JP2656996B2 - Ｎａｎｂｖの診断用薬 - Google Patents

Ｎａｎｂｖの診断用薬

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（NANBV）感染の蔓
延を管理するための材料および方法に関する。より詳細
には、生物学的試料中のHCVの検出のためのアッセイに
有用な、非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）の病原体であるＣ型
肝炎ウイルス（HCV）、およびそのポリヌクレオチドお
よび誘導体に関する。
本出願書に引用される参考文献 Barr et al.（1986）,Biotechniques ４:428. Beaucage et al.（1981）,Tetrahedron Letters 22:185
9. Botstein（1979）,Gene ８:17. Brinton,M.A.（1986）in THE VIRUSES:THE TOGAVIRIDAE
AND FLAVIVIRIDAE （Series eds.Fraenkel−Conrat an
d Wagner,vol.eds.Schlesinger and Schlesinger,Plenu
m Press）,p.327−374. Broach（1981）in:Molecular Biology of the Yeast Sa
ccharomyces,Vol.1,p.445,Cold Spring Harbor Press. Broach et al.（1983）,Meth.Enz.101:307. Brown et al.（1979）,Methods in Enzymology 68:109. Byrne et al.（1988）,Nucleic Acids Res.16:4165. Caste et al.（1986）,Virology 119:10. Chang et al.（1977）,Nature198:1056. Chirgwin et al.（1979）,Biochemistry 18:5294. Choo ら ．（1989）,Science 244:359. ChomczynskiおよびSacchi（1987）,Analytical Biochem
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l.154,RECOMBINANT DNA,Part E. Wu（1987）,Methods in Enzymology vol.155,RECOMBINA
NT DNA,Part F. Zoller（1982）,Nucleic Acids Res.10:6487. 引用される特許 U.S.Patent NO.4,341,761 U.S.Patent NO.4,399,121 U.S.Patent NO.4,427,783 U.S.Patent NO.4,444,887 U.S.Patent NO.4,466,917 U.S.Patent NO.4,472,500 U.S.Patent NO.4,491,632 U.S.Patent NO.4,493,890 U.S.Patent NO.4,683,202 U.S.Patent NO.4,458,066 U.S.Patent NO.4,868,105 発明の背景 非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）は、ウイルスにより引き起
こされると考えられる伝染性あるいは家族性疾病であ
り、既知の肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（HA
V）、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV），デルタ肝炎ウイルス
（HDV）およびサイトメガロウイルス（CMV）、エプスタ
イン・バーウイルス（EBV）により引き起こされる肝炎
を含む、他のウイルス性肝炎と区別ががつかない。NANB
Hは最初に輸血を受けた固体に同定された。ヒトからチ
ンパンジーへの伝染、およびチンパンジーでの連続継代
は、NANBHが伝染性の病原体あるいは複数の病原体によ
ることの証拠を提供した。
疫学的証拠は、NANBHには次の３つのタイプがあるこ
とを提示する。すなわち、水伝播性流行型；血液あるい
は針に関連する型；および散発的に起こる（集団性）型
である。しかし、NANBHの原因となり得る病因の数は不
明である。
これまでに多数のNANBVの候補が挙げられている。例
えばPrince（1983）,FeinstoneおよびHoofngle（1984）
およびOverby（1985,1986,1987）による総説およびIwar
son（1987）による文献を参照のこと。しかし、これら
のどの候補も、NANBHの病原体であることを示す証拠は
ない。
NANBVのキャリヤーおよびNANBVに伝染された血液ある
いは血液製剤をスクリーニング、および同定するため
の、感度が高く特異的な方法の必要性は重大である。輸
血後肝炎（PTH）は輸血された患者の約10％に起こり、N
ANBHはこれらの90％を占める。この疾病の主要な問題
は、慢性的な肝臓の損傷（25−55％）にしばしば進行す
ることである。
患者の処置、および血液および血液製剤によるNANBH
の伝染、あるいは密接な固体間の接触によるNANBHの伝
染は信頼性のある、スクリーニング、診断および予後診
断のための、NANBVに関連する核酸、抗原および抗体の
検出の道具を必要とする。
ハイブリダイゼーションアッセイにより特異的ポリヌ
クレオチドを検出する方法は当該分野で知られている。
例えば、MatthewsおよびKricka81988）,Analytical Bio
chemistry 169:1;Landegreら（1988）,Science 242:22
9;およびMittlin（1989）,Clinical Chem.35:1819,1989
年９月に発行されたアメリカ合衆国特許No.4868105およ
びE.P.O.公開No.225807（1987年６月16日に公開）を参
照のこと。
出願人は新しいウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを発見
し、これが血液伝播性NANBH（BBNANBH）の主要な病原体
であることを証明した。基本型HCV株、CDC?HCV1（HCV1
とも呼ばれる）のゲノムの部分配列を含む、出願人の最
初の仕事はE.P.O公開No.318216（19891年５月31日に公
開）およびPCT公開No.Wo89/04669（1989年６月１日に公
開）に記載されている。これらの特許室願書の開示およ
びすべてのこれらに相当する国内出願書をここに参考文
献として引用する。これらの出願書は、とりわけ、HCV
配列をコローニングする組み換えDNA法、HCVプローブに
よる診断法、および新しいHCV配列の単離法を教示す
る。
発明の開示 本発明は、E.P.O.公開No.318216およびPCT公開No.Wo8
9/04669に記載のHCV配列および本文に記載の他のHCV配
列に基づく。ハイブリダイゼーションのよる特異的ポリ
ヌクレオチドの単離法および／あるいは検出法は、出願
人によってHCVが発見されるまで、HCVのスクリーニング
に用いることはできなかった。
従って、本発明の１つの観点は、少なくとも10個のヌ
クレオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチドプロ
ーブまたはプライマーであって、（ａ）該少なくとも10
個のヌクレオチドの連続する配列は、HCVのポリヌクレ
オチド配列と選択的にハイブリダイズし得、そして、
（ｂ）該少なくとも10個のヌクレオチドの連続する配列
は、図18に示すHCVヌクレオチド配列のヌクレオチド番
号−341〜−311または8858〜9060のいずれか一方の鎖か
ら得られる。
本発明のポリヌクレオチドプローブは、HCVのポリヌ
クレオチド配列を検出するために用いられ得、好ましく
は、標識されたものである。
本発明の他の観点は、上記ポリヌクレオチドプローブ
を適当な容器中に含む、プローブアッセイキットであ
る。
本発明のさらに他の観点は、分析物中のHCVのポリヌ
クレオチド配列を検出するためのプローブアッセイであ
って、（ａ）上記ポリヌクレオチドプローブを、該ポリ
ヌクレオチドプローブと相補的なHCVのポリヌクレオチ
ド配列とをハイブリダイゼーションさせる条件下で、該
分析物と接触させて、ポリヌクレオチド二本鎖を形成さ
せる工程、および（ｂ）該ポリヌクレオチド二本鎖を検
出する工程、を包含するアッセイである。
本発明のプライマーは、HCVのポリヌクレオチド配列
を増幅させるために用いられ得、好ましくは、標識され
たものである。
本発明のさらに他の観点は、少なくとも一方のプライ
マーが上記プライマーである、一対のプライマーを適当
な容器中に含む、PCRアッセイキットである。
本発明のさらに他の観点は、分析物中のHCVのポリヌ
クレオチド配列を増幅するためのPCRアッセイであっ
て、（ａ）少なくとも一方も上記プライマーである、一
対のプライマーから開始されるポリメラーゼチェイン反
応で、HCVのポリヌクレオチド配列を増幅する工程、お
よび、（ｂ）該増幅されたポリヌクレオチド配列を検出
する工程、を包含するアッセイである。
本発明のさらに他の観点は、HCVのポリヌクレオチド
配列に選択的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド
プローブまたはプライマーを調製する方法であって、上
記少なくとも10個のヌクレオチドの連続する配列を含む
ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを合成する
工程を包含する方法である。ここで、上記ポリヌクレオ
チドプローブまたはプライマーは： （ａ）該少なくとも10個の連続する配列を含むポリヌク
レオチドを提供すること； （ｂ）該ポリヌクレオチドを使用して組換えDNAベクタ
ーを調製すること； （ｃ）該ベクターで宿主細胞を形質転換すること； （ｄ）該ベクターが複製し得る条件下で、該宿主細胞を
インキュベートすること； （ｅ）該宿主細胞から該複製されたベクターを単離する
こと；および （ｆ）該複製されたベクターから該ポリヌクレオチドを
単離すること、により合成され得る。上記ポリヌクレオ
チドはまた、化学的に合成され得る。
本発明のさらに他の観点は、HCVを含まない血液を調
製するための方法であって、（ａ）血液試料由来の核酸
分析物を提供する工程、（ｂ）上記ポリヌクレオチドプ
ローブを提供する工程、（ｃ）該ポリヌクレオチドプロ
ーブを、該ポリヌクレオチドプローブと相補的なHCVの
ポリヌクレオチド配列とをハイブリダイゼーションさせ
る条件下で、該核酸分析物と接触させて、ポリヌクレオ
チド二本鎖を形成させる工程、（ｄ）該ポリヌクレオチ
ド二本鎖を検出する工程、および、（ｅ）（ｄ）におい
て二本鎖が検出されなかった血液を蓄える工程、を包含
する方法である。
図面の簡単な説明 図１はクローン12f中のHCVcDNAの配列およびそれにコ
ードされるアミノ酸を示す。
図２はクローンk9−１中のHCV cDNA配列およびそれに
コードされるアミノ酸を示す。
図３はクローン15eの配列およびそれにコードされる
アミノ酸を示す。
図４はクローン13i中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン12fと
オーバーラップする配列を示す。
図５はクローン26j中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン13iと
オーバーラップする配列を示す。
図６はクローンCA59a中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン26jお
よびK9−１の配列とオーバーラップする配列を示す。
図７はクローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローンCA59a
とオーバーラップする配列を示す。
図８はクローンCA156e中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA84aとオーバーラップする配列を示す。
図９はクローンCA167b中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
図10はクローンCA167b中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
図11はクローンCA290a中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA216aとオーバーラップする配列を示す。
図12はクローンag30a中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA290aとオーバーラップする配列を示す。
図13はクローンCA205a中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンCA290a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする配
列を示す。
図14はクローン18g中のHCV cDNAの配列、およびクロ
ーンag30a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする配列
を示す。
図15はクローン16jh中のHCV cDNAの配列、それにコー
ドされるアミノ酸およびクローン15e中のHCV cDNAの配
列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
図16はクローン6k中のHCV cDNAの配列、それにコード
されるアミノ酸およびクローン16jh中のHCV cDNA配列と
オーバーラップするヌクレオチドを示す。
図17はクローンp131jh中のHCV cDNAの配列、それにコ
ードされるアミノ酸およびクローン6k中のHCV cDNAの配
列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
図18はクローンp131jh中のHCV cDNAの配列、それにコ
ードされるアミノ酸およびクローン6k中のHCV cDNAの配
列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。図18はこ
こに記載されているクローンおよび欧州特許第318,216
号に示されているコンパイルされたHCV cDNA配列由来の
コンパイルされたHCV cDNAを示している。配列が由来す
るクローンは５′−クローン32, b114a,18g,ag31a,CA205a,CA290a,CA216a,pi14a,CA167
b,CA156e,CA84a,CA59a,K9−１（k9−１とも呼ばれる）,
26j,13i,12f,14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,
320,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g,15e,b5
a,16jh,6k, およびp131jh.である。
図の中で、配列の上の三つの水平のダッシュは推定の開
始剤メチオニレコドンの位置を示している。この図の中
にはHCV cDNAにコードされた推定ポリ蛋白のアミノ酸配
列もまた示されている。HCV1のクローン化されたDNAの
異質性（heterogeneities）が大きなORFの推定的にコー
ドされた配列の上に示されたアミノ酸によって示されて
いる；かっこはクローン中のHCV cDNAの５′−または
３′−末端に、あるいはそれらの近くで異質性が検出さ
れたことを示している。
図19は、生物学的サンプルのHCV RNAの検出のための
捕捉プローブおよびラベルプローブの配列を示してい
る。
図20は、フラビウイルス ポリ蛋白とHCVゲノムの主
要なORFにコードされた推定HCVポリ蛋白の模式的な配列
を示している。図には、また、フラビウイルス ポリ蛋
白から裂かれたフラビウイルス ポリペプチドの可能な
機能が示されている。加えて、HCVポリペプチド、NANB
5-1-1およびC100の、推定HCVポリ蛋白に対して相対的な
位置が示されている。
図22は、クローン81中のHCV cDNA挿入物のダブルース
ランド ヌクレオチド配列、およびそこにコードされた
ポリペプチドの推定アミノ酸配列を示している。
図23は、クローン36中のHCV cDNA配列、クローン81の
NANBV cDNAとオーバーラップするセグメント、およびク
ローン36の中にコードされたポリペプチド配列を示して
いる。
図24は、クローン37b中のHCV cDNA配列、クローン35
とオーバーラップするセグメント、およびそこにコード
されたポリペプチドを示している。
図25は、NANBH（図25A）を有するチンパンジーの肝の
サンプル由来のRNAおよびNANBH（図25B）を有するイタ
リア人の患者に関するHCV cPCRのオートラジオグラフを
示している。
図26Aおよび図26Bは肝の損傷の表示、HCV RNAの存在
と、NSNBHを有する二匹のチンパンジーに対するアンチ
ーHCV抗体の存在との間の一時的な関係を示すグラフで
ある。
図27は、クローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド
配列、そこにコードされたアミノ酸、およびクローンCA
59aとオーバーラップする配列を示している。
図28は、クローン40b中のHCV cDNA配列、クローン37b
にオーバーラップするセグメント、およびそこにコード
されたポリペプチドを示している。
図29は、HCVゲノムの、ほぼ300,30,および3CIDのラベ
ル化され増幅された生成物を示すオートラジオグラフで
ある。
図32は、クローン40a中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列を示している。
図33は、HCVゲノムの保持領域由来のプライマーから
伸長された増幅された生成物を示すオートラジオグラフ
である。
図34は、クローン35中のHCV cDNA配列、クローン36と
オーバーラップするセグメント、およびそこにコードさ
れたポリペプチドを示している。
図37は、プローブとクローンag30aとk9−１中のHCV c
DNA由来のHCV RNAの５′−領域由来のプライマーとの関
係を示す図表である。
図38は、ag30aおよびk9−１由来のプライマーから伸
俵された増幅された生成物のオートラジオグラフであ
る。
図39は、ヒト分離株23および27とHCV1の並べられたヌ
クレオチド配列を示している。ホモロガスな配列
は（＊）印によって示されている。ノン−ホモロガスな
配列は小文字である。
図40は、ヒト分離株23および27とHCV1の並べられたア
ミノ酸配列を示している。ホモロガスな配列は（＊）印
によって示され、ノン−ホモロガスな配列は小文字であ
る。
図41は、BB−NANBV感染チンパンジーの肝から単離さ
れ、クローン81のBB−NANBV cDNAでプローブされたRNA
のノーザーンブロットのオートラジオグラフの網版再現
性を示している。
図43は、アンチ−NANB5-1-1′で感染されたプラズマ
から捕捉されたNANBV粒子から抽出されクローン81から
の32P−ラベルNANBV cDNAでプローブされた核酸のオー
トラジオグラフの網版再現性を示している。
図44は、単離されたNANBV核酸、クローン81中のNANBV
cDNA由来32Pラベル化されたプラスとマイナスストラン
ドDNAプローブでプローブされた核酸を含有するフィル
ターのオートラジオグラフの再現性を示している。
図46は、ヒト単離株23のヌクレオチドコンセンサス配
列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されてい
る。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた
示されている。
図47は、ヒト単離株27のヌクレオチドコンセンサス配
列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されてい
る。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた
示されている。
図48は、フラビウイスルポリ蛋白および推定HCVポリ
蛋白に対するEnvLとEnvRプローブとの関係を示すグラフ
である。
図49は、単離株Thorm,EC1,HCT＃18,およびHCV1の複合
配列ヌクレオチド配列の比較を示している。
図50は、EC10のヌクレオチド配列とのHCV1配列の複合
体との比較を示している；このEC10配列はドットの上の
ライン上にあり、そしてHCV1配列はドットの下のライン
上にある。
図51は、ヒト単離株HCT＃18,JH23,JH27,Thorne,EC1,
およびHCV1のコンセンサス配列の″EnvL″領域にコード
されたアミノ酸配列117−308（HCV1に相対的に）の比較
を示している。
図52は、ヒト単離株HCT＃18,JH23,JH27,Thorme,EC1,
およびHCV1のコンセンサス配列の“EnvR"領域にコード
されたアミノ酸配列330−360（HCV1に相対的に）の比較
を示している。
図53は、プライマー混合物５′−３の個々のプライマ
ーのヌクレオチド配列を示している。
本発明を実施するための形態 用語「Ｃ型肝炎ウイルス」（HCV）は、非Ａ非Ｂ型肝
炎（NANBH）の従来未知であった病原性物質に対して、
当業者が保留していたものである。HCVの原型の単離物
は、U.S.S.N.122,714（E.P.O.公開第318、216号も参照
のこと）。用語HCVは、それと同じウイルスの種の新し
い単離物もまた包含する。この用語の延長として、HCV
によって引き起こされ、以前には血液性NANB肝炎（BB−
NANBH）と呼ばれていた疾病は、現在Ｃ型肝炎と呼ばれ
ている。用語NANBHおよびＣ型肝炎は、本明細書では互
換可能に用いられ得る。
HCVは、その病原性の株はBB−NANBHを引き起こす、ウ
イルスの種である。それから誘導された弱毒化株あるい
は欠損干渉粒子でもあり得る。以下に示すように、HCV
ゲノムはRNAから構成される。RNAを含むウイルスは、比
較的高い割合で突然変異を有することが知られている。
すなわち、取り込まれるヌクレオチド当り、10-3から10
-4オーダーと報告されている（Fields ＆ Knipe（198
6））。従って、RNAウイルス中では遺伝子型の異質性や
流動性が受け継がれるため、HCVの種の中には毒性ある
いは無毒性などの多数の株／単離物がある。本明細書に
記載の組成物および方法によって、種々のHCV株あるい
は単離物の、増殖、同定、検出、および単離が可能とな
る。
HCVの幾種類かの異なる株／単離物が同定されている
（以下参照）。プロトタイプであるこのような株あるい
は単離物の１つは、CDC/HCV1と呼ばれている（HCV1とも
呼ばれている）。ゲノムの部分配列のような、１つの株
あるいは単離物から得られる情報は、当業者が標準法を
用いて新しい株／単離物を単離し、そしてそのような新
しい株／単離物がHCVであるかどうかを同定のに十分に
役立つ。例えば、いくつかの異なった株／単離物が以下
に示してある。数多くのヒト血清（そして異なる地理的
地域）から得られたこれらの株は、HCV1のゲノムの配列
から得られた情報を利用して単離された。
E.P.O.公開第318,216号および以下に記載の技術を用
いて、HCV1ゲノムのRNAのゲノムの構造およびヌクレオ
チド配列が予想された。このゲノムは、10,000ヌクレオ
チドを含む一本鎖のRNAであることが判っている。この
ゲノムは、正の鎖であり、そして約3,000アミノ酸のポ
リタンパク質をコードする、連続の翻訳オープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を有している。ORF中では、大部
分のポリペプチドタンパク質が非構造タンパク質を担っ
ており、構造タンパク質（単数あるいは複数）は、Ｎ末
端領域の最初のおよそ1/4にコードされているように見
える。全ての既知のウイルスの配列と比較した場合、フ
ラビウイルスのファミリーの非構造タンパク質、そして
ペスチウイルス（これはいまではフラビウイルスのファ
ミリーであると考えられている）と、小さいが十分なコ
リニアーのホモロジーが観察される。
フラビウイルスのポリペプチドタンパク質（例として
ヤローフィーバウイルス）の可能な領域の概略図および
HCVゲノムの主要なORFにコードされる、推定のポリペプ
チドタンパク質を図20に示す。この図では、HCVポリタ
ンパク質の考えられるドメインを示してある。フラビウ
イルスポリタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ、ヌ
クレトキャプシドタンパク質（Ｃ）、マトリックスタン
パク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および
非構造タンパク質（NS）1,2（ａ＋ｂ）、3,4（ａ＋
ｂ）、および５を含む。HCV1のヌクレオチド配列中にコ
ードされる推定のアミノ酸に基づいて、HCVポリタンパ
ク質のＮ末端にある小さなドメインは、フラビウイルス
ポリタンパク質のＮ末端に見いだされるヌクレオキャプ
シドタンパク質（Ｃ）と、大きさおよび塩基性残基の高
い含有率が類似しているように見える。HCVおよびヤロ
ーフィーバウイルス（YFV）の非構造タンパク質２、
３、４、および５′（NS2−５）は、アミノ酸はいれつ
は異なっているが、類似の大きさおよび親水性の相手を
有しているようである。しかし、M,E,およびNS1タンパ
ク質を含むYFVポリタンパク質の領域に対応するHCVの領
域は、配列が異なるだけでなく、大きさ及び親水性の両
方もまた全く異なっている。従って、HCVゲノムの特定
のドメインが本明細書では、例えばNS1あるいはNS2のよ
うに呼ばれて得るが、この命名は推定であることを留意
するべきである。HCVフアミリーとフラビウイルスとの
間には、これから認識されるべき多くの違いが存在し得
る。
HCVの異なる株、単離体、あるいはサブタイプは、HCV
1と比較して、アミノ酸および核酸に改変が含まれると
予想される。多くの単離体は、HCV1と比較した場合、全
アミノ酸配列において相当（すなわち約40％より多い）
ホモロジーを示すと予想される。しかしながら、他のあ
まりホモロジーのないHCV単離体も見いだされ得る。こ
れらは、例えば、HCV1と類似の大きさのポリタンパク質
をコードする約9,000個から約12,000個のヌクレオチド
のORF、HCV1と類似の疎水性および／あるいは免疫原性
の性質を有するコードされたポリタンパク質、およびHC
V1に保存されているコリニアーポプチド配列の存在など
の種々の基準によって、HCVであると定義される。さら
に、ゲノムは正の鎖のRNAであると思われる。
全てのHCV単離体は、本明細書に記載のHCVcDNAにコー
ドされるエピトープと免疫学的に同一（すなわち免疫学
的に交差反応し得る）と見なし得る、少なくとも１つの
エピトープする。好ましくは、このエピトープは、本明
細書に記載のアミノ酸配列中に含まれ、そして既に知ら
れている病原体と比べた場合、HCVに特異である。エピ
トープの特異性は、抗HCV抗体と免疫反応性があって、
そして既知の病原体に対する抗体との免疫反応性がない
ことで決定される。
HCV株および単離体は、進化論的に関連している。従
って、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体的なホモロ
ジーは、約40％以上であり得、おそらく50％以上であ
り、おそらくは60％以上であり、そしてより一般的には
80％である。そして更に、少なくとも約13ヌクレオチド
の連続する配列に対応する。以下に示すように、HCVゲ
ノム中には、可変領域及び超過変領域が存在することを
留意すべきである。従って、これらの領域のホモロジー
は、全体的なゲノムのそれより十分に少ないことが予想
される。HCV株のゲノムの推定の配列と、例えばCDC/HCV
1cDNAとの間の対応は、当業者の技術によって決定され
得る。例えば、推定のHCVからのポリヌクレオチドの配
列と本明細書に記載のHCVcDNA配列の情報とを直接比較
することによって、決定され得る。あるいは、ホモロジ
ーのある領域で安定した二本鎖を形成する条件下（例え
ば、S1消化に先立って用いられる）で、ポリヌクレオチ
ドとハイブリダイゼーションさせ、一本鎖に特異的なヌ
クレアーゼで消化し、そして消化された断片の大きさを
決めることによっても決定され得る。
HCVの株あるいは単離体の進化学的な関連により、推
定のHCV株あるいは単離体は、ポリペプチドレベルでの
ホモロジーによって同定し得る。一般的に、HCV株ある
いは単離体は、ポリペプチドレベルで、少なくとも40％
ホモロジーがあると予想されており、約50％より多く、
おそらくは70％より多く、そしてより一般的には80％ホ
モロジーがあり、およびある場合には90％より多くホモ
ロジーがある。アミノ酸配列のホモロジーを決定する技
術は当分野では公知である。例えば、アミノ酸配列は、
直接決定し得、そして本明細書に提供されている配列と
比較し得る。あるいは推定のHCVのゲノムのヌクレオチ
ド配列が決定され得（普通はcDNAを介して）、そこにコ
ードされる推定アミノ酸が決定され得、そして対応する
領域が比較される。
本明細書で、ある配列から「誘導された」ポリヌクレ
オチドとは、ある配列のヌクレオチド配列中の１つの領
域と少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少な
くとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくと
も約10から12個のヌクレオチド、そしてさらにより好ま
しくは少なくとも約15から20個のヌクレオチドが対応し
ているポリヌクレオチド配列を言う。「対応している」
とは、ある配列とホモロジーがあるかあるいは相補的で
あることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが
誘導されたもとの領域の配列は、HCVゲノムに特異的な
配列とホモロジーがあるかあるいは相補的である。より
好ましくは、誘導された配列は、HCV単離体のすべてあ
るいは大部分に特異的である配列にホモロジーがあるか
相補的である。配列がHCVゲノムに特異的であるか否か
は、当業者には公知の方法で決定され得る。例えば配列
は、感染してない宿主あるいは他の生物に存在している
かどうかを決定するために、例えばジーンバンク（Gene
bank）のようなデータバンク中の配列と比較し得る。配
列はまた、例えばHAV,HBV、およびHDVの様に肝炎を引き
起こすウイルス物質、およびフラビウイルスのメンバー
の様なウイルス物質の配列とも比較し得る。誘導された
配列の他の配列に対する対応あるいは非対応は、適当な
緊縮の条件下でのハイブリダイゼーションによって決定
され得る。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリ
ダイゼーション技術は当分野では公知であり、以下に述
べられている。例えば、Maniatis（1982）らの文献を参
照のこと。更に、ハイブリダイゼーションによって形成
される二本鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、公知の
方法で決定され得る。例えば、二本鎖ポリヌクレオチド
中の一本鎖領域を特異的に消化するS1の様なヌクレアー
ゼによる消化が含まれる。典型的なDNA配列がそこから
「誘導」され得る領域には、例えば、特異的なエピトー
プをコードする領域及び非転写及び／あるいは非翻訳領
域が含まれるが、これらに限定されない。
誘導されたポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチ
ド配列から必ずしも自然に誘導されたものでなくてもよ
く、例えば、化学合成あるいはDNA複製あるいは逆転写
あるいは転写を含むあらゆる方法から作成され得る。更
に、明示された配列に対応する領域の組み合せを意図す
る用途に合うように、当分野に公知の方法で改変し得
る。
本明細書の用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノ
ム、cDNA,半合成、あるいは合成に起源を持つポリヌク
レオチドを指す。このヌクレオチドは、その起源あるい
は操作によって、（１）天然では結び付いているポリヌ
クレオチドのすべてあるいは一部と結び付いていない、
（２）天然に連結しているものとは別のポリヌクレオチ
ドと連結しており、あるいは（３）天然には存在しな
い。
本明細書の用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さ
のポリマー型のヌクレオチドで、リボヌクレオチドとデ
オキシリボヌクレオチドの両方を指す。この用語は、分
子の一次構造のみを指していう。従って、この用語は、
二本鎖あるいは一本鎖のDNAおよびRNAを包含する。この
用語はまた、例えば、当分野には既知の標識、メチル
化、「キャップス」、天然のヌクレオチドの１あるいは
それ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、などの
既知のタイプの改変、例えば、非荷電の連結（例えば、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミ
デート、カルバミン酸塩など）及び荷電の連結（例え
ば、ホスホロチオエート、ホスホロヂチオエートなど）
の様なヌクレオチド間での改変、例えば、タンパク質
（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチ
ド、ポリＬリシンなど）の様な修飾部分を含むもの、イ
ンターカレター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）
と共にあるもの、キレーター（例えば、メタル、ラジオ
アクティブメタル、ホウ素、酸化力のあるメタルなど）
を含むもの、アルキレーターを含むもの、修飾された連
結（例えばアルファアノメリック核酸など）、および非
修飾型のポリヌクレオチドなどが含まれる。
本明細書の用語、核酸の「センス鎖」は、mRNAと配列
上のホモロジーを有する配列を含む。「アンチセンス
鎖」は、「センス鎖」と相補的な配列を含む。
本明細書の用語、ウイルスの「正の鎖のゲノム」は、
RNAであってもDNAであっても、一本鎖で、ウイルスのポ
リペプチド（単数あるいは複数）をコードするゲノムを
指す。正の鎖のRNAウイルスの例には、トガウイルス
科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウ
イルス科、およびカリチウイルス科が含まれる。あるい
は以前はトガウイルス科にクラス分けされていたフラビ
ウイルス科もまた含まれる。Fields ＆ Knipe（1986）
を参照のこと。
本明細書の用語「プライマー」は、適当な条件下にお
かれたとき、ポリヌクレオチド鎖の合成開始の点として
機能し得るオリゴマーのことを指す。プライマーは、完
全に、あるいは実質的に、コピーされるポリヌクレオチ
ドの領域と相補的である。従って、ハイブリダイゼーシ
ョンを行い得る条件下で、プライマーは、分析物の鎖の
相補的な領域にアニールする。適当な反応剤（例えばポ
リメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート、など）の
添加によって、プライマーは、重合剤によって伸長し、
分析物の鎖のコピーを形成する。プライマーは、一本
鎖、あるいは代わりに一部あるいは全部が二本鎖であり
得る。
用語「ポリヌクレオチド分析物」および「分析物鎖」
とは、標的の配列を含んでいると思われる一本鎖あるい
は二本鎖の核酸分子をいい、そして生物学的試料の中に
存在し得る。
本明細書の用語「オリゴマー」とは、プライマーおよ
びプローブをさす。用語オリゴマーは、分子の大きさを
意味しない。しかし、典型的にはオリゴマーは、長さが
1000ヌクレオチドより大きくなく、より典型的には、50
0ヌクレオチドより大きくなく、さらにより典型的に
は、250ヌクレオチドより大きくない。それは100ヌクレ
オチドより大きくなくそして75ヌクレオチドより大きく
なく、そして50ヌクレオチドより大きくない。
本明細書の用語「プローブ」とは、プローブ中の少な
くとも１つの標的の領域の配列との相補性によって、標
的の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチ
ドを含む構造を言う。プローブのポリヌクレオチドの領
域は、DNA,および／あるいはRNA、および／あるいは合
成ヌクレオチドアナログを含み得る。プローブには、
「キャプチャープローブ」および「標識プローブ」が含
まれる。好ましくは、プローブには、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）のプライムに使用された配列と相補的な配
列は含まない。
本明細書の用語「標的領域」は、増幅および／または
検知される核酸の領域をいう。用語「標的の配列」は、
所望とする条件下でプローブまたはプライマーが安定な
ハイブリッドを形成する配列をいう。
本明細書の用語「キャプチャープローブ」は、結合パ
ートナーと結合する一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドをいう。一本鎖ポリヌクレオチドは標的の
ポリヌクレオチドをいう。一本鎖ポリヌクレオチドは標
的のポリヌクレオチド配列からなり、それは分析物であ
るポリヌクレオチド中で見い出される標的領域中の標的
配列に相補的である。この相補的な領域は、分析物であ
るポリヌクレオチドを固形表面に固定するのに充分安定
な二本鎖を与えるのに、充分に長く、標的配列に相補的
である（結合パートナを介して）。
結合パートナーは、第２の結合パートナーに特有であ
り、その第２の結合パートナは固形支持体の表面に結合
されることができるか、もしくは他の構造または結合パ
ートナーを介して固定支持体に直接に結合し得る。
ここで使用される、用語「標的づけるポリヌクレオチ
ド配列」は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的である
ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう。そ
の配列は充分に長く、かつ標的配列に相補的であって所
望とする充分な安定性を有する二本線を形成する。
ここで用いられている用語「結合パートナー」は、リ
ガンド分子に高い特異性で、例えば抗原およびそれに特
異的な抗体として、結合可能な分子のことを言う。一般
に、特異的な結合パートナーは、単離条件下にアナライ
トコピー／相補鎖の二本鎖（捕捉プローブの場合）を不
動化するのに充分なアフィニティーで、結合しなければ
ならない。特異的結合パートナーは当該分野に知られて
おり、例えばビオチンおよびアビジンまたはストレプト
アビジン、IgGおよびプロテインＡ、多くの知られたレ
セプターリガドの組合せ、および相補ポリヌクレオチド
鎖が含まれる。相補ポリヌクレオチド結合パートナーの
場合、パートナーは通常少なくとも約15塩基対の長さで
あり、少なくとも40塩基対の長さであり得る；それに加
えて、ＧおよびＣ含有量が少なくとも約40％であり、約
60％と同じくらいである。ポリヌクレオチドは、DNA、R
NAまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。
ここで用いられている用語「結合」は、共有結合また
は強い非共有性相互作用による結合について言う（例え
ば、疎水性相互作用、水素結合等）。共有結合は、例え
ば、エステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペ
プチド、イミド、炭素−硫黄の結合等であり得る。
ここで用いられている用語「支持体」は、所望の結合
パートナーがアンカーし得るあらゆる固体または半固体
の表面について言う。適当な支持体には、ガラス、プラ
スチック、金属、ポリマーゲル等が含まれ、ビーズ、ウ
ェル、ディップスティック、膜等の形態をとり得る。
ここで用いられている用語「ラベル」は、検出可能な
（好ましくは定量可能な）信号を与えるために用いられ
得る、そして、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに
結合可能な、あらゆる原子または部分のことを言う。
ここで用いられている用語「ラベルプローブ」は、ア
ナライトポリヌクレオチド中の検出すべき標的配列に対
して相補的な、標的付けポリヌクレオチド配列を含むオ
リゴマーについて言う。この相補領域は、ラベルにより
検出される、「ラベルプローブ」と「標的配列」とを含
む二本鎖が与えられるように、標的配列に対し充分な長
さおよび相補性を有する。オリゴマーはラベルに直接
に、または互いに高い特異性を有する一組のリガンド分
子により間接的に、結合する。高い特異性を有する一組
のリガンド分子については、前述したが、多量体も含
む。
ここで用いられている用語「多量体」は、同一の反復
一本鎖ポリヌクレオチド単位の、あるいは異なる一本鎖
ポリヌクレオチド単位の、直鎖または分枝のポリマーの
ことを言う。この単位のうちの少なくとも１つは、第一
の目的の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的にはアナライ
トまたはアナライトに結合するオリゴマー（例えばラベ
ルプローブ）に、特異的にハイブリダイズすることを可
能にする配列、長さ、および組成を有する。このような
特異性および安定性を達成するために、単位は通常少な
くとも約15ヌクレオチドの長さであり、典型的には約50
ヌクレオチド以下の長さであり、好ましくは約30ヌクレ
オチドの長さである；さらに、ＧおよびＣ含有量は、通
常少なくとも約40％であり、せいぜい約60％である。こ
のような単位に加えて、この多量体は、第二の目的の一
本鎖ヌクレオチド、典型的にはラベル化されたポリヌク
レオチドまたは他の多量体に、特異的に、また、安定に
ハイブリダイズ可能な、多数の単位を含有する。これら
の単位は一般に、前述の多量体とおよそ同じサイズおよ
び組成である。多量体がもう一つの多量体にハイブリダ
イズするように設計されている場合、第一の、および第
二のオリゴヌクレオチド単位はヘテロロガスであり（相
違し）、選択されたアッセイ条件下では互いにハイブリ
ダイズしない。従って、多量体は、ラベルリガンドであ
り得、あるいはプローブにラベルを結合させるリガンド
であり得る。
ここで用いられている用語「ウイルスのRNA」にはHCV
RNAが含まれるが、ウイルスのゲノム由来のRNA、その
断片、その転写物、およびそれから由来する変異体配列
のことを言う。
ここで用いられている用語「生物学的試料」は、固体
から単離された組織または液体試料のことを言い、例え
ば血漿、血清、骨髄液、リンパ液、皮膚の外部断片、呼
吸、腸および性尿器管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍
および器官を含み、、インビトロ細胞培養物生分の試料
（ウイルスに感染していると見られる細胞、組換え細
胞、および細胞成分、細胞培養培地中で細胞を生育させ
て得られる馴化培地が含まれるが、これらに限定されな
い）も含むが、これらに限定されない。
発明の詳細な説明 本発明の実施には、他に指示がなければ、当業者の中
に入る化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、およ
び免疫学の通常の技術が用いられる。このような技術は
文献に充分に説明されている。例えば、Maniatis,Fitsc
h ＆ Sambrook,MOLECULAR CLONING;A LABOLATORY MANUA
L（1982）;DNA CLONING,第１および２巻（D.N.Glover
編,1985）;OLIGONUCL EOTIDE SYNTHESIS（M.J.Gait編,1
984）;NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D.Hames ＆ S.
J.Higgins編,1984）;the series,METHODS IN ENZYMOLOG
Y（Academic Press,Inc.），特に第154巻および第155巻
（それぞれ、WuおよびGrossman、およびWu編））。前述
および後述の、ここで述べられている全ての特許、特許
出願、および刊行物は、ここに参考文献として援用され
る。
本発明に有用な物質および方法は、BB−NANBVの病因
因子としてのHCVの同定により、そしてHCV cDNA配列を
含有するcDNAライブラリーから単離される、ヌクレオチ
ド配列ファミリーが与えられることにより、可能とな
る。これらのcDNAライブラリーは、HCV感染したチンパ
ンジーの血漿中に存在する核酸配列に由来する。これら
のライブラリーの一つである「ｃ」ライブラリー（ATCC
番号40394）の構築は、E.P.O.公開第318,216号に記載さ
れている。
ここに記載の配列と共に上記記載のHCV cDNA配列を用
いることにより、生物学的試料中のウイルスのポリヌク
レオチドを検出する試薬として有用な、オノゴマーが構
築され得る。例えば、これらの配列から約８から10ヌク
レオチドのDNAオリゴマーを合成することが可能であ
る。このオリゴマーは、例えばウイルスを有すると思わ
れる対象の供血、血液製剤、血清、またはウイルスが複
製している細胞培養系の中の、HCV RNAの存在を検出す
るためのハイブリダイゼーションプローブとして有用で
ある。さらに、ここに記載の新規なオリゴマーは、HCV
ゲノムを更に特徴付けることを可能にする。これらの配
列に由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマ
ーは、cDNAライブラリー中に存在する配列を増幅させる
ために、および／またはオーバーラップする他のcDNA配
列のcDNA配列をスクリーニングするために用いられ得、
これに続いて、さらにオーバーラップ配列を得るために
使用され得る。前述、およびE.P.O.公開第318,216号に
示された通り、HCVゲノムは、大きなポリタンパク質を
コードする大きなオープンリーディングフレーム（OP
F）を主として含むRNAのようである。
前述に加えて、後述の情報は、さらなるHCV株および
分離株の同定を可能にする。さらなるHCV株および分離
株の単離と特徴付けは、当業者に知られた技術を用いて
行われ得る。例えば、ウイルス粒子および／またはウイ
ルスRNAを含有するウイルス体構成成分から核酸を単離
し、前述のHCV cDNA配列を含むクローンライブラリーを
スクリーニングするために前述のオリゴマーを用いて、
cDNAライブラリーを作成し、そしてE.P.O.公開第318216
号および前記記載のcDNAと新規分離株由来のHCV cDNAと
を比較することにより、行われ得る。前述の定義部分に
記載した、HCVのパラメーター内に適合する株または分
離株は、容易に同定できる。HCV株を同定する他の方法
は、ここに示された情報に基づき、当業者に自明であ
る。
HCV cDNA配列の単離 本発明のオリゴマーは、HCVポリヌクレオチド中の標
的となる配列と、ハイブリッド二本鎖構造を形成する領
域を含有する。オリゴマーの、HCVポリヌクレオチドハ
イブリダイジング領域は、ここに与えられ、EPO公開第3
18216号に記載されたHCV cDNAから確認され得る。プロ
トタイプHCVであるHCV1由来のHCV cDNAの複合物を、図1
8に示す。この複合配列は、λgt11（ATCC番号第40394
号）中に存在する「ｃ」ライブラリーに含まれる多数の
HCV cDNAライブラリーから、およびヒト血清から単離さ
れた、多数のHCV cDNAクローンからの配列情報に基づ
く。HCV cDNAクローンは、EPO公開第318216号に記載の
方法により単離された。簡単に述べると、単離されたほ
とんどのクローンは、慢性HLV感染を伴い、ウイルスの
高タイター、即ち、少なくとも106chimp感染dose/ml（C
ID/ml）を含有するチンパンジーからプールした血清を
用いて構築されたHCV cDNA「ｃ」ライブラリーに由来す
る配列を含んでいた。プールされた血清は、ウイルス粒
子を単離するために用いられた；これらの粒子から単離
された核酸は、ウイルスゲノムに対するcDNAライブラリ
ーを構築するための鋳型として用いられた。最初のクロ
ーンである５−１−１は「ｃ」ライブラリーを感染固体
の血清でスクリーニングすることにより得られた。最初
のクローンの単離の後、配列の残りの部分が、既知のHC
V cDNA配列の５′領域および３′領域に由来する合成ポ
リヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングするこ
とにより得られた。
cDNA配列を繕う方法の記載は、殆ど歴史的な興味があ
る。得られた配列（およびその相補鎖）はここに提供さ
れており、この配列またはその任意の部分が、EPO公開
第318216号に記載の方法と同様の方法を用いて部分配列
を繕うことにより、合成法、あるいは合成法の組合せに
より製造され得る。
オリゴマープローブおよびプライマー HCVゲノム（図18に示す）および／または好ましくはH
CVゲノムの保存領域を用いて、HCV RNAのポジティブス
トランド、およびHCV cDNAにハイブリダイズするおよそ
８ヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴマーが調製され
得る。これらのオリゴマーは、HCVヌクレオチド配列を
含有するポリヌクレオチドを検出（単離および／または
ラベル化を含む）ためのプローブとして、および／また
は標的HCV配列の転写および／または複製の為のプライ
マーとして機能する。このオリゴマーは、標的となるHC
Vヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含
む、標的付けられたポリヌクレオチド配列を含有する；
この配列は、意図する目的のために充分な安定性を有す
る二本鎖を、HCV配列とハイブリダイズするのに充分な
長さおよび相補性を有する。例えば、意図する目的が、
固定化により、標的HCV配列を含むアナライトを単離す
ることである場合、オリゴマーは、単離条件下でオリゴ
マーと結合して固相表面上にアナライトが不動化される
に充分な二本鎖安定性を与えるように、充分な長さと標
的HCV配列に対する相補性を有するポリヌクレオチド領
域を含有するであろう。また、例えば、オリゴマーが、
アナライトのポリヌクレオチド中の標的HCV配列を転写
および／または複製するためのプライマーとして機能す
る場合、オリゴマーは、ポリメライズ条件化で標的配列
と安定な二本鎖をつくっているプライマーからポリメラ
イズ試薬が、連続して複製することを可能にするため
に、充分な長さと標的HCV配列に対する相補性を有する
ポリヌクレオチド領域を含有する。また、例えば、オリ
ゴマーがラベルプローブとして用いられ、あるいは多量
体に結合する場合、標的ポリヌクレオチド領域は、ラベ
ルプローブおよび／または多量体と安定なハイブリッド
二本鎖を形成するための充分な長さと相補性を有する。
オリゴマーは最小約４個の連続したHCV配列に相補的な
ヌクレオチドを含有する；通常オリゴマーは、標的HCV
配列に相補的な、連続した最小約８個のヌクレオチド配
列を含有し、好ましくは、標的HCV配列に相補的な連続
した最小約14個のヌクレオチド配列を含有する。
適切なHCVヌクレオチド標的付け配列は、図18に示さ
れた以下のHCV cDNAヌクレオチドから選択される相補ヌ
クレオチドであるヌクレオチドを包含し得る（nnx−nny
は、約番号ｘのヌクレオチドから約番号ｙのヌクレオチ
ドまでを示す）： nn-340−nn-330；nn-330−nn-320；nn-320−nn-310； nn-310−nn-300；nn-300−nn-290；nn-290−nn-280； nn-280−nn-270；nn-270−nn-260；nn-260−nn-250； nn-250−nn-240；nn-240−nn-230；nn-230−nn-220； nn-220−nn-210；nn-210−nn-200；nn-200−nn-190； nn-190−nn-180；nn-180−nn-170；nn-170−nn-160； nn-160−nn-150；nn-150−nn-140；nn-140−nn-130； nn-130−nn-120；nn-120−nn-110；nn-110−nn-100； nn-100−nn-90；nn-90−nn-80；nn-80−nn-70； nn-70−nn-60；nn-60−nn-50；nn-50−nn-40； nn-40−nn-30；nn-30−nn-20；nn-20−nn-10； nn-10−nn1；nn1−nn10；nn10−nn20；nn20−nn30； nn30−nn40；nn40−nn50；nn50−nn60；nn60−nn70； nn70−nn80；nn80−nn90；nn90−nn100；nn100−n
n110； nn110−nn120；nn120−nn130；nn130−nn140； nn140−nn150；nn150−nn160；nn160−nn170； nn170−nn180；nn180−nn190；nn190−nn200； nn200−nn210；nn210−nn220；nn220−nn230； nn230−nn240；nn240−nn250；nn250−nn260； nn260−nn270；nn270−nn280；nn280−nn290； nn290−nn300；nn300−nn310；nn310−nn320； nn320−nn330；nn330−nn340；nn340−nn350； nn350−nn360；nn360−nn370；nn370−nn380； nn380−nn390；nn390−nn400；nn400−nn410； nn410−nn420；nn420−nn430；nn430−nn440； nn440−nn450；nn450−nn460；nn460−nn470； nn470−nn480；nn480−nn490；nn490−nn500； nn500−nn510；nn510−nn520；nn520−nn530； nn530−nn540；nn540−nn550；nn550−nn560； nn560−nn570；nn570−nn580；nn580−nn590； nn590−nn600；nn600−nn610；nn610−nn620； nn620−nn630；nn630−nn640；nn640−nn650； nn650−nn660；nn660−nn670；nn670−nn680； nn680−nn690；nn690−nn700；nn700−nn710； nn710−nn720；nn720−nn730；nn730−nn740； nn740−nn750；nn750−nn760；nn760−nn770； nn770−nn780；nn780−nn790；nn790−nn800； nn800−nn810；nn810−nn820；nn820−nn830； nn830−nn840；nn840−nn850；nn850−nn860； nn860−nn870；nn870−nn880；nn880−nn890； 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nn1580−nn1590；nn1590−nn1600；nn1600−nn1610； nn1610−nn1620；nn1620−nn1630；nn1630−nn1640； nn1640−nn1650；nn1650−nn1660；nn1660−nn1670； nn1670−nn1680；nn1680−nn1690；nn1690−nn1700； nn1700−nn1710；nn1710−nn1720；nn1720−nn1730； nn1730−nn1740；nn1740−nn1750；nn1750−nn1760； nn1760−nn1770；nn1770−nn1780；nn1780−nn1790； nn1790−nn1800；nn1800−nn1810；nn1810−nn1820； nn1820−nn1830；nn1830−nn1840；nn1840−nn1850； nn1850−nn1860；nn1860−nn1870；nn1870−nn1880； nn1880−nn1890；nn1890−nn1900；nn1900−nn1910； nn1910−nn1920；nn1920−nn1930；nn1930−nn1940； nn1940−nn1950；nn1950−nn1960；nn1960−nn1970； nn1970−nn1980；nn1980−nn1990；nn1990−nn2000； nn2000−nn2010；nn2010−nn2020；nn2020−nn2030； nn2030−nn2040；nn2040−nn2050；nn2050−nn2060； nn2060−nn2070；nn2070−nn2080；nn2080−nn2090； nn2090−nn2100；nn2100−nn2110；nn2110−nn2120； nn2120−nn2130；nn2130−nn2140；nn2140−nn2150； nn2150−nn2160；nn2160−nn2170；nn2170−nn2180； nn2180−nn2190；nn2190−nn2200；nn2200−nn2210； nn2210−nn2220；nn2220−nn2230；nn2230−nn2240； nn2240−nn2250；nn2250−nn2260；nn2260−nn2270； 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nn7790−nn7800；nn7800−nn7810；nn7810−nn7820； nn7820−nn7830；nn7830−nn7840；nn7840−nn7850； nn7850−nn7860；nn7860−nn7870；nn7870−nn7880； nn7880−nn7890；nn7890−nn7900；nn7900−nn7910； nn7910−nn7920；nn7920−nn7930；nn7930−nn7940； nn7940−nn7950；nn7950−nn7960；nn7960−nn7970； nn7970−nn7980；nn7980−nn7990；nn7990−nn8000； nn8000−nn8010；nn8010−nn8020；nn8020−nn8030； nn8030−nn8040；nn8040−nn8050；nn8050−nn8060； nn8060−nn8070；nn8070−nn8080；nn8080−nn8090； nn8090−nn8100；nn8100−nn8110；nn8110−nn8120； nn8120−nn8130；nn8130−nn8140；nn8140−nn8150； nn8150−nn8160；nn8160−nn8170；nn8170−nn8180； nn8180−nn8190；nn8190−nn8200；nn8200−nn8210； nn8210−nn8220；nn8220−nn8230；nn8230−nn8240； nn8240−nn8250；nn8250−nn8260；nn8260−nn8270； nn8270−nn8280；nn8280−nn8290；nn8290−nn8300； nn8300−nn8310；nn8310−nn8320；nn8320−nn8330； nn8330−nn8340；nn8340−nn8350；nn8350−nn8360； nn8360−nn8370；nn8370−nn8380；nn8380−nn8390； nn8390−nn8400；nn8400−nn8410；nn8410−nn8420； nn8420−nn8430；nn8430−nn8440；nn8440−nn8450； nn8450−nn8460；nn8460−nn8470；nn8470−nn8480； nn8480−nn8490；nn8490−nn8500；nn8500−nn8510； nn8510−nn8520；nn8520−nn8530；nn8530−nn8540； nn8540−nn8550；nn8550−nn8560；nn8560−nn8570； nn8570−nn8580；nn8580−nn8590；nn8590−nn8600； nn8600−nn8610；nn8610−nn8620；nn8620−nn8630； nn8630−nn8640；nn8640−nn8650；nn8650−nn8660； nn8660−nn8670；nn8670−nn8680；nn8680−nn8690； nn8690−nn8700；nn8700−nn8710；nn8710−nn8720； nn8720−nn8730；nn8730−nn8740；nn8740−nn8750； nn8750−nn8760；nn8760−nn8770；nn8770−nn8780； nn8780−nn8790；nn8790−nn8800；nn8800−nn8810； nn8810−nn8820；nn8820−nn8830；nn8830−nn8840； nn8840−nn8850；nn8850−nn8860；nn8860−nn8870； nn8870−nn8880；nn8880−nn8890；nn8890−nn8900； nn8900−nn8910；nn8910−nn8920；nn8920−nn8930； nn8930−nn8940；nn8940−nn8950；nn8950−nn8960； nn8960−nn8970；nn8970−nn8980；nn8980−nn8990； nn8990−nn9000；nn9000−nn9010；nn9010−nn9020； nn9020−nn9030；nn9030−nn9040；nn9040−nn9050； nn9050−nn9060． しかしながら、オリゴマーは、標的のHCV配列に相補
的である配列のみからなる必要はない。さらに、ヌクレ
オチド配列あるいはオリゴマーが用いられる標的物に適
切な他の部分を含み得る。例えば、HCV配列のPCRによる
増幅のためのプライマーとしてそのオリゴマーが用いら
れる場合、それらには、２本鎖のとき、増幅される配列
のクローニングを促進する制限酵素部位を形成する配列
を含み得る。例えば、さらに、オリゴマーをハイブリダ
イゼーションアッセイ（下記）の「キャプチャープロー
ブ」として用いられる場合に、標的のHCV配列に相補的
なヌクレオチド配列を含有するオリゴマーにカップルさ
れる結合パートナーをさらに含む。オリゴマーが含まれ
得る。あるいはカップルされ得るのに有用な他の型の部
分あるいは配列は、ヌクレオチドプローブの標識を含
む、種々の目的に適切であることは当分野では公知であ
る。
オリゴマーの調製は、例えば、削除、転写あるいは化
学合成法を含む当分野には公知の方法によってなされ
る。標的のゲノムの配列および／または領域は、オリゴ
マーの標的づけるポリヌクレオチドが標的に依存して相
補的であるように選択される。例えば、最終目的が、生
物学的サンプル（例えば、血液）中のHCVの存在をスク
リーニングすることである場合、 好ましいオリゴマーは、プローブおよび／またはプライ
マーとして用いられ、そしてHCVゲノムの保存領域にハ
イブリダイズされる。オリゴマーが結合し得るHCVゲノ
ムの保存領域のいくつかは、ここに記載されている。例
えば、図18に示されているように、ヌクレオチド番号
が、末端から約５から約200、あるいは約4000から約500
0、あるいは8000から約9040、あるいは好ましくは、ヌ
クレオチド−318から174、4056から4448および4378から
4902を含む領域である。保存されているゲノムの他の領
域は、原型のHCV、すなわちHCV1を含む種々のHCVの単離
物のヌクレオチド配列の比較によって、容易に確定し得
る。保存領域および非保存領域を決定するための遺伝子
型間の比較をする方法は、当分野には公知であって、こ
のような方法の例は、ここに記載されている。
基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおい
て、一本鎖の分析物核酸（DNAあるいはRNA）は、核酸プ
ローブとハイブリダイズされ、そして生じた２本鎖が検
出される。HCVポリヌクレオチドのプローブ（天然のあ
るいは誘導された）は、ハイブリダイゼーションによる
新しいウイルス配列の検出を可能とする長さである。６
−８ヌクレオチドが働き得る長さであるが、10−12のヌ
クレオチドの配列が好ましく、そして約20ヌクレオチド
あるいはそれ以上が最も好ましい。好ましくは、これら
の配列は、異種性を欠く領域に由来する。これらのプロ
ーブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含む、定法を
用いて調製され得る。有用なプローブのなかには、例え
ば、ここに開示されている新しく単離されたクローン由
来のもの、並びに下記に示すcDNAライブラリーをプロー
ブするのに有用な種々のオリゴマーがある。HCVゲノム
の任意の新しい部分への補体は納得される。プローブと
して用いるために、フラグメントの長さが増される必要
はないが、完全な相補性が望まれる。
HCVポリヌクレオチドの存在を検出するための因子と
してこのようなプローブの使用（例えば、汚濁血液のス
クリーニングで）ために、血液あるいは血清のような、
分析される生物学的サンプルが、必要に応じて、含有さ
れる核酸の抽出のために、処理される。サンプルから得
られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは他のサイズ分離
技術に供せられ得、あるいは核酸サンプルは、サイズ分
離しないでドットブロットされ得る。プローブの標的づ
ける配列に二本鎖にブリダイズを形成するのに、分析物
核酸の標的の領域が一本鎖にされる。配列が天然に一本
鎖である場合、変性は要求されない。しかし、配列が２
本鎖である場合、配列は変性される。変性は、当分野に
公知の種々の方法で行われ得る。変性に続いて、分析物
核酸およびプローブは、プローブ中の標的の配列の、分
析物の推定上の標的の配列とのハイブリッド形成をなす
のに適し、そして検出されるプローブを含む２本鎖を得
る条件下に、インキュベートする。
得られた２本鎖の検出は、もしあれば、通常、標識プ
ローブの使用で完成される；あるいは直接的にあるいは
間接的に、標識されたリガンドへの特異的結合によて検
出され得れば、プローブは標識され得ない。適切な標
識、およびプローブおよびリガンドの標識方法は当分野
に公知であって、例えば、公知の方法（例えば、ニック
トランスレーションあるいはキナージング（kinasin
g））を用い得る放射活性標識、ビオチン、蛍光基、ケ
ミルネッセント基（例えば、ジオキシエタン、特に誘起
ジオキシエタン）、酵素、抗体を含む。
分析物に結合さすのに用いられるプローブの領域は、
HCVゲノムに完全に相補的につくられ得る。従って、通
常、不正確さを避けるために高度に厳重な条件が望まれ
る。しかし、高度に厳重な条件は、プローブが異種性を
欠くウイルスゲノムの領域に相補的である場合にのみ、
用いられるべきである。ハイブリダーゼーションの厳重
さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミ
ドの濃度を含み、ハイブリダイゼーションの間、および
洗浄の工程の間の多くの因子によって決定される。これ
らの因子は、例えば、Muiatis,T.（1982）に概説されて
いり。
当分野に公知のこの基本的な方法の変法もまた、外来
物質からの検出されるべき２本鎖の促進された分離およ
び／または標識部分からのシグナルの増幅の方法を含ん
で、用いられ得る。これらの変法の多くは、例えば、Ma
tthewsおよびKricka（1988）,Analytical Biochemistry
169:1;Landegrenら、（1988）,Science 242:229;およ
びMittlin（1989）,Clinicalchem.35:1819に総説されて
いる。これらおよびアッセイの形態が記載されている次
の出版物は、ここに引用文献として援用されている。こ
れらのアッセイでHCVを検出するために適したプローブ
は、標的のHCVポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ
して分析の鎖と２本鎖を形成する配列を含有する。ここ
で、この２本鎖は、特定のアッセイ系において検出のた
めに十分に安定である。
適切な変法は、例えば、1989年９月９日に特許になっ
た、米国特許第4,868,105号、およびE.P.O.公開第225,8
07号（1987年６月16日に公開）に記載されている。これ
らの出版物には、分析物核酸が、標識プローブセットお
よびキャプチャープローブセットにハイブリダイズされ
る、液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイが記載さ
れている。プローブ−分析物複合体は、キャプチャープ
ローブセットと相補的である固体固定されたキュプチャ
ープローブとのハイブリダイゼーションによりカップル
される。分析物のアミノ酸は、固相複合体として溶液か
ら除去される。分析物を固相複合体の形態で有すること
は、アッセイでの次の分離工程を促進する。標識プロー
ブセットは、ハイブリダイゼーションを介しての固相／
分析物複合体に結合される標識されたプローブと相補的
である。
一般に、HCVゲノム配列は、感染患者には比較的に低
レベル、すなわち、ml当たり約102−103のチンパンジー
を感染させる用量（CID）で血清中に存在する。このレ
ベルは、ハイブリダイゼーションアッセイで増幅法が用
いられるのに要求される。このような技術は当分野に公
知である。例えば、Enzo Biochemical Coporation “Bi
o−Brige"システムでは、DNAプローブに非修飾の３′−
ポリ−dT−末端を付加するために末端デオキシヌクレオ
チドトランスフェラーゼが用いられる。このポリdT末端
付加のプローブは、標的のヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズされて、そして次に、ビオチン修飾されたポリＡ
にハイブリダイズされる。PCT公開84/03520およびEP公
開第124221号には、（１）分析物が酵素標識されたオリ
ゴヌクレオチドに相補的である１本鎖のDNAプローブに
アニールされ；そして（２）得られた末端付加された２
本鎖が、酵素標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズされる:DNAのハイブリダイゼーションアッセイが
記載されている。EPA204510には、分析物DNAが、ポリ−
dT末端のような末端を有するプローブ、ポリＡ配列のよ
うなプローブ末端にハイブリダイズする配列を有する増
幅鎖に結合し、および標識鎖の大部分に結合し得るDNA
ハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。E.
P.O.公開第317,077号（1989年５月24日公開）に記載さ
れているハイブリダイゼーションアッセイは、約106/ml
のレベルで配列を検出し、１本鎖の分析物核酸に結合
し、さらに、多くの１本鎖標識オリゴヌクレオチドに結
合する核酸マルチマーを用いている。とくに記載されて
いる技術には、ハイブリダイゼーション系の一部とし
て、血清中に約10,000倍（すなわち、約106配列/ml）標
的のHCV配列の増幅物が含有される。増幅は、例えば、S
aikiら、（1986）、Mullis,米国特許第4,683,196号、お
よびMullisら、米国特許第4,683,202号に記載のポリメ
ラーゼチェーンリアクション（PCR）法により完成され
る。増幅は、HCVの標的配列の精製の前、あるいは好ま
しくは、精製に引き続いてなされ得る。例えば、増幅
は、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイ法ととも
に用いられ得るし、あるいは、さらに増幅が望まれる場
合には、E.P.O.公開第317,077号に記載のハイブリダイ
ズ系とともに用いられ得る。
分析物ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列を検出する好
ましい方法は、米国特許第4,868,105号およびE.P.O.公
開第317,077号に記載のハイブリダイゼーション検出法
に基づいている。これらの方法は、分析物の核酸中の標
的の配列にハイブリダイズするキャプチャーおよび標識
プローブを用いる、液相サンドイッチハイブリダイゼー
ションアッセイである。生物学的サンプルのHCVをスク
リーニングするアッセイの使用において、用いられるプ
ローブは、HCVゲノムの保存領域に結合される。キャプ
チャーおよび標識プローブは、標的の配列への結合に配
置され得る。あるいは、好ましいモードのキャプチャー
および標識プローブはセットで存在し、そして１つのセ
ットのプローブ他のセットのプローブとともに配置され
ない。後者のモードにおいて、好ましくは、複数のキャ
プチャープローブのセットがゲノムの最も保存された領
域にハイブリダイズし、一方、複数の標識プローブのセ
ットは、少しの相違を示すりょいきにハイブリダイズし
得る。例えば、図18に示される原型のHCV1 cDNA配列を
用いて、約−318から約174のヌクレオチドの領域および
／または約4378から4902の領域のヌクレオチド、および
／または約4056から約4448の領域のヌクレオチドの配列
にハイブリダイズするプローブが用いられた。好ましい
プローブは、HCVゲノムの５′領域の配列にハイブリダ
イズする。なぜなら、下記に示すように、この領域は、
高度に保存されるようだ。従って、好ましいプローブ
は、例えば、図18に示されているように、約−318から
約174のヌクレオチドにハイブリダイズし得る。例え
ば、ウイルスゲノム配列の検出、あるいはPCR増幅によ
り生じたHCV cDNA配列の検出、あるいは、正のHCV RNA
鎖に対する複製中間生成物の検出の目的に応じて、保存
領域の正鎖およびまたはその補体にハイブリダイズする
プローブが用いられる。
HCV cPCR法を用いた、HCV RNA及びその由来のポリヌク
レオチドの検出 HCV RNAまたはHCV RNAに由来するポリヌクレオチドの
特に好ましい検出法はこの出願の主題である、HCV/cPCR
法であり、Saiki等（1986）、Mullisによる米国特許番
号4,683,195及びMullis等による米国特許番号4,683,202
により述べられている、ポリメラーゼチェーン反応技術
（PCR）を利用する。HCV/cPCR法はHCVゲノムの性質に関
しここで与えられる情報に由来するプライマーとプロー
ブを利用する。
一般に、PCR技術では、短いオリゴヌクレオチドプラ
イマーが準備され、所望の配列の反対の末端に合う。プ
ライマー間の配列は知られる必要はない。ポリヌクレオ
チドのサンプルは好ましくは熱により抽出され、変性さ
れ、超過モルに存在するオリゴヌクレオチドプライマー
とともにハイブリッドされる。ポリメライゼーション
は、三リン酸デオキシヌクレオチドまたはアナログヌク
レオチド（dNTPs）の存在する時に鋳型及びプライマー
依存的なポリメラーゼにより触媒作用される。このこと
は、５′基のそれぞれのプライマーを含む２つの“長い
生成物”に帰着し、元の鎖の新しく合成された補足に共
有結合される。複製されたDNAは再び変性され、オリゴ
ヌクレオチドプライマーとともにハイブリッドされ、重
合条件にもどされ、２回目の複製回路が始められる。２
回目の回路は２つの元の鎖、回路１からの２つの長い生
成物、及び長い生成物から複製された２つの“短い生成
物”を供給する。短い生成物は標的配列に由来する配列
（センス又はアンチノーゼ）をふくみ、プライマー配列
のある５′及び３′基に側面をもつ。各追加の回路で
は、短い生成物の数が指数関数的に複製される。従っ
て、このプロセスは特別な標的配列の増幅の原因とな
る。この方法では、HCV RNA、またはその断片を含むと
推測されるサンプルが準備される。このサンプルは通常
はNANBHを持つと推測される独立したものから取り出さ
れる。しかしながら、サンプルの他の源は例えば、ウイ
ルスが複製されるvitroシステムからのならし培地また
は細胞が含まれる。サンプルは、しかしながら、標的核
酸配列を含まなければならない。
サンプルはそれからHCV RNAの逆転写であるHCV cDNA
にする条件が行われる。RNAの逆転写は当業者には公知
であり、例えば、Maniatis等（1982）及び酵素学法に述
べられている。逆転写の好ましい方法は例えば、レトロ
ウイルス、好ましくはトリ骨髄芽球ウイルス（AMV）か
ら分離され、組換え分子を含む、様々な源からの逆転写
酵素と、転写に適した条件を利用する。逆転写のHCV cD
NA生成物はRNA、逆転写の一回目の結果である、DNAハイ
ブリッド、それ以降のDNA、及び２回目以上の転写の結
果であるDNAハイブリッド内にある。
逆転写酵素により得られたこのHCVのcDNAを、次に標
的配列を増幅するためにPCRした。これを実施するため
に、このHCVのcDNAを変性し、分離された両鎖は、標的
配列に隣接したプライマーと共にハイブリッドした。
鎖の分離は、適切な変性手段ならば、当業者に知られ
た、物理的、化学的、あるいは酵素的な手段の何によっ
てでもよい。推奨方法は、物理的方法で、完全に（99
％）変性するまで核酸を加熱する工程を含む。典型的な
熱変性は、約80℃から100℃の間の温度でで、約１分か
ら10分間の間行った。HCVのcDNAをプライマーと共にハ
イブリッドした後、標的のHCV配列は、プライマーのオ
リゴヌクレオチドにより複製鎖の合成を開始させるとい
う、ポリマー化手段によって複製した。プライマーは、
HCVのゲノムの配列に相補的である様に選ばれた。HCVの
cDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の領域に相補的な
オリゴマー性のプライマーは、図18に与えられたcompos
ite cDNA配列からのHCVのcDNA配列から設計された。
プライマーは、一つのプライマーから合成され、テン
プレート（相補鎖）から分離した、伸長産物が、他のプ
ライマーの伸長用テンプレートとして、定義された長さ
の複製鎖を与えることができる様に、二重鎖配列の上の
相対的位置がなる様に選択した。
最高効率の増幅のためには、プライマーは単鎖である
のが好適であるが、二重鎖であっても構わない。二重鎖
の場合には、伸長産物を生成するために用いる前に、先
ず、両鎖を分離するために処理しなければならない。プ
ライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドが好適であ
る。プライマーは、ポリマー化用の試薬の存在下で伸長
産物の合成の開始をするためには、十分長くなくてはな
らない。プライマーの適切な長さは、温度、およびプラ
イマーの由来、および使用法等を含む、多くの因子に依
存する。例えば、標的配列のcomplexityに依存して、オ
リゴヌクレオチドプライマーは、典型的には約15から45
のヌクレオチドを含むが、場合によってはこれより多い
ことも少ないこともある。短いプライマー分子で、テン
プレートと十分安定なハイブリッド複合体を形成するに
は、一般により低い温度が要求される。
本明細書に用いたプライマーは、増幅されるべき各特
異的な異なる鎖に「実質的に」相補的な様に選択されて
いる。そのためプライマーは、テンプレートの正確な配
列を反映する必要はなく、それらの対応する鎖に選択的
にハイブリッドするのに十分な相補性を持たなければな
らない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片は、プラ
イマー配列の鎖に相補的な残りの部分で、プライマーの
５′−末端に結合することもある。あるいは、非相補的
な塩基あるいはより長い配列が、プライマーの中に点在
し、そのため、増幅されるべき片方の鎖の配列に対し十
分なだけ相補的となり、それとハイブリダイズし、ポリ
マー化手段により伸長された、二重鎖構造を形成する。
プライマー中の非相補的なヌクレオチド配列は、制限酵
素部位を含むことがある。標的配列の（両）末端に制限
酵素部位を加えることは、標的配列をクローニングする
際に有用である。
本明細書で用いる用語「プライマー」は、特に増幅さ
れるべき標的領域の（両）末端配列に関する情報に幾分
かの曖昧さがある場合に、一つ以上のプライマーを指す
ことがあることは理解されたい。「プライマー」は、配
列中の可能な変化を表す配列を含むプライマーオリゴヌ
クレオチドの集合を包含する、あるいは、典型的な塩基
対形成をするヌクレオチドを含むことが許されるため、
である。この集合中の、プライマーオリゴヌクレオチド
の一つが、標的配列の末端と相同的である。実施例には
この特殊な例を示してあり、44−mersと45−mersのオリ
ゴマーの組を、HCVゲノムの潜在的可変領域の増幅を開
始するのに用いている。
プロトタイプ株であるHCV1から誘導された配列を持つ
のHCVの種々の株あるいは単離種があることは予期され
ていた。そのため、変種株を検出するために、HCVゲノ
ムの保存領域とハイブリッドするプライマーを構成する
ことが好ましい。保存領域は、数種のHCVの株／単離種
ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を比較することによ
って決定される。前出の文献の記述によると、HCVゲノ
ム中には、少なくとも三つのアミノ酸の保存領域があ
り、プライマーはその中から由来させている。これらの
領域は、信じられているものである。後に実施例中で記
述されるプライマーは、Flavivirusesの保存領域との配
列相同性に基づいて、HCVの保存領域と信じられている
部位から由来したものである。
オリゴヌクレオチドプライマーは、適切な方法なら
ば、如何なる方法で調製してもよい。特定の配列を有す
るオリゴヌクレオチドの調製方法は、当該分野では公知
であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限
酵素切断による、および、直接の化学的合成による、方
法を含む方法で調製できる。化学的合成法には、例え
ば、Narangらの（1979）記述したフォスフォトリエステ
ル法、Brownらの（1979）開示したフォスフォジエステ
ル法、Beaucageらの（1981）開示したジエチルフォスフ
ォアミデート法、および米国特許第No.4,458,066号の固
体担体法がある。
所望するならば、分光学的に、光化学的に、微生物学
的に、免疫化学的に、あるいは化学的に検出可能な手段
を組み込むことにより、プライマーは標識してもよい。
テンプレート依存性のオリゴヌクレオチドプライマー
の伸長反応は、ポリマー化薬剤により触媒され、適切な
量の四種のデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェー
ト（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）あるいはその類似物
の存在下で、適切な、塩類、金属カチオン、およびpH緩
衝系からなる反応溶媒中で行われる。適切なポリマー化
薬剤は、プライマー依存性およびテンプレート依存性の
DNA合成を触媒する酵素である。知られているDNAポリメ
ラーゼには、例えば、E. coliのDNAポリメラーゼＩあ
るいはそのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、およびTa
q DNAポリメラーゼがある。これらのDNAポリメラーゼを
用いてDNA合成を触媒する反応条件は公知である。
この合成の産物は、テンプレート鎖およびプライマー
伸長鎖から構成される二重鎖の分子であり、その中に標
的配列を包含している。これらの産物は、次には、以降
の複製の段階ではテンプレートとして機能する。複製の
第２段階では、第１サイクルのプライマー伸長鎖は、そ
の相補的なプライマーとアニールする；この合成は、
５′−末端および３′−末端の両方にプライマー配列あ
るいはその相補体が結合した、「短い」産物を生成す
る。変性、プライマーのアニーリング、および伸長の繰
り返されるサイクルは、プライマーによって定義される
標的領域の指数的な蓄積をもたらす。核酸からなる標的
領域を包含する、所望する量のポリヌクレオチドを得る
ために十分なサイクル数が行われる。所望する量は、変
化し、ポリヌクレオチド産物の果たす機能によって決定
される。
PCR法は、多くの一時的な配列に対して行うことがで
きる。例えば、PCRは、各段階の終わりに新しく試薬を
加え、あるいは、予め決めた段階数の後に新鮮な試薬を
加えることにより、全ての試薬を同時に入れるような様
式で、段階的に行うこともできる。
推奨する方法においては、PCR反応は熱安定性酵素を
利用して、自動化された工程として行った。この工程で
は、反応混合物は、変性過程、プライマーのアニーリン
グ過程、および反応過程をサイクルさせられる。熱安定
性酵素を用いた使用法に特に適合した、酵素を各サイク
ル毎に加える必要がないので液体制御システムを持たな
い、装置を用いてもよい。この種の装置は、Perkin Elm
er Cetus Corp.から市販されている。
PCRによる増幅の後、標的ポリヌクレオチドは、かな
り厳格なから適切に厳格なハイブリダイゼーションおよ
び洗浄条件下で、標的配列と安定にハイブリッドを形成
するプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンにより検出される。もしも、プローブが標的配列と
完全に相補的（即ち、約99％あるいはそれ以上）である
と期待できるならば、かなり厳格な条件が用いられる。
もしも、幾らかのミスマッチが予想されるならば、例え
ば、プローブが完全に相補的ではない変異株が結果とし
て予想されるならば、ハイブリダイゼーションの厳格さ
は減じられる。しかしながら、条件は非特異的／偶発的
結合の排除を目的に選択される。ハイブリダイゼーショ
ンに影響を与える条件、および、非特異的結合を選別す
るための条件、は公知であり、例えば、Maniatisらによ
り（1982）記述されている。一般的に、低い塩濃度およ
び高温は結合のストリンジェンシーを増す。例えば、厳
格な条件とは、約0.1x SSCと、0.1％SDSを含む溶液中で
インキュベートし、約65℃のインキュベーション／洗浄
温度、適度に厳格な条件とは、約１から2 x SSCと、0.1
％SDSで、約50から65℃のインキュベーション／洗浄温
度、と考えられている。低いストリンジェンシー条件
は、2 x SSCで、約30から50℃である。
HCV標的配列のプローブは、図18に示したHCVのcDNA配
列から、あるいは新しいHCV分離株から、由来したもの
でよい。HCVプローブは、標的領域を覆うならば、そし
てプライマー部分が排除されているならば、そして標的
領域と特異的にハイブリダイゼーションするならば、如
何なる長さでもよい。もしも、完全な相補性があるなら
ば、すなわち、その株がプローブと同じ配列を含有する
ならば、二重鎖は厳格な条件下でさえ相対的に安定であ
り、プローブは短くとも、すなわち約10から30塩基対の
長さでも、構わない、もしも、プローブにある程度のミ
スマッチが予想されるならば、すなわち、プローブが変
異した領域とハイブリダイズすることが疑われるなら
ば、長さはミスマッチの効果の幾分かを補償する様に考
えられているため、プローブはより長くされる。この例
は、プローブをHCVの潜在的な変異株に結合させ様と設
計した実施例に見られる。この場合、プライマーは、HC
Vゲノムの仮想的な保存領域に由来したHCV cDNAに結合
する様に設計され、標的領域は潜在的に変異（Flavivir
usのモデルに基づく）を含む部位である。HCV標的配列
を検出するために用いたこのプローブは、およそ268塩
基対であった。
標的配列に相補的なプローブの核酸は、以前にプライ
マー配列の合成用に記述したのと同様な技術を用いて合
成できる。所望するならば、プローブは標識してもよ
い。適切な標識物は、以前に記述してある。
時として、プローブにより検出された、PCR産物の長
さを決定したいことがある。これは、もし変異したHCV
株が標的領域に欠損を有している場合、あるいは、PCR
産物の長さを確認したいと望む場合に、起こる。この様
な場合、プローブとハイブリダイズすると同様に、この
産物をサイズ分析に付することが望ましい。核酸のサイ
ズを決定する方法は、公知であり、たとえば、ゲル電気
泳動、グラジエント中での沈降、およびゲル排除コロマ
トグラフィー、が含まれる。
生物学的試料中の標的配列の存在は、HCVポリヌクレ
オチドプローブとPCR増幅技術にかけたその核酸とが、
ハイブリッドするかどうかを調べることにより検出され
る。プローブと核酸配列との間で形成されたハイブリッ
ドを検出する方法は、公知である。簡単には、たとえ
ば、標識していない試料をそれが結合できる固相マトリ
ックスに移し、そして結合した試料を標識したプローブ
と特異的なハイブリダイゼーションが起こる条件に置
き；次に、固相マトリックスに標識プローブが存在して
いるかどうか調べる。あるいは、試料が標識化されてい
る場合、未標識プローブはこのマトリックスに結合し、
適切なハイブリダイゼーション条件下に曝すことで、マ
トリックスは標識が存在するかどうかを試験される。他
の適切なハイブリダイゼーションアッセイについては以
前に記述してある。
PCRを用いるHCV変異株の配列決定 HCV変異株を同定するために、およびそれによってこれ
らの変異株のプローブを設計するために、上記のHCV/cP
CRの方法がHCVゲノムの変異領域を増幅するのに用いら
れ、それによってこれらの変異した標的領域のヌクレオ
チド配列が決定され得る。一般に、HCVの変異型は、HCV
1株が主（predominant）である地域、例えば、日本、ア
フリカなどの地域とは異なる地域に存在すること；ある
いはウイルスにも感染される異なる脊髄動物種に存在す
ることが予想され得るだろう。HCV変異株は、組織培養
系の継代にも現れ得るし、あるいは突然変異あるいは誘
導された変異の結果として現れ得る。
変異した標的領域を増幅するのに、疑わしい領域をフ
ランキングするように、プライマーが設計され、好まし
くは保存領域に相補的である。HCVの２つの領域（これ
らの領域はフラビウイルスモデルに基づき、おそらく保
存されている）に対するプライマーは実施例に記述され
る。図18に示されるHCV1株の配列の情報を用いて、これ
らのプライマーおよびプローブを設計し得る。
標的領域のヌクレオチド配列決定はPCRで増幅された
生成物を直接分析することによって行われ得る。PCRで
増幅された生成物の配列を直接分析する方法がSaikiら
（1988）に記述されている。
一方、増幅された標的配列は配列決定の前にクローン
され得る。酵素的で増幅されたゲノム断片の直接クロー
ニングおよび配列分析の方法がScharf（1986）によって
述べられた。この方法において、例えば、M13シークエ
ンシングベクターに直接クローニングできるように便利
な制限酵素の切断部位を与えるため、PCR技術に用いら
れるプライマーにはプライマーの５′末端の近傍に改変
される。増幅後、PCR生成物が適切な制限酵素で開裂さ
れる。制限酵素で切断された断片をM13ベクターに組み
込み、そして例えば、JM103宿主に形質転換して、プレ
ートにまき、そしてこのように得られたプラークがラベ
ルしたオリゴポリヌクレオチドプローブでハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングされる。クローニン
グおよび配列分析の他の方法は当該分野で公知である。
フラビウイルスのおよびHCVのユニバサールプライマー HCVのcDNA由来のプローブを用いて、HCVのゲノムの性
質を調べた結果によって、およびHCVのcDNA内に含有さ
れる配列情報によって、HCVがフラビ様ウイルス（Flavi
−like virus）であることが推定される。これらの研究
は、この明細書の譲受人が所有する欧州特許出願公開第
318,216号に記述されている。これの全文は本明細書に
援用されている。HCVのcDNAクローン由来のHCVのcDNA配
列と多数のフラビウイルスの公知の配列との比較から、
HCVが、フラビウイルスの保存配列と相同性である配列
を含有することが分かった。これらの保存配列によっ
て、フラビウイルスの標的領域の増幅、およびHCVに適
用するのに、ユニバーサルであり得るプライマーが作製
され得る。これらの配列は、実施例に記述されるプライ
マーの３′末端由来の16−merあるいはそれより小さい
配列である。次いで、種特異的プローブを用いて、種の
同定は達成される。多数のフラビウイルスのゲノムは当
該分野に公知であり、それらには、例えば、Japanese E
ncephalitisウイルス（Sumiyoshiら（1987））、Yellow
Feverウイルス（Riceら（1985））、Dengue Type2ウイ
ルス（Hahnら（1988））、Dengue Type4ウイルス（Mack
ow（1987））、およびWest Nileウイルス（Castleら（1
986））が含まれる。HCV特異的なプローブを用いて、HC
VのRNAの同定は達成され、そしてこの配列が本明細書に
提供されているHCVのcDNA配列によって決定され得る。
一方、コドン縮退（codon degeneracy）のために設計
されるプローブであって、そして、フラビウイルスおよ
びHCVの共通配列（フラビウイルスの公知の配列とHCVの
アミノ酸配列との比較によって決定される）を含有する
プローブのセットの使用は、これらのウイルスを一般の
検出システムで検出され得る。
所望のDNA配列の構築 Warner（1984）の方法に従って、自動オリゴヌクレオ
チド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドが調製さ
れ得る。所望ならば、反応の標準の条件下で、32P−ATP
の存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼの処理によっ
て、合成鎖が32Pでラベルされ得る。
cDNAライブラリーから単離されたものを含む、DNA配
列が、Zoller（1982）の記載の部位特異的突然変異誘発
のような公知の技術によって改変され得る。要するに、
改変されようとするDNAを単鎖配列として、ファージに
パッケージし、そしてプライマー（改変されるDNAの部
分に相補的である合成オリゴヌクレオチドであり、自分
自身の配列内に所望な改変を有する）を用いて、DNAポ
リメラーゼで２重鎖DNAに変換する。このように得られ
た２重鎖DNAを、ファージを維持できる宿主バクテリウ
ムに形質転換する。ファージの各鎖の複製を含有する、
形質転換したバクテリアの培養物を寒天にプレートし
て、プラークを得る。理論的に、50％の新しいプラーク
は変異した配列を有するプラークを含有し、そして残り
の50％は現型の配列を有する。正しい鎖とハイブリダイ
ズするが、改変されない配列とハイブリダイズしないよ
うなハイブリダイゼー ションの温度および条件下で、これらのプラークの複製
物をラベルした合成プローブとハイブリダイズした。ハ
イブリダイゼションによって同定された配列を回収し、
クローン化する。
HCV由来のポリヌクレオチドをスクリーニングするため
のキット HCVのサンプルの増幅、および／あるいはスクリーニ
ングのための、プローブおよび／あるいはプライマーで
あるオリゴマーがキット内にパッケージされ得る。HCV
配列のスクリーニングのためのキットには、オリゴマー
のプローブDNAが含まれる。HCV配列の増幅のためのキッ
トには、増幅に用いられるオリゴマーのプライマーが含
まれ得る。このキットは通常、特定のハイブリダイゼー
ションおよび／あるいは増幅のプロトコールで必要とさ
れる。前もって測定したあるいは前もって決めた量のプ
ローブあるいはプライマーを含有し、そして他の適切な
包装された試薬および材料をも、別々の適当な容器に入
れられていて、含有する。例えば、キットは標準物、緩
衝剤、支持体、酵素、基質、ラベルプローブ、結合対、
および／あるいはテストを行うするための説明書を含有
する。
実施例 以下、本発明の実施例が述べられている。これらの実
施例は本発明について説明するものであって、本発明を
制限するものではない。
オーバーラップしているHCVのcDNAクローン13i、26J、C
A59a、CA84a、CA156eおよびCA167bの単離および配列 13i、26J、CA59a、CA84a、CA156eおよびCA167bのこれ
らのクローンを、HCVのcDNAを有するラムダーgt11ライ
ブラリー（ATCC No.40394）から単離した。このライブ
ラリーの調製は、欧州特許出願公開第318,216号（1989
年５月31日公開した）およびWO89/04669（1989年６月１
日公開した）に記載されている。Huynh（1985）が述べ
られた方法を用いて、下記のプローブで、このライブラ
リーをスクリーニングした。それぞれのプローブに対す
るポジティブのクローンの検出する頻度は50,000個に約
１個であった。
クローン12fの配列由来の合成プローブを用いて、ク
ローン13iを単離した。このプローブの配列は以下であ
る： ５′ GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3′ クローンK9−１の５′領域由来のプローブを用いて、
クローン26jを単離した。このプローブの配列は以下で
ある： ５′ TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3′ クローン12fおよびクローンk9−１（K9−１とも呼ば
れる）の単離の方法が欧州特許出願公開第318,216号に
記載されている。これらのクローンの配列は図１および
図２それぞれに示されている。クローン13iおよび26jの
HCVのcDNA配列は図４および図５にそれぞれ示されてい
る。これらの図には、これらの配列にコードされるアミ
ノ酸、およびクローン13iのクローン12fとのオーバーラ
ップ、およびクローン26jのクローン13iとのオーバーラ
ップも示されている。これらのクローンの配列はクロー
ンK9−１の配列を確認した。クローンK9−１を別のHCV
のcDNAライブラリーから単離した（欧州特許出願公開第
218,316号参照）。
クローン26jの５′領域の配列に基づくプローブを用
いて、クローンCA59aを単離した。このプローブの配列
は以下である： ５′ CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3′ クローンCA59aの配列由来のプローブが、クローンCA8
4aの単離に用いられた。この単離に用いられるプローブ
の配列は以下である： ５′ AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3′ クローンCA84aの配列由来のプローブを用いて、クロ
ーンCA156eを単離した。このプローブの配列は以下のと
おりであった。： ５′ ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3′ クローンCA 156eの配列由来のプローブを用いてクロ
ーンCA167bを単離した。このプローブの配列は以下のと
おりであった。： ５′ TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3′ クローンCA59a、CA84a、CA156e、およびCA167bにおけ
るHCV cDNAのヌクレオチド配列は図６、７、８、および
９に、それぞれ示されている。ここにコードされている
アミノ酸、および関連したクローンの配列を有するオー
バーラップもまた、これらの図に示されている。
“pi"HCV cDNAライブラリーの創製 欧州特許公開第318,216号に記載されているラムダ−g
tll HCV cDNAライブラリーを構築するために用いられる
感染チンパンジーの血漿の同一のバッチから、本質的に
同様の方法を用いて、HCV cDNAのライブラリー、すなわ
ち“pi"ライブラリーを構築した。しかし、“pi"ライブ
ラリーの構築には、プライマー延長法を用いた。この方
法において、逆転写酵素のプライマーはクローンCA59a
の配列に基づいている。このプライマーの配列は、以下
のとおりである。： ５′ GGT GAC GTG GGT TTC 3′ クローンpil4aの単離および配列 クローンCA167b（上記を参照のこと）を単離するのに
用いたプローブによる上記の“pi" HCV cDNAライブラリ
ーのスクリーニングにより、クローンpil4aが得られ
た。このクローンは、ラムダgt−ll HCV cDNAライブラ
リー（ATCC No.40394）から単離されたクローンCA167
b、CA156e、CA84aおよびCA59aとオーバーラップしてい
る約800塩基対のcDNAを含有している。さらに、pil4aは
また、約250塩基対のDNAを含有しており、その塩基対
は、クローンCA167bにおけるHCV cDNAの上流に存在して
いる。
クローンCA216a、CA290aおよびag30aの単離および配列 クローンCA167bの配列に基づいて、以下の配列を有す
る合成プローブを製造した。： ５′ GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3′ 上記プローブを、スクリーニングするために用い、ク
ローンCA216aを得た。そのHCV配列は図10に示されてい
る。
以下の配列を有するクローンCA216aの配列に基づい
て、他のプローブを製造した。： ５′ TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3′ このプローブでラムダ−gtllライブラリー（ATCC No.
40394）をスクリーニングすることにより、クローンCA2
90aが得られた。その中のHCV配列は図11に示されてい
る。
パラレルアプローチ（parallel approach）では、上
記のオリジナルのラムダ−gtll cDNAライブラリーにお
いて用いた同様の感染血漿から抽出された核酸を用い
て、プライマー延長cDNAライブラリーを製造した。用い
たプライマーはクローンCA216aおよびCA290aの配列に基
づいていた。： ５′ GAA GCC GCA CGT AAG 3′ クローンpil4aおよびk9−１の単離において用いられ
るライブラリーの上記で記載された方法と同様の方法を
用いて、このcDNAライブラリーを製造した。このライブ
ラリーをスクリーニングするのに用いたプローブはクロ
ーンCA290aの配列に基づいていた。： ５′ CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAAA 3′ クローンag30aを上記のプローブを用いて新しいライブ
ラリーから単離した。それは、約670塩基対のHCV配列を
含んでいる。図12を参照のこと。この配列の一部は、ク
ローンCA216aおよびCA290aのHCV配列とオーバーラップ
している。しかし、約300塩基対のag30a配列は、クロー
ンCA290a由来の配列の上流に存在する。オーバーラップ
していない配列はHCV ORFの開始を示し得る開始コドン
（・）および終止コドンを示す。図12には以下のものも
含まれる：翻訳を制御する役割を果たし得るコードされ
た推定される小さいペプチド（＃）、および推定される
ポリペプチドの推定される最初のアミノ酸（／）、およ
びその下流でコードされたアミノ酸。
クローンCA205aの単離おより配列 クローンCA290a（図11）におけるHCV配列由来の合成
プローブを用いて、オリジナルのラムダgt−11ライブラ
リー（ATCC No.40394）からクローンCA205aを単離し
た。このプローブの配列は以下のとおりであった。： ５′ TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3′ 図13に示されるCA205aにおけるHCV cDNAの配列は、クロ
ーンag30aおよびCA290aの両方におけるcDNA配列とオー
バーラップしている。CA290aの配列とオーバーラップし
ている配列はその配列の上に点線で示されている（この
図はまた、この断片においてコードされた推定されるア
ミノ酸を示す。） クローンCA205aおよびag30aにおけるHCV cDNA配列か
ら明らかなように、この推定されるHCVポリプロテイン
はATG開始コドンで始まると思われる；両クローンにお
けるHCV配列は、このATGから42ヌクレオチド上流に、フ
レーム内の連続するダブルストップコドン（TGATAG）を
含有する。このHCV ORFはこれらの終止コドンの後で開
始し、そして、少なくとも8907ヌクレオチド延長すると
考えられる（図18において示されるコンポジット（comp
osite）HCV cDNAを参照のこと）。
クローン18gの単離および配列 クローンag30a（図12を参照のこと）およびオリジナ
ルのラムダgt−11ライブラリー（ATCC No.403949）由来
のオーバーラップしているクローンの配列に基づいて、
CA230a、すなわち、以下の配列を有する合成プローブを
製造した。： ５′ CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3′ プローブでオリジナルのラムダ−gt11 HCV cDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、クローン18g
が得られ、そのHCV cDNA配列は図14に示されている。こ
の図には以下のものもまた示されている：クローンag30
aとのオーバーラップ、およびHCV cDNA中でコードされ
た推定されるポリペプチド。
クローン18g（C18gまたは18g）におけるcDNAは、クロ
ーンag30aおよびCA205aにおけるcDNAとオーバーラップ
しており、そのことは上記で記載されている。C18gの配
列はまた、クローンag30aにおいて見られるダブルスト
ップコドン領域を含む。これらの終止コドンの上流のポ
リヌクレオチド領域は、おそらくHCVゲノムの５′領域
の一部を表す。これは、短いORFを有し得、そして精製H
CVゲノムの直接配列決定法により、確認され得る。これ
らのコードされた推定される小さいペプチドは、翻訳に
おいて制御する役割を果たし得る。C18gで表される領域
の上流のHCVゲノムの領域は、本質的に欧州特許公開第3
18,216号に記載された方法（これは、クローン12fにお
けるHCV cDNA配列の上流のcDNA配列を単離する方法であ
る。）を用いて、配列決定のために、単離され得る。本
質的にC18gの配列に基づく逆転写酵素の小さい合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてHCVゲノムR
NAにおいて相当する配列と結合するために用いられる。
このプライマー配列は既知のC18gの５′末端に近いが、
プライマー配列の上流のプローブ配列の設計を可能にす
るのに十分なだけ下流に存在する。周知のプライミング
（priming）およびクローニングの標準法が用いられ
る。得られたcDNAライブラリーをプライミング部位の上
流の配列でスクリーニングする（C18gの明らかにされた
配列から推測される）。NANBHを有する個体由来の血漿
または肝臓のサンプルのいずれかからHCVゲノムRNAを得
る。HCVはフラビ様ウィルスであると考えられるので、
このゲノムの５′末端は“cap"構造で修飾され得る。フ
ラビウィルスゲノムが５′末端“cap"構造を含んでいる
ということは知られている。（黄熱病ウィルス、ライス
（Rice）ら、（1988）；デング熱ウィルス、ハーン（Ha
hn）ら、（1988）；日本脳炎ウィルス（1987）。
β−HCV cDNAライブラリー由来のクローンの単離および
配列 HCVゲノムの３′末端領域を代表するcDNAを含むクロ
ーンをオリジナルの感染チンパンジー血漿プール（HCV
cDNAラムダ−gt11ライブラリー（ATCC No.40394）の創
製のためにもちいられ、欧州特許公開第318,216号に記
載されている）から構築したcDNAライブラリーから単離
した。DNAライブラリーを創製するために、血漿から抽
出されたRNAをポリ（rA）ポリメラーゼを用いてポリrA
で付加（tailed）し、そして、cDNAを逆転写酵素のプラ
イマーとしてオリゴ(dT)12-18を用いて合成した。得ら
れたDNA:cDNAハイブリッドをRNAase Hで分解し、そして
二本鎖HCV cDNAに変換した。この得られたHCV cDNAを、
本質的にヒューン（Huynh）（1985）において記載され
た方法を用いて、ラムダ−gt10にクローン化し、β（ま
たはｂ）HCV cDNAライブラリーを得た。用いられた方法
は以下のとおりであった。
血漿のアリクォート（12ml）をプロテイナーゼＫで処
理し、0.05MのトリスCl、pH7.5、0.05％（v/v）β−メ
ルカプトエタノール、0.1％（w/v）ヒドロキシノロン、
1mM EDTAで飽和させた同量のフェノールで抽出した。得
られた水相をフェノール混合物で再抽出し、次いで、フ
ェノールおよびクロロホルム：イソアミルアルコール
（24:1）を（1:1）で含有する混合物で３回抽出し、次
いで、クロロホルム：イソアミルアルコール（1:1）で
２回抽出した。NaClについて水相を200mMに調製した
後、水相における核酸を−20℃で一晩、2.5容量の冷却
した無水エタノールで沈澱させた。この沈澱物を遠心分
離（10.000 RPM、40分間）により集め、20mMのNaClを含
有する70％エタノール、そして100％冷却したエタノー
ルで洗浄し、デシケーター中で５分間乾燥し、そして、
水で溶解した。
感染チンパンジー血漿プール由来の単離した核酸に、
ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（HPRI）（Amer
sham Corp.から購入した）の存在下でポリ−Ａポリメラ
ーゼを用い、担体としてMS2 RNAを用いて、ポリrAを付
加した。2mlの血漿中の核酸と等量の単離された核酸をT
MN（50mMのトリスHCl、pH7.9、10mMのMgCl2、250mMのNa
Cl、2.5mMのMnCl2、2mMのジチオスレイトール（DDT）、
40マイクロモルのα−［32P］ATP、20単位のHPRI（Amer
sham Corp.）、および約９から10単位のRNaseを含まな
いポリ−Ａポリメラーゼ（BRL）を含有する溶液中でイ
ンキュベートした。37℃で10分間、インキュベートを行
い、この反応をEDTAで終了させた（最終濃度約250m
M）。この溶液を同量のフェノール−クロロホルムで抽
出し、そして、同量のクロロホルムで抽出し、そして、
核酸を200mMのNaClの存在下で2.5容量のエタノールで−
20℃で一晩、沈澱させた。
クローンb5aの単離 βHCV cDNAライブラリーを、クローン15e中のHCV cDN
A配列に基づいた配列を有した合成プローブを使用する
ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
クローン15eの単離は、E.P.O.公開第318,216号に記載さ
れており、その配列は、図３に示されている。合成プロ
ーブの配列は、以下の通りであった。
５′ ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3′ ライブラリーのスクリーニングによって、約1,000個の
塩基対のHCV cDNA領域を有するクローンβ−5a（b5a）
が生産された。このcDNAの５′領域は、クローン35f、1
9g、26gおよび15eと重複している（これらのクローン
は、前述されている）。
３′末端ポリＡ配列とクローン15eに重複する３′配
列との間の領域は、約200個の塩基対を含んでいる。こ
のクローンによって、３′末端配列の領域がHCVゲノム
であると同定され得る。
b5aの配列は、クローン16jh（以下に記載されてい
る）中のHCV cDNAの配列内に含まれている。さらに、配
列はまた、オリジナルのλ−gt11ライブラリー（ATCC N
o.40394）から単離された、CC34a中に存在している。
（オリジナルのλ−gt11ライブラリーは、本願では、
“C"ライブラリーと呼ばれる）。
HCVゲノムの３′領域のPCR増幅によって生成されたクロ
ーンの単離と配列 HCVゲノムの３′領域由来のヌクレオチド配列を有す
る複数のcDNAクローンを生成した。これは、以下に記載
のように改変された、Saikiら（1986）およびSaikiら
（1988）に記載のポリメラーゼ鎖反応技術によって、ゲ
ノムの標的領域を増幅させることによって成し遂げられ
た。増幅されたHCV RNAを、E.P.O.公開第318,216号に記
載のHCV cDNAλ−gt11ライブラリー（ATCC No.40394
号）の生産に使用されたオリジナルの感染性チンパンジ
ープラズマプールから得た。HCV RDNAの単離について
は、前述した。チンパンジ血清から単離された核酸を核
酸基質の代わりに用いたこと以外は、Sippel（1973）に
記載されるように、E.coliポリＡポリメラーゼによって
単離されたRNAの３′末端にATPを付加した。ついで、プ
ライマー−アダプターの成分および配列が以下の通りで
あったこと以外は、実質的にHan（1987）によって記載
されるように、付加されたRNAを、オリゴdT−プライマ
ーアダプターを使用して、逆転写酵素によってcDNAに逆
転写した。
得られたcDNAを、２つのプライマーを使用するPCRによ
って増幅にかけた。プライマー 配列 JH32（30 mer） ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC JH11（20 mer） AATTCGGGCGGCCGCCATACGA JH32プライマーは、66℃の算出されたTmで、cDNAの標的
領域の５′末端にハイブリダイズ可能な20個のヌクレオ
チド配列を有していた。JH11は、オリゴdT−プライマー
アダプターの一部から由来したものであるため、64℃の
Tmで、cDNAの３′末端に特異的である。両方のプライマ
ーは、増幅されたHCV cDNAの配列クローニングに使用さ
れる、５′末端における制限酵素である、NotIのための
認識部位を有するように設計された。
Perkin Elmer Cetus PCRキット（N801−0043またはN8
01−0055）中にある、４つのデオキシリボヌクレオシド
トリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、およびTher
mus aquaticus（Taqポリメラーゼ）から単離された熱安
定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反応
混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることによ
って、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer Cet
us DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクル
は、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２
分間のアニーリング工程、および72℃における３分間の
プライマー延長工程から構成された。PCR生産物を、ク
ローン15eの３′末端領域の配列に基づいた配列であ
る、30個のヌクレオチドプローブ、JH34を使用するサザ
ンブロット分析にかけた。JH34の配列は、以下の通りで
ある。
５′ CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3′ HCV cDNAプローブによって検出されたPCR生産物のサイ
ズは、約50個から約400個の塩基対の範囲であった。
増幅されたHCV cDNAをクローン化するために、PCR生
産物は、Notlで消化されポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によってサイズをした。300個の塩基対よりも大き
なDNAは、pUC18SのNotl部位にクローン化された。ベク
ターpUC18Sは、pUC18のEcoRIとSaII部位との間にクロー
ン化されたNotIポリリンカーを含ませることによって構
築される。クローンのHCV cDNAの存在を、JH34プローブ
を使用して、スクリーニングした。陽性クローンの数を
得て、配列決定した。これらのクローンの１つである16
jh中の、HCV cDNA挿入部のヌクレオチド配列、およびそ
こにコードされたアミノ酸を、図15に示す。クローン16
jhにおけるHCV cDNAの配列中に検出されたヌクレオチド
異変性を、この領域のもう一つのクローンと比較したも
のを、この図に示す。
クローン6kの単離および配列 クローン16jhおよびクローンb5a（上記を参照）の配
列に基づいて、以下の配列を有する合成プローブを生産
した。
５′ TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3′ オリジナルのλ−gt11HCV cDNAライブラリーをプローブ
を用いて（E.P.O.公開第318,216号に記載されるよう
に）スクリーニングすることによって、106中約１の頻
度でクローンを生産した。これらの一つをクローン6kと
名付け（また、C6kとも名付け）、そのHCV cDNA配列を
図16中に示す。また、この図に示されているのは、クロ
ーン16jhと重複しているものと、HCV cDNA内にコードさ
れた推定ポリペプチドである。クローン6k中のHCV cDNA
上の配列情報を、１本鎖のみから得た。クローンが、λ
gt11 c6kとして名付けられている、寄託されたこのク
ローン情報は、以下に記載している。C6K配列が、HCV1
ポリペプチドをコードするORFの一部であるという確認
は、他の重複クローンを配列決定することによって得ら
れた。
クローンp131jhの単離および配列 HCVゲノムの３′領域からの配列を含み、インフレー
ム終止コドンを含むクローンを、実質的に以下に記載さ
れるように単離した。すなわち、以下のオリゴヌクレオ
チドを使用して、HCV1 RNAをcDNAに変換したこと以外
は、ゲノムの３′領域のPCR増幅によって生成されたク
ローンを単離した。
５′ AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT
ATA GAA T15 3′ ついで、cDNAを、以下のプライマーを使用して、PCR反
応によって増幅させた。
５′ TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAC ACA T 3′ および ５′ AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3′ 増幅後、PCR生産物を、スペルミンで沈澱させ、Notl
で消化し、フェノールで抽出した。精製された生産物
を、pUC18SのNotl部位にクローン化し、HCV陽性クロー
ンを以下のオリゴヌクレオチドを使用して選択した。
５′ CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3′ pl31jhとして名付けられた１つのクローン中のHCV cDNA
は、図17に示される。このクローンは、HCVゲノム中に
含まれる大きなORFのインフレーム終止コドンを含んで
いる。
クローン５′−クローン32の単離および配列 クローンb114a中の配列の上流側である、HCVゲノムの
５′領域からの配列を含むクローンを単離し、本願に参
考のために取り入れたU.S.S.N.456.637号に記載され
る、ゲノムの３′領域のPCR増幅によって生成されたク
ローン単離と配列のための方法を改変したものによっ
て、ヌクレオチド配列を決定した。一般に、ゲノムの標
的領域を、Saikiら（1986）およびSaikiら（1988）に記
載のPCR法によって増幅させた。増幅されたHCV RNAを、
Hanら（1987）によって記載されるコールドグアニジニ
ウムチオシアネート法を使用して、ヒト血清（米国臨床
単離株、HCV27）を抽出することによって得た。抽出さ
れたRNAを、HCVゲノムのヌクレオチド−250から−223に
相補的なプライマーJH94を使用して、逆転写酵素を用い
て、一本鎖cDNAに変換した（図18を参照）。JH94の配列
は、以下の通りである。
５′ CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3′ 一本鎖から二本鎖HCV cDNAへの変換を、末端デオキシヌ
クレオチジル トランスフェラーゼを使用して、約20か
ら50個のdA残基をDNAに付加（Sambrookら（1989）,MOLE
CULAR CLONING）、NtoI部位およびsp6プロモータ−を有
する以下のオリゴdTプライマー−アダプターを使用し
て、この付加された分子を複製することによって成し遂
げた。
得られたcDNAを、JH94（上記に記載されている）および
以下の配列を有しているJH11の２つのプライマーを使用
して、PCRによって増幅にかけた。プライマー 配列 JH11（20 mer） AATTCGGGCGGCCGCCATACGA Perkin Elmer Cetus PCRキット（N801−0043またはN8
01−0055）中にある、４つのデオキシリボヌクレオシド
トリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、およびTerm
us aquaticus（Taqポリメラーゼ）から単離された熱安
定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反応
混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることによ
って、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer Cet
us DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクル
は、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２
分間のアニーリング工程、および72℃における３分間の
プライマー延長工程から構成された。
PCR生産物を、NotIで消化し、pUC185にクローン化し
た。HCVヌクレオチド配列を含むクローンを、以下の配
列を有する、HCV1ゲノムのヌクレオチド−312から−283
由来のプローブであるAlex90でスクリーニングすること
によって得た。
５′ ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3′ 単離されたクローン中のHCV cDNAを、ジデオキシ鎖ター
ミネーション法（Sangerら（1977））によって配列決定
した。単離されたクローンの１つである５′−クローン
32中のHCV cDNAの配列は、図18のヌクレオチド−224か
ら−341までの領域に至っている。
HCV cDNAのヌクレオチド配列を分析すると、HCV RNA
ストランドの複製物が、安定したヘアピン構造を形成し
得るGCが豊富な配列を含んでいるのが示された。
この構造において、ダッシュ線は、相補的なヌクレオチ
ド間の可能な水素結合を示す。
コンピューターデータベースである遺伝子バンク（Ge
nebank）をサーチして、相同な配列が、既知のウィルス
配列には見られないことが示された。従って、この配列
は、HCVゲノムの５′末端に特有のものであり得る。
ヘアピン構造は、転写酵素の認識信号としての役割を
果たし得、および／または５′末端におけるRNAの安定
性に貢献し得る。
編集されたHCV cDNA配列 本願およびE.P.O.公開第318,216号に記載の様々なHCV
cDNAライブラリー由来の一連の重複クローンから、HCV
cDNAを編集した。図18が由来するところのクローン
は、５′−32、b114a、18g、ag30a、CA205a、CA290a、C
A216a、pi14a、CA167b、CA156e、CA84a、CA59a、K9−１
（またK9−１とも名付けられている）、26j、13i、12
f、14i、11b、7f、7e、8h、33c,40b、37b、35、36、8
1、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19
g、26g、15e、b5a、16jh、C6kおよびpl31jhである。こ
れらのクローンの単離方法および配列は、本願および本
願に参考のために採り入れられたE.P.O.公開第318,216
号に記載されている。図18において、配列の上にある３
つのダッシュは、推定開始メチオニンコドンの位置を示
す。
クローンbl14aが、クローン18g（すなわち、５′−C
A）における配列の上流側にさらに２つヌクレオチドを
含んでいること以外は、クローンbl14aは、クローン18
g、ag30aおよびCA205aと重複している。これらの余分な
二つのヌクレオチドは、図18に示されるように、HCVゲ
ノム配列中に含まれている。
上記に記載のクローンのいくつかは、オリジナルのHC
V cDNAλ−gt11 Cライブラリー（ATCC No.40394）以外
のライブラリーから得られたが、これらのクローンは、
オリジナルのライブラリー中のHCV cDNA配列と重複する
HCV cDNA配列を含んでいる。従って、実質的にすべての
HCV配列が、第1HCV cDNAクローン（５−１−１）を単離
するのに使用されたオリジナルのλ−tg11 Cライブラリ
ー（ATCC No.40394）から抽出できる。クローン５−１
−１の単離については、本願で参考のために取り入れた
E.P.O.公開第318,216号に記載されている。
HCV1 cDNAの複合体（composite）中にコードされた主
要なHCVポリタンパクの推定配列をまた示す。この配列
中の第１アミノ酸は、大きなORFの推定開始メチオニン
である。クローナル不均一性による、変異アミノ酸は、
配列の上に示されている。λ gt11ライブラリーは、１
つの個体から得られた血清から生産された（E.P.O.公開
第318,216号）ため、この結果は、変異型ウィルス配列
（ヌクレオチドおよびアミノ酸）が、この個体中に存在
していることを示唆している。
複合（composite）HCV cDNA配列を調べると、大きなO
RFの他に、ポリタンパクをコードする配列の上流側に、
多数のORFが存在し、ポリタンパクをコードする配列内
においては、他の２つの翻訳フレーム中に多数の小さな
ORFが存在していることが示される。HCVポリタンパクの
上流側にあるORFは、表のすぐ下に示されている。
ポリタンパクの推定イニシエータMETをコード化する配
列より下流側のORFのリーディングフレーム、位置およ
びサイズを下表に示す。主要なポリタンパクはリーディ
ングフレーム２から翻訳されるものである。
上記に加えて、HCV RNAのゲノムストランドと相補す
る配列の試験もまたいくつかの小さなORFを含有する。H
CV RNA配列の−341から＋837のヌクレオチドと相補する
これらORFの１つは385アミノ酸のポリペプチドをコード
化する。
異なる地理的場所からのHCV単離体から得られる５′領
域の配列の比較 米国（HCV18、HCV27）、イタリア（HCVI1、HCVI24）
および韓国（HCVK1）のそれぞれからのHCV単離体の５′
領域からのヌクレオチド配列を比較した。
HCV cDNA配列の単離は、以下の点を除いては、本質的
には上述の５′クローン32の単離に対してと同様に行わ
れた。HCVヌクレチオド−90から−73および366から383
にそれぞれ相補するJH51またはr16のいずれかをプライ
マーとして使用して、抽出されたRNAをcDNAへと逆転写
した。これらのプライマーの配列は以下の通りである。プライマー 配列 JH51 ５′ CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3′ r16 ５′ CAC GTA AGG GTA TCG ATG 3′ HCV dsDNAの増幅は、５′および３′プライマーとして
それぞれJH93およびJH52を使用してPCR方法により行な
われた。JH92におけるHCV配列は−317から−296のHCVヌ
クレチオド由来であり、JH52における配列は−93から−
117のHCVヌクレチオドに由来する。ヌクレチオド番号は
配列の下の括弧内に示す。JH52では下線を引いたジヌク
レチオドが突然変異してNotIサイトを生成した。これら
のプライマーの配列は以下の通りである。
増幅の後、PCR生成物はNotIにより分裂しpUC18Sへとク
ローン化された。HCV cDNAsは、PCRによる増幅のあと直
接配列決定により、またはクローン化されたHCV cDNAs
がプライマーの延長およびジデオキシ法により配列決定
された。配列決定のプライマーの延長およびジデオキシ
法は、上述の５′クローン32に対してと同様に行われ
た。
直接配列決定のためのPCR法は５′プライマーとしてA
lex90（上記の該配列について参照）を使用し、また
３′プライマーとしてr25を使用した。Alex90は−312か
ら−283のHCVヌクレオチドに由来し、r25は365から342
のヌクレオチドに由来する（図18参照）。r25の配列は
以下の通りである。
５′ ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3′ HCV27,HCVK1、HCVI1、HCVI24、およびHCV18の５′領
域の配列と、プロトタイプHCV、HCV1の配列との比較は
以下のことを示した。試験された５′領域は5HCV単離体
の間に高度に保持される。配列は、HCVI24の位置−171
で削除された１つのヌクレオチド、および単離体HCVK1
の位置−222から−219の４個のヌクレオチドが不明瞭で
ある以外は同じであるように見えた。
この領域での高レベルでの配列保持はウィルスの複製
および／または転写および／または翻訳におけるこの領
域の役割を反映し得る。
異なる個体からのHCV単離体における配列変異 CDC/HCV1から逸脱する配列を含むHCVの単離体がヒト
の個体において同定された。これらのいくつかは抗C100
−３抗体に対して血清学的にポジティブであった（EC10
は抗体に対してネガティブであった）。これらの新しい
単離体の同定は、CDC/HC1配列を使用するPCR法により増
幅されたHCVゲノムのクローン化および配列決定セグメ
ントにより行われた。増幅は本質的にはHCV/cPCR法に基
づいて行われた。この方法は本明細書にて述べたHCV cD
NAに基づいてプライマーおよびプローブを使用する。こ
の方法の第１段階は、逆転転写酵素を使用してcDNAをHC
Vゲノムまたはその複製中間物のいずれかへと合成する
ことである。HCV cDNAの合成後、および増幅の前にサン
プルのRNAは当該分野において既知の方法により減退さ
れる。HCV cDNAの特定のセグメントは次に適切なプライ
マーを使用して増幅される。増幅された配列はクローン
化され、増幅した配列を含むクローンが、プライマーの
間に存在するがプライマーとは重複しない配列に相補す
るプローブにより探知される。
米国のヒトから単離されたHCV単離体 HCVビリオンの源として使用された血液サンプルがノ
ースカロライナ州シャーロットの米国赤十字社およびミ
ズーリ州カンサスシティのcommunity Blood Center of
Kansasから得られた。サンプルは、EPO公開第318,216号
にて述べられているELISAアッセイを使用してHCV C100
−３抗原に対する抗体を求めてスクリーニングされ、ま
た多クローン性のヤギの抗ヒトHRPを使用して相補するW
esternブロット分析を行って抗HCV抗体を測定した。そ
れぞれ米国赤十字社およびCommunity Blood Center of
Kansasからの２つのサンプル、＃23および＃27がこれら
のアッセイによりHCVポジティブであると決定された。
これらのサンプルの血清中に存在するウィルス粒子
が、Bradleyら（1985）の述べた条件の下で超遠心分離
法により単離された。10マイクログラム/mlのプロティ
ナーゼＫおよび0.1％のSDSという最終濃度でプロティナ
ーゼＫおよびSDSによる消化によりRNAが粒子から抽出さ
れた。消化は37℃で１時間の間行われた。ウィルスRNA
は、EPO公開第318,216号にて述べられているようにクロ
ロホルム−フェノールによる抽出によりさらに精製され
た。
RNAの調製においてHCV RNAは、cDNA配列1958−1939に
対応しまた次の配列をもつオリゴヌクレチオドJHC 7が
逆転写酵素の反応のためのプライマーとして使用された
ということ以外は、本質的にはEPO公開第318,216号にて
述べられているように、cDNAへと逆転写された。
JHC 7: CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG cDNAの両ストランドが合成された後、結果として得ら
れたcDNAは次に、使用したオリゴヌクレオチドプライマ
ー、すなわちJHC 6およびALX 80が、673から1751のCDC/
HCV1ヌクレオチドからのHCVゲノムの1080ヌクレオチド
セグメントを増幅するように設計されているという点以
外は、本質的にはPCR増幅により生成されたクローンの
単離に対して上述したPCR法により増幅された。さら
に、プライマーはPCR生成物の３′末端でNOT I制限サイ
トを、および５′終端でプラント末端を組み込むように
設計されている。プライマーの配列は次の通りである。
ALX 80: TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG および JHC 6: ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA ALX 80はCDC/HCV1配列のヌクレオチド673−702に対応す
る。JHC 6はHCV1のヌクレオチド1752−1738に対応す
る。（さらにNotIサイトをコード化する12個の余分のヌ
クレオチドがある）。JHC 6におけるヌクレオチドの命
名、すなわち下降番号はアンチセンスストランドにおけ
る配置を示している。
PCRの上述のプライマーとの増幅の後、プラントエント
テルミヌスは次のようにNOT Iサイトに変換された。15
DgSのホモポリマーテイルが最後のデオキシヌクレオチ
ド転写酵素を使用してPCR生成品に接着され、この生成
品はJHC 6およびJHC 13をプライマーとして使用してPCR
により再び増幅された。下記の配列をもつ後者のプライ
マー、JHC 13は、SP6ファージプロモータに加えてNOT I
サイトを含有するように設計されている。（SP6プロモ
ータについてはJ.Setlow編のGENETIC ENGINEERING（198
8）に述べられている。） JHC 13: AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC
ACT ATA GAA CCC CCC CCC CCC CCC 増幅されたHCV cDNAをクローン化するために、PCR生成
品がNotIにより分裂され、スペルミンにより沈澱して遊
離オリゴヌクレオチドを除去（Hoopesら（1981））、次
いでpUC18SのNotIサイトへとクローン化された（第IV.
A.34参照）。各HCV単離体に由来する３個のクローンに
おけるHCV cDNAに対して配列分析が行われた。分析は本
質的にはChenおよびSeeburg（1985）により述べられた
方法により行われた。
サンプル23および27においてHCVに由来するクローン
のコンセンサス配列をそれぞれ図46および図47に示す。
これらの図には、コンセンサス配列においてコード化さ
れたアミノ酸と同様、変異配列もまた示されている。
図39および図40は、サンプル23、27およびHCV1の整合
したポジティブストランドのヌクレオチド配列（図39）
および推定のアミノ酸配列（図40）の比較を示す。図39
のHCV1のアミノ酸配列は、HCVゲノムRNAの中の大きなOR
Fによりコード化されたHCVポリタンパクのアミノ酸番号
129−467を表わす。図46および図47の試験は３個の単離
クローンの配列において変異が存在することを示す。ヌ
クレオチドレベルおよびアミノ酸レベルでの配列変異を
すぐ下の表にて要約する。表において、ＳおよびNS1と
命名されたポリペプチドはそれぞれアミノ酸番号130か
ら約380、および380から約470を表す。番号付けは推定
イニシエータメチオニンからのものである。ＳおよびNS
1という用語はFlavivirusモデルを使用してポリペプチ
ドをコード化する配列の位置決めに基づくものである。
しかし上述のように、ウィルスのポリペプチド領域、特
に推定のE/NS1領域に関してはHCVとFlavivirusとの間に
は全体的な相関関係はないことが最近明らかとなってい
る。実際には、HCVポリペプチドおよびそれらのコーデ
ィング領域はFlavivirusモードからの実質的な由来を示
し得る。
新たに単離されたHCV配列においては変異は存在しな
いが、サンプル23および27（HCV23およびHCV27と呼ばれ
る）からクローン化された配列はそれぞれ1019ヌクレオ
チドを含有し、選択されたクローンにおけるこの領域の
削除および追加ミュータントの欠如を示している。図39
および40における配列はまた単離配列がこの領域で再配
列されていないことを示す。
HCV1のための同意配列とHCVのその他の単離体のため
の同意配列との比較を上の表に要約する。チンパンジー
の単離HCV1とヒトから単離されたHCVとの間の配列変異
は、ヒト起源のHCVの間に見られるものとほとんど同じ
であった。
２つの推定領域における配列変異が均一でなはいとい
うことは興味深い。推定Ｓ領域における配列は比較的一
定しているように見え、領域を通じて不規則に分散され
ている。これに対して、推定NS1領域は全体の配列より
変異程度が高く、変異は推定ポリタンパクの推定Ｎ−テ
ルミヌスから約70個のアミノ酸だけ下流に位置する約28
個よりなる高可変ポケット内にあるように見える。
探知された変異は増幅プロセスの間に導入されたと論
じされ得るが、変異のすべてはこの結果からであると思
われない。Taqポリメラーゼがサイクル当りのDNAテンプ
レート10キロベース当り約１ベースで配列にエラーを導
入することが概算されている（Saikiら（1988））。こ
の概算に基づけば、1019 bp DNAフラグメントのPCR増幅
の間に最大７個のエラーが導入されたであろうことにな
る。しかし、HCV−23およびHCV−27の３個のサブクロー
ンはそれぞれ29および14のベース変異を生じた。次のこ
とはこれらの変異が自然に発生することを示唆する。ベ
ース変化の約60％はアミノ酸配列を変化させない静かな
突然変異である。Taqポリメラーゼにより導入された変
異は無作意に起こることが予想される。しかし結果は、
変異配列が少なくとも１つの特定の領域に密集する。さ
らに、PCR増幅生成品から由来する多数の異なるクロー
ンを配列決定することにより、コンセンサス配列が由来
する。
イタリア及び米国に於けるヒトからのHCV分離株 異なった分離株に存在するHCV RNAのセグメントはHCV
/cPCR法により拡大された。これらのセグメントは推定H
CVポリ蛋白のメチオニンコード開始コドンから下流の〜
0.6kbから〜1.6kbの領域を作り出す。分離株はHCV感染
の個体から得られる生物学的標本からのものである。よ
り詳細には、分離株HCT＃18は米国に於ける個体のヒト
プラズマから、EC1およびEC10はイタリアの患者の肝の
生検から、そしてThはアメリカ人の患者の末梢血単核球
分画からのものである。HCV RNAの比較できるセグメン
トはチンパンジーから単離された。
RNAはヒトプラズマの標本からフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール抽出液を使用して抽出され
た。0.1mlまたは0.01mlのプラズマを10から40μg/mlの
ポリアデニル酸を含むTENB/プロテアーゼK/SDS溶液（0.
05Mトリス−HCL、pH8.0,0.001M EDTA,0.1M NaCl,1mg/ml
プロテアーゼＫ、および0.5％SDS）で最終容量の1.0ml
に希釈し、37℃で60分間培養した。このプロテアーゼＫ
の消化の後、得られたプラズマ分画をTE（50mMトリス−
HCl,pH8.0,1mM EDTA）飽和フェノールで、pH6.5で抽出
することによって脱蛋白した。フェノール相を遠心分離
によって分離し、0.1％SDSを含むTENBで再抽出した。得
られた各抽出からの水相を集め、等容量のフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール／［1:1（99:
1）］，で二度抽出し、次いで等容量のクロロホルム／
イソアミルアルコールの99:1混合液で二度抽出した。遠
心分離により相分離をし、水相を0.2M酢酸ナトリウムの
最終濃度にし、二容量のエタノールを加えて核酸を沈澱
させた。沈澱した核酸をSW41 38Kのローター中で４℃で
60分間超遠心分離により、または10Kのマイクロフェー
ジ中で４℃で10分間超遠心分離した。
肝の生検から抽出されたRNAがOspedale Maggiore di
S.Giovanni Battista,Torino,ItalyのF.Bonino博士によ
り提供された。
単核球分画がメーカーの指示を用いてFicoll−Paque
（ファルマシア社）を通して得られる個体の血の部分
標本の沈澱によって得られた。全RNAを分画から欧州特
許第318,216号（Chooら（1989）をも参照）に記載のグ
アニジンチオシアネート法を用いて抽出した。サンプル
からのHCV cDNAの合成を逆転写酵素と、クローン156eお
よびクローンK91由来のプライマーを使用して行った。
ゲノムRNAに相対的なアンチセンスであるこれらのプラ
イマーは次の様な配列を有する。
156e16B: 5′ CGA CAA GAA AGA CAG A 3′， および K91/16B 5′ CGT TGG CAT AAC TGA T 3′。
エタノール沈澱に続いて沈澱したRNAまたは核酸分画
を乾燥し、DEPC処理された希釈水中に再懸濁した。核酸
中の二次構造を65℃で10分間加熱して壊し、そのサンプ
ルを直ちに氷上で冷却した。cDNAを１から３μｇの肝か
ら全RNA、または10から100μｌのプラズマから抽出され
た核酸（またはRNA）を使用して合成した。その合成に
は逆転写酵素が用いられ、メーカーにより特定されたプ
ロトコールのBRLを用いて25μｌの反応であった。cDAN
合成のためのすべての反応混合物はRNAase阻害剤、RNAS
IN（Fisher/Promega）の23単位を含んでいた。cDNA合成
に続いて、その反応混合物を水で希釈し、10分間ボイル
し、そして速やかに氷上で冷却した。
各サンプルは２周のPCR増幅を受けた。反応のための
プライマーを"EnvL"および"EnvR"と示された領域を増幅
するために選択した。"EnvL"領域はヌクレオチド669−1
243、および推定アミノ酸117から308を包含しており;"E
nvR"領域はヌクレオチド1215−1629を包含し、推定アミ
ノ酸300から408（推定アミノ酸は推定メチオニン開始コ
ドンから始めて番号づけられる）をコードする。これら
の領域のHCV cDNAにコードされた推定ポリ蛋白に対する
相対的な関係、そしてFlavirusモデルにコードされたポ
リペプチドに対する相対的な関係を第48図に示す。
第１ラウンドのPCR反応のためのプライマーはクロー
ンag30a、クローン156e、またはクローンK9−１のいず
れかのHCV cDNA配列から誘導された。EnvL領域の増幅の
ために用いられるプライマーは156e16B（上出の）、お
よびセンスストランドのためのag30a16Aであった;EnvR
の増幅にはプライマーK91/16B（上出の）が使用され、
センスストランドのためには156e16aが用いられた。セ
ンスストランドプライマーの配列は次の様である。
For EnvR,ag30a16A:5′ CTC TAT GGC AAT GAG G 3′ および For Envr,156e16A:5′ AGC TTC GAC GTC ACA T 3′ PCR反応は、１μｇのRNaseAを加えること以外は本質
的にメーカーの指示（Cetus−Perkin−Elmer）に従って
行われた。反応は最終容量が100μｌになるように行わ
れた。PCRを、94℃（１分）、37℃（２分）、および72
℃（３分）、そして最終サイクルの72℃では７分間延長
する方式を利用して30サイクル行った。次いで、サンプ
ルをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで
２回沈澱させ、10mMトリス塩酸中にpH8.0で再懸濁さ
せ、Centricon−30（Amicon）濾過を用いて濃縮した。
この方法は効率的に30ヌクレチドより小さなオリゴヌク
レオチドを除去する；このようにして、PCR増幅の第１
ラウンドからのプライマーを除去する。
Centricon−30で濃縮されたサンプルは、次いで、Env
L領域のためにクローン202aおよび156eから、そしてEnv
R領域のために156eおよび59aから設けられたプローブを
用いるPCR増幅の第２ラウンドにかけられた。EnvL領域
の増幅のためのプライマーは次の様な配列を有する。
202aEnv4la:5′ CTT GAA TTC GCA ATT TGG GTA AGG T
CA TCG ATA CCC TTA CG 3′ および 156e38B′:5′ CTT GAA TTC GAT AGA GCA ATT GCA AC
C TTG CGT CGT CC 3′ ヒト由来のRNAsのEnvR領域の増幅のためのプライマー
は次の様な配列を有する。
156e38A′:5′ CTT GAA TTC GGA CGA CGC AAG GTT GC
A ATT GCT CTA TC 3′ および 59aEnv39C:5′ CTT GAA TTC CAG CCG GTG TTG AGG CT
A TCA TTG CAG TTC 3′ PRCによる増幅は、94℃（１分）、60℃（１分）、お
よび72℃（２分）で、最後のサイクルでは72℃で７分間
延長する方式を用いた35サイクルであった。そのサンプ
ルを、次いで、フェノール：クロロホルムで抽出し、２
回沈澱させ、そしてEcoRlで消化した。PCR反応生成物を
６％ポリアクリルアシドゲルの電気泳動により生成物を
分析した。ほぼ推定された大きさの期待されたPCR生成
物のDNAがゲルから電気溶出され、pGEM−４プラスミド
ベクターまたはラムダgt11のいずれかにサブクローンさ
れた。増幅の第一ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待
される生成物の大きさはそれぞれ615bpおよび683bpであ
り；増幅の第二ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待さ
れる生成物の大きさはそれぞれ414bpおよび575bpであ
る。増幅された生成物を含むプラスミドを宿主細胞を形
質転換するために用いた;pGEM−４プラスミドをDH5−ア
ルファを形質転換するために使用し、ラムダgt11をc600
デルタ−HFLを形質転換するために使用した。適当なHCV
プローブ（以下に記述される）にハイブリダイズするか
または正しい大きさの挿入物を有するプローブにハイブ
リダイズした形質転換された細胞のクローンを選択し
た。次いで、挿入物をM13にクローンし、配列した。
すべてのHCV/cPCR生成物のためのプローブは、HCV cD
NAの32Pラベル化セクションから成り、このcDNAはクロ
ーン216（プライマーとしてCA216a16Aおよび216a16Bを
使用する）、およびクローン84（プライマーとしてCA84
a16AおよびCA84a16BまたはCA84a16cを使用する）の領域
のPCR増幅によって調製された；32Pはニッケル翻訳によ
りPCR生成物の中に導入された。EnvL増幅の第一および
第二ラウンドのプローブはクローン216からのものであ
った。EnvR増幅の第一ラウンドのためのプローブは84
（すなわち、CA84a16AおよびCA84a16B）からのものであ
り、EnvL増幅の第二ラウンドのためのプローブはCA84a1
6AおよびCA84a16Cであった。これらのプローブはHCV/cP
CR反応に用いられるプライマーとオーバーラップしなか
った。プローブのPCR増幅のためのプライマー配列は次
の表でのようである。
EnvL領域の変位体（Variants）についての配列情報は
HCT＃18からの３クローン、THからの２クローン、EClか
らの３クローンから得られ、そして前出の欧州特許第31
8,216号に記載のHCV1クローンから得られた。図49に
は、これらのクローン由来の各々の分離株の複合のヌク
レオチド配列の比較が示されている。この図であ、各配
列がEnvL領域のセンスストランドのために５′から３′
に示され、そしてその配列が並べられている。垂直線お
よび大文字は配列ホモロジーを示し、線がなくて大文字
化されていない文字はホモロジーがないこと示してい
る。
線で示されている配列は次の様である： 線１、Thorn;線２、ECl;線３、HCT＃18;線４、HCV1 EnvR領域の変位体についての配列情報はEC10の２つの
クローンから、そして前出の欧州特許第318,216号に記
載されているHCV1クローンから得られた。二つのEC10ク
ローンは一つのヌクレオチドだけ異なっていた。図50
に、EC10（クローン２）のヌクレオチド配列と複合物の
HCV1配列との比較が示されている；各々の配列をEnvR領
域のセンスストランドに対して５′から３′と示されて
おり、その配列が並べられている。配列間のダブルドッ
トは配列ホモロジーを示している。
EnvL（アミノ酸＃117−308）にコードされたアミノ酸
配列と各々の単離体のEnvR領域（アミノ酸＃300−438）
との比較が図51および図52にそれぞれ示されている。こ
れらの図に前述の分離株JH23およびJH27の配列が含まれ
ている。日本人の分離株からの配列もまた示されてい
る；これらの配列は日本のT.Miyamuraによって提供され
た。図には、その領域んとアミノ酸がHCV1に対してそっ
くりそのまま与えられており、種々の分離株のノン−ホ
モロガスアミノ酸が示されている。
図51からわかるように、EnvL領域ではHCV1と他の分離
株との間に全体でおよそ93％のホモロジーがある。HCT1
8,Th,およびEClはHCV1とおよそ97％のホモロジーがあ
り;JH23およびJH27はHCV1と、それぞれおよそ96％およ
び95％のホモロジーを有する。図52はEnvR領域のホモロ
ジーがEnvL領域よりも有意に少なくて；さらに、一つの
副領域は超可変性（すなわちアミノ酸383−405から）の
ように見える。このデータをすぐ下の表に要約する。
ポジティブおよびネガティブストランドの検出血清中の
５′HCV RNA 血清から単離された、HCV27のRNAは、PCR法を用いてポ
ジティブおよびネガティブストランドの存在について分
析した。PCR法については、次の事柄を除いて、基本的
に上述のように実施した。抽出したHCV27 RNAは、Alex9
0またはJH52（配列については前出参照）をプライマー
として用いて、一本鎖cDNAに逆転写した。Alex90の配列
はHCV RNAのポジティブストランドの−312から−283位
のヌクレオチドに一致している。これに対して、JH52
は、ネガティブストランドの−117から−93位のヌクレ
オチドに一致している。得られた一本鎖HCN cDNAは、各
々Alex90およびJH52を用いたPCRにより増幅を行った。
増幅された生産物はAlex89をプローブとしてサザンブロ
ッティングにより行われた。Alex89はHCV RNAの−203か
ら−175位のヌクレオチドに一致する。Alex89の配列は
次のとおりである。
５′ CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3′ この方法によると、分析により、RNAの両ストランド
の増幅生産物のシグナルは同等の強度を有することが示
された。このことにより、HCVのRNAの５′領域は二本鎖
RNAとして存在し得ることが示唆された。
HCVのサンソイッチハイブリダイゼーションのためのプ
ローブ 本実施例は、米国特許第4868105号に記載の分析方法
を基本的に用いて生物学的資料中のHCV RNAを検出する
のに有用な一対のラベルおよびカプチャープローブを例
示する。この方法は、溶液相サンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイであり、このアッセイにおいては、
分析物である核酸において標的の配列にハイブリダイズ
する、カプチャーおよびラベルプローブを用いる。生物
学的資料のスクリーニングにおいて使用されたプローブ
は、HCVゲノムの保持領域（conserved regions）に結合
し、HCV結合領域はHCVゲノムに対するユニーク性につい
て選択される。カプチャープローブの結合パートナーに
結合する領域、またはラベル部分（あるいは、EPO公開N
o.317,077に開示の方法が用いられるのであれば、増幅
多量体）に結合するラベルプローブの部分は、次のよう
に選択される。つまり、それらはデータバンクまたはHC
Vの既知の配列のいずれにも結合しないように、そして
それらは選択条件下において、それらの相補体と安定な
二本鎖を形成するようにＧおよびＣの適切な量を有する
ように、選択される。カプチャーおよびラベルプローブ
はセットであり、一組のプローブは他の組のプローブに
変化を与えない。これらのプローブは、第18図に示され
るプロトタイプHCV cDNA配列のコード鎖の中の次のヌク
レオチド配列に相補的な配列を含む。
上記のセットにおいて、各々のカプチャープローブ
は、HCV配列に相補的な配列に加えて、次の配列をHCV配
列の下流（つまり、３′末端）に有する： ５′ CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG 3′ 各々のカプチャープローブに共通の配列は結合パート
ナーの配列に相補的であり、従って、ハイブリダイゼー
ションの後、二本鎖は固相に固定することにより捕捉さ
れ得る。
各セットにおいてまた、各ラベルプローブはHCV配列
の相補的な配列に加えて、次の配列をHCV配列の下流に
有する： ５′ TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC 3′ EPO公開No.317,007に記載の方法が用いられる場合に
は、各ラベルプローブに共通の配列は、多量体（multim
er）の配列に相補的であり、該多量体とのハイブリッド
二本鎖の形成を可能とする。
上記セット中のプローブの配列を第19図に示す。
PCR増幅を用いたHCVポリヌクレオチド配列の検出 cPCRによるHCV RNAの増幅の一般化された方法におい
て、RNA鎖はビリオンまたはmRNA鎖であり、これは”セ
ンス”鎖である。しかし、中間体の複製型がまた、“ア
ンチセンス”であるとして検出されることも可能であ
る。この場合にはプライマーが”センス”である。標的
領域を含むRNAセンス鎖がアンチセンスプライマーとハ
イブリダイズし、このアンチセンスプライマーは、標的
を含む複製ストランドの合成をプライムする。RNA鋳型
に対するcDNAは、プライマーおよび鋳型依存性逆転写酵
素を用いて合成される。得られたRNA:cDNAハイブリッド
のcDNAは変性およびRNAseによる処理により放出され
る。プライマーはcDNAにアニールし、プライマーおよび
鋳型依存DNAポリメラーゼにより伸長する。生産物は変
性され、プライマーに再びアニールされ、２回目の合成
が続けられる。標的領域を含む増幅された生産物が所望
の量（これは少なくとも検知し得るレベルである）に達
するまで、何度も繰り返して行われる。
NANBHを有するチンパンジー由来の肝臓および血漿標品
におけるHCV核酸配列由来の増幅されたHCV核酸配列の検
出 NANBHを有するチンパンジーの肝臓および血漿に存在
し、コントロールのチンパンジーには存在しないHCV核
酸は、基本的にSaikiら（1986）に記載されたポリメラ
ーゼチェーンリアクションにより増幅された。プライマ
ーオリゴヌクレオチドは、クローン81（第22図）、また
はクローン36（第23図）およびクローン37b（第24図）
中のHCV cDNA配列に由来する。増幅された配列は、ゲル
電気泳動および改変されたサザンブロッティング法を用
いて決定された。この方法においては、２つのプライマ
ー間の配列であってプライマーを含まない配列により適
当なcDNAオリゴマーまたはニック翻訳されたcDNA配列を
プローブすることにより、決定された。
増幅システムにより調べられるHCV配列を含むRNAのサ
ンプルが、NANBHを有する３匹のチンパンジーおよび２
匹のコントロールのチンパンジーの肝臓生検材料から単
離された、polyA+ RNAフラクションの単離は、Maniatis
ら（1982）に記載のグアニジンチオシアネート法により
行われた。
増幅システムにより調べられたRNAのサンプルはま
た、NANBHを有する２匹のチンパンジーおよび一匹のコ
ントロールのチンパンジー、さらにコントロールのチン
パンジーの血漿のプールから単離された、一匹の感染し
たチンパンジーは106CID/ml以上のタイターを有し、も
う一匹の感染したチンパンジーは105CID/ml以上のタイ
ターを有していた。
核酸を血漿から次のように抽出した。0.1mlまたは0.0
1mlの血漿を、10μg/mlのポリアデニル酸を含むTENB/プ
ロテイナーゼK/SDS溶液（0.05MトリスHCl、pH8.0、0.00
1M EDTA、0.1M NaCl、1mg/mlプロテイナーゼＫ、および
0.5％SDS）で希釈して、最終容量を1.0mlとして、37℃
で60分間インキュベートした。このプロテイナーゼＫで
の消化の後、得られた血漿画分は、TE（10.0mMトリスHC
l、pH8.0、1mM EDTA）で飽和したフェノールにより抽出
することにより脱タンパクを行った。フェノール相を遠
心分離により分離し、0.1％SDSを含むTENBで再抽出し
た。各抽出物から得られた水相をプールし、等量のフェ
ノール／クロロホルム／ イソアミルアルコール［1:1
（99:1）］で抽出し、次いでクロロホルム／イソアミル
アルコールの99:1の混合物等量により２度抽出した。遠
心分離による相分離に続き、水相を酢酸ナトリウムが0.
2Mの濃度となるようにし、そしてエタノール２倍容量を
加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸はSW41ローター
を用い38Kで４℃にて60分間超遠心分離により回収し
た。
上記に加えて、高タイターのチンパンジー血漿および
プールされたコントロール血漿を、それぞれ、Chomcyzs
kiおよびSacchi（1987）の方法により50μｇのポリＡキ
ャリアを用いて抽出した。この方法においては、酸性グ
アニジンチオシアネート抽出（acid guanidinium thioc
yanate extraction）を用いる。RNAを、10.000RPMで４
℃にて10分間、エッペンドルフマイクロチューブにより
遠心分離することにより回収した。
２つの場合において、PCR反応にてcDNAの合成に先立
ち、プロテイナーゼK/SDS/フェノール法により血漿から
抽出された核酸は、さらに、ＳおよびS Elutip−Ｒカラ
ムに結合および溶出させることにより精製される。製造
者の指示による方法が、それに続いて行われる。
PCR反応に鋳型として用いられるcDNAは、上記のよう
にして調製された核酸（総核酸またはRNA）由来であ
る。エタノール沈澱に続き、沈澱した核酸を乾燥し、DE
PC処理された蒸留水に再懸濁する。核酸の２次構造を、
65℃で10分間加熱することにより破壊し、サンプルを直
ちに氷上で冷却した。チンパンジーの肝臓由来、または
10〜100μｌの血漿から抽出した核酸（またはRNA）由来
の、チンパンジーの総RNA1〜３μｇを用いて合成され
た。合成には逆転写酵素を用い、製造業者であるBRLに
より決めれたプロトコルにより25μｌで反応を行った。
cDNAの合成に用いたプライマーはまた、PCR反応に用い
たそれである。cDNA合成のためのすべての反応混合物
は、RNAaseインヒビター、RNASINTM（Fisher/Promega）
23単位を含有していた。cDNAの合成に続き、反応混合物
を水で希釈し、10分間煮沸し、そして、速やかに氷上で
冷却した。
PCR反応は、RNaseAを１μｇ加えたことを除いては、
基本的には製造業者であるCetus−Perkin−Elmerの指示
書に従って行った。反応は、最終容量100μｌで行っ
た。PCR反応は37℃（２分）,72℃（３分）および94℃
（１分）で35サイクル行った。
cDNA合成のためのプライマーおよびPCR反応のための
プライマーはクローン81、クローン36またはクローン37
bのHCVcDNA配列に由来していた。（クローン81、36およ
び37bのHCVcDNAの配列を、各々第22図、第23図および第
24図にそれぞれ示す。）クローン81由来の２種の16量体
の配列は次のとおりである。
５′ CAA TCA TAC CTG ACA G 3′ および ５′ GAT AAC CTC TGC CTG A 3′ クローン36由来のプライマーの配列は次のとおりであ
る： ５′ GCA TGT CAT GAT GTA T 3′ クローン37b由来のプライマーの配列は次のとおりで
ある： ５′ ACA ATA CGT GTG TCA C 3′ PCR反応において、プライマー対を、クローン81由来の
２つの16−mer、またはクローン36由来の16−merおよび
クローン37b由来の16−merから構成した。
PCR反応生産物を、アルカリゲル電気泳動法による生
産物の分離に次いで、サザンブロットおよびプライマー
に重複しないHCV cDNAの領域由来の32Pで標識された内
部オリゴヌクレオチドプローブで、増幅されたHCV−cDN
A配列を検出することによって、分析した。PCR反応混合
液を、フェノール／クロロホルムで抽出し、核酸を塩お
よびエタノールを用いて水溶相から沈澱させた。沈澱さ
せた核酸を、遠心分離によって収集し、蒸留水中に溶解
させた。サンプルの一部を、1.8％のアルカリアガロー
スゲル上で電気泳動にかけた。長さが60、108および161
のヌクレオチドの一本鎖DNAを、分子量マーカーとして
ゲル上で共電気泳動にかけた。電気泳動の後、ゲル中の
DNAを、Biorad Zeta Probem紙上に移した。プレハイブ
リダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、なら
びに洗浄条件は、製造業者（Biorad）によって規定され
たものであった。
増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼーション検
出に使用されたプローブは、以下の通りであった。一対
のPCRプライマーをクローン81から得たとき、プローブ
は、２つのプライマーの配列間の領域中に配置されてい
る配列に対応する配列を有する108−merであった。一対
のPCRプライマーをクローン36および37bから得たとき、
プローブは、そのヌクレオチド配列が図34に示されるク
ローン35由来のニックトランスレートされたHCV cDNAイ
ンサートであった。プライマーを、クローン37bインサ
ートのヌクレオチド155−170およびクローン36インサー
トのヌクレオチド206−268から得る。クローン35中のHC
V cDNAインサートの３′末端は、クローン36中のインサ
ートのヌクレオチド１−186に重複し、クローン35イン
サートの５′末端は、クローン37b中のインサートのヌ
クレオチド207−269に重複する。（図23、34および24を
比較すること）。従って、クローン35中のcDNAインサー
トは、クローン36および37b由来のプライマーの配列間
の領域の一部に延長し、これらのプライマーを含む増幅
された配列のプローブとして有用である。
肝臓検体からのRNAの分析は、プライマーおよびプロ
ーブの両方を使用して、上記の手法に従った。NANBHを
有する３匹のチンパンジーの肝臓からのRNAは、予想さ
れたサイズ（81および36および37bのそれぞれに対する1
61および586のヌクレオチド）の増幅配列に対して陽性
のハイブリダイゼーション結果を生み出したのに対し
て、対称群のチンパンジーは、陰性のハイブリダイゼー
ション結果を生み出した。実験を３回繰り返すと、同一
の結果が得られた。
核酸およびプラズマからのRNAの分析はまた、プライ
マーおよびクローン81からのプローブを使用して、上記
の手法に従った。プラズマは、NANBHを有する２匹のチ
ンパンジー、対称群のチンパンジおよび対称群のチンパ
ンジーからプールされたプラズマから得た。NANBHプラ
ズマの両方は、PCR増幅されたアッセイにおいて陽性の
結果を生み出したのに対して、対称群のプラズマの両方
は、陰性の結果を生み出した。これらの結果は、繰り返
して何度も得られた。
欠陥ウィルスは、RNAウィルス中に発生することが知
られている。PCR技術を使用することによって、HCVゲノ
ムの配列を増幅させるためにプライマーを設計すること
が可能である。増幅された生産物を分析することによっ
て、ウィルスゲノムの欠陥および野性型のウィルス種の
両方を同定することが可能であると予想される。従っ
て、既知のHCV配列に基づいて２つのプライマーを使用
すると、PCR生産物の予想サイズが正確に予想され得
る。ゲル電気泳動法およびハイブリダイゼーション分析
によって観察された大きな種はいずれも、潜在的に異型
のゲノムを示し得た。あるいは、このように観察された
小さな種のいずれもが、欠陥作用因を示し得た。これら
の型の分析は、それが本当に野生型ウィルス配列である
かまたは欠陥ゲノムであるか、既知のHCV配列の正確な
起源を確認するのに有用であり得る。これらの分析の技
術および方法は、当該技術分野において既知であり、前
述されている。この方法によって、当業者は、ウィルス
ゲノムの関連した（野生または欠陥）型を得ることが可
能となる。
PCRで増幅されたときにクローン81の由来のHCVcDNAと雑
種形成する、捕捉粒子の配列の検出 捕捉粒子のRNAは下記のようにして得た。クローン81
由来のHCVcDNAと雑種形成する配列の分析は、雑種形成
のプローブが、クローン81のcDNA配列由来のキナーゼ処
理を行ったオリゴヌクレオチドであることを除いて、先
に述べたのと同様のPCR増幅法を利用して実施した。試
験結果は、増幅された配列が、HCVcDNAプローブと雑種
形成したことを示している。
粒子は、クローン５−１−１にコードされているポリ
ペプチドに対する免疫精製抗体でコードされたポリスチ
レンビーズを用いて、HCVを感染させたチンパンジーの
血漿から捕捉された。免疫精製された抗体の製剤の製造
方法は、本願出願人が権利を有するヨーロッパ特許願公
開第318,216号に記載されているが、上記特許出願は本
願に援用するものとする。簡単に述べれば、クローン５
−１−１内にクローン化されたHVポリペプチドは、スー
パーオキシドジムスターゼ（SOD）によって融合ポリペ
プチドとして発現された。これは、クローン５−１−1c
DNA挿入断片を発現ベクターpSODcf1にサブクローン化す
ることによて行った（Steimer等の1986年の文献）。pSO
Dcf1から単離したDNAをBamIとEcoRIで処理し、これら制
限酵素によって生成した線状DNAに下記のリンカーを連
結させた。
５′ GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT
TTT AA 3′ クローン化した後、上記挿入断片を含有するプラスミ
ドを単離した。この挿入断片を含有するプラスミドをEc
oRIで切断した。クローン５−１−１中のHCVcDNA挿入断
片をRcoRIで切取り、上記のEcoRIで線状にしたDNAに連
結させた。得られたDNA混合物を用いて、イーコリ（E.C
oli）菌株D1210（Sadler等の1980年の文献）を形質転換
させた。ORFを発現するのに正しい配向の５−１−1cDNA
を有する組換え体を、制限地図を作成し、ヌウレオチド
の配列を決定することによって同定した。１つのクロー
ン由来の組換え体細菌を,IFTGの存在下、増殖させるこ
とによって、SOD−NANB5-1-1ポリペプチドを発現するよ
う誘導した。生成した融合ポリペプチドを、細胞抽出液
を尿素で分画抽出し次いでアニオン交換カラムとカチオ
ン交換カラムのクロマトグラフィを行うことによって、
組換え体イー・コリから精製した。精製されたSOD−NAN
B5-1-1ポリペプチドをニトロセルロース膜に結合させ
た。HCV感染血漿の試料中の抗体を、前記マトリックス
に結合させたオリペプチドに吸収させた。洗浄して、非
特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、結
合した抗体を結合したポリペプチドから放出させた。
NANBHを有する個体由来の肝臓と血清中のHCV RNAを検出
するcPCR法 HCVの感染を検出する、PCR検定法すなわちcPCR検定法
の改変法の信頼性と有用性を、感染個体由来の全肝臓RN
Aと血漿について検定することによって試験した。cPCR
検定法では、試料中の推定ウイルスRNAは、逆転写酵素
によってcDNAに逆転写され、得られたcDNAのセグメント
は、次ぎに、Saiki等の1986年の文献に記載されたPCR法
の改変法を利用して増幅される。。このcPCR法のプライ
マーは、HCV RNAから誘導され、本願発明で提供されるH
CVcDNAのファミリーいよって同定することができる。HC
V−RNAに対応する増幅生成物は本願発明のファミリー由
来で提供されるHCVcDNAのプローブを利用して検定され
る。
これらの試験に用いられるcPCR/HCV検定法は、次のよ
うな方法を使って行った。すなわち、RNAを製造し、得
られたRNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNAの特異的セ
グメントをPCRで増幅し、次いでPCR産生物を分析する方
法である。
RNAは、Maniatis等の1982年の文献に記載されてい
る、全RNAの製造法のグアニジウムイソシアネート法を
利用して肝臓から抽出した。
血漿から全RNAを単離するために、血漿をTENS［0.1M
NaCL、50mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDTA］で５倍〜1
0倍希釈し、プロティナーゼ、K/SDS溶液（0.5％のSDS、
1mg/mlのプロティナーゼ、20μg/mlのポリＡキャリア
ー）中で37℃にて60〜90分間インキュベートした。得ら
れた試料をフェノール（pH6.5）で１回抽出し、生成し
た有機相を、0.1％SDS含有TENSで１回再抽出し、両抽出
の水性相をプールして、同容積のフェノール／CHCl3／
イソアミルアルコール［1:1（99:1）］で２回抽出し
た。生成した水性相を同容積のCHCl3／イソアミルアル
コール（99:1）で２回抽出し、0.2M酢酸ナトリウム（pH
6.5）と2.5倍容積の100％エタノールを使用してエタノ
ール沈澱を行い、20℃で一夜沈澱させた。
PCR反応の鋳型として用いられるcDNAは、対応するcDN
Aを製造するための指定の試料を利用して製造した。各R
NA試料（２μｇの熱変性させた全チンパンジー肝臓RN
A、２μｌの血漿由来のRNAまたは10mm×4mmの円筒形の
ヒト肝臓生検品から抽出したRNAを100％含有している）
を、１μＭの各プライマー、1mMの各デオキシリボヌク
レオチド３リン酸（dNTP）,50mMトリス−HCl（pH8.3）,
5mM MgCl2、5mMジチオトレイトール（DTT）、73mM KC
l、40単位のRNアーゼ阻害剤（RNASiN）および５単位のA
MV逆転写酵素を含有する25μｌの反応物中でインキュベ
ートした。このインキュベーションは、37℃で60分間行
った。cDNAの合成に続いて、得られた反応混合物を、50
μｌの脱イオン水（DIW）で希釈し、10分間沸騰させて
から氷上で冷却した。
HCVcDNAのセグメント増幅は、２つの合成オリゴマー
すなわち、HCVcDNAクローン36（アンチセンスクロー
ン）と同クローン37b（センスクローン）由来の配列を
有する16マーのプライマーを利用して行った。
クローン36由来のプライマーの配列は、 ５′ GCA TGT CAT GAT GTA T 3′であり、 クローン37b由来のプライマーの配列は、 ５′ ACA ATA CGT GTG TCA C 3′であった。
これらのプライマーは、各々1mMの最終の濃度で使用
した。プライマーが隣接しているHCV cDNAのセグメント
を増幅するために、cDNA資料を、0.1μｇのRNアーゼＡ
と、Perkin Elmer Cetus PCR キット（N801−0043もし
くはN801−0055）のPCR反応物質とともに、このメーカ
ーの説明書に従って、インキュベートした。PCR反応
は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal cycler中で30サ
イクルまたは60サイクル行った。各サイクルは、94℃で
１分間の変性工程、37℃で２分間のアニール工程および
72℃で３分間の伸長工程で構成されている。しかし最終
サイクル（30もしくは60サイクル）は、３分間ではなく
で７分間に下。増幅後、試料を、同容積のフェノール：
クロロホルム（1:1）で抽出し、次に同容量のクロロホ
ルムで抽出し、得られた試料を0.2Mの酢酸ナトリウムを
含有するエタノールで沈澱させた。
CPCR生成物は次のようにして分析した。生成物を、Mu
rakawa等の1988年の文献に記載されている方法に従っ
て、1.8％のアルカリ性アガロースゲル上で電気泳動さ
せ、ゲルを0.4M NaOH中で一夜ブロットさせることによ
って、ゼータ（登録商標）プローブ紙（BioRad Corp.
社）に転移させた。得られたブロットを2XSSC（1XSSCは
0.15M NaClと0.015Mクエン酸ナトリウムを含有してい
る）で中和し、0.3M NaCl,15mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.8）,15mM EDTA, 1.0％ SDS,0.5％脱脂牛乳（Carn
ation Co.社）、および0.5mg/mlの音波処理を行った変
性サケ精子DNAを含有する液中で予備雑種形成を行っ
た。HCVcDNA断片について分析すべきブロットを、ヨー
ロッパ特許願公開第318,216号に記載されている。クロ
ーン35のHCV cDNA挿入断片配列のニックトランスレーシ
ョンによって作成した。32Pで標識を受けたプローブと
雑種形成させた。雑種形成を行った後、ブロットを0.1X
SSC（1XSSCは0.15MのNaClと0.01Mのクエン酸ナトリウム
を含有している）中で65℃にて洗浄し、乾燥し、オート
ラジオグラフにかけた。予想生成物の大きさは長さが58
6ヌクレオチドであり、プローブと雑種形成し、この大
きさの範囲でゲル中に移動する生成物は、ウィルスRNA
に対して陽性であった。
対照として、α−１抗トリプシンmRNAを増幅するよう
設計されたcPCRプライマーを、各被分析試料中にRNAが
存在することを確認するために用いた。α−１抗トリプ
シン遺伝子のコーディング領域は、Rosenberg等の1984
年の文献に記載されている。α−１抗トリプシン遺伝子
のコーディング領域の365ヌクレオチドの断片を増幅す
るように設計された合成オリゴマーの16マープライマー
は、ヌクレオチド22−37（センス）およびヌクレオチド
372〜387（アンチセンス）から誘導した。cDNA/PCRプラ
イマーの配列の間に存在してその配列を含有せず、ニッ
クトランスレーションを行い、32Pで標識をつけたプロ
ーブを用いて、PCR産生物を検出した。
PCR反応は高度に感受性なために、全試料について少
なくとも３回試験した。次のような注意、すなわち、
１）ゴム製０リング密閉具を備えた、ねじぶた付きチュ
ーブを用いてエーロゾルをなくし、２）使い捨てピスト
ン／キャピラリーを有するRanin Microman（登録商標）
容量ピペットでピペット採取し、および３）非隣接cDNA
クローンから、cDNAとPCRプライマーのオリゴヌクレオ
チド配列を選択することによって、すべての偽陽性がな
くなった。
cPCR法により肝サンプルのＣ型肝炎ウイルスHCV RNAの
検出 実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎因子に感染させたチ
ンパンジー３頭の肝臓及び、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝
炎と診断されたイタリア人患者の肝生検から分離した総
RNAのcPCR検定を実施した。
第25図Ａは、肝総RNAの各標本から１μｇを用いたcPC
R検定の結果を表している。このRNAは、非Ａ非Ｂウイル
ス性肝炎慢性期のチンパンジー１頭（910）（レーン
１）及び、感染急性期のチンパンジー２頭（1028及び50
8）（それぞれレーン２及び３）の肝サンプルから分離
したものである。30サイクル用レーン１−３のサンプル
についてPCRを実施し、これらのレーンを含むブロット
のオートラジオグラムを５時間暴露した。急性感染動物
1028（レーン４）及び非感染チンパンジー３頭（レーン
５−７）の総RNA 1μｇから得られたcDNAを60サイクル
用に増幅し、これらのレーンを含むオートラジオグラム
を７日間暴露した。32PラベルしたMspl−同化pBR322 DN
Aをオートラジオグラム全てのマーカーとして用いた。
結果からわかるように、HCV RNAに相当するcDNAは、急
性・慢性を問わず、非Ａ非Ｂウイルス性肝炎チンパンジ
ーのサンプルにのみ認められた（レーン１、３、４）。
これらのレーンにおけるcPCR産物は527から622ヌクレオ
チドまでのマーカーフラグメントを移動した（表示せ
ず）。
第25図Ｂは、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝炎患者15例の
10mm×4mmの肝生検シリンダーから抽出したRNAの10％を
使用して検定したcPCRの結果を表すもので（レーン１−
15）、１症例は細胞発生性肝疾患患者（レーン16），も
う１症例は慢性Ｂ型肝炎患者のコントロールサンプル
（レーン17）である。PCRによる増幅は30サイクル用と
し、ブロット用オートラジオグラムはレーン１の15時間
暴露を除き、４日間暴露した。結果からわかるように、
ヒトサンプルの9/15（60％）はHCV RNA陽性であった
（レーン1,2,4,6,7,10−13）。細胞発生性肝疾患と診断
された１症例（レーン16）及び慢性HBV感染患者１症例
（レーン17）はcPCR検定を繰り返しても陰性であった。
ヒト肝生検のHCV/cPCR検定とHCV C100−３ポリペプチド
を用いた血清のラジオイムノアッセイとの比較 SOD/HCV C100−３ポリペプチド（C100とも呼ぶ）は、
ウイルスのアミノ酸363個を含む組み換え型融合ポリペ
プチドである。本ペプチドはHCVに対する抗体の検出に
有用である（Kuoら（1989）参照）。C100の調製法はB.
P.O 318.216号公報に記述されている。
上記肝サンプルのHCV/cPCR検定を行った患者と同じ患
者17例から採取した血清について、C100を使用したラジ
オイムノアッセイを実施した。肝生検と同じ日に血清を
採取した。一般に所有され、参考文献によりここに組み
込まれているB.P.O 318,216号公報の記述に本質的に従
って検定した。簡潔に言うと、Microtiterプレート（Im
munol 2, Removeawell Strips）を0.1μｇの純粋なC100
でコーティングした。コーティングしたプレートを、血
清サンプル（1:100希釈液100μｌ）又は適切なコントロ
ールと共に37℃で１時間インキュベートした。インキュ
ベート後、非結合物質を除去し、このプレートを洗浄し
てから125Iラベルしたヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとイ
ンキュベートしてヒト抗体−C100複合体を検出した。結
合していないラベルした抗体を吸引で除去し、プレート
を洗浄した。ウェルごとの放射能を測定した。
イムノラジオアッセイの結果から、これらのサンプル
の67パーセントが抗C100抗体陽性であった。細胞発生性
肝疾患と診断された患者の血清は抗C100抗体陽性であっ
たが、本症例の肝サンプル中のウイルスRNAレベルは検
出不可能であった。抗C100抗体の存在とHCV RNAとの相
関水準は70％であった。ラジオイムノアッセイで抗体陰
性であった症例の肝HCV RNAレベルは有意であった（デ
ータは示さず）。
循環性抗C100抗体を有する患者の肝臓には往々にして
ウイルスが存在していることをこの結果は示しており、
抗C100抗体の存在がHCV被曝を正確に表すことが確証に
より明白である。さらに、これらを組み合わせると、本
研究の症例では、このタイプのHCVが非Ａ非Ｂウイルス
性肝炎の少なくとも75％の原因であり、イタリアで優勢
のHCV菌株が合衆国で流行するHCV菌株と密接な関係があ
ると考えられる。
血清のHCV/cPCR検定：チンパンジーに置ける急性期感染
症のウイルスRNAの検出 肝障害の発症、HCV RNAの存在、抗HCV抗体の存在との
間の一般的な関係を、実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎
を感染させたチンパンジー２頭の血清でモニターした
（No.771及び910）。alanine amino transferase（AL
T）レベルにより肝障害を測定し、また上述のHCV cPCR
検定でHCV RNAの存在を決定し、さらに抗HCV抗体はC100
ラジオイムノアッセイを用いて検出した。
チンパンジーの血漿１μｇから抽出したRNAのHCV/cPC
R分析を実施した。注射後25、32、70、88日にチンパン
ジー771から血清を採取し、30サイクル用cPCRを実施し
てオートラジオグラムを18日間暴露した。注射後11、2
8、67日にチンパンジー910から血清を採取し、60サイク
ル用cPCRを実施してオートラジオグラムを５日間暴露し
た。
アッセイの結果は、チンパンジー771は、図26Aに、そ
してチンパンジー910については図26Bに示している。図
26Aと図26Bとの比較から、急性肝炎間の初期のよく特徴
づけられたALT値は、感染した個体中のウイルスRNAの存
在に相関するようである。
データは、HCVのRNAの存在をも示唆しており、そのこ
とは抗HCV抗体の存在に先立つウイルス血症の状態を示
している。チンパンジー771（図26A）は、28日目に輸血
後のNANBHのはっきり特徴づけられた急性の症状を示
す。これは、ALTレベルの初期のピークに特徴的であ
る。HCVのRNAは、25日目および32日目に集められた血清
中に検出された。しかしながら、この急性の時期に、抗
HCV抗体は、存在しない。反対に、70日目のHCVのRNA
は、実験で検出するレベルを下回っていた。そして抗HC
V抗体は上昇していた。88日目に、HCVのRNAは検出され
ないままで、一方抗HCV抗体は、70日目の値より有為に
上昇していた。
チンパンジー910の血清から得られた結果は、パター
ンとだいたい同様であったが、感染によって誘導された
HCV抗体の時間は、疾病の急性の時期では検出されず、
少なくとも67日目まで伸びた。11日目にRIAによって検
出された抗HCV抗体は、動物の接種に用いたプラズマ由
来の抗体で個体910を受動免疫したことによった。抗HCV
抗体は、感染の後期の慢性期のチンパンジー910の血清
に見いだされた（データは示さない）。
慢性のNANBHにかかっている個体由来のプラズマ中の
低いALT値は、必ずしも弱いウイルスの生産と相関して
いるわけではない。接種後２年から３年および１年半に
わたって、チンパンジー910から取った17の異なるプラ
ズマ試料のプールのALTレベルおよびHCVのRNAをモニタ
ーした。試料のALT値は45mU/mlを越えず、力価研究は、
HCVの高いタイターを示した（３×106CID/ml）。cPCR
は、30サイクル行い、そしてオートラジオグラムを15時
間でとった。cPCR分析で、ウイルスRNAの存在がはっき
りと示された（データは示していない）。
血清のHCV/cPCRアッセイ：ヒトの急性期の感染でのウイ
ルスRNAの発見 早期の急性NANBHの間収集された人の外科患者からの
血清が、それぞれHCV/cRNAアッセイおよびC100−RIAを
利用して、HCV RNAおよび抗HCV抗体を試験した。
HCV/cPCRアッセイは、その患者からの１マイクロリッ
ターの血漿を用いて行われ、そして、知られた血統の４
人から行われた。cPCRは13回行われ、そして、ハイブリ
ダーゼーションと洗浄の後、オートラジオグラムが８時
間暴露された。
感染の急性期の間、外科患者から収集された血清は高
い値のウイルスRVAを含み、そして抗−HCV抗体はC100−
RIAによって検出されなかった結果を示した（データは
現在示されない）。（外科患者からの急性期の血漿は、
NANBH感染試薬の高い力価を有していることが知られ
た。［106.5CID/ml、フェインストーン（Feinstone）ら
により決定された（1981）；フェインストーン（Feinst
one）ら（1981）。しかしながら、この患者は感染後ほ
ぼ９カ月、C100/RIAにより抗HCV抗体にセロ変換された
ことは注意すべきである。
人制御血漿の血統からの血清は、HCV/cPCRアッセイと
C100−RIAに対してともに否定的であった。
HCV/cPCRアッセイの感度 HCV/cPCRアッセイの感度は、既知の力価の血清の10倍
連続希釈の分析によって決定された。チンパンジーの血
漿は〜３×105CIDの力価を持っていた。そしてRNAはそ
の血漿１マイクロリッターの10倍希釈から抽出された。
cPCRは30回なされた。そしてハイブリダイゼーションと
洗浄の後、オートラジオグラムが15時間暴露された。30
0、30および３倍のHCVのCIDゲノム増幅から得られたcPC
R生成物は、図29のコース１〜３に示す。
コース１と２は２時間暴露されたオートグラムに検知
されたものである。
感染されたHCVの力価の平均は、ほぼ100と10,000 CID
/ml血清の間であるので、このデータはHCV/cPCRアッセ
イは臨床的に有用であると思われる。
種々のHCV株のためのHCV/cPCRアッセイ オリゴマー44−merのセットとオリゴマー45−merのセ
ットからなるプライマーはHCV株を増幅するために設計
された。その株は図18の中のcDNA配列が導かれているHC
Vから分離されたHCVに類似または同一である。
これらのプライマーの設計の土台となる前提は、我々
の発見であり、HCVはフラビのような（Flavi−like）ウ
イルスである。
フラビウイルス科ファミリーのメンバーは、HCVと比
較されるとき、二つの主に保存されたアミノ酸配列セッ
トを有する。それはTATPPGとQRRGRであり、これらのウ
イルスのNS3の中にある。他の少量のセットのいくつか
は、例えば、推定上のNS5領域中のGDOである。他のセッ
トは既知のアミノ酸配列のHCVとの比較によって決定さ
れる。この情報はいくつかのフラビウイルス科のメンバ
ーの配列から推論される。そのフラビウイルス科は、日
本エンサイクロペデア ウイルス（Sumiyoshiら（198
7））、Yellow Fever Virus（Riceら（1985））、Dengu
e Type 2 Virus（Macknow（1987））、およびWest Nile
Virus（Castleら（1986））らによって開示されてい
る。変換されたアミノ酸配列とコドン利用はすぐ次の表
にある。
注：プライマー配列の３′末端におけるヌクレオチド縮
退性の数を最低限にし、上記に示した保存されたアミノ
酸をコードする可能なヌクレオチド配列またはその相補
体のいずれかに、正確に適合する、それぞれのプライマ
ーの３′末端におけるヌクレオチド数を最高にするよう
に、プライマー配列を選択した。
44−merおよび45−merのオリゴマープライマーは、こ
れらのアミノ酸をコードした配列がプライマー内に組み
込まれるように明示された。さらに、それらは、それぞ
れのプライマーの３′末端における縮退を含有し、クロ
ーン40b（図28参照）に存在し、HCVの推定NS3をコード
する領域から誘導されるHCVゲノムの異なった２つの領
域から誘導される。組になったオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列式は、ＸがA,T,GまたはＣの時、 ５′ GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC
GCC ACC CCX CC 3′ であり、ＹがＴまたはＣの時 ５′ TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT
GCC CCG ACT YTG 3′ である。
HCV/cPCRアッセイが、チンパンジー910プラスマにお
けるHCV RNAを増幅するために、これらのプライマーを
用いて実施された。アッセイ方法は、オリゴマープライ
マーの44−merおよび45−merの組が、クローン36および
クローン37bより誘導されたプライマーに代換される以
外は、本質的に前述部分で説明した通りである。加え
て、増幅されたHCV cDNAの検出がクローン40aから誘導
されたプローブとのハイブリッド形式によって行われ、
その配列は図32に示されている。
該プローブは、前述のPCR法を用いて、クローン40aの
セグメントを増幅することによって準備され、18−mer
のプライマーは以下の配列を含有していた。
５′ GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3′ と ５′ GAG CGT GAT TGT CTC AAT 3′ 増幅の後、プローブの準備はニックトランスレーション
により32Pで標識された。
図33は、クローン40aから誘導された配列でプローブ
されたサザーンブロットの放射線写真を示している。32
Pで標識されたMspl消化pBR322 DNAの断片がマーカーと
して使われた（レーン１）。これらのプライマーを用い
て増幅した結果のPCR産物の予想される大きさは、490ヌ
クレオチド（nt）である。複製反応がレーン２および３
に示されている。
HCVの５′領域における変形の分析 フラヴィウイルスモデルに基づいて、クローンag30a
およびk9−１に標本された領域に隣接する５′領域のHC
V cDNAは、推定容器および またはマトリックスプロテ
インのセグメントをコードする（E/M）。「ｃ」ライブ
ラリーが構成されるチンパンジーから得た血清が、この
標的領域に変形が存在するか否かを判断するためにHCV/
cPCRによって分析された。
HCV/cPCRアッセイが、クローン５′−32の単離に対し
て、使用されるプライマーとプローブ以外は、前述と本
質的には同様に行われる。図37は、プライマーおよびプ
ローブ（およびその誘導されたクローン）の関係とHCV
cDNAの標的領域の関係とを示している。PCRプライマー
の１組である、ag30a16AおよびK91Env16Bは、クローンa
g30aおよびk9−１から誘導されたが、これらはそれぞれ
標的配列の上流および下流にある。ag30a16AおよびK91E
nv16BによりプライムされたcPCR産物の期待される大き
さは、HCV cDNAの確認された配列に基づいて1.145kbで
ある。ag30a16AおよびK91Env16Bを用いて増幅された領
域におよび、互いに重複しているPCRプライマーの他の
２組もまた、血清中のHCV RNAのPCR増幅のために用いら
れる。このように、この場合には、プライマーag30a16A
およびCA156e16Bを１つの組として、プライマーCA156e1
6Aおよびk91Env16Bをもう１つの組として用いることに
よって、PCR反応が起こされる。これらの組に対する予
測されるPCR産物の大きさは、それぞれ615ヌクレオチド
（NT）および683ヌクレオチドであった。この直後の表
は、プライマーおよびそれが誘導されたクローンおよび
プライマー配列を記載している。
すべてのHCV/cPCR産物のためのプローブが、クローン21
6（CA216a16Aおよび216a16Bをプライマーとして用い
て）およびクローン84（CA84a16AおよびCA84a16Bをプラ
イマーとして用いて）の領域をPCR増幅して準備され
た、HCV cDNAの32Pで標識された部分から成り、32Pはニ
ックトランスレーションによりPCR産物に導入された。
これらのプローブは、HCV/cPCR反応に用いられたプライ
マーには重複しなかった。
図38は、HCV/cPCR産物が32Pで標識されたプローブと
ハイブリッド形成されたサザーンブロットの放射線写真
を示している。プライマーag30a16AおよびK91Env16B
（レーン１）から伸びたHCV/cPCR産物は、約1.1Kbであ
った。15時間放射の間に、他のPCR産物は観察されなか
った。プライマーの組ag30a15A/CA156e16B（レーン２）
およびCA156e16A/K91Env16B（レーン３）から伸びたHCV
産物は、それぞれ約625NTおよび約700NTであった。PCR
産物の大きさは、MsplでのpBR322の消化およびHaeIIIで
消化されたPhix174の消化の結果としての相対的な断片
移動に比較して決定される（レーン５）。
上記の研究は、約20NTから50NTの小ささの挿入または
欠失、および標的DNAの大きさを変化させるDNAの再配列
を検出する。図38の結果により、チンパンジー血清内の
HCVのE/M領域から誘導されたcDNAの唯一の主要種が存在
することが確信できる。
フラヴィウイルスゲノム配列の保存された領域から誘導
されたプライマーおよびPCRを使用したHCV cDNA配列の
クローニングのための増幅 HCVがフラヴィ状のウイルスであるという我々の発見
により、PCR技術を用いての、特徴づけされていないHCV
cDNA配列のクローニングのための戦略、およびフラヴ
ィウイルスにおいて保存されたアミノ酸配列をコードす
る領域から誘導されたプライマーが可能になる。一般
に、プライマーの１つが、定義されたHCVゲノム配列か
ら誘導され、そして配列されていないHCVポリヌクレオ
チドの領域に隣接する他のプライマーが、フラヴィウイ
ルスゲノムの保存された領域から誘導される。フラヴィ
ウイルスゲノムは、NS1およびフラヴィウイルスゲノム
の５′末端にコードされたＥポリペプチドに保存された
配列を包含することは公知である。このように、HCVゲ
ノムの推定比較領域から誘導されたcDNA配列を単離する
ためには、これらのフラヴィウイルスポリペプチドに保
存された配列から誘導された上流プライマーが明示され
る。下流プライマーは、HCV cDNAの公知の上流末端から
誘導される。
コードの変性のため、フラヴィウイルスプローブおよ
び対応するHCVゲノム配列の間に適合間違いが起こり得
る。ゆえに、Lee（1988）によって説明されているもの
に類似した戦略が用いられる。Leeの手順は、アミノ酸
配列の逆トランスレーション産物に相補的な混合オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いる。混合プライマー内の
配列は、保存されたアミノ酸配列のそれぞれのコドン変
性を考慮に入れている。
３組のプライマー混合物が、デング熱−2,4（Ｄ−2,
4）、日本脳炎ウイルス（JEV）、黄熱病（YF）およびウ
エストナイルウイルス（WN）を含むいくつかのフラヴィ
ウイルス内に見られるアミノ酸同族に基づいて発生させ
られる。最上流に保存された配列（５′−１）から誘導
されるプライマー混合物は、アミノ酸配列gly−trp−gl
yに基づいており、これは、Ｄ−２、JEV、YFおよびWNの
Ｅプロテインに見られる保存された配列asp−arg−gly
−trp−gly−aspNの一部である。その次のプライマー混
合物（５′−２）は、Ｅプロテイン内の下流に保存され
た配列phe−asp−gly−asp−ser−tyr−ileu−phe−gly
−asp−ser−tyr−ileuに基づいており、phe−gly−asp
から誘導される。保存された配列はＤ−２、JEV、YFお
よびWNに存在する。三番目のプライマー混合物（５′−
３）は、アミノ酸配列arg−ser−cysに基づいており、
これは、Ｄ−２、Ｄ−４、JEV、YFおよびWNのNSIプロテ
インに保存された配列cys−cys−arg−ser−cysの一部
である。５′−３の混合物を形成する個別のプライマー
は図53に示されている。保存された領域から誘導された
変性配列に加えて、それぞれの混合物内のそれぞれのプ
ライマーは、酵素、HindIII、Mbol、およびEcoRIを制限
するためにコードする配列位置を含有する、５′末端に
おいて不変領域をも包含する。
下流プライマー、ssc5h20A、は、クローン14i及び11b
の配列とオーバーラップする配列を有するHCV cDNAを含
有し、クローン5h中のヌクレオチド配列から誘導され
る。ssc5h20Aの配列は、 ５′ GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3′である。
これに代わるプライマー、ssc5h34A、も使用され得る。
このプライマーは、クローン5h中の配列から誘導され
る。そしてさらに制限定酵素部位をつくるヌクレオチド
を５′末端に持ち、そのためクローン化を促している。
この配列ssc5h34Aは、 ５′ GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA CTC
A 3′である。
はじめにSaikiらによって開示された（1986）PCR反応
は、cDNAのためのテンプレートがHCVに感染したチンパ
ンジーの肝臓から分離されたRNAである点、またはHCVに
感染したチンパンジーの血清から分離されたウィルス粒
子から成る点を除いて、Leeらに開示された（1988）よ
うに、本質的に行われた。さらに、HVC配列にアニーリ
ングするプライマーの一部は、ヌクレオチドが９しかな
く、そしてミスマッチし得るので、アニーリング条件は
増幅の一回目において緩和されている（0.6M NaCl,25
℃）。さらに、もし、ssc5h34Aが使用されるならば、HC
Vゲノムから誘導されていない付加的な配列は、プライ
マー−テンプレートハイブリッドを不安定にする傾向が
ある。一回目の増幅の後、アニーリング条件はより厳し
くなり得る（0.066M NaCl,32℃−37℃）。なぜなら増幅
された配列は、このときプライマーと相補的にまたは重
複する領域を持っているからである。加えて、増幅のは
じめの10サイクルは、Klenow酵素Ｉと共に、その酵素に
適したPCR条件の下で行われる。これらのサイクルが終
了すると、サンプルは抽出され、Kit方向に沿って、Cet
us/Perkin−Elmerにより供給されるように、Taqポリメ
ラーゼと共に使用される。
増幅の後、増幅されたHVC cDNA配列は、クローン5hか
ら誘導されるプローブを使用して交雑されることによ
り、検知される。このプロブは、プライマーを誘導する
ために使用される配列の上方の配列から誘導され、プラ
イマーを誘導したクローン5hの配列とオーバーラップし
ない。このプローブの配列は、 ５′ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC
GGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT G
GC GC 3′である。
産業上の利益 ここの記載される方法、オリゴマー、HCV cDNAから誘
導されたプローブとプライマーの両方、そしてそれらを
含むkitsは、正確で、比較的簡単で、経済的に、生物学
的なサンプル中、（さらに詳細には、輸血に使用され得
る血液、及びHCV感染を持つ疑いのある人の中に）HCVが
存在することを決定するために有用である。さらにま
た、これらの方法とオリゴマーは、再結合HCVポリペプ
チドの使用に基づく免疫学的分析法よりも早い段階での
HCV感染を検知するために有用である。また、増幅され
たポリヌクレオチド交雑分析法は、抗HCV抗体を持たな
い場合のサンプルにおいてHCV RNAを検知する。このよ
うにして、ここで記述されたプローブとプライマーは、
HCV、及び血液を含むHCV感染された生物学的検体による
感染を一層完全に同定するためにHCVポリペプチドに基
づく免疫学的を利用して、増幅交雑分析法に使用され得
る。
ここで提供される情報により、HCVゲノムの保持領域
から誘導されたプライマーそして／またはプローブが明
示できる。これらのプライマーとプローブを提供するこ
とで、種々のHCV株を検知し且つ血液と血液製剤をスク
リーニングする際に使用される一般的な方法が利用可能
になる。
もし、この方法で使用されるプライマーが、HCVゲノ
ンの保持領域から誘導されると、この方法は種々のHCV
株の検知そして／または同定に有用である。これは、換
言すると、HCVの検知と分析のさらなる免疫学的な試薬
の開発、及びHCVの検知そして／または処理のためのさ
らなるポリヌクレオチド試薬の開発を可能にする。
加えて、Flaviviruses及びHCVの保持されたアミノ酸
配列から示されたプライマー及びプローブの組は、これ
らの感染性薬剤の万能な検知法を与える。
以下に挙げられた素材は、American Type Culture Co
llection（ATCC）,12301 Parklawn Dr.,Rockville,Mary
land 20852、のブダペスト条約に関して寄託されてお
り、以下の符号数字が付与されている。lambda-gtll ATCC No. 寄託日 HCV cDNA library 40394 1 Dec.1987 clone 81 40388 17Nov.1987 clone 91 40389 17Nov.1987 clone 1−２ 40390 17Nov.1987 clone 5−１−１ 40391 18Nov.1987 clone 12f 40514 10Nov.1988 clone 35f 40511 10Nov.1988 clone 15e 40513 10Nov.1988 clone K9−１ 40512 10Nov.1988 JSC 308 20879 5May 1988 ps356 67683 29April 1988 さらに、以下の寄託が1989年５月11日になされた。株 リンカー ATCC No. D1210 （Cf1/5−１−１） EF 67967 D1210 （Cf1/81） EF 67968 D1210 （Cf1/CA74a） EF 67969 D1210 （Cf1/35f） AB 67970 D1210 （Cf1/279a） EF 67971 D1210 （Cf1/C36） CD 67972 D1210 （Cf1/13i） AB 67973 D1210 （Cf1/C33b） EF 67974 D1210 （Cf1/CA290a） AB 67975 HB101 （AB24/C100 ＃3R） 67976 以下の株D1210は、1989年５月３日に寄託された。誘導株 ATCC No. pCF1CS/CBf 67956 pCF1AB/C12f 67952 pCF1EF/14c 67949 pCF1EF/15e 67954 pCF1AB/C25c 67958 pCF1EF/C33c 67953 pCF1EF/C33f 67050 pCF1CD/33g 67951 pCF1CD/C39c 67955 pCF1EF/C40b 67957 pCF1EF/CA167b 67959 以下の株は、1989年５月12日に寄託された。株 ATTC No. Lambda gt11（C35） 40603 Lambda gt10（beta−5a） 406023 D1210（C40b） 67980 D1210（M16） 67981 以下の生物学的素材は、1990年３月23日に寄託され
た。材料 ATTC No. ５′−clone32（in pUC18S） 68276
フロントページの続き (72)発明者 クオ，ジョージ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94112 サンフランシスコ，シックスス アベニュー 1370 (72)発明者 ハン，ジャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549 ラファイエット，デル マール 3238 (72)発明者 アーディア，マイケル エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94501 アラモ，バンス ミドウ ロー ド 100 (72)発明者 ワイナー，エミイ ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611 オークランド，インディアン ウェイ 1766

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のポリヌクレオ
    チドを検出するための、少なくとも15個のヌクレオチド
    の連続する配列を含むポリヌクレオチドプローブであっ
    て、 （ａ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、該HCVのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、
    それによって該HCVのポリヌクレオチドの検出が可能と
    なり；そして、 （ｂ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、以下に示すヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖か
    ら得られる、 ポリヌクレオチドプローブ： −341 GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCCACCATGAA CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTACTT。
  2. 【請求項２】標識された、請求項１に記載のポリヌクレ
    オチドプローブ。
  3. 【請求項３】請求項１または２に記載のポリヌクレオチ
    ドプローブを、適当な容器中に含む、プローブアッセイ
    キット。
  4. 【請求項４】サンプル中のHCVのポリヌクレオチドを検
    出するためのプローブアッセイであって、以下の工程： （ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプロ
    ーブを、該ポリヌクレオチドプローブと相補的なHCVの
    ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせる条
    件下で、該サンプルと接触させて、ポリヌクレオチド二
    本鎖を形成させる工程；および （ｂ）該ポリヌクレオチド二本鎖を検出する工程、 を包含する、アッセイ。
  5. 【請求項５】HCVのポリヌクレオチドを増幅するための
    一対のPCRプライマーであって、該一対のPCRプライマー
    が、それぞれ独立して、少なくとも15個のヌクレオチド
    の連続する配列を含み、ここで （ａ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、該HCVのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、
    それによって該HCVのポリヌクレオチドの増幅が可能と
    なり；そして、 （ｂ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、以下に示すヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖か
    ら得られる、 一対のPCRプライマー： −341 GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCCACCATGAA CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTACTT。
  6. 【請求項６】少なくとも一方のPCRプライマーが標識さ
    れた、請求項５に記載の一対のPCRプライマー。
  7. 【請求項７】請求項５または６に記載の一対のPCRプラ
    イマーを適当な容器中に含む、PCRアッセイキット。
  8. 【請求項８】サンプル中のHCVのポリヌクレオチドを増
    幅し検出するためのPCRアッセイであって、以下の工
    程： （ａ）請求項５または６に記載の一対のPCRプライマー
    から開始されるポリメラーゼチェイン反応で、HCVのポ
    リヌクレオチドを増幅する工程；および （ｂ）該増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程、 を包含する、PCRアッセイ。
  9. 【請求項９】HCVのポリヌクレオチドを検出するための
    ポリヌクレオチドプローブを調製する方法であって： 少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列を含むポ
    リヌクレオチドを合成する工程、ここで （ａ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、該HCVのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、
    それによって該HCVのポリヌクレオチドの検出が可能と
    なり；そして、 （ｂ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、以下に示すヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖か
    ら得られる、 を包含する方法： −341 GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCCACCATGAA CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTACTT。
  10. 【請求項１０】HCVのポリヌクレオチドを増幅するため
    の一対のPCRプライマーを調製する方法であって： 独立して、少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配
    列を含む２つのポリヌクレオチドを合成する工程、ここ
    で （ａ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、該HCVのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、
    それによって該HCVのポリヌクレオチドの増幅が可能と
    なり；そして、 （ｂ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    が、以下に示すヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖か
    ら得られる、 を包含する方法： −341 GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCCACCATGAA CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTACTT。
  11. 【請求項１１】請求項９または10に記載の方法であっ
    て、ここで、前記少なくとも15個のヌクレオチドの連続
    する配列を含むポリヌクレオチドが： （ａ）該少なくとも15個のヌクレオチドの連続する配列
    を含むポリヌクレオチドを提供すること； （ｂ）該ポリヌクレオチドを使用して組換えDNAベクタ
    ーを調製すること； （ｃ）該ベクターで宿主細胞を形質転換すること； （ｄ）該ベクターが複製し得る条件下で、該宿主細胞を
    インキュベートすること； （ｅ）該宿主細胞から該複製されたベクターを単離する
    こと；および （ｆ）該複製されたベクターから該ポリヌクレオチドを
    単離すること、により合成される、方法。
  12. 【請求項１２】前記ポリヌクレオチドが化学的に合成さ
    れる、請求項９または10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記サンプルが血液サンプル由来の核酸
    である請求項４に記載のプローブアッセイであって、 （ｃ）前記工程（ｂ）において二本鎖が検出されなかっ
    た血液を蓄える工程、をさらに包含するプローブアッセ
    イ。
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