ES2288969T3

ES2288969T3 - Inmunoensayos para anticuerpos anti-hcv.

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Publication number: ES2288969T3
Application number: ES01952156T
Authority: ES
Inventors: David Y. Chien; Phillip Arcangel; Laura Tandeske; Carlos George-Nasciemento; Doris Coit; Angelica Medina-Selby
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2021-06-14
Also published as: AU2001272945A1; JP2011125350A; CN1214244C; BRPI0111731C1; JP2004506878A; BRPI0111731B8; EP1350105A2; DE60125240T2; BR0111731A; CN1660913A; BRPI0111731B1; US6797809B2; US20020146685A1; WO2001096875A2; PL213363B1; US20040063092A1; US7241879B2; SK17772002A3; EP1354204A2; CZ304185B6

Abstract

Un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo NS3/4a y/o dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccionan de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV, y en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

Description

Inmunoensayos para anticuerpos anti-HCV.

Campo técnico

La presente invención concierne en general al diagnóstico vírico. En particular, la invención se refiere a inmunoensayos que usan múltiples antígenos de HCV, para diagnosticar con precisión una infección producida por el virus de la hepatitis C.

Antecedentes de la invención

El Virus de la Hepatitis C (HCV) es la principal causa de hepatitis parenteral no A, no B (NANBH) que se transmite mayormente a través de la transfusión de sangre corporal y del intercambio de fluidos corporales. El virus está presente en del 0,4% al 2% de la población general de los Estados Unidos. La hepatitis crónica se desarrolla en aproximadamente el 50% de las infecciones y de ellas, aproximadamente el 20% de los individuos infectados desarrolla una cirrosis hepática que a veces da lugar a un carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, el estudio y el control de esta enfermedad son de importancia médica.

El HCV fue identificado y caracterizado por primera vez por Hougthen y col. como causante de la NANBH. Se conoce la secuencia del genoma vírico del HCV así como los métodos para obtener la secuencia. Véanse, p. ej., las Publicaciones Internacionales, documentos WO 89/04669; WO 90/11089 y WO 90/14436. El HCV posee un genoma de RNA monocatenario, de 9,5 kb y de sentido positivo, y es miembro de la familia de virus Flaviridiae. Se han identificado al menos seis genotipos distintos, aunque relacionados, de HCV, partiendo de análisis filogenéticos (Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). El virus codifica una única poliproteína que tiene más de 3.000 residuos de aminoácidos (Choo y col., Science (1989) 244:359-362); Choo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). La poliproteína experimenta un procesamiento co-traduccional y post-traduccional dando lugar a proteínas estructurales y proteínas no estructurales (NS) (del inglés, " Non-Structural proteins").

En concreto, como se muestra en la Figura 1, el HCV codifica varias proteínas. El orden y la nomenclatura de los productos de escisión de la poliproteína de HCV es el siguiente: NH_{2}-C-El-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOOH. La escisión inicial de la poliproteína la catalizan proteasas del hospedador que liberan tres proteínas estructurales, la proteína N-terminal de la nucleocápsida (denominada "c" (del inglés, "core")) y dos glicoproteínas de la envoltura, "El" (también conocida como E) y "E2" (también conocida como E2/NS1), así como proteínas no estructurales (NS) que contienen las enzimas víricas. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b. NS2 es una proteína integral de membrana con actividad proteolítica. NS2, ya sea sola o en combinación con NS3, escinde el enlace "sissle" NS2-NS3 lo que a su vez genera la terminación N de NS3 y libera una poliproteína de gran tamaño que incluye las actividades de serina-proteasa y RNA-helicasa. La proteasa NS3 se usa para procesar lo que queda de la poliproteína. La finalización de la maduración de la poliproteína se inicia con la escisión autocatalítica de la unión NS3-NS4a catalizada por la serina-proteasa de NS3. Las posteriores escisiones de la poliproteína de HCV, mediadas por NS3, parece que implican el reconocimiento de los enlaces a escindir de la poliproteína por acción de una molécula NS3 de otro polipéptido. En estas reacciones, NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a), NS4b y NS5a (NS5A contiene una función de fosforilación) y una RNA-polimerasa dependiente de RNA (NS5b).

Se han descrito diversos polipéptidos generales y polipéptidos específicos, útiles como reactivos inmunológicos y de diagnóstico para el HCV, derivados de la poliproteína del HCV. Véanse Houghton y col., Publicaciones europeas Núms. 318.216 y 388.232; Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kuo y col., Science (1989) 244:362-364; Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39); Chien y col., Publicación internacional, documento WO 93/00365; Chien y col., Publicación internacional, documento WO 94/01778. Estas publicaciones proporcionan unos extensos antecedentes sobre el HCV en general, así como sobre la fabricación y usos de reactivos inmunológicos basados en los polipéptidos de HCV.

Métodos sensibles y específicos para realizar escrutinios e identificar portadores del HCV y sangre o productos derivados de la sangre contaminados por HCV, proporcionarían un avance importante en medicina. La hepatitis post-transfusional (PTH) sobreviene en aproximadamente el 10% de los pacientes transfundidos y el HCV ha sido el responsable de hasta el 90% de estos casos. La atención a los pacientes así como la prevención y la transmisión del HCV por la sangre y por productos derivados de la sangre, o por contacto personal cercano, requieren herramientas fiables de diagnóstico y pronóstico. Por consiguiente, se han desarrollado varios ensayos para el serodiagnóstico de la infección producida por HCV. Véase, p. ej., Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kuo y col., Science (1989) 244:362-364; Choo y col., Br. Med. Buli. (1990) 46:423-441; Ebeling y col., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel y col., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel y col., Lancet (1991) 337:317-319; Chien D.Y., Publicación internacional, documento WO 94/01778; Valenzuela y col., Publicación internacional, documento WO 97/44469; y Kashiwakuma y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.871.904.

Un problema importante encontrado con algunos ensayos realizados en suero es que existe un espacio de tiempo importante entre la infección y la detección del virus, que frecuentemente excede de 80 días. Este espacio de tiempo en relación con el ensayo puede crear un gran riesgo para los receptores de transfusiones de sangre. Para solucionar este problema, se han desarrollado ensayos basados en ácidos nucleicos (NAT) (del inglés, " Nucleic Acid-based Test") que detectan directamente el RNA vírico, y ensayos con antígenos de la nucleocápsida del HCV que analizan el antígeno vírico en lugar de la respuesta de los anticuerpos. Véase, p. ej., Kashiwakuma y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.871.904.

Sin embargo, siguen haciendo falta herramientas de diagnóstico y pronóstico precisas con el fin de proporcionar una atención adecuada a los pacientes, así como de prevenir la transmisión del HCV por la sangre o por productos derivados de la sangre o por contacto personal cercano.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de que el uso de epítopos conformacionales NS3/4a, en combinación con antígenos de fusión de múltiples epítopos, proporciona un método sensible y fiable para detectar una seroconversión temprana por HCV. Los ensayos que aquí se describen detectan también la infección por HCV causada por cualquiera de los seis genotipos de HCV conocidos. El uso de proteínas de fusión de múltiples epítopos presenta también las ventajas añadidas de disminuir los problemas de enmascaramiento, mejorar la sensibilidad de la detección de los anticuerpos al permitir la presencia de un número mayor de epítopos sobre un área unitaria de sustrato, y mejorar la selectividad.

Por consiguiente, en una de las realizaciones, la presente invención se dirige a un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo NS3/4a y/o dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccionan de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

El epítopo NS3/4a puede comprender la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia del 90% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores, con la condición de que la secuencia posea actividad de proteasa. En algunas realizaciones, el epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D.

En realizaciones adicionales, el antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia del 90% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores, con la condición de que la secuencia reaccione de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV. En algunas realizaciones, el antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

En otra realización más, la presente invención se dirige a un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella y que posee actividad de proteasa, y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella y que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV. En algunas realizaciones, el epítopo conformacional NS3/4a de HCV y el antígeno de fusión de múltiples epítopos tienen una identidad de secuencia de al menos el 90%, el 98% (o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores) con respecto a las secuencias de aminoácidos de las Figuras 3A-3D y de las Figuras 5A-5F respectivamente, con la condición de que la secuencia de NS3/4a posea actividad de proteasa y el antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccione de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV. En algunas realizaciones, el epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, y el antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

En otra realización, la invención se dirige a un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

En otra realización más, la invención se dirige a un método para detectar una infección por el virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un soporte sólido para inmunoensayo según se ha descrito en lo que antecede;

(b) mezclar una muestra biológica con dicho soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos contra HCV, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse a dicho epítopo NS3/4a y/o a dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos para formar un primer inmunocomplejo;

(c) añadir al soporte sólido de la etapa (b), en condiciones formadoras de complejos, un anticuerpo marcado de manera detectable, en el que dicho anticuerpo marcado es reactivo con dicho inmunocomplejo;

(d) detectar los segundos inmunocomplejos formados entre el anticuerpo marcado de manera detectable y el primer inmunocomplejo, en caso de que existan, como indicativos de una infección por HCV en la muestra biológica.

(a) proporcionar un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F;

En otra realización, la invención se dirige a un kit para ensayo inmunodiagnóstico que comprende un soporte sólido para inmunoensayo según se ha descrito en lo que antecede, e instrucciones para llevar a cabo el ensayo inmunodiagnóstico.

En otra realización, la presente invención se dirige a un método para producir un soporte sólido para inmunoensayo, que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido; y

(b) unir al soporte sólido al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, en el que dicho epítopo NS3/4a y/o dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccionan de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

En algunas realizaciones, el epítopo conformacional comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia del 90% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores, con la condición de que la secuencia posea actividad de proteasa; y el antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia del 90% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores, con la condición de que la secuencia reaccione de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

En otra realización más, el epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D y el antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

En otra realización, la invención se dirige a un método para producir un soporte sólido para inmunoensayo, que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido; y

(b) unir al soporte sólido al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

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En otra realización más, la presente invención se dirige a un antígeno de fusión de múltiples epítopos que comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, o con una identidad de secuencia del 90% con respecto a ella, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 98% con respecto a ella, o de cualquier valor de número entero comprendido entre esos valores, secuencia que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

En algunas realizaciones, el antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

En otras realizaciones, la invención se dirige a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el antígeno de fusión de múltiples epítopos, un vector recombinante que comprende el polinucleótido y elementos de control operativamente ligados a dicho polinucleótido por medio de los cuales la secuencia codificadora puede ser transcrita y traducida en una célula hospedadora, una célula hospedadora transformada con el vector recombinante y un método para producir un antígeno recombinante de fusión de múltiples epítopos que comprende proporcionar una población de células hospedadoras como las anteriormente mencionadas y cultivar dicha población de células en condiciones en las que se expresa el antígeno de fusión de múltiples epítopos codificado por la secuencia codificadora presente en dicho vector recombinante.

Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes con referencia a la descripción detallada que viene a continuación y a los dibujos que se adjuntan.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación diagramática del genoma del HCV, que representa las diferentes regiones de la poliproteína de la que derivan los reactivos analíticos de la presente invención (proteínas y anticuerpos).

La Figura 2 es un dibujo esquemático de un inmunoensayo representativo según la invención.

Las Figuras de 3A a 3D representan el DNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un antígeno conformacional NS3/4a representativo, para usar en los presentes ensayos. Los aminoácidos de las posiciones 403 y 404 de las Figuras de 3A a 3D representan sustituciones de Thr por Pro y de Ser por Ile en la secuencia de aminoácidos natural del HCV-1.

La Figura 4 es una representación diagramática de MEFA 7.1.

Las Figuras 5A-5F representan el DNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos de MEFA 7.1.

Las Figuras 6A-6C muestran los MEFA representativos para usar con los inmunoensayos de los que trata la presente invención. La Figura 6A es una representación diagramática de MEFA 3. La Figura 6B es una representación diagramática de MEFA 5. La Figura 6C es una representación diagramática de MEFA 6.

Las Figuras 7A-7D son diagramas de la construcción de psMEFA7.

La Figura 8 es un diagrama de la construcción de psMEFA7.1.

La Figura 9 es un diagrama de la construcción de pd.HCV1a.ns3ns4aPl.

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Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención utilizará, salvo que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e inmunología, que forman parte de la experiencia en la técnica. Estos métodos se encuentran explicados de manera más completa en la bibliografía. Véanse, p. ej., Fundamental Virology, 2ª edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, redactores); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, redactores, Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1.993); A.L., Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook y col., Molecular Clonning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1.989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, redactores, Academic Press, Inc.).

Debe de señalarse que, según se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que se adjuntan, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen a los referentes plurales salvo que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más antígenos, etc.

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Las siguientes abreviaturas de los aminoácidos se utilizan a lo largo del texto:

Alanina: Ala (A): Arginina: Arg (R)

Aspararagina: Asn (N): Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C): Glutamina: Gln (Q)

Ácido glutámico: Glu (E): Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H): Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L): Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M): Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P): Serina: Ser (S)

Threonina: Thr (T): Triptófano: Trp (W)

Tyrosina: Tyr (Y): Valina: Val (V)

I. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se utilizarán los siguientes términos y expresiones y se pretende que queden definidos como se indica a continuación.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y polipéptidos y proteínas similares, están incluidos en esta definición. Tanto las proteínas de longitud completa como sus fragmentos están contenidos en esta definición. Estos términos también incluyen modificaciones producidas con posterioridad a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y modificaciones similares. Además, para los fines de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), con respecto a la secuencia natural, siempre y cuando esa proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, como las producidas mediante mutagénesis dirigida a sitios específicos, o pueden ser accidentales, como las originadas por mutaciones en los hospedadores que producen las proteínas, o por errores debidos a la amplificación por PCR.

Un polipéptido de HCV es un polipéptido, según se ha definido en lo que antecede, derivado de la poliproteína de HCV. No es necesario que el polipéptido derive físicamente de HCV sino que se puede producir mediante técnicas de síntesis o técnicas recombinantes. Además, el polipéptido puede derivar de cualquiera de las diferentes cepas y muestras aisladas de HCV, tales como, pero sin limitarse a ellas, cualquiera de las muestras aisladas procedentes de las cepas 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 de HCV. Se conocen diversas regiones conservadas y regiones variables entre estas cepas y, en general, las secuencias de aminoácidos de epítopos derivados de estas regiones presentarán un alto grado de homología entre las secuencias, p. ej., una homología entre las secuencias de aminoácidos de más del 30%, preferiblemente, de más del 40%, cuando las dos secuencias están alineadas. Así, por ejemplo, la expresión polipéptido "NS3/4a" se refiere a un NS3/4a natural procedente de cualquiera de las diferentes cepas de HCV, así como también a análogos, muteínas y fragmentos inmunogénicos de NS3/4a, según se definen más adelante. Se conocen los genotipos completos de muchas de estas cepas. Véase, p. ej., la Patente de EE. UU. Núm. 6.150.087 y los números de registro de GenBank AJ238800 y AJ238799.

Los términos "análogo" y "muteína" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, o fragmentos de esos derivados, que conservan la actividad deseada, tal como la inmunorreactividad en los ensayos que aquí se describen. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que poseen una secuencia polipeptídica y una estructura naturales con una o más adiciones, sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) y/o deleciones de aminoácidos, con respecto a la molécula natural, siempre y cuando esas modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica. El término "muteína" se refiere a péptidos que contienen uno o más componentes peptidomiméticos ("peptoides"), tales como los descritos en la Publicación internacional, documento WO 91/04282. Preferiblemente, el análogo o la muteína poseen al menos la misma inmunorreactividad que la molécula natural. En le técnica se conocen métodos para elaborar análogos y muteínas de polipéptidos y se describen más adelante.

Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que guardan relación en sus cadenas laterales. De manera específica, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) aminoácidos ácidos: aspartato y glutamato; (2) aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) aminoácidos sin carga polar: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptófano y tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, se puede predecir razonablemente que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por otro aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta un máximo de aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o incluso hasta un máximo de 15-20 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o cualquier valor de un número entero entre 5-25, con la condición de que la función deseada de la molécula permanezca intacta. Un experto en la técnica puede determinar con facilidad regiones de la molécula de interés que son capaces de tolerar un cambio tomando como referencia los gráficos de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, muy conocidos en la técnica.

Por "fragmento" se quiere indicar un polipéptido que consiste en solamente una parte de la secuencia y la estructura intactas del polipéptido de longitud completa. Ese fragmento puede incluir una deleción C-terminal y/o una deleción N-terminal del polipéptido natural. Un "fragmento inmunogénico" de una proteína de HCV concreta generalmente incluirá al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa y muy preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, que definen un epítopo, o un número entero cualquiera comprendido entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, con la condición de que el fragmento en cuestión conserve la inmunorreactividad en los ensayos que aquí se describen. Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos preferidos incluyen, pero no se limitan a ellos, fragmentos de la nucleocápsida del HCV, que comprenden, p. ej., los aminoácidos 10-45, 10-53, 67-88 y 120-130 de la poliproteína, el epítopo 5-1-1 (de la región NS4a/Ns4b del genoma vírico), así como epítopos definidos, derivados de cualquiera de las regiones de la poliproteína mostrada en la Figura 1, tal como, pero sin limitarse a ellas, las regiones El, E2, NS3 (p. ej., el polipéptido c33c procedente de la región NS3), la región NS4 (p. ej., el polipéptido c100 procedente de las regiones NS3/NS4) y las regiones NS3/4a y NS5 de la poliproteína de HCV, así como cualquiera de los demás epítopos diferentes identificados en la poliproteína de HCV. Véase, p. ej., Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39); Chien y col., Publicación internacional, documento WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicación internacional, documento WO 94/01778; Patentes de EE. UU. Núms. 6.150.087 y 6.121.020.

El término "epítopo", según aquí se utiliza, se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente de 3 a 5 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente de 5 a 10 ó 15 aminoácidos, y de no más de aproximadamente 1.000. aminoácidos (o de un número entero cualquiera de aminoácidos de entre los mencionados), que define una secuencia que por sí misma, o como parte de una secuencia más grande, se une a un anticuerpo generado en respuesta a esa secuencia. No existe límite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender cerca de la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epítopos de la poliproteína de HCV. Un epítopo para usar en le presente invención no se limita a un polipéptido que tenga la secuencia exacta de la porción de la proteína de origen de la que el epítopo deriva. De hecho, los genomas víricos están en un estado de constante cambio y contienen varios dominios variables que exhiben grados de variabilidad relativamente altos entre las muestras aisladas. Así pues el término, "epítopo" incluye secuencias idénticas a la secuencia natural, así como también modificaciones de la secuencia natural tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa).

Se pueden identificar regiones de un polipéptido determinado que incluyen un epítopo, usando cualquiera de los diversos métodos de mapeo de epítopos, muy conocidas en la técnica. Véase p. ej., Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, redactor, 1.996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar epítopos lineales, p. ej., sintetizando al mismo tiempo grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, péptidos que corresponden a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos se encuentran todavía unidos a los soportes. Esos métodos son muy conocidos en la técnica y se encuentran descritos, p. ej., en la Patente de EE. UU. Núm. 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Usando estas técnicas, se han identificado varios epítopos de HCV. Véanse, p. ej., Chien y col., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) págs. 320-324, y citas mencionadas más adelante. De manera similar, se identifican fácilmente epítopos conformacionales determinando la conformación espacial de los aminoácidos, como por ejemplo, mediante cristalografía por rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase p. ej., Epitope Mapping Protocols, supra. También se pueden identificar regiones antigénicas de proteínas usando gráficos estándar de antigenicidad e hidropatía, tales como los calculados usando, p. ej., el programa de soporte lógico Omiga version 1.0, disponible procedente de Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método de Hopp/Woods, Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte y col., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para determinar los gráficos de hidropatía.

Según aquí se utiliza, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a una porción de una proteína de longitud completa, o a uno de sus análogos o a una de sus muteínas, que tiene características estructurales naturales en relación con la secuencia de aminoácidos que codifica el epítopo dentro de la proteína natural de longitud completa. Las características estructurales naturales incluyen, pero no se limitan a ellas, la glicosilación y la estructura tridimiensional. La longitud de la secuencia que define un epítopo puede estar sometida a grandes variaciones ya que se piensa que estos epítopos se forman debido a la forma tridimensional del antígeno (p. ej., al plegamiento). Por lo tanto, los aminoácidos que definen el epítopo pueden ser relativamente escasos en número, pero pueden estar muy dispersados a lo largo de la molécula, siendo colocados en la conformación correcta del epítopo a través del plegamiento. Las porciones del antígeno situadas entre los residuos que definen el epítopo, pueden no ser críticas para la estructura conformacional del epítopo. Por ejemplo, la deleción o sustitución de estas secuencias interpuestas puede no afectar al epítopo conformacional siempre y cuando las secuencias críticas para la conformación del epítopo se mantengan (p. ej., las cisteínas implicadas en la formación de enlaces disulfuro, los sitios de glicosilación, etc.).

Los epítopos conformacionales presentes en la región NS3/4a se identifican fácilmente usando los métodos anteriormente comentados. Además, la presencia o ausencia de un epítopo conformacional en un polipéptido concreto, puede determinarse fácilmente sometiendo a escrutinio al antígeno de interés con un anticuerpo (un suero policlonal o un anticuerpo monoclonal dirigido contra el epítopo conformacional) y comparando su reactividad con la de una versión desnaturalizada del antígeno que conserve únicamente epítopos lineales (en caso de conservarlos). En ese escrutinio en el que se usan anticuerpos policlonales, puede ser ventajoso absorber el suero policlonal primero con el antígeno desnaturalizado y observar si retiene anticuerpos dirigidos contra el antígeno de interés. De manera adicional, en el caso de NS3/4a, molécula que conserva la conformación natural, éste también tendrá las actividades enzimáticas de proteasa y, opcionalmente, de helicasa. Esas actividades se pueden detectar usando ensayos enzimáticos, como los que se describen más adelante.

Preferiblemente, un epítopo conformacional se produce por medio de técnicas recombinantes y es expresado en una célula de la que se puede extraer en condiciones que mantienen sus características estructurales deseadas, p. ej. sin que se produzca la desnaturalización del epítopo. Esas células incluyen bacterias, levaduras, células de insectos y células de mamíferos. La expresión y el aislamiento de epítopos conformacionales recombinantes procedentes de la poliproteína de HCV se encuentran descritos p. ej., en las Publicaciones internacionales, documentos WC 96/04301, WC 94/01778, WC 95/33053, WC 92/08734. Como alternativa, es posible expresar los antígenos y renaturalizar después la proteína una vez recuperada. Es también sabido que la síntesis química puede también proporcionar mimotopos conformacionales de antígenos que dan reacciones cruzadas con el epítopo conformacional del antígeno "natural".

La expresión "antígeno de fusión de múltiples epítopos" o "MEFA", según aquí se utiliza, quiere indicar un polipéptido en el que múltiples antígenos de HCV forman parte de una cadena de aminoácidos única y continua, cadena que no se encuentra presente en la naturaleza. Los antígenos de HCV pueden estar unidos directamente entre sí a través de enlaces peptídicos o pueden estar separados por secuencias de aminoácidos interpuestas. Los antígenos de fusión pueden contener también secuencias exógenas en relación con la poliproteína de HCV. Además, las presentes secuencias de HCV pueden proceder de múltiples genotipos y/o muestras aisladas de HCV. Ejemplos de MEFA particulares para usar en los presentes inmunoensayos se encuentran detallados, p. ej., en la Publicación internacional, documento WO 97/44469, y se describe más adelante.

Un "anticuerpo" quiere indicar una molécula que, a través de medios químicos o físicos, se une específicamente a un polipéptido de interés. Así, por ejemplo, un anticuerpo de la nucleocápsida de HCV es una molécula que se une específicamente a la proteína de la nucleocápsida de HCV. El término "anticuerpo", según aquí se utiliza, incluye anticuerpos obtenidos a partir de preparaciones policlonales y de preparaciones monoclonales, así como también los siguientes anticuerpos: moléculas híbridas (quiméricas) de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Winter y col. (1991) Nature 349:293-299; y la Patente de EE. UU. Núm. 4.816.567); los fragmentos F(ab')_{2} y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, véanse, por ejemplo, Inbar y col. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; y Ehrlich y col. (1980) Biochem. 19:4091-4096); moléculas Fv monocatenarias (sFv) (del inglés, " single-chain Fv " (véase, por ejemplo, Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); construcciones diméricas y triméricas de fragmentos de anticuerpos; minianticuerpos (véanse, p. ej., Pack y col. (1992) Biochem. 31:1579-1584; Cumber y col. (1992) J. Immunology 149B:120-126); moléculas de anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan y col. (1988) Science 239:1534-1536; y la Publicación de Patente de U. K., documento GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1.994); y cualquiera de los fragmentos funcionales obtenidos a partir de estas moléculas, en el que estos fragmentos conservan las propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo de origen.

Según aquí se utiliza, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que contiene una población homogénea de anticuerpos. Esta expresión no está limitada con respecto a la especie o a la procedencia del anticuerpo, ni se pretende que esté limitada por la manera en la que el anticuerpo se prepara. Por lo tanto, esta expresión incluye anticuerpos obtenidos de hibridomas murinos, así como anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos en lugar de hibridomas murinos. Véase, p. ej., Cote y col. Monclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, pág. 77.

Por "aislado" se da a entender, cuando se hace referencia a un polipéptido, que la molécula indicada es una molécula separada y discreta procedente del organismo completo en el que la molécula se encuentra en la naturaleza, o que la molécula está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido, indica una molécula de ácido nucleico desprovista, en su totalidad o en parte, de las secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o indica una secuencia igual a la que existe en la naturaleza pero que contiene secuencias heterólogas asociadas con ella; o indica una molécula desligada del cromosoma.

Por "determinante antigénico equivalente" se quiere indicar un determinante antigénico procedente de diferentes subespecies o cepas de HCV, tales como de las cepas 1, 2 ó 3 de HCV. Más concretamente, se conocen epítopos, como el 5-1-1, y esos epítopos varían entre las cepas 1, 2 y 3. Así pues, los epítopos 5-1-1 de estas tres cepas diferentes son determinantes antigénicos equivalentes y por lo tanto son "copias" aunque sus secuencias no sean idénticas. Por lo general, las secuencias de aminoácidos de determinantes antigénicos equivalentes tendrán un alto grado de homología de las secuencias, p. ej., una homología de las secuencias de aminoácidos de más del 30%, preferiblemente de más del 40%, cuando las dos secuencias están alineadas.

"Homología" se refiere a la similitud en tanto por ciento entre dos polinucleótidos o entre dos restos polipeptídicos. Dos DNA, o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente homólogas" una con respecto a la otra cuando las secuencias exhiben una similitud de las secuencias de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente de al menos aproximadamente el 80%-85%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 90% y muy preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%-98%, a lo largo de una longitud definida de esas moléculas. Según aquí se utiliza, sustancialmente homólogas se refiere también a secuencias que muestran una identidad completa con respecto al DNA especificado o a la secuencia polipeptídica especificada.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o de aminoácido con aminoácido de dos polinucleótidos o de dos secuencias polipeptídicas respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información sobre las secuencias entre las dos moléculas, alineando sus secuencias, contando el número exacto de coincidencias existentes entre esas dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.

Se pueden usar programas informáticos fáciles de conseguir que ayudan en el análisis de la homología o identidad, tales como el programa ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O. Dayhoff, redactor, Supl. 5, 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981, para el análisis de péptidos. Programas para determinar la homología entre secuencias de nucleótidos se encuentran disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible procedente de Genetics Computer Group, Madison, WI), por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas son fáciles de utilizar con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package, anteriormente mencionado. Por ejemplo, el porcentaje de homología de una secuencia de nucleótidos concreta, con respecto a una secuencia de referencia, se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuaciones por defecto y una penalización por salto de seis posiciones de nucleótidos.

Otro método para establecer el porcentaje de homología en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete de programas de MPSRCH, registrado como propiedad por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). En esta serie de programas se puede utilizar el algoritmo de Smith-Waterman en el que se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, puntuación 12 de penalización por apertura de salto, puntuación 1 de penalización por la extensión de salto y puntuación 6 por salto). A partir de los datos generados, el valor de "Coincidencias" refleja la "homología de las secuencias". En la técnica se conocen de manera general otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es el programa BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, se pueden utilizar BLASTN y BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; valor de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cqibin/BLAST.

Como alternativa, la homología se puede determinar mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones en las que se forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específica de cadenas sencillas, y de determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones de rigurosidad, según se definen para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas forma parte de la experiencia en la técnica. Véanse, p. ej., Sambrook y col., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de un DNA) y se traduce (en el caso de un mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando está situada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de iniciación en la terminación 5' (amino) y por un codón de terminación de la traducción en la terminación 3' (carboxi). Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada en 3' con respecto a la secuencia codificadora.

"Operativamente ligado" se refiere a una ordenación de elementos en la que los componentes así descritos están configurados de manera que realicen la función que se desea que tengan. Así, un promotor determinado operativamente ligado a una secuencia codificadora es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora cuando están presentes factores de transcripción, etc. apropiados. El promotor no necesita ser contiguo a la secuencia codificadora siempre y cuando actúe dirigiendo su expresión. Así, por ejemplo, puede haber secuencias interpuestas, no traducidas aunque sí transcritas, entre la secuencia del promotor y la secuencia codificadora, lo mismo que pueden haber intrones transcritos, y la secuencia del promotor aún así se considera "operativamente ligada" a la secuencia codificadora.

"Recombinante" según aquí se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, un cDNA, un polinucleótido de origen vírico, semisintético o sintético, que en virtud de su origen o de su manipulación, no está asociado con la totalidad o con una porción del polinucleótido con el que se encuentra asociado en la naturaleza. El término "recombinante", según se utiliza con respecto a una proteína o a un polipéptido, significa un polipéptido producido mediante expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y después se expresa en organismos transformados, según se describe más adelante. El organismo hospedador expresa el gen extraño para producir la proteína en condiciones adecuadas para la expresión.

Un "elemento de control" se refiere a una secuencia polinucleotídica que ayuda en la expresión de una secuencia codificadora a la que está unida. Esta expresión incluye promotores, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, señales de poliadenilación, regiones que no se traducen que incluyen las 5'-UTR y las 3'-UTR y, cuando proceda, secuencias conductoras y secuencias estimuladoras de la transcripción, que de manera colectiva hacen posible la transcripción y la traducción de una secuencia codificadora en una célula hospedadora.

Un "promotor" según aquí se utiliza, es una región de DNA reguladora, capaz de unirse a la RNA-polimerasa en una célula hospedadora y de iniciar la transcripción de una secuencia codificadora en dirección aguas abajo (dirección 3'), operativamente ligada a ella. Para los fines de la presente invención, una secuencia de promotor incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de un gen de interés a niveles detectables sobre el fondo. Dentro de la secuencia del promotor hay un sitio de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso), responsables de la unión de la RNA-polimerasa. Los promotores de eucariotas con frecuencia contendrán, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".

Una secuencia de control "dirige la transcripción" de una secuencia codificadora en una célula, cuando la RNA-polimerasa se une a la secuencia del promotor y transcribe la secuencia codificadora dando lugar a un mRNA que después es traducido dando lugar al polipéptido codificado por la secuencia codificadora.

"Casete de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia(s) de interés o del gen(es) de interés. La casete de expresión incluye elementos de control, como los anteriormente descritos, tales como un promotor que está operativamente ligado a (de manera que dirige la transcripción de) la secuencia(s) de interés o el gen(es) de interés, y suele incluir también una secuencia de poliadenilación. En algunas realizaciones de la invención la casete de expresión aquí descrita, puede estar contenida dentro de una construcción plasmídica. Además de los componentes de la casete de expresión, la construcción plasmídica puede también incluir uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite que la construcción plasmídica exista en forma de un DNA monocatenario (p. ej., un origen de replicación de M13), al menos un sitio de clonación múltiple, y un origen de replicación en "mamíferos" (p. ej., un origen de replicación de SV40 o de adenovirus).

"Transformación" según aquí se utiliza, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, independientemente del método usado para la inserción: por ejemplo, transformación mediante incorporación directa, transfección, infección y métodos similares. Para una mayor información sobre métodos de trasnfección particulares, véase más adelante. El polinucleótido exógeno se puede mantener en forma de un vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o como alternativa, se puede integrar en el genoma hospedador.

Una "célula hospedadora" es una célula que ha sido transformada o que es capaz de ser transformada por una secuencia de DNA exógena.

Según aquí se utiliza, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de un tejido o de un fluido, aislada procedente de un sujeto, que comúnmente incluye anticuerpos producidos por ese sujeto. Muestras típicas que incluyen esos anticuerpos son conocidas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a ellas, sangre, plasma, suero, heces, orina, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, linfa, muestras de piel, secreciones de la piel, del aparato respiratorio, secreciones intestinales y del aparato genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, material procedente de biopsias y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro que incluyen, pero que no se limitan a ellos, medios acondicionados resultantes del crecimiento de células y tejidos en un medio de cultivo, p. ej., células recombinantes y componentes celulares.

"Soporte sólido común" quiere indicar una matriz sólida individual a la que los polipéptidos de HCV usados en los inmunoensayos de la presente invención, se unen covalentemente o se unen por medios no covalentes tales como por adsorción hidrófoba.

"Inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

"Inmunocomplejo" quiere indicar la combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epítopo presente sobre un antígeno.

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Según aquí se utiliza el término "marcador" y la expresión "marcador detectable" se refieren a una molécula que puede ser detectada e incluyen, pero no se limitan a ellos, isótopos radiactivos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, cromóforos, colorantes, iones metálicos, dispersiones coloidales de metales, ligandos, (p. ej., biotina, avidina, estreptavidina o haptenos) y compuestos similares. La expresión "compuesto fluorescente" se refiere a una sustancia o a una porción de esas sustancia que es capaz de exhibir fluorescencia en el rango detectable. Ejemplos particulares de marcadores que se pueden usar con la invención, incluyen, pero no se limitan a ellos, peroxidasa de rábano (HRP) (del inglés, " Horse Radish Peroxidase"), fluoresceína, FITC, rodamina, dansilo, umbeliferona, éster de dimetil-acridinio (DMAE), rojo Texas, luminol, NADPH y \alpha-\beta-galactosidasa.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención con detalle, se debe saber que esta invención no se limita a formulaciones particulares o a parámetros de procedimiento particulares y, como tal, puede desde luego variar. También se debe saber que la terminología aquí utilizada tiene como fin describir únicamente realizaciones concretas de la invención y no pretende ser limitativa.

Aunque varias composiciones y varios métodos similares o equivalentes a los aquí descritos se pueden usar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos son los que aquí se describen.

Según se ha indicado en lo que antecede, la presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos métodos de diagnóstico para detectar con precisión una infección temprana producida por HCV. Los métodos se basan en la identificación y uso de antígenos de HCV altamente inmunogénicos, que están presentes durante las etapas tempranas de la seroconversión producida por HCV, aumentando así la precisión de la detección y disminuyendo la incidencia de resultados falsos. En particular, los inmunoensayos que aquí se describen utilizan epítopos conformacionales altamente inmunogénicos derivados de la región NS3/4a de la poliproteína de HCV y antígenos de fusión de múltiples epítopos que comprenden diferentes polipéptidos de HCV, ya sean procedentes del mismo genotipo o de la misma muestra aislada de HCV o ya sean procedentes de genotipos y muestras aisladas de HCV diferentes, tal como los epítopos inmunodominantes múltiples, por ejemplo, los epítopos lineales principales de la nucleocápsida de HCV, secuencias El, E2, NS3, 5-1-1, c100-3 y NS5. Los métodos se pueden poner en práctica cómodamente en un ensayo único, usando cualquiera de los diferentes formatos analíticos i anteriormente descritos tales como, pero sin limitarse a ellos, los formatos analíticos que utilizan un soporte sólido al que se unen los antígenos de HCV.

Se ha descrito la región NS3/4a de la poliproteína de HCV y la secuencia de aminoácidos y la estructura global de la proteína han sido divulgadas en, p. ej., Yao y col., Structure (Noviembre de 1.999) 7:1353-1363; Sali y col., Biochem. (1998) 37:3392-3401; y Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Véase también, Dasmahapatra y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.843.752. Los inmunoensayos de la presente invención utilizan al menos uno de los epítopos conformacionales derivados de la región NS3/4a que existe en la conformación que se encuentra en la partícula de HCV presente en la naturaleza o en su producto infectivo, según se evidencia por la conservación de las actividades enzimáticas de proteasa y, opcionalmente, de helicasa, normalmente presentadas por el producto del gen de NS3/4a, y/o por la inmunorreactividad del antígeno con anticuerpos presentes en una muestra biológica procedente de un sujeto infectado por HCV, y por una pérdida de la inmunorreactividad de los epítopos después de desnaturalizado el antígeno. Por ejemplo, el epítopo conformacional se puede romper por acción de calor, cambiando el pH a un pH extremadamente ácido o básico, o añadiendo desnaturalizantes orgánicos conocidos, tales como ditiotreitol (DTT) o un detergente apropiado. Véase, p. ej., Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Harris y S. Angal, redactores, IRL Press) y el producto desnaturalizado se puede comparar con el producto que no se ha tratado de la manera anteriormente explicada.

La actividad de proteasa y la actividad de helicasa se pueden determinar utilizando ensayos enzimáticos estándar muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de proteasa se puede determinar usando el procedimiento que se describe más adelante en los ejemplos, así como usando ensayos muy conocidos en la técnica. Véase., p. ej., Takeshita y col., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi y col., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali y col., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Cho y col., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani y col., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang y col., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi y col., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler y col., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; y Kim y col., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. De manera similar, los ensayos de la actividad de helicasa son muy conocidos en la técnica y la actividad de helicasa de un epítopo NS3/4a se puede determinar usando, por ejemplo, un ensayo de ELISA, según se describe, p. ej., en Hsu y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; un sistema analítico de centelleo por proximidad según se describe en Kyono y col., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126; ensayos de escrutinio de alta capacidad de procesamiento según se describen en, p. ej., Hicham y col., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 y Kwong y col., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; así como otros métodos analíticos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Khu y col., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama y col., Virology (2000) 273:316-324; Paolini y col., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat y col., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat y col., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; y Hesson y col., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.

La longitud del antígeno es suficiente para mantener un epítopo conformacional inmunorreactivo. Muchas veces, el polipéptido que contiene el antígeno usado, será casi de longitud completa, aunque sin embargo, el polipéptido puede también estar truncado, por ejemplo, para aumentar su solubilidad o para mejorar su secreción. Generalmente, el epítopo conformacional encontrado en NS3/4a se expresa en forma de un polipéptido recombinante en una célula y este polipéptido proporciona el epítopo en la forma deseada, según se describe con detalle más adelante.

Una secuencia de aminoácidos representativa del polipéptido NS3/4a se muestra en las Figuras de 3A a 3D. La secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 2-686 de la figura, corresponde a las posiciones 1.027-1.711 de la secuencia de aminoácidos HCV-1. Un codón de iniciación (ATG) que codifica Met, se muestra en la posición 1. Además, la Thr que normalmente se encuentra en la posición 1.428 de HCV-1 (posición 403 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 3) está mutada a Pro, y la Ser que normalmente se encuentra en la posición 1.429 de HCV-1 (posición 404 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 3) está mutada a Ile. Sin embargo, la secuencia natural con o sin una Met N-terminal, o el análogo representado con o sin la Met N-terminal, u otros análogos o fragmentos, se pueden usar en los ensayos de la presente la invención, siempre que el epítopo se produzca usando un método que mantenga o restablezca su conformación natural de manera que la actividad de proteasa, y opcionalmente, la actividad de helicasa se conserva. Dasmahapatra y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.843.752 y Zhang y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.990.276, describen análogos de NS3/4a.

La proteasa NS3 de NS3/4a se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.027-1.207, numeradas con respecto a HCV-1 (véase, Choo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455), posiciones 2-182 de la Figura 3. Se conoce la estructura de la proteasa NS3 y de su centro activo. Véase, p. ej., De Francesco y col., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch y col., Biochemistry (2001) 40:631-640. Los cambios realizados en la secuencia natural que normalmente serán tolerados son aquellos cambios efectuados fuera del centro activo de la molécula. En particular, es conveniente mantener los aminoácidos 1-155 ó 2-155 de la Figura 3 con pocas sustituciones o con solamente sustituciones conservativas. Los aminoácidos que se encuentren más allá de la posición 155, tolerarán cambios mayores. Además, si se usan fragmentos de la secuencia de NS3/4a que se encuentra en la Figura 3, estos fragmentos generalmente incluirán al menos los aminoácidos 1-155 ó 2-155, preferiblemente los aminoácidos 1-175 ó 2-175 y muy preferiblemente los aminoácidos 1-182 ó 2-182, con o sin la Met N-terminal. El dominio de la helicasa se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.193-1.657 de HCV-1 (posiciones 207-632 de la Figura 3). Por lo tanto, si se quiere que haya actividad de helicasa, esta porción de la molécula se mantendrá con pocos cambios o con sólo cambios conservativos. El experto en la técnica está capacitado para determinar con facilidad otras regiones que toleran cambios, sobre la base de la estructura conocida de NS3/4a.

Los inmunoensayos que aquí se describen utilizan también antígenos de fusión de múltiples epítopos (designados "MEFA"), según se describen en la publicación internacional, documento WO 97/44469. Estos MEFA incluyen múltiples epítopos derivados de dos o más de las distintas regiones víricas de la poliproteína de HCV mostrada en la Figura 1 y en la Tabla 1. En particular, según se muestra en la Figura 1 y en la Tabla 1, una poliproteína de HCV después de sometida a escisión, produce al menos diez productos diferentes en el orden de NH_{2}-C(nucleocápsida)-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOOH. El polipéptido de la nucleocápsida (se encuentra en las posiciones 1-191, numeradas en relación con HCV-1 (véase, Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, para una mayor información sobre el genoma de HCV-1). Este polipéptido es procesado de nuevo para producir un polipéptido de HCV con aproximadamente los aminoácidos 1-173 aminoácidos. Los polipéptidos de la envoltura, El y E2, se encuentran aproximadamente en las posiciones 192-383 y 384-746 respectivamente. El dominio de P7 se encuentra aproximadamente en las posiciones 747-809. NS2 es una proteína integral de membrana con actividad proteolítica y se encuentra aproximadamente en las posiciones 810-1.026 de la poliproteína. NS2, sola o en combinación con NS3 (que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.027-1.657), escinde el enlace "sissle" NS2-NS3 que a su vez genera la terminación N de NS3 y libera una poliproteína grande que incluye las actividades de serina-proteasa y de RNA-helicasa. La proteasa NS3, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.027-1.207, sirve para procesar el resto de la poliproteína. La actividad de helicasa se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.193-1.657. La finalización de la maduración de la poliproteína se inicia con la escisión autocatalítica del enlace NS3-NS4a, catalizada por la serina-proteasa de NS3. Las posteriores escisiones de la poliproteína de HCV, mediadas por NS3, parece que implican el reconocimiento de los enlaces a escindir de la poliproteína por una molécula de NS3 de otro polipéptido. En estas reacciones, NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.658-1.711), dos proteínas (NS4b que se encuentra aproximadamente en las posicione 1.712-1.972 y NS5a que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1.973-2.420) y una RNA-polimerasa dependiente de RNA (NS5b que se encuentra aproximadamente en las posiciones 2.421-3.011).

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Los múltiples antígenos de HCV forman parte de una cadena de aminoácidos, única y continua, cadena que no está presente en la naturaleza. Por ello, el orden lineal de esos epítopos es diferente del orden lineal que tienen en el genoma en el que se encuentran. El orden lineal de las secuencias de los MEFA de uso de la presente invención se establece preferiblemente para conseguir una antigenicidad óptima. Preferiblemente, los epítopos proceden de más de una cepa de HCV, proporcionando así una capacidad añadida para detectar múltiples cepas de HCV en un único ensayo. Así pues, los MEFA de uso en la presente invención puede comprender diferentes regiones inmunogénicas derivadas de la poliproteína anteriormente descrita. Además, una proteína resultante de un desplazamiento del marco de lectura en la región de la nucleocápsida de la poliproteína, tal como se describe en la Publicación internacional, documento WC 99/63941, se puede usar en los MEFA. Si se desea, en la proteína de fusión puede haber al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más de uno o más epítopos derivados de la poliproteína de HCV.

Por ejemplo, en el antígeno MEFA se pueden incluir epítopos derivados, p. ej., de la región hipervariable de E2, tal como una región que se extiende por los aminoácidos 384-410 ó 390-410. Un epítopo de E2 particularmente eficaz es un epítopo que incluye una secuencia consenso derivada de esta región, tal como la secuencia consenso Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, que representa una secuencia consenso correspondiente a los aminoácidos 390-410 del genoma del HCV de tipo 1. Un epítopo E2 representativo presente en un MEFA de la invención puede comprender un epítopo híbrido que se extiende por los aminoácidos 390-444. Ese epítopo E2 híbrido puede incluir una secuencia consenso que representa a los aminoácidos 390-410 fusionados a la secuencia de aminoácidos natural correspondiente los aminoácidos 411-444 de E2 de HCV.

Además, los antígenos pueden derivar de diferentes cepas de HCV. Se conocen múltiples cepas víricas de HCV y epítopos derivados de cualquiera de estas cepas se pueden usar en una proteína de fusión. Es un hecho muy conocido que cualquier especie determinada de un organismo varía de un organismo individual a otro y además que un organismo determinado tal como un virus puede tener varias cepas diferentes. Por ejemplo, según se ha explicado en lo que antecede, HCV incluye al menos 6 genotipos. Cada uno de estos genotipos incluye determinantes antigénicos equivalentes. Más concretamente, cada cepa incluye un número de determinantes antigénicos que están presentes en todas las cepas de los virus pero que son ligeramente diferentes de una cepa vírica a otra. Por ejemplo, HCV incluye el determinante antigénico conocido como 5-1-1. (Véase la Figura 1). Este determinante antigénico concreto aparece en tres formas diferentes en las tres cepas víricas diferentes de HCV. Por consiguiente, en una realización preferida de esta invención, las tres formas de 5-1-1 están presentes en el antígeno de fusión de múltiples epítopos usado en los inmunoensayos de la presente invención. De manera similar, determinantes antigénicos equivalentes procedentes de la región en la nucleocápsida de cepas de HCV diferentes, también pueden estar presentes. En general, los determinantes antigénicos equivalente presentan un alto grado de homología en lo que respecta a la secuencia de aminoácidos, grado de homología que generalmente es del 30% o mayor, preferiblemente del 40% o mayor, cuando las secuencias están alineadas. El epítopo de múltiples copias de la presente invención pueden también incluir múltiples copias que son copias exactas del mismo epítopo.

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Las Figuras 4 y 6A-6C muestran MEFA representativos, de uso en la presente invención, que derivan de HCV. Sin embargo, se ha de saber que otros epítopos derivados del genoma de HCV también se podrán utilizar en los presentes ensayos.

La secuencia de DNA y la correspondiente secuencia aminoácidos de uno de los antígenos de fusión de múltiples epítopos representativo, el MEFA 7.1, se muestran en las Figuras de la 5A a la 5F. La fórmula estructural general del MEFA 7.1 se muestra en la Figura 4 y es la siguiente: hSOD-El(tipo 1)-E2 HVR consenso(tipo la)-E2 HVR consenso (tipos 1 y 2)-helicasa(tipo 1)-5-1-1(tipo 1)-5-1-1(tipo 3)-5-1-1(tipo 2)-c100(tipo 1)-NS5(tipo 1)-NS5(tipo 1)-nucleocápsida(tipos 1+2)-nucleocápsida(tipos 1+2). Este epítopo de múltiples copias incluye la siguiente secuencia de aminoácidos, numerada en relación con HCV-1 (el sistema de numeración de los aminoácidos expuesto más adelante sigue la manera de expresar la numeración proporcionada en Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, en la que el aminoácido Núm. 1 es la primera metionina codificada por la secuencia codificadora de la región de la nucleocápsida: aminoácidos 1-156 de la superóxidodismutasa (SOD, usada para activar la expresión recombinante de la proteína); aminoácidos del 303 al 320 de la poliproteína, procedentes de la región El; aminoácidos del 390 al 410 de la poliproteína, que representan una secuencia consenso correspondiente a la región hipervariable E2 de HCV-1a; aminoácidos del 384 al 414 de la poliproteína, procedentes de la región E2, que representan una secuencia consenso correspondiente a las regiones hipervariables E2 de HCV-1 y HCV-2; aminoácidos 1.193-1.658 de la poliproteína de HCV-1 que definen la helicasa; tres copias de un epítopo procedente de 5-1-1, aminoácidos 1.689-1.735, una copia procedente de HCV-1, una copia procedente de HCV-3 y otra copia procedente de HCV-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes procedentes de las tres cepas víricas de HCV; el polipéptido C100 de HCV procedente de HCV-1, aminoácidos 1.901-1.936 de la poliproteína; dos copias exactas de un epítopo procedente de la región NS5 de HCV-1, cada copia con los aminoácidos del 2.278 al 2.313 de la poliproteína de HCV; y dos copias de un epítopo procedente de la región de la nucleocápsida, una copia procedente de HCV-1 y otra copia procedente de HCV-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes representados por los aminoácidos del 9 al 32, 39-42 y 64-88 de HCV-1 y por los aminoácidos 67-84 de HCV-2.

La Tabla 2 muestra las posiciones de los aminoácidos de los diferentes epítopos, haciendo referencia a las Figuras desde la 5A hasta la 5F aquí incluidas.

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En una de las realizaciones de la invención, representada en la Figura 2, se realiza un inmunoensayo rápido de captura de ligando usando un epítopo conformacional procedente de NS3/4a y uno o más antígenos de fusión de múltiples epítopos, tal como el MEFA 7.1. La muestra se mezcla con los antígenos, que pueden estar presentes sobre en un soporte sólido, según se describe más adelante. Si la muestra está infectada con HCV, los anticuerpos de HCV dirigidos contra esos epítopos presentes sobre el soporte sólido se unirán a los componentes del soporte sólido. La detección se realiza por medio de la unión de un marcador detectable (tal como peroxidasa de rábano (HRP) según se muestra en la Figura 2) a uno de los miembros del complejo antígeno/anticuerpo. La unión puede hacerse por medios covalentes o mediante la posterior unión de anticuerpos marcados de manera detectable, tal como en un ensayo en sándwich estándar, o mediante una reacción enzimática cuyo producto de reacción es detectable. El marcador detectable puede incluir, pero no se limita ellos, un cromóforo, un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un compuesto reactivo con enzimas cuyo producto de escisión es detectable, rodamina o derivados de rodamina, biotina, avidina, estreptavidina, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente tal como el éster de dimetil-acridinio (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.), derivados y/o combinaciones de estos marcadores. Un anticuerpo anti-seres humanos marcado de manera detectable, capaz de detectar una molécula de IgG humana presente, se puede usar por razones de comodidad.

Con el fin de una mejor comprensión de la invención, a continuación se proporciona un análisis más detallado en lo que respecta a la producción de los polipéptidos para usar en los inmunooensayos y a los métodos para llevar a cabo los inmunoensayos.

Producción de antígenos para usar en los inmunoensayos de HCV

Según se ha explicado en lo que antecede, las moléculas de la presente invención generalmente se producen mediante técnicas recombinante. Así, los polinucleótidos que codifican antígenos de HCV para usar con la presente invención se pueden preparar usando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que codifican las moléculas anteriormente descritas se pueden obtener usando métodos recombinantes, tales como mediante escrutinios de cDNA y de bibliotecas genómicas procedentes de células que expresan el gen, u obteniendo el gen a partir de un vector que se sabe que incluye ese gen. Además, el gen deseado se puede aislar directamente a partir de moléculas de ácido nucleico vírico, usando técnicas de usando métodos descritos en la técnica, tales como en Houghton y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.350.671. El gen de interés también se puede producir por métodos de síntesis, en lugar de ser clonado. Las moléculas se pueden diseñar con codones apropiados para la secuencia particular. La secuencia completa se ensambla después a partir de los oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos estándar y se ensambla en forma de una secuencia codificadora completa. Véanse, p. ej., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; y Jay y col. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Así pues, se pueden obtener secuencias de nucleótidos particulares a partir de vectores que albergan las secuencias deseadas o se puede sintetizar totalmente o en parte usando diferentes métodos de síntesis de oligonucleótidos, conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a un sitio específico y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuando sea necesario. Véase, p. ej., Sambrook, supra. En particular, uno de los métodos para obtener secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias deseadas es hibridando grupos complementarios de oligonucleótidos sintéticos solapantes, producidos en un sintetizador convencional y automático de polinucleótidos, seguido de ligación con una DNA ligasa apropiada y de amplificación de las secuencias nucleotídicas ligadas a través de PCR. Véase, p. ej., Jayaraman y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. De manera adicional, la síntesis dirigida por oligonucleótidos ((Jones y col. (1986) Nature 54:75-82), la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de regiones de nucleótidos (Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327 y Verhoeyen y col. (1988) Science 239:1534-1536), y el rellenado enzimático de oligonucleótidos que presentan huecos, usando la DNA-polimerasa de T4 (Queen y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033), se pueden usar en esta invención para proporcionar moléculas que poseen capacidades alteradas o potenciadas de unión a antígenos y/o una inmunogenicidad reducida.

Una vez preparadas o aisladas las secuencias codificadoras, esas secuencias se pueden clonar en un vector o en un replicón adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de la elección que se haga. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a ellos, plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, cromosomas o virus que son capaces de replicarse cuando se encuentran asociados con elementos y control apropiados.

La secuencia codificadora se sitúa luego bajo el control de elementos de control adecuados, dependiendo del sistema que se va a usar para la expresión. Así, la secuencia codificadora se puede situar bajo el control de un promotor, un sitio de unión a ribosomas (en el caso de expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de manera que la secuencia de DNA de interés se transcribe en forma de un RNA por medio de un transformante adecuado. La secuencia codificadora puede contener o no contener un péptido señal o una secuencia conductora que puede más tarde ser retirada por el hospedador en un procesamiento post-traduccional. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. Núms. 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

Además de secuencias de control, puede ser conveniente añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias relacionadas con el crecimiento de la célula hospedadora. Los expertos en la técnica conocen secuencias reguladoras y ejemplos de ellas incluyen las secuencias que producen la expresión de un gen que ha de ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluyen la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores pueden también están presentes en el vector. Por ejemplo, en la presente invención se pueden usar elementos estimuladores de la transcripción para aumentar los niveles expresión de las construcciones. Los ejemplos incluyen elementos estimuladores de la transcripción de genes tempranos de SV40 ((Dijkema y col. (1985) EMBO J. 4:761), el elemento estimulador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) y elementos derivados del CMV humano (Boshart y col. (1985) Cell 41:521), tales como elementos incluidos en la secuencia del intrón A de CMV (Patente de EE.UU. Núm. 5.688.688). La casete de expresión puede incluir además un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula hospedadora adecuada, uno o más marcadores seleccionables, uno o más sitios de restricción, un potencial para expresar un número alto de copias y un promotor fuerte.

Un vector de expresión se construye de manera que la secuencia codificadora particular se coloca en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo la posición y la orientación de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias de control tal que la secuencia codificadora se transcribe bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la RNA-polimerasa que se une a la molécula de DNA de las secuencias de control transcribe la secuencia codificadora). La modificación de las secuencias que codifican la molécula de interés puede ser conveniente para conseguir este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de manera que se pueda unir a las secuencias de control en la orientación correcta; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia codificadora antes de la inserción en un vector. Como alternativa, la secuencia codificadora se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

Según se ha explicado en lo que antecede, también puede ser conveniente producir mutantes o análogos del antígeno de interés. Esto es particularmente cierto con NS3/4a. Métodos para hacer esto se describen, p. ej., en Dasmahapatra y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.843.752 y en Zhang y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.990.276. Los mutantes o análogos de ésta o de otras proteínas de HCV para usar en los ensayos de la presente invención se pueden preparar mediante la deleción de una porción de la secuencia que codifica el polipéptido de interés, mediante inserción de una secuencia y/o mediante sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Métodos para modificar secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis dirigida a un sitio específico, y métodos similares, son muy conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook y col., supra; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448, Geisselsoder y col. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller y Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409.

Las moléculas se pueden expresar en una amplia variedad de sistemas que incluyen sistemas de expresión en insectos, mamíferos, bacterias, virus y levaduras, todos ellos muy conocidos en la técnica.

Por ejemplo, los sistemas de expresión en células de insectos, tales como los sistemas que utilizan baculovirus, son conocidos por los expertos en la técnica y se encuentran descritos, p. ej., en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Núm. 1555 (1987). Los materiales y métodos de los sistemas expresión que usan baculovirus/células de insectos se encuentran comercialmente disponibles en forma de kit procedente, inter alía, de Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). De manera similar, los sistemas expresión en bacterias y en células de mamíferos son muy conocidos en la técnica y se encuentran descritos, p. ej., en. Sambrook y col., supra. Los sistemas expresión en levaduras también son muy conocidos en la técnica y se encuentran descritos, p. ej., en Yeast Genetic Engineering (Barr y col., redactores, 1989) Butterworths, Londres.

También se conocen diversas células hospedadoras apropiadas para usar con los sistemas anteriormente mencionados. Por ejemplo, en la técnica se conocen líneas celulares de mamíferos e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles procedentes de la American Type Culture Collection (ATCC), tales como, pero sin limitarse a ellas, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster joven (BHK), células de riñón de mono (COS), células de riñón embrionario humano, células que carcinoma hepatocelular humano, (p.ej., Hep G2), células de riñón bovino de Madin-Darby ("MDBK") (del inglés, " Madin-Darby Bovine Kidney"), así como otras líneas celulares. De manera similar, células hospedadoras bacterianas tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., serán de utilidad en relación con las presentes construcciones de expresión. Hospedadores de tipo levaduras útiles en la presente invención incluyen, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Células de insectos para usar con los vectores de expresión de tipo baculovirus incluyen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

Las moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos de interés se pueden integrar de manera estable en el genoma de una célula hospedadora o se pueden mantener en un elemento episómico estable en una célula hospedadora adecuada, usando diversos métodos de entrega de genes muy conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Patente de EE. UU. Núm. 5.399.346.

Dependiendo del sistema de expresión y del hospedador seleccionado, las moléculas se producen cultivando las células hospedadoras transformadas con uno de los vectores de expresión anteriormente descritos, en condiciones en las que la proteína se expresa. La proteína expresada se aísla luego a partir de las células hospedadoras y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en el medio de cultivo, el producto se puede purificar directamente a partir del medio. Si la proteína no es secretada, se puede aislar a partir de los lisados celulares. La selección de las condiciones de cultivo apropiadas y de los métodos de recuperación forma parte de la experiencia en la técnica.

Se ha descrito la producción de diferentes antígenos de HCV, que incluyen antígenos usados en las proteínas de fusión de múltiples antígenos anteriormente descritas. Véanse, p. ej., Houghton y col., Patentes de EE. UU. Núms. 5.350.671 y 5.683.864; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien y col., Publicación internacional, documento WC 93/00365; Chien, D.Y., Publicación internacional, documento WC 94/01778; Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien, D.Y., Publicación internacional, documento WC 94/01778; y solicitudes de Patente de EE. UU., aprobadas y de propiedad común, Series Núms. 08/403.590 y 08/444.818.

Ensayos inmunodiagnósticos

Una vez producidos, los antígenos de HCV se pueden usar en virtualmente cualquier formato analítico que emplea un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se pone en contacto con el componente del organismo del que se sospecha que contiene anticuerpos contra HCV, en condiciones que permiten que el antígeno se una a cualquiera de esos anticuerpos presentes en el componente. Esas condiciones típicamente son la temperatura fisiológica, el pH y la fuerza fónica usando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con el espécimen va seguida de la detección de los inmunocomplejos que comprenden el antígeno.

El diseño de los inmunoensayos es objeto de gran cantidad de variaciones y en la técnica se conocen muchos formatos. Los protocolos pueden usar, por ejemplo, soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos conllevan el uso de un anticuerpo o un polipéptido marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos o moléculas colorantes, según se ha tratado con detalle en lo que antecede. También se conocen ensayos que amplifican las señales procedentes de los inmunocomplejos; ejemplos de estos ensayos son ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos mediados y marcados con enzimas, tales como los ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede tener, sin limitación, un formato heterogéneo o un formato homogéneo, y puede ser de tipo estándar o de tipo competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido típicamente se une a una matriz sólida o a un soporte sólido para facilitar la separación entre la muestra y el polipéptido después del incubación. Un soporte sólido, para los fines de esta invención, puede ser cualquier material que es una matriz insoluble y puede tener una superficie rígida o semirígida. Ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a ellos, sustratos tales como nitrocelulosa (p. ej., en forma de membrana o en forma de pocillos de microtitulación); poli(cloruro de vinilo) (p. ej., láminas o pocillos de microtitulación); látex de poliestireno (p. ej., bolitas o placas de microtitulación); poli(fluoruro de vinilideno); papel diazotizado; membranas de nilón; bolitas activadas, bolitas con respuesta magnética y soportes similares. Soportes particulares incluyen placas, gránulos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, alfileres, fibras sólidas, bolitas de celulosa, bolitas de vidrio poroso, geles de sílice, bolitas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, bolitas de copolímeros de injerto, bolitas de látex, bolitas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N-N'-bis-acriloiletilendiamina y partículas de vidrio revestidas con un polímero hidrófobo.

Si se desea, a las moléculas que se han de añadir al soporte sólido se les puede añadir por comodidad funciones para crear restos de estireno o acrilato, permitiendo así la incorporación de estas moléculas en forma de poliestireno, poliacrilato u otros polímeros tales como poliimida, poliacrilamida, polietileno, polivinilo, polidiacetileno, poli(fenileno-vinileno), polipéptidos, polisacáridos, polisulfona, polipirrol, poliimidazol, politiofeno, poliéter, compuestos epoxi, vidrio de sílice, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarosa, celulosa y polímeros similares.

En uno de los contextos, un soporte sólido primero se hace reaccionar con los antígenos de HCV (denominados aquí colectivamente "componentes de la fase sólida"), en condiciones de unión adecuadas de manera que las moléculas queden suficientemente inmovilizadas en el soporte. Algunas veces, la inmovilización en el soporte se puede aumentar acoplando primero el antígeno y/o el anticuerpo a una proteína que posee mejores propiedades de unión a la fase sólida. Las proteínas adecuadas para el acoplamiento incluyen, pero no se limitan a ellas, macromoléculas tales como albúminas séricas que incluyen albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulinas, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas muy conocidas por los expertos en la técnica. Otros reactivos que se pueden usar para unir moléculas al soporte incluyen polisacáridos, ácidos poli-lácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y reactivos similares. Estas moléculas y los métodos para acoplar estas moléculas a antígenos son muy conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, p. ej., Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida y col. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; y Anjaneyulu y Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

Una vez que el soporte sólido ha reaccionado con los componentes de la fase sólida, todos los componentes de la fase sólida no inmovilizados se retiran del soporte mediante lavado y los componentes unidos al soporte se ponen entonces en contacto con una muestra biológica de la que se sospecha que contiene anticuerpos contra HCV (denominados aquí colectivamente "moléculas de ligando") en condiciones de unión adecuadas. Si en la muestra hay anticuerpos contra HCV, formarán un complejo con los antígenos de HCV. Después de los lavados para retirar todas las moléculas de ligando no unidas, se añaden los anticuerpos anti-xenogénicos (p. ej., anti-seres humanos) marcados de manera detectable, que reconocen un epítopo sobre los anticuerpos anti-HCV. Estos anticuerpos se unen debido a la formación de complejos.

En un formato homogéneo, la muestra a ensayar se incuba con la mezcla de los antígenos en disolución. Por ejemplo, esto puede tener lugar en condiciones en las que precipitarán todos los complejos antígeno-anticuerpo que se formen. Tanto el formato estándar como el formato competitivo de los ensayos homogéneos se conocen también en la técnica.

En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos anti-HCV que forman parte del complejo antígeno anticuerpo se detecta directamente. Esto puede realizarse determinando si los anticuerpos antixenogénicos (p. ej., anti-seres humanos) marcados que reconocen un epítopo sobre los anticuerpos anti-HCV, se unen debido a la formación de complejos. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos anti-HCV presentes en la muestra se deduce controlando el efecto competitivo que tiene sobre la unión una cantidad conocida de anticuerpo marcado (o de otro ligando competidor) en el complejo.

Más en particular, los complejos formados que comprenden el anticuerpo anti-HVC (o, en el caso de los ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo competidor) se detectan mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas, dependiendo de formato. Por ejemplo, los anticuerpo anti-HCV no marcados presentes en el complejo, se pueden detectar usando un conjugado de una Ig antixenogénica que está formando un complejo con un marcador (p. ej., un marcador enzimático). En un formato analítico de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre los antígenos de HCV y el anticuerpo forma una reticulación que precipita en el seno de la disolución o de la suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si en el espécimen a ensayar no hay anticuerpos anti-HCV, no se forma un precipitado visible.

Los reactivos analíticos anteriormente descritos, que incluyen el soporte sólido para inmunoensayo que lleva unidos anticuerpos y antígenos, así como los anticuerpos y antígenos que se han de hacer reaccionar con la muestra capturada, pueden ser suministrados en kits, junto con las instrucciones adecuadas y con otros reactivos necesarios, con el fin de llevar a cabo inmunoensayos como los anteriormente descritos. El kit normalmente contiene en recipientes independientes la mezcla de antígenos (o bien ya unidos a una matriz sólida o bien sueltos y acompañados de reactivos para unirlos la matriz), formulaciones de anticuerpos de control (positivos y/o negativos), un anticuerpo marcado cuando el formato analítico lo requiere y reactivos generadores de señales (p. ej., el sustrato de una enzima) cuando el marcado no genera directamente una señal. Las instrucciones (p. ej., por escrito, en cinta grabada, en VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo normalmente estarán incluidas en el kit. El kit también puede contener, dependiendo del imunoensayo particular que se utilice, otros reactivos y materiales envasados (es decir, tampones de lavado y reactivos y materiales similares). Usando estos kits se pueden llevar a cabo inmunoensayos estándar como los descritos en los antecede.

III. Parte experimental

A continuación vienen ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen exclusivamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.

Se ha hecho todo lo posible para garantizar la precisión en lo relativo a las cifras utilizadas (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero desde luego se debe permitir que pueda haber cierto error y desviación experimental.

Ejemplo 1 Construcción de MEFA 7 y MEFA 7.1

El siguiente ejemplo ilustra la preparación de una casete de múltiples epítopos de HCV que expresa una poliproteína. La poliproteína expresada por la casete de múltiples epítopos se denomina aquí Antígeno de Fusión de Múltiples epítopos (MEFA). Preferiblemente, cuando un epítopo está repetido, la copia o copias adicionales se disponen en tándem en la misma orientación. Se entiende que la región de una secuencia codificadora vírica usada como epítopo se puede variar ligeramente y aún así conservar la actividad antigénica, y que la manera de expresar la numeración de los aminoácidos puede variar de unas cepas a otras. Así, los epítopos repetidos puede variar entre ellos en la secuencia de aminoácidos debido a las variaciones y/o a la manera de expresar la numeración de las secuencias de las cepas. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de los epítopos repetidos dentro de un MEFA son homólogas en al menos el 30% en lo que a los aminoácidos se refiere, más preferiblemente son homólogas en al menos el 40% en lo que a los aminoácidos se refiere.

Se introdujeron sitios únicos para enzimas de restricción con el fin de conectar los epítopos en el orden prescrito y aumentar la utilidad de la invención facilitando las modificaciones en el diseño de un antígeno quimérico. La elección de los sitios para enzimas de restricción y de los procedimientos de clonación es fácil de determinar por un experto ordinario en la técnica. Preferiblemente, las uniones entre los epítopos (las secuencias de aminoácidos creadas entre los epítopos debido a la clonación) no generan epítopos inespecíficos. Son epítopos inespecíficos, por ejemplo, secuencias no pertenecientes a HCV que no están contiguas a los epítopos de HCV en la naturaleza. Los epítopos inespecíficos se pueden unir a los anticuerpos presentes en una muestra a ensayar produciendo resultados falsos positivos en el ensayo. Preferiblemente, la proteína de fusión de múltiples epítopos, se ensaya con respecto a resultados falsos positivos debidos a esas secuencias generadas en las uniones entre los epítopos. Para evitar las interacciones inespecíficas con el MEFA debidas a las secuencias de las uniones, la secuencia de DNA que codifica la unión se puede, por ejemplo, mutar de manera que las interacciones inespecíficas con la secuencia de aminoácidos mutante se reduzcan y que la clonación de los fragmentos de los epítopos sea posible.

Las casetes de expresión de los MEFA 7 y MEFA 7.1 de HCV se construyeron clonando las secuencias de nucleótidos codificadoras que contenían epítopos principales en una ordenación en tándem, según se muestra en la Figura 4. La elección de un epítopo principal se realizó sobre la base de la frecuencia de reacciones y de la intensidad de las reacciones (título) de los anticuerpos contra ese epítopo (Chein, D.Y. y col. (1994) Viral Hepatitis and Liver Disease, págs. 320-324). Los diversos segmentos de DNA que codifican los epítopos de HCV se construyeron mediante amplificación por PCR o con oligonucleótidos sintéticos. Los aminoácidos de cada uno de los segmentos se encuentran expuestos en la anterior Tabla 2 y se muestran en las Figuras 5A-5F. La secuencia de aminoácidos completa de HCV-1 (3.011 aminoácidos) había sido determinada por Choo, y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455. Oligonucleótidos capaces de unirse a HCV se describen en la Patente de EE. UU. Núm. 5.350.671. La numeración de los aminoácidos en los epítopos de la invención sigue la manera de expresar la numeración facilitada en Choo y col., supra, en la que el aminoácido Núm. 1 es la primera metionina codificada por la secuencia codificadora de la región de la nucleocápsida, salvo que se especifique lo contrario. Por ejemplo, un segmento epitópico de la región NS5 está representado por los aminoácidos del 2.278 al 2.313 de la poliproteína de HCV. Un epítopo de la región El está representado por los aminoácidos del 303 al 320, numerados en relación con la poliproteína de HCV-1.

Tanto MEFA 7 como MEFA 7.1 contienen epítopos procedentes de HCV-1, HCV-2 y HCV-3, lo que permite la detección de múltiples tipos de un virus en un solo ensayo. En el documento WO 96/27153 se encuentran métodos para determinar el serotipo de HCV. Por ejemplo, se ha descubierto que epítopos procedentes de la región 5-1-1 varían entre los serotipos de HCV. Una copia de cada uno de los epítopos 5-1-1 específicos del tipo de HCV, presentes en los MEFA que aquí se describen, permite que tenga lugar la unión de cualquiera de los tipos de HCV que pudiera estar presente en la muestra biológica que se ha de analizar.

Las construcciones de MEFA 7 y MEFA 7.1 se realizaron mediante técnicas de ingeniería genética para su expresión en Saccharomyces cerivisiae utilizando el vector pBS24.1 de expresión en levaduras que contiene secuencias de 2 \mum para la replicación autónoma en levaduras y los genes leu2-d y URA3 de levaduras como marcadores seleccionables. El gen de la \beta-lactamasa y el origen de replicación de ColE1n, requerido para la replicación de plásmidos en bacterias, estaban también presentes en este vector de expresión. El vector de expresión en levaduras que codifica MEFA 7, el ps.MEFA7, se construyó primero. Posteriormente, en el plásmido se modificó la región codificadora de los epítopos de la nucleocápsida de HCV para crear el plásmido ps.MEFA7.1, que codifica el antígeno MEFA 7.1.

En concreto, como se muestra en las Figuras de 7A a 7D, un plásmido de expresión en levaduras que codifica MEFA 7, se construyó de la siguiente manera. En primer lugar, un fragmento BamHI/HindIII de 1.896 pb, que codifica el promotor híbrido ADH2/GAPDH, hSOD (aminoácidos 1-156), seguido de un epítopo El (aminoácidos 303-320, cepa HCV1), se aisló procedente de ps.MEFA6, plásmido de expresión que codifica MEFA 6, descrito en la Publicación internacional, documento WO 97/44469. A continuación, se creó un fragmento HindIII/SphI de DNA sintético, de 269 pb, que contiene la secuencia codificadora de un epítopo consenso E2 HVR1 (aminoácidos 390-410, HCV-1), un epítopo consenso E2 HVR1+2 (aminoácidos 384-414, HCV1+2) y el extremo 5' del dominio de la helicasa (aminoácidos 1.193-1.229, HCV-1). Un fragmento SphI/EclXI, de 1.264 pb, que codifica la parte restante del dominio de la helicasa (aminoácidos 1.230-1.651, HCV-1), se purificó en gel a partir del DNA del plásmido pTac5/HelI. El fragmento HindIII/SphI de DNA sintético y el fragmento SphI/EclXI, de 1.264 pb, se ligaron en el vector pSP72new.HindIII/EclXI para producir el pSP72new.HindIII/EclXI/e2.helicasa. Este vector derivaba de pSP72, vector de E. coli comercialmente disponible procedente de Promega, Madison, WI (véase, GenBank/EMBL, Número de registro X65332). En particular, para facilitar la subclonación de los diversos epítopos de MEFA 7, se introdujo un nuevo fragmento conector plural con sitios de clonación múltiple (MCS), a través de oligos sintéticos, entre los sitios SphI y BglII de pSP72. Este nuevo plásmido, denominado pSP72new, se digirió con HindIII y EclXI (también conocida como EagI), que tienen sitios únicos en el MCS. Después se desfosforiló y se purificó en gel.

Células competentes HB101 de E. coli se transformaron con este plásmido y se sembraron en placas de agar Luria que contenían ampicilina, 100 \mug/ml. Los clones deseados se identificaron usando un análisis de DNA de minipreps (preparaciones de DNA plasmídico purificado). Una vez verificadas las secuencias, el subclón número 4 del plásmido pSP72new.HindIII/EclXI/e2.helicasa se digirió con HindIII y EclXI (EagI) para generar un fragmento de 1.534 pb. El fragmento HindIII/EclXI se purificó en gel y se ligó con los oligonucleótidos EclXI/SphI, que codifican los últimos aminoácidos del dominio de la helicasa (aminoácidos 1.651-1.658, HCV-1), en el interior de un vector pGEM7HindIII/SphI. Las células competentes HB101 se transformaron y se sembraron en placas de agar Luria-ampicilina (100 \mug/ml). Una vez identificados los clones deseados y confirmadas sus secuencias, el subclón número 9 del pGEM7HindIII/SphI se digirió con HindIII y SphI para generar un fragmento de 1.560 pb, que se purificó en gel (véase, Figura 7A).

Para ensamblar la porción del extremo 3' de MEFA 7, se realizaron las siguientes etapas. Los epítopos 5-1-1 (aminoácidos 1.689-1.735) procedentes de HCV-1, HCV-3 y HCV-2 (en este orden) se aislaron en gel procedentes de ps.MEFA6, plásmido de expresión que codifica MEFA 6, descrito en la Publicación Internacional, documento WC 97/44469, en forma de un fragmento SphI/AvaI de 441 pb. Este fragmento se ligó con oligonucleótidos sintéticos AvaI/XbaI que codifican el epítopo c100 (aminoácidos 1.901-1.936) en el interior del vector pSP72new.SphI/XbaI. Después de la transformación de HB101, de la identificación de los clones y de la verificación de las secuencias, el pSP72newSXi subclón número 6 se digirió con XbaI y NotI para preparar un vector pSP72newXbaI/NotI. De manera adicional, un fragmento XbaI/NcoI de 221 bp, que codificaba una repetición doble de un epítopo NS5 (aminoácidos 2.278-2.313, HCV-1), se aisló procedente de ps.MEFA6. El fragmento XbaI/NcoI se ligó con oligonucleótidos NcoI/NotI, que codifican los primeros aminoácidos del epítopo de la nucleocápsida de HCV-1, aminoácidos 9-17, en los que la Lys de la posición 9 se había cambiado por Arg y la Asn de la posición 11 se había cambiado por Thr, en el interior del vector pSP72newXbaI/NotI preparado en lo que antecede. Los transformantes de HB101 se analizaron y sus DNA plasmídicos se secuenciaron. Un subclón, denominado pSP72newSX/XNi número 3, se digirió con NotI/SalI para preparar un vector para una posterior subclonación (véase, Figura 7B).

Para completar el ensamblaje del extremo 3' de MEFA 7, una repetición doble de la secuencia que codifica un epítopo de la nucleocápsida con los aminoácidos 9-53 procedentes de HCV-1, más dos epítopos específicos de genotipo de la región de la nucleocápsida, (aminoácidos 64-88, HCV-1, y aminoácidos 67-84, HCV-2) se subclonaron como se explica a continuación en el interior del pSP72newSX/XNi subclón número 3 digerido con NotI-SalI. En primer lugar, un fragmento NotI/XmnI de 92 pb, que codifica los aminoácidos 18-51 de un epítopo de la nucleocápsida, se aisló procedente del pd.Corel9lRT clon número 20. El plásmido pd.Corell9lRT se había construido ligando en el interior del vector pBS24.1BamHI-SalI de expresión en levaduras, un fragmento BamHI-NcoI de 1.365 pb, que expresa el promotor de ADH2/GAPDH, y un fragmento NcoI-SalI, de 615 pb, que codifica los 191 primeros aminoácidos de la nucleocápsida de HCV-1 que lleva mutado el aminoácido 9 de Lys a Arg y que lleva mutado el aminoácido 11 de Asn a Thr. El fragmento NcoI-SalI, de 615 pb, derivaba de un vector de expresión en E. coli en el que se había clonado la secuencia de la nucleocápsida que corresponde a los aminoácidos 1-191, con las mismas dos mutaciones anteriormente descritas.

El fragmento NotI/XmnI de 92 pb se ligó con un vector pSP72newNot/Kpn y con oligonucleótidos XmnI/KpnI que codifican el extremo 3' del epítopo de la nucleocápsida completo. Una vez verificada la secuencia de los clones positivos, el pSP72newNKi subclón número 4 se digirió con NotI y KpnI, y un fragmento de 224 pb se aisló en gel. Este fragmento NotI/KpnI se ligó con oligonucleótidos de 284 pb (extremos KpnI-SalI) que codifican una repetición completa del epítopo de la nucleocápsida anteriormente descrito, en el interior del vector pSP72newSX/XNiNot/VSalI anteriormente descrito. Después de la transformación de HB101, la identificación de los clones y la verificación de las secuencias, el pSP72newSX/XN/NSi subclón número 18 se digirió con SphI y SalI y un fragmento de 1.317 pb se aisló en gel (véase, Figura 7C).

Por último, los fragmentos que vienen a continuación, descritos en lo que antecede, se ligaron en el interior del vector pBS24.1BamHI/SalI de expresión en levaduras para crear ps.MEFA7 (véase, Figura 7D):

el fragmento BamHI/HindIII, de 1.896 pb (Figura 7A)

el fragmento HindIII/SphI de 1.560 pb (Figura 7A)

el fragmento SphI/SalI de 1.317 pb (Figura 7C)

La cepa AD3 de S. cerevisiae se transformó con ps.MEFA7 y se verificó la expresión de los transformantes individuales después de agotada la glucosa en el medio. La proteína recombinante se expresó a niveles altos en levaduras, según se detectó mediante tinción con azul de Coomassie. En particular, las células de levadura se transformaron con el plásmido de expresión del MEFA usando un protocolo que utiliza acetato de litio. Transformantes Ura^{-} se sembraron en estrías para obtener colonias individuales y se motearon sobre placas que contenían Leu/glucosa al 8% para aumentar el número de copias del plásmido. Los cultivos iniciadores Leu^{-} se cultivaron durante 24 horas a 30ºC y después se diluyeron en proporción 1:20 en medio YEPD (extracto de levadura, bactopeptona, glucosa al 2%). Las células se cultivaron durante 48 horas a 30ºC y se recogieron. Para realizar el ensayo de la expresión del antígeno recombinante MEFA 7, una parte alícuota de las células se lisó con bolitas de vidrio en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 10 mM). El lisado se centrifugó a alta velocidad. El sobrenadante y el sedimento insoluble se analizaron sobre geles de proteína en presencia de SDS. La fracción correspondiente al sedimento insoluble estaba muy enriquecida en MEFA 7.

El antígeno MEFA 7 se purificó de la siguiente manera. Las células de S. cerevisiae que expresan MEFA 7 se recogieron según se ha descrito anteriormente. Las células se suspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 8,0) y se lisaron en un aparato Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o en un aparato equivalente usando bolitas de vidrio. El lisado se centrifugó en condiciones de baja velocidad (de 3.000 a 5.000 rpm, 15 min) y el sedimento que contenía la fracción de proteínas insolubles se lavó con concentraciones crecientes de urea (1 M, 2 M, 3 M) en tampón de lisis. La proteína presente en el sedimento de la centrifugación se solubilizó con NaOH 0,1 N, urea 4 M en tampón de lisis. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación a baja velocidad de 3.000 a 5.000 rpm, 15 min. El sobrenadante se ajustó a pH 8,0 con HCl 6 N para precipitar las proteínas insolubles en estas condiciones.

El precipitado se separó mediante centrifugación y el sobrenadante se ajustó a SDS al 2,3%, DTT 50 mM, pH 8,0 y se mantuvo en ebullición durante 3 min. Las proteínas presentes en la mezcla se fraccionaron mediante filtración en gel, en Sephacryl S-400 de Pharmacia en una disolución salina tamponada con fosfato que contenía SDS al 0,1%, EDTA 1 mM y se ajustó a pH 7,4. Se recogieron las fracciones del líquido eluido de la columna que contenían MEFA 7, se reunieron y se concentraron sobre una membrana YM-30 de Amicon. Se repitió la filtración en gel de las fracciones reunidas usando la misma columna y las mismas condiciones.

Durante el análisis del MEFA 7 en un ensayo de prueba, se descubrió que un anticuerpo monoclonal usado como conjugado en la detección, reaccionaba con una secuencia específica del epítopo de la nucleocápsida (aminoácidos 33-38). Por ello, el ps.MEFA7.1 se diseñó para eliminar los aminoácidos 33-38 de la región del epítopo de la nucleocápsida.

Un vector de expresión en levaduras que codifica MEFA 7.1 se preparó de la siguiente manera. Primero se modificó la repetición doble del epítopo de la nucleocápsida situado en el extremo 3' de ps.MEFA7. Para hacerlo, un fragmento sintético NcoI/KpnI de 206 pb, que codifica la primera repetición del epítopo de la nucleocápsida (aminoácidos 9-32, 39-42 y 64-88 de HCV-1, y aminoácidos 67-82 de HCV-2), y un fragmento sintético KpnI/SalI de 233 pb que codifica los aminoácidos 83 y 84 de HCV-2, seguido por la segunda repetición del epítopo de la nucleocápsida (aminoácidos 9-32, aminoácidos 39-42 y aminoácidos 64-88 de HCV-1, y aminoácidos 67-84 de HCV-2), se subclonaron respectivamente en el vector pSP72new.NcoI/KpnI y en el vector pSP72new.KpnI/SalI. Después de la transformación de HB101, de la identificación de los clones y de la confirmación de las secuencias, el pSP72newNKi clon número 21 se digirió con NcoI y KpnI para aislar el fragmento NcoI/KpnI de 206 pb, y el pSP72newKSi clon número 32 se digirió con KpnI y SalI para aislar el fragmento KpnI/SalI de 233 pb.

El plásmido ps.MEFA7.1 se ensambló ligando los siguientes fragmentos en el interior del vector pBS24.1BamHI/
SalI de expresión en levaduras (véase, Figura 8):

el fragmento BamHI/HindIII de 1.896 pb, anteriormente descrito en el caso de ps.MEFA.7;

el fragmento HindIII/SphI de 1.560 pb, anteriormente descrito en el caso de ps.MEFA.7;

un fragmento SphI/NcoI de 776 pb, aislado a partir de ps.MEFA.7, que codifica los epítopos 5-1-1, el epítopo c100 y el epítopo NS5;

el fragmento NcoI/KpnI de 206 pb;

y un fragmento KpnI/SalI de 233 pb.

La cepa AD3 de S. cerevisiae se transformó con ps.MEFA7.1 y se verificó la expresión de los transformantes individuales después de agotada la glucosa en el medio. La proteína recombinante se expresó a niveles altos en levaduras, según se detectó mediante tinción con azul de Coomassie.

El antígeno MEFA 7.1 se purificó de la siguiente manera. Las células de S. cerevisiae que expresan MEFA 7.1 se recogieron según se ha descrito anteriormente. Las células se suspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 8,0) y se lisaron en un aparato Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o en un aparato equivalente usando bolitas de vidrio. El lisado se centrifugó a 10.000 rpm en condiciones de baja velocidad (de 3.000 a 5.000 rpm, 30 min, en un rotor JA-10, y el sedimento que contenía la fracción de proteínas insolubles se lavó con concentraciones crecientes de urea (1 M, 2 M, 3 M) en tampón de lisis. La proteína presente en el sedimento de la centrifugación se solubilizó con NaOH 0,1 N, urea 4 M en tampón de lisis. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación a 14.000 rpm, 20 min, en un rotor JA-14. El sobrenadante se ajustó a pH 8,0 con HCl 6 N para precipitar las proteínas insolubles en estas condiciones.

El precipitado se separó mediante centrifugación a 14.000 rpm, 20 min, en un rotor JA-14. El sobrenadante se ajustó a SDS al 2,3%, se calentó a 70ºC-75ºC en agua hirviendo y después se enfrió a temperatura ambiente. Las proteínas presentes en la mezcla se fraccionaron mediante filtración en gel, en Sephacryl S-400 HR de Pharmacia, en una disolución salina tamponada con fosfato que contenía SDS al 0,1%, EDTA 1 mM, y se ajustó a pH 7,4. Se recogieron las fracciones eluidas de la columna que contenían MEFA 7.1, se reunieron y se concentraron sobre una membrana YM-30 de Amicon. Las fracciones resultantes de la filtración en gel reunidas se ajustaron a SDS al 2,3%, DTT 50 mM y se calentaron/enfriaron igual que la vez anterior. Este material reunido resultante se sometió a una segunda etapa de filtración en gel en una columna de Sephacryl S-300 HR de Pharmacia en las mismas condiciones que las de la primera etapa de filtración en gel.

Ejemplo 2 Producción recombinante de un epítopo conformacional NS3/4a

Se obtuvo un epítopo conformacional NS3/4a de la siguiente manera. Este epítopo tiene la secuencia especificada en las Figuras de 3A a 3D y difiere de la secuencia natural en las posiciones 403 (aminoácido 1.428 de la secuencia de HCV-1 de longitud completa) y 404 (aminoácido 1.429 de la secuencia de HCV-1 de longitud completa). Concretamente, la Thr que normalmente se encuentra en la posición 1.428 de la secuencia natural se ha mutado a Pro y la Ser que se encuentra en la posición 1.429 de la secuencia natural se ha mutado a Ile.

En particular, el vector de expresión en levaduras usado fue pBS24.1, anteriormente descrito. El plásmido pd.hcvla.
ns3ns4aPl, que codificaba un epítopo NS3/4a representativo usado en los inmunoensayos de la presente invención, se produjo de la siguiente manera. Se usó un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, los siguientes trozos de DNA se ligaron entre sí: (a) oligonucleótidos sintéticos que proporcionen un sitio de clonación HindIII en 5', seguidos de la secuencia ACAAAACAAA, el ATG iniciador y codones de HCV1a, comenzando con el aminoácido 1.027 y continuando hasta un sitio BglI en el aminoácido 1.046; (b) un fragmento de restricción BglI-ClaI, de 683 pb, (que codifica los aminoácidos 1.046-1.274) procedente de pAcHLTns3ns4aPI; y (c) un vector pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL número de registro X65332) que había sido digerido con HindIII y ClaI, desfosforilado y purificado en gel. El plásmido pAcHLTns3ns4aPI derivaba de pAcHLT, un vector de expresión de tipo baculovirus, comercialmente disponible procedente de BD Pharmingen (San Diego, CA). En particular, se preparó un vector pAcHLTEcoRI-PstI, así como los siguientes fragmentos: EcoRI-AlwnI, de 935 pb, que corresponde a los aminoácidos 1.027-1.336 del genoma de HCV-1; AlwnI-SacII, de 247 pb, que corresponde a los aminoácidos 1.336-1.419 del genoma de HCV-1; HinfI-BglI, de 175 pb, que corresponde a los aminoácidos 1.449-1.509 del genoma de HCV-1; BglI-PstI, de 619 pb, que corresponde a los aminoácidos 1.510-1.711 del genoma de HCV-1, más el codón de terminación de la transcripción. Un fragmento SacII-HinfI generado mediante síntesis química, de 91 pb, que corresponde a los aminoácidos 1.420-1.448 del genoma de HCV-1 y que contiene las mutaciones PI (Thr-1.428 mutada a Pro, Ser-1.429 mutada a Ile), se ligó con el fragmento HinfI-BglI, de 175 pb, y con el fragmento BglI-PstI, de 619 pb, anteriormente descritos, y se subclonó en el vector pGEM-5Zf(+) digerido con SacII y PstI. El pGEM-5Zf(+) es un vector de E. coli comercialmente disponible (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL número de registro X65308). Después de la transformación de células HB101 competentes, análisis de miniescrutinio de los clones individuales y verificación de las secuencias, un fragmento SacII-PstI, de 885 pb, procedente del clon 2 de pGEM5.PI, se purificó en gel. Este fragmento se ligó con el fragmento EcoRI-AlwnI, de 935 pb, con el fragmento AlwnI-SacII de 247 pb y con el vector pAcHLTEcoRI-PstI, anteriormente descritos. La construcción resultante se denominó pAcHLTns3ns4aPI.

Con la anterior mezcla de ligación se transformaron células competentes HP101 y se sembraron en placas de agar Luria que contenían ampicilina, 100 \mug/ml. Análisis de minipreps de los clones individuales condujeron a la identificación de los clones positivos putativos, dos de los cuales se amplificaron. Los DNA plasmídicos de los clones número 1 y número 2 de pSP721aHC, se prepararon con un kit Maxiprep de Qiagen y se secuenciaron.

A continuación, los siguientes fragmentos se ligaron entre sí: (a) un fragmento HindIII-ClaI, de 761 pb, procedente del pSP721aHC clon número 1 (el pSP72.laHC se había generado ligando juntos los siguientes fragmentos: pSP72 que se había digerido con HindIII y ClaI, oligonucleótidos sintéticos que proporcionen un sitio de clonación HindIII en 5', seguidos de la secuencia ACAAAACAAA, el codón ATG de iniciación y codones de HCVla, comenzando con el aminoácido 1.027 y continuando hasta un sitio BglII en el aminoácido 1.046, y un fragmento de restricción BglII-ClaI de 683 pb (que codifica los aminoácidos 1.046-1.274) procedente de pAcHLTns3ns4aPI); (b) un fragmento BamHI-HindIII, de 1.353 pb, que codifica el promotor híbrido de ADH2/GAPDH de levaduras; (c) un fragmento ClaI-SalI, de 1.320 pb, (que codifica los aminoácidos 1.046-1.711 de HCV1a con la Thr-1.428 mutada Pro y la Ser-1.429 mutada a Ile), procedente de pAcHLTns3ns4aPI; y (d) el vector pBS24.1 de expresión en levaduras que se había digerido con BamHI y SalI, se había desfosforilado y purificado en gel. Con la mezcla resultante de la ligación se transformaron células competentes HB101 y se sembraron en placas de agar Luria que contenían ampicilina, 100 \mug/ml. Análisis de minipreps de las colonias individuales condujeron a la identificación de los clones con el inserto BamHI-SalI esperado, de 3.446 pb, que comprendía el promotor de ADH2/GAPDH, el codón iniciador ATG y NS3/4a de HCVla procedente de los aminoácidos 1.027-1.711 (mostrados como los aminoácidos 1-686 de las Figuras 3A-3D), con la Thr-1.428 (posición del aminoácido 403 de las Figuras 3A-3D) mutada a Pro y con la Ser-1.429 (posición del aminoácido 404 de las Figuras 3A-3D) mutada a Ile. La construcción se denominó pd.HCVla.ns3ns4aPl (véase, Figura 9).

La cepa AD3 de S. cerevisiae se transformó con pd.HCVla.ns3ns4aPl y se verificó la expresión de los transformantes individuales después de agotada la glucosa en el medio. La proteína recombinante se expresó a niveles altos en levaduras, según se detectó mediante tinción con azul de Coomassie y se confirmó mediante análisis de inmunotranferencia usando un anticuerpo policlonal dirigido contra el dominio de la helicasa de NS3.

Ejemplo 3 Purificación del epítopo conformacional NS3/4a

El epítopo conformacional NS3/4a se purificó de la siguiente manera. Células de S. cerevisiae del apartado anterior, que expresan el epítopo NS3/4a se recogieron de la manera anteriormente descrita. Las células se suspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 \muM, leupeptina 0,1 \muM) y se lisaron en un aparato Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o en un aparato equivalente usando bolitas de vidrio, en una proporción de 1:1:1 de células:tampón:bolitas de vidrio de 0,5 mm. El lisado se centrifugó a 30.100 x g durante 30 min a 4ºC y el sedimento que contenía la fracción de proteínas insolubles se añadió al tampón de lavado (6 ml/g peso del sedimento de células inicial) y se hizo oscilar a temperatura ambiente durante 15 min. El tampón de lavado consistió en NaPO_{4} 50 mM pH 8,0, NaCl 0,3 M, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol al 10%, octil-glucósido al 0.05%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 1 \muM, leupeptina 1 \muM. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación a 30.000 x g durante 30 min a 4ºC. El sobrenadante se desechó y el sedimento se
conservó.

La proteína se extrajo del sedimento de la siguiente manera. Se añadió el tampón de extracción, 6 ml/g, y se hizo oscilar a temperatura ambiente durante 15 min. El tampón de extracción consistió en Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 1 M, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 \muM, leupeptina 1 \muM. Se centrifugó a 30.100 x g durante 30 min a 4ºC. El sobrenadante se conservó y se añadió sulfato amónico hasta alcanzar el 17,5% usando la siguiente fórmula: volumen de sobrenadante (ml) multiplicado por sulfato amónico al x%/(1 - sulfato amónico al x%) = ml de una disolución saturada de sulfato amónico 4,1 M que se ha de añadir al sobrenadante. El sulfato amónico se añadió gota a gota con agitación sobre hielo y la disolución se agitó sobre hielo durante 10 min. La disolución se centrifugó a 17.700 x g durante 30 min a 4ºC y el sedimento se conservó y se guardó a de 2ºC a 8ºC durante un máximo de 48 h.

El sedimento se resuspendió y se hizo fluir por una columna de Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) a 4ºC de la siguiente manera. El sedimento se resuspendió en 6 ml de tampón de equilibrado para Poly U por gramo de peso del sedimento. El tampón de equilibrado consistía en HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, DTT 5 mM (añadido recién preparado), glicerol 10%, 1,2 octilglucósido. La disolución se hizo oscilar a 4ºC durante 15 min y se centrifugó a 31.000 por g durante 30 min a 4ºC.

Se preparó una columna de Poly U (1 ml de resina por gramo de peso de sedimento de partida). La velocidad de flujo lineal fue 60 cm/h y la velocidad de flujo de empaquetamiento fue el 133% de 60 cm/h. La columna se equilibró con tampón de equilibrado y el sobrenadante del sedimento obtenido con sulfato amónico resuspendido se cargó sobre la columna equilibrada. La columna se lavó hasta obtener la línea base con el tampón de equilibrado y la proteína se eluyó con una elución por etapas en el siguiente tampón de elución para Poly U: HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 1 M, DTT 5 mM (añadido recién preparado), glicerol al 10%, 1,2 octilglucósido. El líquido eluido de la columna se hizo fluir sobre SDS-PAGE (teñida con Coomassie) y las partes alícuotas se congelaron y se almacenaron a -80ºC. La presencia del epítopo NS3/4a se confirmó mediante transferencia Western, usando un anticuerpo policlonal dirigido contra el epítopo 5-1-1 (HCV 4a).

De manera adicional, la actividad enzimática de proteasa se sometió a seguimiento durante la purificación de la siguiente manera. Un péptido NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) y la muestra que contiene el epítopo conformacional NS34a, se diluyeron en 90 \mul del tampón de reacción (Tris 25 mM, pH 7, 5, NaCl 0,15 M, EDTA 0,5 mM, glicerol al 10%, 0,05 n-Dodecil-B-D-Maltósido, DTT 5 mM) y se dejó que la mezcla tuviera lugar durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadieron 90 \mul de la mezcla a una placa de microtitulación (Costar, Inc., Corning, NY) y se añadieron 10 \mul de sustrato de HCV (AnaSpec, Inc., San José CA). El contenido de la placa se mezcló y la placa se leyó en un lector para placas Fluostar. Los resultados se expresaron en forma de unidades de fluorescencia relativas (RFU) por minuto.

Usando estos métodos, el producto resultante de la extracción con NaCl 1 M contenía una actividad de 3,7 RFU/min, el precipitado en sulfato amónico tenía una actividad de 7,5 RFU/min y el producto resultante de la purificación en Poly U tenía una actividad de 18,5 RFU/min.

Ejemplo 4 Revestimiento de soportes sólidos con los antíqenos de HCV

Con el epítopo conformacional NS3/4a de HCV y el antígeno MEFA 7.1 se revistieron las placas de la siguiente manera. El tampón de revestimiento para HCV (NaPO_{4} 50 mM pH 7,0, EDTA 2 mM y Cloroacetamida al 0,1%) se filtró a través de una unidad de filtración de 0,22 \mum. Los siguientes reactivos se añadieron luego por orden al tampón de revestimiento para HCV y se agitaron después de cada adición: BSA-Sulfhydryl Modified, 2 \mug/ml, preparado a partir de una disolución con una concentración de 10 mg/ml (Bayer Corp. Pentex, Kankakee, Illinois); DTT 5 mM preparado a partir de una disolución 1 M (Sigma, St. Louis, MO); NS3/4a, 0,45 \mug/ml (concentración de proteína de 0,3 mg/mi); MEFA 7.1, 0,375 \mug/ml (concentración de proteína de 1 mg/ml). La disolución final se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Se añadieron 200 \mul de la disolución anterior a cada uno de los pocillos de una placa Costar, High binding, de fondo plano (Corning Inc., Corning, N.Y.) y las placas se incubaron toda la noche en una cámara húmeda. Las placas se lavaron luego con el tampón de lavado (PBS 1X, TWEEN-20 al 0,1%), se secaron gradualmente y se añadieron 285 \mul de Ortho Post-Coat Buffer (PBS 1X, pH 7,4, BSA al 1%, sacarosa al 3%). Las placas se incubaron durante al menos 1 hora y se secaron gradualmente toda la noche a 2ºC-8ºC. Las placas se introdujeron en bolsas con desecantes para su futuro uso.

Ejemplo 5 Estudios sobre seroconversión temprana

El funcionamiento de los antígenos NS3/4a y MEFA 7.1 en un ensayo combinado (HCV 4.0) se comparó con el de otros ensayos del HCV para determinar los límites de detección de la seroconversión y para comparar estos límites con los obtenidos en otros ensayos comercialmente disponibles. Se usaron paneles de muestras de sangre humana, comercialmente disponibles, que estaban infectadas por HCV. Los paneles PHV mostrados en las tablas que aparecen más abajo se adquirieron procedentes de Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI). Los 6.212 paneles se adquirieron procedentes de Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP). Los paneles SC se adquirieron procedentes de North American Biologics, Inc., BocaRaton, FL (NABI). En las tablas se indica en día en el que se obtuvieron las muestras de sangre.

El ensayo de HCV 4.0 se llevó a cabo de la siguiente manera. Doscientos microlitros de tampón diluyente de los especímenes (caseína 1 g/l, SOD humana recombinante 100 mg/l, cloracetamida 1 g/l, BSA 10 g/l, extracto de levadura 500 mg/l, EDTA 0,366 g/l, KPO_{4} 1,162 g/l, Tween-20 5 ml/l, NaCl 29,22 g/l, NaPO_{4} 1,627 g/l, SDS al 1%) se añadieron a las placas revestidas. A continuación se añadieron 20 \mul de muestra. Se incubó a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron con el tampón de lavado (PBS 1X, pH 7,4, Tween-20 al 0,1%). Se añadieron 200 \mul de la disolución del conjugado (conjugado HRP-IgG anti-seres humanos, procedente de ratón, tal como un conjugado HRP-IgG anti-seres humanos, procedente de ratón, diluido 1:22.000 in el diluyente a granel para conjugados ORTHO HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe (Ortho-Clinical Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) y se hizo una incubación de 60 minutos a 37ºC. Se lavó igual que en el caso anterior y se añadieron 200 \mul de la disolución del sustrato (1 comprimído de OPD/10 ml). El comprimido de OPD contiene dihidrocloruro de o-fenilenediamina y peróxido de hidrógeno para el desarrollo de color de la reacción catalizada por la peróxidasa de rábano. Se hizo una incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N y las placas se leyeron a 492 nm, en relación con la absorbancia a 690 nm como control.

Los otros ensayos usados en el estudio fueron los siguientes:

El ensayo PRISM de Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), se encuentra comercialmente disponible y es un ensayo de detección basado en anticuerpos. El ensayo se realizó usando las instrucciones del fabricante.

El sistema ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey), es un ensayo de detección basado en anticuerpos. El ensayo se realizó usando las instrucciones del fabricante.

En ensayo Pasteur MONOLISA anti-HCV Plus Versión 2 (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette, Francia) es un ensayo de detección basado en anticuerpos. El ensayo se realizó usando las instrucciones del fabricante.

El funcionamiento del ensayo HCV 4.0 se comparó con el de los ensayos HCV 3.0, PRISM y Pasteur (véanse las Tablas 3 y 4). Los anticuerpos contra HCV presentes en los paneles de las muestras de sangre (anti-c33c o anti-c22) se encuentran expuestos en la Tabla 4. En concreto, 17 paneles de seroconversión de las tres fuentes comerciales anteriormente presentadas se sometieron a ensayo usando las técnicas anteriormente mencionadas. Como puede observarse, en el caso de los paneles correspondientes a c33c, el HCV 4.0 mostró una detección más temprana (sangres recogidas por los días 1-3) que el HCV 3.0 en 9 de los 9 paneles correspondientes a c33c, y una detección más temprana que PRISM en 6 de los 9 paneles, y una detección equivalente comparado con PRISM en 3 de los 9 paneles. En el caso de los paneles correspondientes a c22, el HCV 4.0 mostró una detección más temprana que el HCV 3.0 en 3 de 8 paneles, y una detección equivalente en los otros 5 paneles. El HCV 4.0 también mostró una detección más temprana que PRISM en 2 de los 8 paneles y una detección equivalente en 6 de los 8 paneles. El intervalo de mejora observado fue de 2-14 días sobre ambos de los ensayos HCV 3.0 y PRISM.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

1

TABLA 3 (continuación)

2

TABLA 3 (continuación)

3

TABLA 4

4

Ejemplo 6 Sensibilidad de HCV 4.0 a los genotipos

La sensibilidad del ensayo HCV 4.0 a los genotipos se comparó con la de los ensayos HCV 3.0 y Pasteur, anteriormente descritos. En particular, muestras de 10 genotipos diferentes de HCV, especificados en la Tabla 5, se diluyeron según se indica en la tabla (2 veces o 10 veces dependiendo del título inicial de la muestra) y se utilizaron en los tres ensayos, usando los procedimientos anteriormente descritos. Los tres ensayos se ejecutaron simultáneamente. Los datos se muestran en forma de la O.D. de la señal o de la O.D. primaria. Los datos sugieren que el prototipo HCV 4.0 es más sensible en la detección de las muestras diluidas de los genotipos.

5

Ejemplo 7 Estudios de competición

El siguiente estudio de competición se llevó a cabo con el fin de evaluar si el epítopo conformacional NS3/4a detectaba anticuerpos diferentes que los detectados por otros antígenos de HCV. En particular, el antígeno NS3/4a se comparó con el antígeno c200 de la siguiente manera.

Se mezclaron 0,5 \mug y 1,0 \mug de NS3/4a, producido según se ha descrito en lo que antecede, o de c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, disponible en el ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) con 20 \mul de la muestra PHV914-5 (una muestra de sangre de seroconversión temprana obtenida procedente de sangre de un individuo infectado) en un volumen total de 220 \mul (PBS 1X). La mezcla se incubó durante 1 hora en micropocillos a 37ºC. La mezcla se transfirió después a placas revestidas con NS3/4a y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron y se sometieron a ensayo de la siguiente manera.

Se añadió 1 \mug del antígeno c200 a 10 \mul de la muestra PHV914-5 en un volumen total de aproximadamente 220 \mul. La mezcla se incubó 1 hora en un micropocillo a 37ºC y se transfirieron 200 \mul a una placa revestida con NS3/4a (100 ng/ensayo) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron cinco veces con PBS 1X, Tween-20 al 0,1%. Se añadieron 200 \mul de la disolución que contiene el conjugado (anteriormente descrita) y las placas se incubaron y se analizaron según se describe en el Ejemplo 4 en el caso del ensayo HCV 4.0. Controles, que consistían en PHV914-5 y PBS 1X (sin antígeno) se trataron también de la misma manera anterior.

Los resultados se muestran en la Tabla 6. Los resultados de los porcentajes de inhibición mostrados en la columna 4 están calculados como columna 3 menos (columna 2 dividida entre columna 3 multiplicada por 100). Como puede observarse, los datos muestran que NS34a es neutralizado por los anticuerpos de la seroconversión temprana y c200 no lo es. Se obtuvo una señal fuerte cuando los anticuerpos presentes en el miembro PHV914-5 del panel de seroconversión temprana inducida por c33c reaccionaron sobre la placa revestida con NS34a. El antígeno c200 no fue neutralizado por estos anticuerpos. Esto se muestra en el panel superior de la Tabla 6. Cuando NS34a se mezcló con la muestra PHV914-5, quedó neutralizado y por lo tanto en la muestra no había anticuerpos para reaccionar con el NS34a que estaba revistiendo la microplaca. Los datos indican que NS34a puede estar detectando una clase de anticuerpos diferente de la que es detectada por c200.

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(Tabla pasa a página siguiente)

6

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Ejemplo 8 Estudios sobre la estabilidad del epítopo conformacional NS3/4a

Para valorar el papel de la estabilidad del epítopo NS3/4a en el funcionamiento del ensayo, se realizó el siguiente estudio para determinar la inmunorreactividad de NS3/4a frente al tiempo, a temperatura ambiente. Partes alícuotas pequeñas del NS3/4a de partida se dejaron asentar a temperatura ambiente y después se congelaron a intervalos de tiempo como se muestra en la Tabla 7. Todos los viales se usaron simultáneamente en el revestimiento de las placas y se sometieron a ensayo frente a dos paneles de seroconversión temprana inducida por NS3. Los ensayos se llevaron a cabo de la manera anteriormente descrita en el Ejemplo 5 para el caso de HCV 4.0.

Como se puede observar en la Tabla 7, el NS3/4a de partida no es estable y la inmunorreactividad disminuye con el tiempo. Además, para la inmunorreactividad es necesario que se mantenga la conformación de NS3/4a.

Se llevaron a cabo nuevos estudios sobre la estabilidad de la siguiente manera. Los paneles de seroconversión temprana con anti-HCV se sustituyeron por dos anticuerpos monoclonales conformacionales preparados contra NS3/4a usando procedimientos estándar. Los viales del NS3/4a de partida se guardaron a temperatura ambiente a intervalos de tiempo de 3, 6 y 24 horas. Con el NS3/4a de los viales congelados se hizo el revestimiento, utilizando una concentración de 90 ng/ml, y se realizó el ensayo usando el procedimiento anteriormente descrito. Los resultados sugirieron que los dos anticuerpos monoclonales eran de verdad conformacionales y que su reactividad era sensible a la manipulación del antígeno NS3/4a de partida a temperatura ambiente. La reactividad de un anticuerpo monoclonal de control positivo no experimentó cambio.

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(Tabla pasa a página siguiente)

7

Ejemplo 9 Inmunorreactividad del epítopo conformacional NS3/4a frente a un NS3/4a desnaturalizado

La inmunorreactividad del epítopo conformacional, producido según se ha descrito en lo que antecede, se comparó con la de un NS3/4a que se había desnaturalizado añadiendo SDS a la preparación del epítopo conformacional NS3/4a hasta alcanzar una concentración final del 2%. Con el NS3/4a desnaturalizado y el NS3/4a conformacional se revistieron placas de microtitulación según se ha descrito en lo que antecede. Con el antígeno c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, disponible en el sistema ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) se revistieron también placas de microtitulación. El antígeno c200 se usó como comparación. Se supone que este antígeno es no conformacional debido a la presencia de un agente reductor (DTT) y de un detergente (SDS) en su formulación.

El ensayo de inmunorreactividad se realizó frente a dos paneles de seroconversión temprana contra HCV, el panel PHV 904 y el panel PHV 914 (muestras de sangre humana comercialmente disponibles procedentes de Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA), usando el procedimiento analítico ELISA anteriormente descrito. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los datos sugieren que la forma desnaturalizada o linearizada de NS3/4a (así como el c200) no detecta los paneles de seroconversión temprana tan pronto como el epítopo conformacional NS3/4a.

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TABLA 8

8

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El ensayo de inmunorreactividad de este epítopo conformacional se realizó también usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra NS3/4a, preparados usando procedimientos estándar. Estos anticuerpos monoclonales se sometieron después a ensayo en el formato ELISA anteriormente descrito, frente a NS3/4a y a NS3/4a desnaturalizado, y frente al antígeno c200. Los datos muestran que los anticuerpos monoclonales anti-NS3/4a reaccionan frente a NS3/4a y a NS3/4a desnaturalizado de la misma manera que frente a los paneles de seroconversión mostrados en la Tabla 9. Este resultado proporciona también una evidencia más de que el NS3/4a tiene una naturaleza conformacional ya que se pueden preparar anticuerpos monoclonales dirigidos contra él que tienen una reactividad similar frente a los paneles de seroconversión temprana inducida por c33c.

9

Por consiguiente, quedan descritos nuevos ensayos de detección de HCV. A partir de lo anteriormente expuesto, se percibirá que aquí se han descrito realizaciones específicas de la invención con fines de ilustración.

<110> CHIRON CORPORATION

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<120> INMUNOENSAYOS DE ANTICUERPOS ANTI-HCV

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<130> 2302-17039,40 / PP17039,003

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<140> PCT/US01/19156

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<141> 14-06-2.001

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<160> 7

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<170> PatentIn Versión 2.0

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<210> 1

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<211> 2.058

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: antígeno conformacional NS3/4a representativo

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2.058)

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<400> 1

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10

11

12

13

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<210> 2

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<211> 686

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 2

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14

15

16

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<210> 3

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<211> 3.297

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: MEFA 7.1

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(3.297)

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<400> 3

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17

18

19

20

21

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<210> 4

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<211> 1.099

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: MEFA 7.1

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<400> 4

22

23

24

25

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<210> 5

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso

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<400> 5

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\sa{Gly Ser Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gly Phe Val Ser Leu Phe Ala Pro}

\sac{Gly Ala Lys Gln Asn}

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<210> 6

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<211> 10

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: trozo de DNA ligado

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

acaaaacaaa

\hfill

10

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<210> 7

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NS4A

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<400> 7

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\sa{Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys}

\sac{Pro Ala Ile Ile Pro Lys Lys}

Claims

1. Un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo NS3/4a y/o dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccionan de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV, y en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

2. El soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90% con respecto a ella, que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

3. El soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

4. El soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

5. El soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho epítopo NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, que posee actividad de proteasa.

6. El soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho epítopo NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90% con respecto a ella, que posee actividad de proteasa.

7. El soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho epítopo NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 98% con respecto a ella, que posee actividad de proteasa.

8. El soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho epítopo NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D.

9. Un soporte sólido para inmunoensayo que consiste esencialmente en al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, unidos al soporte, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

10. Un kit para ensayo inmunodiagnóstico que comprende el soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, e instrucciones para llevar a cabo el ensayo inmunodiagnóstico.

11. Un método para producir un soporte sólido para inmunoensayo, que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido; y

(b) unir al soporte sólido al menos uno de los epítopos conformacionales NS3/4a de HCV y un antígeno de fusión de múltiples epítopos, en el que dicho epítopo NS3/4a y/o dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos reaccionan de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV, y en el que dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, que reacciona de manera específica con anticuerpos anti-HCV presentes en una muestra biológica procedente de un individuo infectado por HCV.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el epítopo conformacional NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a ella, que posee actividad de proteasa.

13. El método de la reivindicación 11, en el que el epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 3A-3D y dicho antígeno de fusión de múltiples epítopos consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 5A-5F.

14. Un método para producir un soporte sólido para inmunoensayo, que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido; y

15. Uso de un soporte sólido para inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la elaboración de un reactivo de diagnóstico para usar en un método para detectar una infección por el virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra biológica.

16. Un método para detectar una infección por el virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un soporte sólido para inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1-9;

(c) añadir al soporte sólido de la etapa (b), en condiciones formadoras de complejos, un anticuerpo marcado de manera detectable, en el que dicho anticuerpo marcado es reactivo con dicho inmunocomplejo; y