessa ja/tai identifioinnissa. Tämän vuorostaan tulisi johtaa immunologisten lisäreagenssien kehittämiseen HCV:n 5 osoittamiseen ja diagnosointiin ja myös lisäpolynukleotidirea-genssien kehittämiseen HCV:n osoittamiseksi ja käsittelemiseksi.
Lisäksi alukkeiden ja koettimien sarjat, mitkä on rakennettu flaviviruksien ja HCV:n säilyvistä aminohapposekvensseistä, 10 sallivat näiden infektoivien aineiden yleisen osoitusmenetelmän.
Seuraavat luetellut materiaalit on talletettu Budapest Treaty:n ehdoilla American Type Culture Collection' iin (ATCC), osoitteessa 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, USA ja niille 15 on annettu seuraavat talletusnumerot.
lambda-gtll ATCC No. Talletusnäivä HCV:n cDNA-kirjasto 40394 01.12.1987 klooni 81 40388 17.11.1987 20 klooni 91 40389 17.11.1987 klooni 1-2 40390 17.11.1987 klooni 5-1-1 40391 18.11.1987 klooni 12f 40514 10.11.1988 klooni 35f 40511 10.11.1988 25 klooni 15e 40513 10.11.1988 klooni X9-1 40512 10.11.1988 JSC 308 20879 05.05.1988 « · pS356 67683 29.04.1988 • 1« f • · · c ·”·. 30 Lisäksi tehtiin seuraavat talletukset 11.05.1989.
• · · % · · · · ... Kanta ink1 e Eli ATCC-Nq-».
: D1210 (Cfl/5-1-1) EP 67967 D1210 (Cf1/81) EP 67968 \'·ί 35 D1210 (Cfl/CA74a) EP 67969 '·'?'· Dl210 (Cfl/35f) AB 67970 D1210 (Cfl/279a) EF 67971 D1210 (Cf1/C36) CD 67972 » · • · · tl· a a i a t » a a a a a a 104 105279 D1210 (Cf1/131) AB 67973 D1210 (Cf1/C33b) EF 67974 D1210 (Cfl/290a) AB 67975 HB101 (AB24/C100 #3R) 67976 5
Seuraavat kannan D1210 johdannaiset talletettiin 03.05.1989.
Kannan. johdannainen ATCC Ng-».
pCFlCS/C8f 67956 10 pCFlAB/C12f 67952 pCFlEF/14c 67949 pCFlEF/15e 67954 pCFlAB/C25c 67958 pCFlEF/C33c 67953 15 pCFlEF/C33f 67050 pCFlCD/33g 67951 pCFlCD/C39c 67955 pCFlEF/C40b 67957 pCFlEF/CA167b 67959 20
Seuraavat kannat talletettiin 12.05.1989.
Kanta ATCC No.
Lambda gtll (C35) 40603 25 Lambda gtlO (beta-5a) 40602 D1210 (C40b) 67980 • · D1210 (M16) 67981 • * · • · · ..!·* Seuraavat biologiset materiaalit talletettiin 23.03.1990.
j.· · 30 Materiaali ATCC No.
·:··: 5' -klooni32 (pUC18S:ssä) 68276 • · · • « · • · · t < « • · « « ·

Claims (25)

105 105279
1. Polynukleotid vilken kan hybridisera tili en HCV-sekvens i en nukleotidsträng i en analyt, kännetecknad därav att den JS omfattar en kontinuerlig sekvens om minst ätta nukleotider härstammande frän HCV-genomets beständiga region, eller ett komplement därtill.
1. Polynukleotidi joka voi hybridisoitua analyytin polynukle-otidisäikeen HCV-sekvenssiin, tunnettu siitä että se käsittää 5 ainakin kahdeksan nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta tai sen komplementin.
2. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att 20 den omfattar en kontinuerlig sekvens om minst tio nukleotider härstammande frän HCV-genomets beständiga region, eller ett komplement därtill.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää ainakin kymmenen nukleotidin jatkuvan 10 sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
3. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att 25 den omfattar en kontinuerlig sekvens om minst tolv • · · : .·. nukleotider härstammande frän HCV-genomets beständiga region, • · · • · · · eller ett komplement därtill. • · • · • « · • · « ·
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää ainakin kahdentoista nukleotidin jat- 15 kuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
4. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att .···. 30 den omfattar en kontinuerlig sekvens om minst femton nukleo- * I · ···, tider härstammande frän HCV-genomets beständiga region, eller * · ett komplement därtill. I I T I « * < * I ( ( « ·
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää ainakin viidentoista nukleotidin jat- 20 kuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
5. Polynukleotid enligt nägot av patentkrav 1-4, kännetecknad :\\\’ 35 därav att den beständiga regionen är inom NS3, höljet eller • * * • · · • · 105279 de omräden vilka kodar kärnan, eller den 5'ej translaterade regionen i ett HCV-genom.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että säilyvä alue sisältyy HCV-genomin NS3- 25 alueeseen, kuoreen, ydintä koodaaviin alueisiin tai ei- • ••I : transloituun 5'- alueeseen. * · · • * · · • ·
6. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att 5 polynukleotiden omfattar (i) en nukleotidsekvens som kodar polypeptidsekvensen TATPPG eller QRRGR, eller (ii) ett kom-plement tili nukleotidsekvensen enligt (i).
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu “ # siitä että polynukleotidi käsittää (i) nukleotidisekvenssin .···. 30 joka koodaa polypeptidisekvenssiä TATPPG tai QRRGR tai (ii), • · · .···. (i)-kohdan mukaisen sekvenssin komplementin. • · • * * I 1 I f » I
7. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att 10 polynukleotiden omfattar sekvensen 5' ACC GCC ACC CCX CC 3', väri X är en valbar nukleotid, eller 5' CCT GCC CCG ACG XTG 3', väri X är T eller C.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu • I siitä että polynukleotidi käsittää sekvenssin • · · 35 5' ACC GCC ACC CCX CC 3', missä X on mikä tahansa nukleotidi, « · • *·· tai .06 105279 5' CCT GCC CCG ACG XTG 3', missä X on T tai C.
8. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att polynukleotiden omfattar (i) en nukleotidsekvens vilken kodar polypeptidsekvensen GWG, FGD eller RSC, eller (ii) ett kom-plement tili nukleotidsekvensen enligt (i).
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää (i) nukleotidisekvenssin 5 joka koodaa polypeptidisekvenssiä GWG, FGD tai RSC, tai (ii), (i)-kohdan mukaisen nukleotidisekvenssin komplementin.
9. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att polynukleotiden ingär i en blandad mängd oligonukleotid-primers omfattande de individuella sekvenserna enligt figur 53.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että polynukleotidi kuuluu sekaoligonukleotialukkeiden 10 joukkoon joka käsittää kuvion 53 mukaiset yksittäissekvens-sit.
10. Polynukleotid enligt patentkrav 1, kännetecknad därav att • .·. polynukleotiden omfattar en sekvens vald ur gruppen bestäende ♦ · · ♦ ·· · av • · .... 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' ; 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'; ... 30 5' CGA CAA GAA AGA CAG A3'; • » 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'; • · 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3'; : . 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3'; 5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3'; och 35 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3'. • « · • · , I « • · · • · 105279
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää sekvenssin joka on valittu 15 joukosta joka koostuu seuraavista: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' ; 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'; 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3' } 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'; 20 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3' ; 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3'; 5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3'; ja 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3' .
11. Polynukleotid enligt nägot av patentkrav 1-10, känneteck-nad därav att polynukleotiden är i en redskapsförpackning packad i ett lämpligt kärl och försedd raed bruksanvisning. 5 12. Förfarande för detektering av en HCV-sekvens eller dess komplement i en analytsträng vilken misstänks innehälla se-kvensen, kännetecknat därav att det omfattar att anal-ytsträngen bringas i kontakt med en polynukleotid omfattande en sekvens om ätminstone litta kontinuerliga nukleotider frän 10 en beständig region av ett HCV-genom eller dess komplement, och analytsträngen inkuberas med polynukleotiden sä specifika hybridduplex uppstär mellan polynukleotiden och anlytsträng-en, och närvaron av det specifika hybridduplexet detekteras. 15 13. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar en kontinuerlig sekvens om ätminsto-ne 10 nukleotider frän en beständig region av ett HCV-genom, eller ett komplement därtill. 20 14. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar en kontinuerlig sekvens om ätminsto-ne 12 nukleotider frlin en beständig region av ett HCV-genom, eller ett komplement därtill. • « i > 25 15. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att ·«·· : .·; polynukleotiden omfattar en kontinuerlig sekvens om ätminsto- • M · ne 15 nukleotider frlin en beständig region av ett HCV-genom, eller ett komplement därtill. • ·β· · .··. 30 16. Förfarande enligt nägot av patentkrav 12-15, kännetecknat « · · • · · .···. därav att den beständiga regionen är inom NS3, höljet eller de omräden vilka kodar kärnan, eller den 5'ej translaterade regionen i ett HCV-genom. < 35 17. Förfarande enligt nägot av patentkrav 12-16, kännetecknat '/·· därav att polynukleotiden är en sond och förfarandet vidare 1052” omfattar detektering av hybrider mellan sonden och anal-ytsträngen.
11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen polynukleoti- • · · · : .·. di, tunnettu siitä että se on välinesarjassa pakattuna sopi- • i f • · · · vaan astiaan käyttöohjeilla varustettuna. « · · • · « • · ·
12. Menetelmä HCV-sekvenssin tai sen komplementin toteamisek-,···. 30 si analyyttisäikeestä, jota epäillään sisältävän sekvenssin, • m .···. tunnettu siitä että se käsittää analyyttisäikeen tuomisen • rf f kosketukseen polynukleotidin kanssa joka käsittää ainakin : kahdeksan nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin I « HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin, ana-35 lyyttisäikeen inkuboinnin polynukleotidin kanssa spesifisten, :\i polynukleotidin ja analyyttisäikeen välisten hybrididupleksi- 105279 en muodostamiseksi, ja spesifisten hybrididupleksien toteamisen.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä 5 että polynukleotidi käsittää ainakin kymmenen nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä 10 että polynukleotidi käsittää ainakin kahdentoista nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä 15 että polynukleotidi käsittää ainakin viidentoista nukleotidin jatkuvan sekvenssin joka on peräisin HCV-genomin säilyvältä alueelta, tai sen komplementin.
16. Jonkin patenttivaatimuksista 12-15 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä että säilyvä alue sisältyy HCV-genomin NS3- alueeseen, kuoreen, kuorta koodaaviin alueisiin tai ei-transloituun 5'- alueeseen.
17. Jonkin patenttivaatimuksista 12-16 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä että polynukleotidi on koetin ja että menetel- • · · · : mä edelleen käsittää koettimen ja analyyttisäikeen välisten • · · · hybridien toteamisen. • · « • · « • · · ▼ ·
18. Förfarande enligt nägot av patentkrav 12-16, kännetecknat 5 därav att polynukleotiden ingär i en primermängd vilken är lämplig för utförande av polymeraskedjereaktion (PCR) och ligger intill en mälregion vilken skall araplifieras, och väri mälregionen amplifieras tili följd av hybridformation. 10 19. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar (i) en nukleotidsekvens som kodar polypeptidsekvensen TATPPG eller QRRGR, eller (ii) ett kom-plement tili nukleotidsekvensen enligt (i). 15 20. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar sekvensen 5' ACC GCC ACC CCX CC 3', väri X är en valbar nukleotid, eller 5' CCT GCC CCG ACG XTG 3', väri X är T eller C. 20
18. Jonkin patenttivaatimuksista 12-16 mukainen menetelmä, .···. 30 tunnettu siitä että polynukleotidi kuuluu alukejoukkoon, joi- • · • · · .···, loin alukejoukko soveltuu polymeraasiketjureaktion (PCR) suo- • 1 « rittamiseen ja sijaitsee monistettavan kohdealueen vieressä, • « c ja jolloin kohdealue monistuu hybridimuodostuksen seuraukse- « · ’··.·' na. ««« : : 35 f M · « · · • · · • 1 108 105279
19. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää (i) nukleotidisekvenssin joka koodaa polypeptidisekvenssiä TATPPG tai QRRGR, tai (ii) kohdan (i) mukaisen nukleotidisekvenssin komplementin. 5
20. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää sekvenssin 5' ACC GCC ACC CCX CC 3', missä X on mikä tahansa nukleotidi, tai 10 5' CCT GCC CCG ACG XTG 3', missä X on T tai C.
21. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar (i) en nukleotidsekvens vilken kodar polypeptidsekvensen GWG, FGD eller RSC, eller (ii) ett kom-plement tili nukleotidsekvensen enligt (i). 25 • · · · : .·. 22. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att • · · • « · * polynukleotiden ingär i en blandad mängd oligonukleotid- • * primers omfattande de individuella sekvenserna enligt figur • « · 53. ··· < 30 •
21. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää (i) nukleotidisekvenssin joka koodaa polypeptidisekvenssin GWG, FGD tai RSC, tai (ii) koh- 15 dan (i) mukaisen nukleotidisekvenssin komplementin.
22. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polynukleotidi kuuluu sekaoligonukleotidialukkeiden joukkoon joka käsittää kuvion 53 mukaiset yksittäissekvens- 20. it.
23. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat därav att polynukleotiden omfattar en sekvens vald ur gruppen bestäende av 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3'; < 35 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'; i < · 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3'; • « 105279 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3' ; 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3'; 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3'; 5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3'; och 5 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3' .
23. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polynukleotidi käsittää sekvenssin joka on valittu joukosta joka koostuu seuraavista: 25 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3'; 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'; i » · 5' CGA CAA GAA AGA CAG A3'; • a 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'; • · · 5' TGA ACT ATG CAA CAG G 3'; .···, 30 5' GGA GTG TGC AGG ATG G 3'; • · 5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3'; ja a · 5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3' .
24. Förfarande enligt nägot av patentkrav 12-23, kännetecknat därav att analytsträngen är närvarande i blod eller en blod-produkt, och väri blodet eller blodprodukten som inte hybri- 10 diserar med polynukleotiden sparas och potentiellt infektiöst HCV sälunda elimineras frän ett förräd blod eller blodproduk-ter.
24. Jonkin patenttivaatimuksista 12-23 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä että analyyttisäie on läsnä veressä tai veri- tuotteessa, ja missä veri tai verinäyte joka ei muodosta hyb- 105279 ridiä polynukleotidin kanssa säilytetään, jolloin potentiaalisesti tarttuva HCV hävitetään veren tai verituotteen varastosta.
25. Menetelmä HCV-sekvenssin käsittävän polynukleotidin tuot tamiseksi, tunnettu siitä että menetelmä käsittää nukleotidien polymerisoinnin käyttäen polymerisaation aikaansaavaa ai-, netta, jolloin saadaan jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mu kainen polynukleotidi. JO
25. Förfarande för framställning av en polynukleotid omfat-15 tande en HCV-sekvens, kännetecknat därav att förfarandet om- fattar polymerisation av nukleotider med hjälp av ett polyme-riserande medel sä en polynukleotid enligt nägot av patentkrav 1-12 uppstär. ···· • · • · · • · · ··· · • · • M • · * I I · - » · · • · « « * • · * • · « · • · f « * 4 » * 4 4« 4 9 • * • I * V « · 9 9 9 9 9 9 9 • 99 • ·
FI915443A 1989-05-18 1991-11-18 Polynukleotideja ja menetelmiä jotka ovat hyödyllisiä hepatitis C-viruksen seulomisessa FI105279B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35596189A 1989-05-18 1989-05-18
US35596189 1989-05-18
US45663789A 1989-12-21 1989-12-21
US45663789 1989-12-21
US50543590A 1990-04-04 1990-04-04
US50543590 1990-04-04
US9002853 1990-05-18
PCT/US1990/002853 WO1990014436A1 (en) 1989-05-18 1990-05-18 Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI915443A0 FI915443A0 (fi) 1991-11-18
FI105279B true FI105279B (fi) 2000-07-14

Family

ID=27408242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915443A FI105279B (fi) 1989-05-18 1991-11-18 Polynukleotideja ja menetelmiä jotka ovat hyödyllisiä hepatitis C-viruksen seulomisessa

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0398748B1 (fi)
JP (3) JP2656996B2 (fi)
AT (1) ATE211772T1 (fi)
AU (1) AU638719B2 (fi)
BG (1) BG60348B2 (fi)
CA (1) CA2017157C (fi)
DE (1) DE69033891T2 (fi)
DK (1) DK0398748T3 (fi)
ES (1) ES2166749T3 (fi)
FI (1) FI105279B (fi)
GE (1) GEP20002164B (fi)
HU (1) HUT59964A (fi)
LV (1) LV10729B (fi)
MC (1) MC2188A1 (fi)
NO (1) NO303503B1 (fi)
RO (1) RO113059B1 (fi)
WO (1) WO1990014436A1 (fi)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2482618A2 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Teknoware Oy LED tubular lamp and lighting fixture arrangement

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6489246A (en) * 1987-09-30 1989-04-03 Sony Corp Fixing method for color sorting mechanism of color cathode-ray tube
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
US5714596A (en) * 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US5712088A (en) * 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
US6861212B1 (en) 1987-11-18 2005-03-01 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
ES2029171A6 (es) * 1989-12-18 1992-07-16 Wellcome Found Un procedimiento para preparar un polipeptido virico de hepatitis no a y no b post-transfusional (pt-nanbh)
CA2044296A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-13 Hiroaki Okamoto Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus
US5747339A (en) * 1990-06-25 1998-05-05 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide
DE69106141T2 (de) * 1990-06-30 1995-05-24 Akzo Nobel Nv Non-a non-b sequenzen.
DK0469348T3 (da) * 1990-07-11 1997-04-01 Shionogi & Co cDNA-sekvens og detektering af hepatitis C-virus
WO1992001714A1 (en) * 1990-07-24 1992-02-06 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Non-a non-b hepatitis virus antigen
DK0543924T3 (da) * 1990-08-10 1997-09-08 Chiron Corp NANBV-diagnostik: polynucleotider, som er anvendelige til screening for hepatitis C-virus
KR920703640A (ko) * 1990-11-29 1992-12-18 테루카츄 아리마 비a비b형 간염 바이러스 항원 단백질
AU1459792A (en) * 1991-01-14 1992-08-27 James N. Gamble Institute Of Medical Research Basic structural immunogenic polypeptides having epitopes for hcv, antibodies, polynucleotide sequences, vaccines and methods
EP0501557B1 (en) * 1991-03-01 1994-10-12 Akzo Nobel N.V. Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis Non-A, Non-B virus
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
EP0510952A1 (en) * 1991-04-26 1992-10-28 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus
FR2677372B1 (fr) * 1991-06-06 1994-11-10 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques.
IT1249684B (it) * 1991-07-19 1995-03-09 Sorin Biomedica Spa Epitopi della proteina env del virus dell'epatite c.
DE69223562T2 (de) * 1991-08-27 1998-06-04 Hoffmann La Roche Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von Hepatitis C
WO1993005181A1 (en) * 1991-09-12 1993-03-18 Cedars-Sinai Medical Center Direct detection of hepatitis c virus rna
JPH06511149A (ja) * 1991-09-13 1994-12-15 カイロン　コーポレイション 免疫反応性ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド組成物
EP0573624A4 (en) * 1991-11-07 1997-09-17 Baxter Diagnostics Inc Epitope mapping ot the c33c region of hcv
DE69232906T2 (de) 1991-11-21 2004-01-15 Common Services Agency Edinbur Detektion des Hepatis-C Virus.
GB9204274D0 (en) * 1992-02-28 1992-04-08 Wellcome Found Novel peptides
US5866139A (en) * 1992-06-04 1999-02-02 Institut Pasteur Nucleotide and peptide sequences of a hepatitis C virus isolate, diagnostic and therapeutic applications
US6057093A (en) * 1992-09-28 2000-05-02 Chiron Corporation Methods and compositions for controlling translation of HCV proteins
JPH06153961A (ja) * 1992-11-27 1994-06-03 Imuno Japan:Kk Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法
WO1994026306A1 (en) 1993-05-12 1994-11-24 Chiron Corporation Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region
WO1996004301A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Chiron Corporation Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same
JP3793571B2 (ja) 1994-07-29 2006-07-05 カイロン コーポレイション 新規ｃ型肝炎ｅ１およびｅ２短縮型ポリペプチドならびにこれらを得る方法
US5837442A (en) 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
ATE437951T1 (de) 1997-05-06 2009-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Intrazelluläre herstellung von verkürztem hepatitis c-polypeptid e2
DE19832050C2 (de) * 1998-07-16 2002-10-10 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zum Nachweis von Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virusgenomen in Plasmaproben und spezifische Primer
DE69942774D1 (de) 1999-02-26 2010-10-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Verwendung von bioadhaesiven und adjuvantien für die mukosale anwendung von antigenen
AU2875700A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Chiron Corporation Microemulsions with adsorbed macromoelecules and microparticles
US7196066B1 (en) 1999-11-03 2007-03-27 Powderject Vaccines, Inc. DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens
EP1350105B1 (en) * 2000-06-15 2007-07-25 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunoassays for anti-hcv antibodies
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
WO2002013855A2 (en) 2000-08-17 2002-02-21 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
RU2286172C2 (ru) 2000-08-17 2006-10-27 Трипеп Аб Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования
US6586584B2 (en) 2001-01-29 2003-07-01 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus
EP1399183B1 (en) 2001-05-31 2010-06-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
CA2476626A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
US7598421B2 (en) 2002-05-08 2009-10-06 Ucl Biomedica Plc Materials for the delivery of biologically-active material to cells
WO2004060396A2 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
AU2004246999B2 (en) 2003-02-06 2010-06-10 Aduro Biotech, Inc., Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the listeria, and methods of use thereof
US7833775B2 (en) 2003-02-06 2010-11-16 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
US7695725B2 (en) 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US7842289B2 (en) 2003-12-24 2010-11-30 Aduro Biotech Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
WO2006078318A2 (en) 2004-07-29 2006-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
JP4836281B2 (ja) 2004-08-27 2011-12-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド Ｈｃｖ非構造タンパク質変異体およびその使用
EP1888751A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Tripep Ab A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene
US20110136678A1 (en) * 2006-10-20 2011-06-09 Erwin Sablon Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
US20090214593A1 (en) 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
CA2724649A1 (en) 2008-05-19 2009-11-26 Anza Therapeutics, Inc. Compositions comprising prfa* mutant listeria and methods of use thereof
RU2011140858A (ru) 2009-03-09 2013-04-20 Уилльям ХЕНРИ Конъюгаты гаптен-носитель, содержащие в качестве носителя бактериальные токсины, обладающие сигнальным пептидом, и их применение в иммуногенных композициях

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
HU220204B (hu) * 1987-11-18 2001-11-28 Chiron Corp. HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet
US5191064A (en) * 1988-09-30 1993-03-02 The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide
HU225068B1 (en) * 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
AU638304B2 (en) * 1989-12-22 1993-06-24 Abbott Laboratories Hepatitis c assay
CA2079677A1 (en) * 1990-04-03 1991-10-04 Kenneth H. Burk Purified hcv and hcv proteins and peptides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2482618A2 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Teknoware Oy LED tubular lamp and lighting fixture arrangement

Also Published As

Publication number Publication date
LV10729A (lv) 1995-06-20
ATE211772T1 (de) 2002-01-15
GEP20002164B (en) 2000-07-10
ES2166749T3 (es) 2002-05-01
JPH1089A (ja) 1998-01-06
EP0398748A3 (en) 1991-10-23
DE69033891D1 (de) 2002-02-21
BG60348B2 (bg) 1994-09-30
AU5812390A (en) 1990-12-18
JPH10113176A (ja) 1998-05-06
CA2017157A1 (en) 1990-11-18
HU904754D0 (en) 1992-01-28
MC2188A1 (fr) 1992-09-16
DK0398748T3 (da) 2002-03-18
HUT59964A (en) 1992-07-28
DE69033891T2 (de) 2002-08-29
LV10729B (en) 1995-12-20
JP2656996B2 (ja) 1997-09-24
NO914517D0 (no) 1991-11-18
CA2017157C (en) 2003-07-29
RO113059B1 (ro) 1998-03-30
AU638719B2 (en) 1993-07-08
WO1990014436A1 (en) 1990-11-29
NO303503B1 (no) 1998-07-20
FI915443A0 (fi) 1991-11-18
EP0398748B1 (en) 2002-01-09
EP0398748A2 (en) 1990-11-22
JP3701754B2 (ja) 2005-10-05
JPH05500155A (ja) 1993-01-21
JP3698520B2 (ja) 2005-09-21
NO914517L (no) 1992-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI105279B (fi) Polynukleotideja ja menetelmiä jotka ovat hyödyllisiä hepatitis C-viruksen seulomisessa
US5863719A (en) Methods for detecting hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
US5714596A (en) NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
FI106211B (fi) HCV-polypeptidi ja HCV:n määritysmenetelmä sekä vasta-ainekoostumukset
FI106214B (fi) NANBV-diagnostiikka: Hepatiitti-C-viruksen seulonnassa käyttökelpoisia polynukleotidejä
JP2005040145A (ja) Ｈｃｖ関連オリゴヌクレオチドおよびｈｃｖ単離物の特定領域遺伝子の増幅方法
Frangeul et al. Mutations in NS5A region of hepatitis C virus genome correlate with presence of NS5A antibodies and response to interferon therapy for most common European hepatitis C virus genotypes
US5851759A (en) Heteroduplex tracking assay (HTA) for genotyping HCV
RU2145635C1 (ru) Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови
US20040101820A1 (en) Polynucleotide probe and primer originating in hepatitis e virus of japanese, chips having the same, kits having the same and method of detecting hepatits e virus using the same
PT94081B (pt) Diagnosticos para o nambv: polinucleotidos uteis na deteccao do virus da hepatite c
IL143675A (en) Polynucleotide capable of hybridizing to a complement of a genomic sequence of hepatitis c virus, polynucleotide probe comprising said polynucleotide and methods using said probe

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC.

Free format text: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC.