CZ20024058A3 - Kombinační stanovení HCV antigen/protilátka - Google Patents
Kombinační stanovení HCV antigen/protilátka Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20024058A3 CZ20024058A3 CZ20024058A CZ20024058A CZ20024058A3 CZ 20024058 A3 CZ20024058 A3 CZ 20024058A3 CZ 20024058 A CZ20024058 A CZ 20024058A CZ 20024058 A CZ20024058 A CZ 20024058A CZ 20024058 A3 CZ20024058 A3 CZ 20024058A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hcv
- antibody
- core
- epitope
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 197
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 196
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 196
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 59
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 91
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 52
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 202
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 96
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 82
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 122
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 79
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 62
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102200076914 rs104893959 Human genes 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 2
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enamide Chemical compound CC(C)=CC(N)=O WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150031523 4a gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100024358 Arf-GAP with dual PH domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N D-Asparagine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229930182846 D-asparagine Natural products 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000832784 Homo sapiens Arf-GAP with dual PH domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101150038760 Ns3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OSZNNLWOYWAHSS-UHFFFAOYSA-M neostigmine methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.CN(C)C(=O)OC1=CC=CC([N+](C)(C)C)=C1 OSZNNLWOYWAHSS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011130 pituitary stalk interruption syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000553 poly(phenylenevinylene) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000015 polydiacetylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229930185790 proserin Natural products 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
Tento vynález se obecně týká virové diagnostiky. Konkrétně se tento vynález týká kombinačního stanovení antigen/protilátka pro přesnou diagnózu infekcí virem hepatitidy C.
Dosavadní stav techniky
Virus hepatitidy C (HCV) je zásadní příčinou parenterální hepatitidy jiného typu než A a Β (NANBH), která se většinou přenáší transfuzí krve a pohlavním stykem. Tento virus je přítomen u 0,4 až 2,0 % dárců krve. Chronická hepatitida se rozvine zhruba u 50 % infekcí a zhruba u 20 % infikovaných osob se vyvine cirhóza, která někdy vede k hepatocelulárnímu karcinomu. Proto má studium a kontrola této choroby lékařský význam.
Houghten a kol. jako první identifikovali a charakterizovali HCV jako příčinu NANBH. Virová genomová sekvence HCV je známa a jsou též k dispozici způsoby zjištění této sekvence. Viz například Mezinárodní publikace č. WO 89/04669, WO 90/11089 a WO 90/14436. HCV má genom jednovláknové RNA 9,5 kb v kladném směru a patří do skupiny virů Flaviridae. Bylo identifikováno alespoň šest rozlišených avšak příbuzných genotypů HCV na základě fylogenetických analýz [Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391-2399 <1993)] . Virus kóduje jednotlivý polyprotein mající více než 3000 aminokyselinových zbytků [Choo a kol., Science, 244. 359-362 (1989), Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88. 2451-2455 (1991), Han a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, • ·· • ·
88. 1711-1715 (1991)]. Polyprotein se zpracovává kotranslaČně a posttranslačně na strukturní a nestrukturní (NS) proteiny.
Konkrétně, jak ukazuje obrázek 1, se několik proteinů kóduje HCV genomem. Pořadí a nomenklatura produktů štěpení HCV polyproteinu je následující: NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Počáteční štěpení polyproteinu se katalyzuje proteasami hostitele, které uvolňují tři strukturní proteiny, N-terminální nukleokapsidový protein (zvaný jádro) a glykoproteiny obálky, El (též známé jako E) a E2 (též známé jako E2/NS1), stejně tak jako nestrukturní (NS) proteiny obsahující virové enzymy. Oblasti NS se nazývají NS2, NS3, NS4 a NS5. NS2 je protein integrální membrány s proteolytickou aktivitou. NS2, buď samotný nebo v kombinaci s NS3, štěpí vazbu NS2, NS3, čímž se dále tvoří konec N NS3 a uvolňuje se velký polyprotein, který zahrnuje aktivity serin proteasy a RNA helikasy. NS3 proteasa slouží pro zpracování zbývajícího polyproteinu, Dokončení zrání polyproteinu začíná autokatalytickým štěpením spojení NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serin proteasou. Následující štěpení HCV polyproteinu zprostředkovaná NS3 zahrnují rozpoznání míst štěpení polyproteinu molekulou NS3 jiného polypeptidu.
V těchto reakcích uvolňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteiny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentní RNA polymerasu (NS5b).
Popisuje se řada obecných a specifických polypeptidu použitelných jako imunologické a diagnostické prostředky pro HCV odvozených of HCV polyproteinu. Viz například Houghton a kol., evropská publikace č. 318 216 a 388 232, Choo a kol., Science, 244. 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Houghton a kol., Hepatology, 14.
381-388 (1991), Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, * · ··« • · · ♦ · · · · · * 11 · 99 «·· «9 99 £2., 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., £, S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365, D. Y. Chien, mezinárodní publikace č. WO 94/01778. Tyto publikace poskytují rozsáhlý základ pojednávající obecně o HCV stejně tak jako o přípravě a použití HCV polypeptidových imunologických reakčních prostředků.
Citlivé a specifické způsoby pro screening a identifikaci nosičů HCV a HCV kontaminované krve či krevních produktů by poskytly důležitý pokrok v lékařství. Posttransfuzní hepatitida (PTH) se vyskytuje zhruba u 10 % pacientů po transfuzi a HCV odpovídá za 90 % těchto případů. Péče o pacienty stejně tak jako o prevenci přenosu HCV krví a krevními produkty nebo těsným osobním kontaktem vyžaduje diagnostické a prognostické prostředky. Existuje několik způsobů rozboru pro serodiagnózu infekce HCV. Viz například Choo a kol., Science, 244. 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Choo a kol., Br. Med. Bull., 46,
423-441 (1990), Ebeling a kol., Lancet, 335. 982-983 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 335. 558-560 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 337. 317-319 (1991), D. Y.
Chien, mezinárodní publikace č. WO 94/01778, Valenzuela a kol., mezinárodní publikace č. WO 97/44469 a Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904.
Značným problémem při rozborech založených na krevním séru je dlouhý interval mezi infekcí a detekcí viru, který často překračuje 80 d. Tento interval může představovat pro příjemce krevní transfuze značné riziko. Pro překonání tohoto problému slouží vypracované testy založené na nukleových kyselinách (NAT) detekující přímo virovou ribonukleovou kyselinu a testy antigenu jádra HCV, které stanovují virový antigen místo protilátkové odpovědi. Viz například Kashiwa-
kuma a kol., US patent č. 5 871 904, Beld a kol., Transfusion, 42, 575-579 (2000).
Zůstává však potřeba citlivého diagnostického a prognostického způsobu zajištujícího adekvátní péči o pacienta stejně tak jako prevenci přenosu HCV krví a krevními produkty nebo těsným osobním kontaktem.
Podstata vynálezu
Tento vynález se Částečně zakládá na zjištění, že protilátky serokonverze HCV jsou obvykle protilátkami proti jádru a proti NS3 (helikase). V souladu s tím tento vynález poskytuje kombinační rozbor antigenu jádra HCV a protilátky NS3 detekující antigeny HCV i protilátky přítomné ve vzorku s použitím jednoho tuhého nosiče.
Proto se v jednom svém ztělesnění tento vynález zaměřuje na pevný nosič pro imunoesej obsahující alespoň jednu protilátku proti jádru HCV a alespoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a připojený k tomuto nosiči. Protilátka a epitop NS3/4a může být kterákoliv z molekul, které se zde popisují. Navíc může pevný nosič zahrnovat kterýkoliv z antigenů obdržených spojením více epitopů, které se zde popisují, jako je antigen obdržený spojením více epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.
V určitých ztělesněních jsou na pevný nosič připojené alespoň dvě protilátky proti jádru. Dále může být protilátkou proti jádru monoklonální protilátka. Navíc může být epitop NS3/4a konformační epitop, jako je konformační epitop NS3/4a zahrnující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na obrázcích 4A až 4D.
• ··· • ·
V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na pevný nosič pro imunoesej, ke kterému se připojují alespoň dvě monoklonální protilátky proti jádru HCV a alespoň jeden konformační epitop NS3/4a HCV s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obrázcích 4A až 4D,
V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoesej, jak se popisuje výše, (b) kombinaci biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek, které umožní antigenům HCV a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vazbu na alespoň jednu protilátku proti jádru respektive epitopu NS3/4a, (c) přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru je zaměřená proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivního s epitopem NS3/4a a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigenem (ii) a (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku. Epitop NS3/4a může být konformačním epitopem, jako je konformační epitop mající sekvenci NS3/4a znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.
V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) poskytnutí pevného nosiče pro imunoesej s ales- 6 « ♦ · · ·«· * · · « » fr · * · · · · * ·· · ··«·· ·· ·· poň dvěma protilátkami proti jádru HCV připojenými na tento nosič, jak se popisuje výše, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek umožňujících antigenům HCV a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vazbu na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD a (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, indikující infekci HCV v biologickém vzorku. Epitop NS3/4a může být konformačním epitopem, jako je konformační epitop mající sekvenci NS3/4a znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.
Ve kterémkoliv z výše popsaných ztělesnění může být protilátka proti jádru zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako například proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, a/nebo může být detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako jsou aminokyseliny 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1. Navíc může být antigen reagující s protilátkou HCV biologického vzorku z oblasti NS3, jako je epitop c33c oblasti HCV polyproteinu a může být spojen s lidskou aminokyselinovou sekvencí superoxid dismutasy (hSOD). V tomto ztělesnění je druhá detekova• · ♦·· • · · ·* *·φ tělně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD.
V dalším ztělesnění tohoto vynálezu je způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje včetně monoklonálních protilátek proti jádru HCV a konformačního epitopu zahrnujícího aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek umožňujících vazbu HCV antigenu a protilátek, pokud se vyskytují ve vzorku, s alespoň dvěma protilátkami proti jádru a konformačním epitopem NS3/4a, přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s popsanou aminokyselinovou sekvencí hSOD, a detekci komplexů mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, indikující infekci HCV v biologickém vzorku.
V určitých ztělesněních jsou alespoň dvě protilátky proti jádru zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako je oblast aminokyselin 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako je oblast aminokyselin 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
·· • 4 * 44 4 4 4 4 4 «4 · 4« ··· ·· ··
V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje {a} zajištění pevného nosiče pro imunoesej zahrnujícího antigen obdržený spojením více epitopů, (b) kombinaci biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících vazbu HCV antigenu a protilátek, pokud jsou v biologickém vzorku, s alespoň jednou protilátkou proti jádru, epitopem NS3/4a a antigenem obdržením spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde touto první detekovatelně značenou protilátkou je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde značená protilátka proti jádru je zaměřená proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) prvního a druhého antigenu reagujícího s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a a antigenem obdrženým spojením více epitopů a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigeny (ii), (d) detekci komplexů tvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou ve vzorku, indikující infekci HCV biologického vzorku.
Protilátka proti jádru se může zaměřovat proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV se může zaměřovat proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jak se popisuje výše. Dále může první antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahovat epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV a může být spojený s aminokyselinovou sekvencí hSOD. V této souvislosti je druhá detekovatelně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Navíc • · *·· ·* * «· ··· ♦ ♦ ·· druhý antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku může obsahovat epitop z oblasti c22 polyproteinu HCV, jako je epitop obsahující aminokyseliny Lysio až Sergg polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, Tento epitop může být spojený s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Pokud je tomu tak, je druhá detekovatelně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Antigen obdržený spojením více epitopů může obsahovat aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.
V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku, který zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoesej obsahujícího dvě monoklonální protilátky proti jádru HCV, konformační epitop HCV NS3/4a obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a antigen obdržený spojením více epitopů obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F, které se k němu připojují, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek, které umožňují vazbu HCV antigenů a protilátek, pokud jsou v biologickém vzorku, s alespoň dvěma protilátkami proti jádru, s konformačním epitopem NS3/4a respektive antigenem s vícečetným spojením epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči v kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než poslední dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopů z oblasti c33c polyproteinu HCV připojené na aminokyselinovou sekvenci hSOD a epitopů z oblasti c22 polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně zna·*· ·« čené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovými sekvencemi hSOD, (d) detekci komplexů tvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomné, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
V tomto ztělesnění se alespoň dvě protilátky proti jádru mohou zaměřovat proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1, a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV se zaměřuje proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1. Navíc může epitop z oblasti c22 obsahovat aminokyseliny Lysio až Serg9 polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1.
V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na imunodiagnostické soupravy obsahující pevný nosič pro imuno eseje popsaný výše a instrukce pro provádění imunodiagnostického testu.
V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na způsoby přípravy pevného nosiče pro imunoesej zahrnující (a) zajištění pevného nosiče a {b> vazbu alespoň jedné protilátky proti jádru HCV, jako je jedna, dvě či více protilátek a alespoň jednoho izolovaného připojeného epitopu HCV NS3/4a a případně antigenu obdrženého spojením více epitopů. Protilátky proti jádru, epitopy NS3/4a a antigeny s vícečetným spojením epitopů jsou podle popisu výše.
V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na antigen s vícečetným spojením epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F nebo aminokyselinovou sekvenci s alespoň 80% sekvenční identitou, jako je 90% nebo vyšší sekvenční identita reagující specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku z jednotlivce infikovaného HCV. V určitých ztělesněních se antigen s vícečetným připojením epitopu skládá z aminokyselinové sekvence popsané na obrázcích 5A až 5F.
V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na polynukleotid zahrnující kódovací sekvenci pro antigen s vícečetným spojením epitopů výše, rekombinantní vektory zahrnující polynukleotidy, hostitelské buňky transformované rekombinantními vektory a způsoby tvorby rekombinantního antigenu s vícečetným spojením epitopů zahrnující: (a) zajištění populace hostitelských buněk, jak se popisuje výše, a (b) pěstování populace buněk za podmínek, za kterých se exprimuje antigen obsahující spojení více epitopů kódovanou sekvencí přítomnou v rekombinantním vektoru.
Tyto a další aspekty tohoto vynálezu budou zřejmé při odkazu na následující podrobný popis a připojené výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 je diagramem znázorňujícím HCV genom s různými oblastmi polyproteinu, od kterých se odvozují reakční složky eseje (proteiny a protilátky).
Obrázek 2 je schématický výkres representativní kombinační eseje protilátka/antigen podle tohoto vynálezu.
Obrázek 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci repre* · • v #· ·· · zentativního NS3/4a konformačního antigenu pro použití v těchto esejích. Zvýrazněný alanin v poloze 182 nahrazuje nativní serin, který se normálně vyskytuje v této poloze.
Obrázky 4A až 4D znázorňují deoxyribonukleovou kyselinu a odpovídající aminokyselinovou sekvenci dalšího reprezentativního NS3/4a konformačního antigenu pro použití v těchto esejích. Aminokyseliny v polohách 403 a 404 obrázků 4A až 4D představují substituce Pro místo Thr a Ile místo Ser nativní aminokyselinové sekvence HCV-1.
Obrázek 5 je diagram konstrukce pd.HCVla.ns3ns4aPI.
Obrázek 6 je diagram znázorňující MEFA 12.
Obrázky 7A až 7F znázorňují deoxyribonukleovou kyselinu a odpovídající aminokyselinovou sekvenci MEFA.
Obrázek 8 je schématický výkres reprezentativní imunoeseje podle tohoto vynálezu s použitím MEFA 12.
Následuje podrobný popis vynálezu.
Praxe tohoto vynálezu používá, pokud se nepopisuje jinak, konvenční způsoby chemie, biochemie, způsoby s rekombinantní deoxyribonukleovou kyselinou a způsoby imunologie v rámci současné znalosti oboru. Tyto způsoby se plně vysvětlují v literatuře. Viz například Fundamental Virology,
2. vydání, díl I & II (B. N. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, díly I až IV (D. M.
Weir a C. C. Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehnin13 • * · ϊ ϊ ··· ί · *’ • · · · · ·«·» ·· · *· ··· ·· ·· ger, Biochemistry (Worth Publishers, lne., current addition), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání, 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan, red., Academie Press, lne).
Je třeba poznamenat, že v tomto popisu a připojených nárocích zahrnují singulární formy odkazy na množné číslo, pokud zřejmě obsah neurčuje jinak. Takže například odkaz na antigen zahrnuje směs dvou či více antigenů a podobně.
V celém textu se používají následující zkratky amino-
kyselin. | |
Alanin; Ala (A) | Arginin: Arg (R) |
Asparagin: Asn (N) | Kyselina aspargová: Asp (D) |
Cystein: Cys (C) | Glutamin: Gin (Q) |
Kyselina glutamová: Glu (E) | Glycin: Gly (G) |
Histidin: His (H) | Isoleucin; Ile (I) |
Leucin: Leu (L) | Lysin: Lys (K) |
Methionin: Met (M) | Fenylalanin: Phe (F) |
Prolin: Pro (P) | Serin: Ser (S) |
Threonin: Thr (T) | Tryptofan: Trp (W) |
Tyrosin: Tyr (Y) | Valin: Val (V) |
I. Definice |
Při popisu tohoto vynálezu se používají následující pojmy, jejichž význam je podle definice popsané níže.
Pojmy polypeptid a protein se vztahují k polymeru aminokyselinových zbytků a nejsou omezené minimální délkou produktu. Peptidy, oligopeptidy, dimery, multimery a podobně se zahrnují do této definice. Definice zahrnuje proteiny ·· ··· ·· plné délky i fragmenty. Tyto pojmy též zahrnují postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a podobně. Dále se pro účely tohoto vynálezu pojem polypeptid vztahuje k proteinu zahrnujícímu modifikace, jako jsou delece, adice a substituce (obecně konzervativní svou povahou) nativní sekvence, pokud protein zachovává požadovanou aktivitu. Tyto modifikace mohou být úmyslné, jako je tomu prostřednictvím mutageneze směrované na místo, nebo mohou být náhodné, jako je tomu prostřednictvím mutací hostitele poskytujících proteiny, nebo chyby následkem amplifikace PCR.
Polypeptid HCV je polypeptid, jak se definuje výše, odvozený od polyproteinu HCV. Tento polypeptid nemusí být fyzicky odvozený od HCV, avšak může být vytvořený synteticky či rekombinačně. Navíc tento polypeptid může být odvozený od kteréhokoliv z kmenů HCV, jako jsou kmeny 1, 2, 3 nebo 4. Je známá řada zachovaných a proměnných oblastí mezi těmito kmeny a obecně aminokyselinové sekvence epitopů odvozené od těchto oblastí budou mít vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest homologii aminokyselinové sekvence více než 30 %, přednostně více než 40 % při seřazení sekvencí. Pojem NS3/4 polypeptid se tedy vztahuje k nativnímu NS3/4a z kteréhokoliv z různých kmenů HCV stejně tak jako k analogům NS3/4a, muteinům a imunogenním fragmentům, jak se definují níže. Jsou známy úplné genotypy mnohého z těchto kmenů. Viz například US patent č. 6 150 087 a GenBank Accession č. AJ238800 a AJ238799.
Pojmy analog” a mutein se týkají biologicky aktivních derivátů referenční molekuly nebo fragmentů těchto derivátů, které zachovávají požadovanou aktivitu, jako je imunoreaktivita v esejích, které se zde popisují. Obecně se po• · · • · »·© * © © © · · · © · © · * © · ·· #·· ·* ·· jem analog týká sloučenin majících nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s adicí jedné či více aminokyselin, substitucemi (obecně svou povahou konzervativními) a/nebo delecemi oproti nativní molekule, pokud tyto modifikace neničí imunogenní aktivitu. Pojem mutein se týká peptidů majících jedno či více peptidových mimetik (peptoidů), jak se popisují v mezinárodní publikaci č. WO 91/04282. Přednostně má analog či mutein alespoň stejnou imunoaktivitu jako nativní molekula. Způsoby přípravy polypeptidových analogů a muteinů jsou známy v oboru a popisují se dále níže.
Zvláště preferované analogy zahrnují substituce, které jsou svou povahou konzervativní, to jest takové substituce, které nastávají ve skupině aminokyselin příbuzných ve svých postranních řetězcích. Konkrétně se aminokyseliny dělí do 4 skupin: (1) kyselé - aspartát a glutamát, (2) bázické - lysin, arginin, histidin, (3) nepolární - alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a (4) polární bez náboje - glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin se někdy klasifikují jako aromatické aminokyseliny. Například lze rozumně předvídat, že izolovaná náhrada leucinu isoleucinem nebo valinem, asparátu glutamátem, threoninu serinem nebo podobná konzervativní náhrada aminokyseliny strukturně příbuznou aminokyselinou nebude mít velký účinek na biologickou aktivitu. Například může daný polypeptid zahrnovat až zhruba 5 až 10 konzervativních či nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo dokonce až zhruba 15 až 25 konzervativních nebo nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo jakékoliv celé číslo mezi 5 až 25, pokud zůstává požadovaná funkce molekuly neporušená. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno určit oblasti dané molekuly, které mohou tolerovat změnu s odkazem na grafy Hopp/4 v «
I 4 444 ► 4 • 4 »·· • 4 4 I
44 v oboru.
Woods a Kyte-Doolittle dobře známé
Fragmentem se rozumí polypeptid skládající se pouze z části intaktní polypeptidové sekvence a struktury plné délky. Fragment může zahrnovat C-terminální deleci a/nebo N-terminální deleci nativního polypeptidu. Imunogenní fragment daného proteinu HCV bude obecně zahrnovat alespoň 5 až 10 souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, přednostně alespoň zhruba 15 až 25 souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky a nejpřednostněji alespoň zhruba 20 až 50 či více souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, které definují epitop, nebo jakýkoliv počet mezi 5 aminokyselinami a sekvencí plné délky s podmínkou, že daný fragment zachovává imunoreaktivitu v esejích, které se zde popisují. Preferované imunogenní fragmenty například zahrnují, avšak bez omezení, fragmenty jádra HCV obsahující například aminokyseliny 10 až 45, 10 až 53, 67 až 88 a 120 až 130 polyproteinu, epitop 5-1-1 (v oblasti NS3 virového genomu) stejně tak jako epitopy odvozené od oblastí El, E2, c33c (NS3), clOO (NS4), NS3/4a a NS5 polyproteinu HCV, stejně tak jako kterýkoliv z dalších epitopů identifikovaných z polyproteinu HCV. Viz například Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, ££, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., £, S33-39 (1993),
Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365, Chien,
D. Y., mezinárodní publikace č. WO 94/01778, US patent č.
150 087 a 6 121 020.
Pojem epitop, jak se zde používá, se týká sekvence alespoň zhruba 3 až 5 přednostně zhruba 5 až 10 Či 15 a ne více než zhruba 1000 aminokyselin (nebo sekvence o jakémkoliv počtu mezi těmito hodnotami), která definuje sekvenci, která je sama Částí větší sekvence a váže se na protilátku • · · · · ··· · • · ♦ · · · · «· # ·· ··* ·* ·» vytvořenou na základě odpovědi na tuto sekvenci. Neexistuje žádná kritická horní mez na délku fragmentu, který může obsahovat proteinovou sekvenci téměř plné délky nebo dokonce spojený protein zahrnující dva či více epitopů polyproteinu HCV. Epitop používaný v rámci tohoto vynálezu se neomezuje na polypeptid mající přesnou sekvenci části mateřského proteinu, ze kterého se odvozuje. Virové genomy jsou skutečně ve stavu konstantního toku a obsahují několik proměnných domén vykazujících relativně vysoké stupně variability mezi izolovanými částmi. Proto pojem epitop zahrnuje sekvence identické s nativní sekvenci stejně tak jako modifikace nativní sekvence, jako jsou delece, adice a substituce (obecně svou povahou konzervativní).
Oblasti daného polypeptidu zahrnující epitop lze identifikovat s použitím řady způsobů mapování epitopů dobře známých v oboru. Viz například Epitop Mapping Protocols v monografii Methods in Molecular Biology, díl 66 (Glenn E. Morris, redakce, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Například lineární epitopy lze stanovit současnou přípravou velkého počtu peptidů na pevných nosičích, kde peptidy odpovídají částem molekuly proteinu, a reakcí peptidu s protilátkami, při které peptidy zůstávají připojené na nosiče. Tyto způsoby jsou známé v oboru a popisují se například v US patentu č. 4 708 871, Geysen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, fil, 3998-4002 (1984), Geysen a kol., Proč, Nati. Acad. Sci. USA, 82, 172-182 (1985), Geysen a kol., Molec. Immunol., 22., 709-715 (1986) .
S použitím těchto způsobů se identifikuje řada epitopů HCV. Viz například Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320-324 (1994) a další níže. Podobně se snadno identifikují konformační epitopy stanovením prostoro( Ι'Γ
Η*
Ι»ί '11 vé konformace aminokyselin, například rentgenovou krystalografií a dvojrozměrnou nukleární magnetickou rezonancí. Viz například Epitope Mapping Protocols, výše. Antigenní oblast proteinů lze též identifikovat s použitím standardních vyne sení antigenního působení a hydropatie, jako jsou výpočty s použitím například programového vybavení Omiga verze 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program využívá způsob Hopp/Woods, Hopp a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981) pro stanovení antigenního působení a způsob Kyte-Doolittle, Kyte a kol., J. Mol. Biol., 157. 105-132 (1982) pro vynesení hydropatie.
Pojem konformační epitop, jak se zde používá, se týká části proteinu plné délky nebo analogu či muteinu toho to proteinu majícího strukturní vlastnosti nativní jako ami nokyselinová sekvence kódující epitop v rámci přirozeného proteinu plné délky. Nativní strukturní vlastnosti zahrnují avšak bez omezení, glykosylaci a trojrozměrnou strukturu. Délka epitopu definující sekvenci může být předmětem širokých změn neboť, se uvažuje, že tyto epitopy se vytvářejí trojrozměrným tvarem antigenu (například skládáním). Proto stačí relativně málo aminokyselin pro definici epitopu, avšak jsou široce rozptýleny podél délky molekuly (nebo dokonce na různých molekulách v případě dimerů, atd.) s tvorbou správné konformace epitopu skládáním. Části antigenu me zi zbytky definujícími epitop nemusí být pro konformační strukturu epitopu kritické. Například delece či substituce těchto zasahujících sekvencí nemusí ovlivňovat konformační epitop s podmínkou, že sekvence kritické pro konformaci epi topu jsou zachované (například cysteiny účastnící se disulfidových vazeb, místa glykosylace atd.).
Konformační epitopy přítomné v oblasti NS3/4a se • · ··· ·· « · · « «» · ·· 9·· ·» ·« snadno identifikují s použitím výše diskutovaných způsobů. Navíc přítomnost či nepřítomnost konformačního epitopu v daném polypeptidu lze snadno stanovit screeningem antigenu protilátkou (polyklonálním sérem či monoklonálním vůči konformačnímu epitopu) a srovnáním reaktivity s případem denaturované verze antigenu, která zachovává nejvýše lineární epitopy. Při takovém screeningu s použitím polyklonálních protilátek může být výhodné absorbovat polyklonální sérum nejprve denaturovaným antigenem a pozorovat, zda zadržuje protilátky proti danému antigenu. Navíc v případě NS3/4a molekula zachovávající nativní konformaci bude též mít proteasové a případně i helikasové enzymatické aktivity. Tyto aktivity lze detekovat s použitím enzymatických analýz, jak se dále popisují níže.
Přednostně se konformační epitop tvoří rekombinačně a exprimuje se v buňce, ze které jej lze odstranit za podmínek zachovávajících jeho požadované strukturní funkce, například bez denaturace epitopu. Tyto buňky zahrnují bakterie, kvasinky, hmyzí a savčí buňky. Exprese a izolace rekombinačních konformačních epitopů z polyproteinu HCV se popisuje například v mezinárodní publikaci č. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053,WO 92/08734. Alternativně lze exprimovat antigeny a dále renaturovat protein po jeho získání. Uvažuje se, že chemická syntéza může též poskytnout konformační antigenové mimitopy vykazující zkříženou reakci s nativním konformačním epitopem antigenu.
Pojem vícečetný epitopový spojený antigen nebo MEFA, jak se zde používá, znamená polypeptid, ve kterém tvoří více HCV antigenů část jednoho spojitého řetězce aminokyselin, který se v přírodě nevyskytuje. HCV antigeny lze spojovat přímo navzájem peptidovými vazbami nebo je lze od• · ♦ · ·
- 20 dělovat vloženými sekvencemi aminokyselin. Spojené antigeny mohou též obsahovat sekvence exogenní vůči HCV polyproteinu. Navíc mohou přítomné HCV sekvence vznikat z více genotypů a/nebo izolovaných částí HCV. Příklady konkrétních MEFA pro použití v imunoesejích podle tohoto vynálezu se podrobně popisují například v mezinárodní publikaci Č. WO 97/44469 a dále se popisují níže.
Pojem protilátka” znamená molekulu, která se chemicky nebo fyzikálně váže na daný polypeptid. Proto je protilátka jádra HCV molekula, která se specificky váže na protein jádra HCV. Pojem protilátka, jak se zde používá, zahrnuje protilátky obdržené z polyklonálních i monoklonálních přípravků, stejně tak jako hybridní (chimérické) protilátkové molekuly (viz například Winter a kol., Nátuře, 349. 293-299 (1991) a US patent č. 4 816 567, F(ab’)2 a F(ab) fragmenty, molekuly Fv (nekovalentní heterodimery, viz například Iribar a kol., Proč Nati Acad Sci USA, 69, 2659-2662 a Ehrich a kol., Biochem., 12, 4091-4096 (1980), molekuly Fv o jednom řetězci (sFv) (viz například Huston a kol., Proč Nati Acad Sci, £2, 5879-5883 (1988), dimerní a trimerní konstrukty protilátkových fragmentů, miniprotilátky (viz například Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B. 120-126 (1992), humanizované protilátkové molekuly (viz například Riechmann a kol., Nátuře, 332, 323-327 (1988), Verhoeyan a kol·., Science, 239. 1534-1536 (1988) a patentovou publikaci UK, č. GB 2 276 169, publikovanou 21. září 1994) a jakékoliv funkční fragmenty obdržené z těchto molekul, kde tyto fragmenty zachovávají imunologické vazebné vlastnosti mateřské protilátkové molekuly.
Pojem monoklonální protilátka se týká protilátkové9 · »· ho složení majícího homogenní populaci protilátek. Tento termín se neomezuje na druh či zdroj protilátky ani se neomezuje způsobem, kterým vzniká. Proto tento termín zahrnujprotilátky obdržené z myších hydridomů stejně jako lidské monoklonální protilátky obdržené s použitím spíše lidských než myších hybridomů. Viz například Cote a kol., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, str. 77.
Rekombinační protein je protein, který zachovává svou požadovanou aktivitu a který byl připraven způsoby rekombinační deoxyribonukleové kyseliny, jak se zde popisuje. Obecně se daný gen klonuje a poté se exprímuje v trans formo váných organismech, jak se dále popisuje níže. Hostitelský organismus exprímuje cizí gen s obdržením proteinu za podmí nek exprese.
Pojem izolovaný ve vztahu k polypeptidu znamená, ž je daná molekula oddělená a diskrétní oproti celému organis mu, ve kterém je tato molekula přítomná v přírodě, nebo je přítomná v podstatě v nepřítomnosti jiných biologických mak romolekul téhož typu. Pojem izolovaný v souvislosti s polynukleotidem je molekula nukleové kyseliny zbavená jako ce lek nebo část sekvencí normálně připojených k této molekule v přírodě nebo sekvence, jak existuje v přírodě, avšak mají připojené heterologní sekvence, nebo molekula oddělená z chromozomu.
Pojem ekvivalentní antigenní determinant znamená antigenní determinant z různých podruhů či kmenů HCV, jako jsou kmeny 1, 2 nebo 3 HCV. Konkrétněji jsou známé epitopy jako 5-1-1 a tyto epitopy se mění mezi kmeny 1, 2 a 3. Epitop 5-1-1 z různých kmenů tedy představuje antigenní determinanty, takže kopie a dokonce ani jejich sekvence nejsou
4·
- 22 4 4 444 identické. Obecně budou mít aminokyselinové sekvence ekvivalentních antigenních determinantů vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest sekvenční homologii více než 30 %, přednostně více než 40 %, když jsou obě sekvence seřazeny.
Homologie se týká procentické podobnosti mezi dvěma polynukleotidovými nebo dvěma polypeptidovými zbytky. Dvě deoxyribonukleové kyseliny nebo dvě polypeptidové sekvence jsou podstatně homologní navzájem, pokud sekvence vykazují alespoň 50 %, přednostně alespoň 75 %, přednostněji alespoň 80 až 85 %, ještě přednostněji alespoň 90 % a nejpřednostněji alespoň 95 až 98 % sekvenční podobnosti na definované délce molekul. Pojem podstatně homologní, jak se zde používá, se též vztahuje k sekvencím vykazujícím úplnou identitu se specifikovanou sekvencí deoxyribonukleové kyseliny nebo polypeptidu.
Obecně se identita týká přesné korespondence mezi nukleotidy nebo aminokyselinami ve dvou polynukleotidových či polypeptidových sekvencích. Procento identity lze stanovit přímým srovnáním sekvenční informace mezi dvěma molekulami seřazením sekvencí, zjištěním přesného počtu odpovídajících shodných dvojic mezi dvěma seřazenými sekvencemi, dělením délkou kratší sekvence a násobením výsledku 100.
Pro pomoc při analýze podobnosti a identity lze použít snadno dostupný počítačový program, jako je ALIGN,
M. 0. Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure M.O. Dayhoff, redakce, 2, Suppl. 5, 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, který přizpůsobuje algoritmus lokální homologie Smithe a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482-489 (1981) pro peptidovou analýzu. Programy pro stanovení nukleotidové sekvenční podobnosti • « • · · ·· *
- 23 a identity jsou k dispozici jako Wisconsin Sequence Analysis Package, verze 8 {dodává Genetics Computer Group, Madison,
WI), například programy BESTFIT, PASTA a GAP, které se rovněž zakládají na algoritmu Smithe a Watermana. Tyto programy lze snadno použít s parametry standardního nastavení doporučenými výrobcem a popsanými ve výše citovaném Wisconsin Sequence Analysis Package. Například procentická podobnost dané nukleotidové sekvence s referenční sekvencí se stanoví s použitím algoritmu homologie Smithe a Watermana s tabulkou skóre ve standardním nastavení a s mezerou Šesti nukleotidových poloh.
Další způsob zjištění procentické podobnosti v souvislosti s tímto vynálezem je použití souboru programu MPSRCH, University of Edinburgh, autorů John F. Collinse a Shane S. Sturroka distribuovaný společností IntelliGenetics, lne. (Mountain View, CA). Z těchto souborů lze použít Smithův-Watermanův algoritmus s použitím parametrů standardního nastavení ze skórovací tabulky [například gap open penalty 12, gap extension penalty 1 a gap 6]. Hodnota Match (shody) vytvořená z údajů odráží sekvenční podobnost . Další vhodné programy pro výpočet procenta identity či podobnosti mezi sekvencemi jsou v oboru dobře známy, například další program BLAST použitý s parametry standardního nastavení. Například BLASTN a BLASTP je použitelný s následujícími parametry standardního nastavení: genetický kód = standardní, filtr = žádný, vlákno = obě, zkrácení = 60, očekávání = 10, Matrice = BLOSUM62, popisy = 50 sekvencí, hodnocení = vysoké skóre, databáze = nerendundantní, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS překlady + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podrobnosti o těchto programech lze nalézt na následující internetové adrese http:/www.nebi.nlm.gov/cgi -bin/BLAST.
• ♦ · « • * * · · • · · · ·· ·
- 24 *· ···
Alternativně lze homologii stanovit hybridizací polynukleotidů za podmínek tvořících stabilní duplexy mezi homologními oblastmi s následným natrávením jednovláknově specifickou nukleázou a stanovením velikosti natrávených fragmentů. Sekvence DNA, které jsou v podstatě homologní, lze identifikovat Southernovou hybridizací například za přísných podmínek definovaných pro daný systém. Definice příslušných podmínek hybridizace spadá do oblasti zkušenosti v oboru.
Viz například Sambrook a kol., výše, DNA Cloning, výše, Nucleic Acid hybridization, výše.
Kódovací sekvence nebo sekvence, která kóduje zvolený polypeptid, je molekula nukleové kyseliny, která se přepisuje (v případě deoxyribonukleové kyseliny) a překládá {v případě mRNA) do polypeptidu in vitro nebo in vivo při umístění pod kontrolu příslušných regulačních sekvencí. Meze kódovací sekvence se stanoví zahajovacím kodonera při konci 5' (amino) a kodonem zastavení translace při konci 3' (karboxy). Sekvence ukončení transkripce se může připojovat v poloze 3' ke kódovací sekvenci.
Pojem operabilně spojený se týká uspořádání elementů, ve kterých se takto popisované složky konfigurují tak, aby prováděly své požadované funkce. Proto j e daný promotor operabilně připojený ke kódovací sekvenci schopen provádět expresi kódovací sekvence za přítomnosti vhodných transkripčních faktorů atd. Promotor nemusí být spojený s kódovací sekvencí, pokud je jeho funkcí směrovat její expresi. Proto například vložené nepřeložené a přitom přepsané sekvence mohou být mezi sekvencí promotoru a kódovací sekvencí, jako je tomu pro přepisované introny, a sekvence promotoru se přitom může považovat za operabilně připojenou ke kódovací sek- 25 věnci.
Pojem kontrolní element se týká sekvence polynukleotidu, která napomáhá expresi kódovací sekvence, ke které se připojuje. Tento pojem zahrnuje promotory, sekvence ukončení transkripce, domény vzestupné regulace, signály polyadenylace, nepřeložené oblasti, včetně 5’-UTR a 3'-UTR a ve vhodných případech vedoucí sekvence a enhancery, které společně zajišťuj i transkripci a translaci kódovací sekvence v buňce hostitele.
Pojem promotor, jak se používá zde, je DNA regulační oblast schopná vazby RNA polymerasy v hostitelské buňce a zahájení transkripce sestupné (směr 3') kódovací sekvence, ke které je operabilně připojená. Pro účely tohoto vynálezu zahrnuje sekvence promotoru minimální počet bází či elementů nezbytných pro zahájení transkripce daného genu na úrovních detekovatelných nad pozadím. V rámci sekvence promotoru je místo zahájení transkripce stejně tak jako domény vazby proteinu (sekvence konsensu) odpovědné za vazbu RNA polymerasy. Eukaryotické promotory často, avšak ne vždy, obsahují boxy TATA a boxy CAT.
Kontrolní sekvence směruje transkripci kódovací sekvence v buňce, když se RNA polymerasa váže na sekvenci promotoru a přepisuje kódovací sekvenci do mRNA, která se poté překládá do kódovaného polypeptidu kódovací sekvencí.
Expresní kazeta nebo expresní konstrukt se týká souboru schopného směrovat expresi dané sekvence (sekvencí) nebo daného genu (genů). Expresní kazeta zahrnuje kontrolní prvky, jak se popisují výše, jako je promotor, který je operabilně připojený k dané sekvenci (sekvencím) nebo danému • · • ·
- 26 • » · »« ··· )
·♦ genu (genům) a často též zahrnuje sekvenci polyadenylace.
Při určitých ztělesněních tohoto vynálezu může být expresní kazeta, která se zde popisuje, obsažena v rámci plasmidového kontruktu. Navíc ke složkám expresní kazety může plasmidový konstrukt též obsahovat jeden či více volitelných markérů, jejichž signál umožňuje existenci plasmidového konstruktu ve formě jednovláknové deoxyribonukleové kyseliny (například původ M13 replikace), v alespoň jednom místu vícečetného klonování a savčí původ replikace (například SV40 nebo adenovirový původ replikace).
Pojem transformace, jak se zde používá, se týká vložení exogenního polynukleotidu do hostitelské buňky bez ohledu na způsob použitý při tomto vložení: například transformace přímým zachycením, transfekcí, infekcí a podobně. Ohledně konkrétních způsobů transfekce viz dále níže. Exogenní polynukleotid se může udržovat jako neintegrovaný vektor, například episom nebo alternativně může být integrovaný do hostitelova genomu.
Hostitelská buňka je buňka, která se transformovala nebo je schopna transformace exogenní sekvencí deoxyribonukleové kyseliny.
Obvyklý pevný nosič značí jednotlivou tuhou matrici, ke které se polypeptidy použité v daných imunoesejích vážou kovalentně nebo nekovalentními způsoby, jako je hydrofobní adsorpce.
Pojem imunologicky reaktivní znamená, že daný antigen bude reagovat specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku od jednotlivce infikovaného HCV.
v · · ·· ·
- 27 Pojem imunitní komplex znamená kombinaci vytvořenou při vazbě protilátky na epitop antigenu.
Pojem biologický vzorek, jak se zde používá, se týká vzorku tkáně nebo kapaliny izolované ze subjektu včetně, avšak bez omezení, například krve, plazmy, séra, hmoty stolice, moče, kostní dřeně, žluče, spinální tekutiny, lymfatické tekutiny, vzorků kůže, vnějších sekretů kůže, respíračního intestinálního a urogenitálního traktu, slz, slin, mléka, krvinek, orgánů, biopsií a rovněž vzorků složek buněčné kultury in vitro včetně, avšak bez omezení, upravených medií získaných z růstu buněk a tkání v médiu, například rekombinantních buněk a buněčných složek.
Pojmy značka a detekovatelná značka, jak se zde používají, se týkají molekuly schopné detekce včetně, avšak bez omezení, radionuklidů, fluorescenčních látek, chemiluminiscenčních látek, chromoforů, enzymů, enzymových substrátů, enzymových kofaktorů, enzymových inhibitorů, chromoforů, barviv, kovových iontů, kovových solů, ligandů (například biotin, strepavidin nebo hapteny) a podobně. Pojem fluorescenční látka se týká látky nebo její části, která je schopná vykazovat fluorescenci v detekovatelném rozmezí. Konkrétní vzorky značek, které lze využít v rámci tohoto vynálezu, zahrnují, avšak bez omezení, křenovou peroxidasu (HRP), fluoresceín, FITC, rhodamin, dansyl, umbelliferon, dimethylakridiniumester (DMAE), texaskou červeň, luminol, NADPH a α-β-glaktosidasu.
II. Způsoby provedení vynálezu
Před podrobným popisem tohoto vynálezu je třeba si • A • · ···
A A 9
9 9 ·
999 * uvědomit, že se tento vynález neomezuje na konkrétní formulace nebo že se parametry procesu mohou samozřejmě měnit. Je třeba si též uvědomit, že terminologie, která se zde používá, slouží pouze pro účely popisů konkrétních ztělesnění tohoto vynálezu a není omezující.
když počet směsí a způsobů podobných či ekvivalentních těm, které se zde popisují, lze použít v praxi tohoto vynálezu, jsou preferovanými látkami a způsoby ty, které se zde popisují.
Jak se poznamenává výše, zakládá se tento vynález na objevu nových diagnostických způsobů pro přesné stanovení časné infekce HCV. Tyto způsoby se zakládají na identifikaci a použití vysoce imunogenních HCV protilátek a antigenů, které se vyskytují v časných fázích serokonverze HCV, čímž se zvyšuje správnost detekce a snižuje výskyt falešných výsledků. Tyto způsoby lze vhodným způsobem provádět ve formátu jednotlivé eseje.
Konkrétněji se esej provádí na pevné podložce, ke které se naváže jedna či více protilátek proti jádru HCV (směrované buď proti stejným nebo jiným epitopům jádra HCV) a epitop odvozený od oblasti NS3/4a polyproteinu HCV. Příklady konkrétních protilátek proti jádru použitelných v tomto vynálezu zahrnují, avšak bez omezení, protilátkové molekuly, jako jsou monoklonální protilátky zaměřené proti epitopům v oblasti jádra mezi aminokyselinami 10 až 53, aminokyselinami 10 až 45, aminokyselinami 67 až 88, aminokyselinami 120 až 130 nebo protilátky zaměřené proti epitopům jádra identifikovaným například v Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol, &, • · ··♦
·· » ♦ · · · • · · · ***** ·· ·· ·* ··
S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365, D. Y. Chien, mezinárodní publikace č. WO 94/01778 a US patentové přihlášky č. 08/403 590 a 08/444 818 přijaté do obecného vlastnictví.
Oblast NS3/4a polyproteinu HCV se popisuje a aminokyselinová sekvence a celková struktura proteinu se uveřejňuje například v Yao a kol., Structure, Ί, 1353-1363 (1999), Sáli a kol., Biochem., 17, 3392-3401 (1998) a R. Bartenschlager, J. Viral Hepat., £, 165-181 (1999). Víz též Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 843 752. Imunoeseje subjektu používají alespoň jeden konformační epitop odvozený od oblasti NS3/4a, který se vyskytuje v konformaci nalézané v přirozené částici HCV nebo v jejím neúčinném produktu, jak se ukazuje zachováním proteasové a případně helikasové enzymatické aktivity normálně vykazované produktem genu NS3/4a a/nebo imunoreaktivitou antigenu s protilátkami v biologickém vzorku subjektu infikovaného HCV a ztrátou imunoreaktivity epitopu při denaturaci antigenu. Například konformační epitop lze porušit zahříváním, změnou pH na mimořádně kyselé či bázické nebo přidáním známých organických denaturačních prostředků, jako je dithiothreitol (DTT) nebo příslušný detergent, viz například Protein Purification Methods, a practical approach (E. L. V. Harris a S. Angal, red., IRL Press), a denaturovaný produkt se srovnává s produktem, který se nezpracovává, jak se popisuje výše,
Proteasovou a helikasovou aktivitu lze stanovit s použitím standardních způsobů stanovení enzymů dobře známých v oboru. Například lze proteasovou aktivitu stanovit s použitím eseji dobře známých v oboru. Viz například Takéshita a kol., Anal. Biochem., 247. 242-246 (1997), Kakiuchi a kol., J. Biochem., 122. 749-755 (1997), Sáli a kol., Bio• · ··· ·· ·
- 30 chemistry, 37. 3392-3401 (1998), Cho a kol., J. Virol.
Meth., 72, 109-115 (1998), Cerretani a kol., Anal. Biochem., 266. 192-197 (1999), Zhang a kol., Anal. Biochem., 270, 268-275 (1999), Kakiuchi a kol., J. Virol. Meth., ££, 77-84 (1999), Fowler a kol., J. Biomol. Screen, 2, 153-158 (2000) a Kim a kol., Anal. Biochem., 284, 42-48 (2000). Zvláště vhodnou esej pro stanovení aktivity proteasy ukazují příklady popsané níže.
Podobně jsou v oboru dobře známé eseje aktivity helikasy a aktivitu helikasy epitopů NS3/4a lze stanovit například s použitím eseje ELISA, jak se popisuje například v Hsu a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 594-599 (1998) a scintilaČním systémem, jak popisuje Kyono a kol., Anal. Biochem., 257. 120-126 (1998) screeningovými esejemi s vysokými výkony, jak se popisují například v Hicham a kol., Antiviral Res., 46. 181-193 (2000) a Kwong a kol., Methods Mol. Med., 24. 97-116 (2000) stejně tak jako jinými způsoby eseji známými v oboru. Viz například Khu a kol., J. Virol., 22, 205-214 (2001), Utama a kol., Virology, 222, 316-324 (2000), Paolini a kol., J. Gen. Virol., £1, 1335-1345 (2000), Preugschat a kol., Biochemistry, 22/ 5174-5183 (2000), Preugschat a kol., Methods Mol. Med., 19. 353-364 (1998) a Hesson a kol., Biochemistry, 22, 2619-2625 (2000).
Délka antigenu je dostatečná pro udržení imunoreaktivního konformaČního epitopů. Často má užívaný polypeptid obsahující antigen téměř plnou délku, avšak tento polypeptid může být též zkrácený, například pro zvýšení rozpustnosti či zlepšení sekrece. Obecně se může konformační epitop v NS3/4a exprimovat jako rekombinantní polypeptid v buňce a tento polypeptid poskytuje epitop žádané formy, jak se popisuje podrobně níže.
• 4 ··* · • 4 « *
3J
- 31 Reprezentativní aminokyselinové sekvence pro polypeptidy NS3/4a ukazují obrázky 3 a obrázky 4A až 4D. Zvýrazněný alanin v poloze 182 na obrázku 3 se substituuje místo aktivního šeřinu přítomného v této poloze, aby se zabránilo autokatalýze molekuly, která jinak mohla nastat. Aminokyselinová sekvence znázorněná v polohách 3 až 686 obrázků 4A až 4D odpovídá aminokyselinovým polohám 1027 až 1711 HCV-1. Iniciátorový kodon (ATG) kódující Met je znázorněný jako poloha 1. Navíc Thr normálně přítomný v poloze 1428 HCV-1 {aminokyselinová poloha 403 obrázku 4) se mutuje na Pro a Ser normálně přítomný v poloze 14289 HCV-1 (aminokyselina poloha 404 v obrázku 4) se mutuje na Ile. Avšak nativní sekvence s nebo bez N-terminálního Met, znázorněný analog s nebo bez N-terminálního Met nebo další analogy a fragmenty lze použít v esejích subjektu, pokud se epitop tvoří s použitím způsobu, který zachovává nebo obnovuje nativní konformaci, takže se zachovává proteasová a případně též helikasová aktivita. Dasmahapatra a kol., US patent č.
843 752 a Zhang a kol., US patent č. 5 990 276 popisují analogy NS3/4a.
NS3 proteasa NS3/4a je zhruba v polohách 1027-1207, číslováno vzhledem k HCV-1, polohy 1 až 182 obrázku 4. Struktura NS3 proteasy a aktivní místo jsou známy. Viz například De Francesco a kol.. Antivir. Ther., 3., 99-109 (1998), Koch a kol., Biochemistry, 40. 631-640 (2001). Změny nativní sekvence, které lze normálně tolerovat, jsou ty, které jsou vně aktivního místa molekuly. Konkrétně je vhodné zachovávat aminokyseliny 1- nebo 2 až 155 obrázku 4 s málo substitucemi nebo pouze s konzervativními substitucemi. Aminokyseliny mimo 155 budou tolerovat větší změny. Navíc, pokud se použijí fragmenty sekvence NS3/4a znázorněné na ob• · ··· • · · * « < · » · · · 1· ··« ·· ··
- 32 rázku 4, budou tyto fragmenty obecně zahrnovat alespoň aminokyseliny 1 nebo 2 až 155, přednostně aminokyseliny 1 nebo 2 az 175 a nejpřednostněji aminokyseliny 1 nebo 2 až 182 s N-terminálními Med nebo bez nich. Helikasová doména je zhruba v polohách 1193 až 1657 HCV-1 (polohy 207 až 632 na obrázku 4). Proto, pokud se požaduje helikasová aktivita, bude tato část molekuly zachovaná s málo změnami nebo pouze s konzervativními změnami. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno stanovit další oblasti, které budou tolerovat změnu na základě známé struktury NS3/4a.
Pevný nosič může též obsahovat další antigeny. Například antigeny tvořené spojením více epitopů (zvané MEFA), jak se popisují v mezinárodní publikaci č. WO 97/44469, se mohou vázat na pevný nosič pro použití v esejích subjektu. Tyto MEFA obsahují víceČetné epitopy odvozené od dvou či více různých virových oblastí znázorněných na obrázku 1 a v tabulce 1. Konkrétně, jak ukazuje obrázek 1 a tabulka 1, tvoří HCV polyprotein při štěpení alespoň deset různých produktů v pořadí
NH2-jádro-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Polypeptid jádra se vyskytuje v polohách 1 až 191, číslováno vzhledem k HCV-l [viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 2451-2455 (1991) ohledně genomu HCV-1]. Tento polypeptid se dále zpracovává s obdržením HCV polypeptidu s aminokyselinami zhruba 1 až 173. Polypeptidy obálky, El a E2 se vyskytují zhruba v polohách 192 až 383 respektive 384 až 746. Doména P7 je zhruba v polohách 747 až 809, NS2 je integrální membránový protein s proteolytickou aktivitou a je zhruba v polohách 810 až 1026 polyproteinu. NS2, buď samotný nebo v kombinaci s NS3 (v polohách zhruba 1027 až 1657) štěpí vazbu NS2-NS3, která tvoří konec N NS3 a uvolňuje velký polyprotein zahrnující aktivity serin proteasy a RNA helika« · ··· ··
- 33 « · · · ♦ · ··« ·♦ ·» sy. NS3 proteasa v polohách 1027 až 1207 slouží ke zpracování zbývajícího polyproteinu. Helikasová aktivita je zhruba v polohách 1193 až 1657. Dokončení zrání polyproteinu se zahajuje autokatalytickým štěpením spojení NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serin proteasou. Následující štěpení HCV polyproteinu zprostředkované NS3 zahrnuje rozpoznání spojů štěpení polyproteinu molekulou NS3 dalšího polypeptidu. V těchto reakcích NS3 uvolňuje kofaktor NS3 (NS4a v polohách 1658 až 1711), dva proteiny (NS4b zhruba v polohách 1712 až 1972 a NS5a zhruba v polohách 1973 až 2420) a RNA-dependentní RNA polymerasu (NS5b přítomnou zhruba v polohách 2421 až 3011).
Tabulka l
Doména | Přibližné rozmezí·* |
C (core) | 1-191 |
El | 192-383 |
E2 | 384-746 |
P7 | 747-809 |
NS2 | 810-1026 |
NS3 | 1027-1657 |
NS4a | 1658-1711 |
NS4b | 1712-1972 |
NS5a | 1973-2420 |
NS5b | 2421-3011 |
♦Číslování vzhledem k HCV-l. Viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 2451-2455 (1991).
Vícečetné antigeny HCV jsou částí jednoho spojitého « · ··* • · 9 · 9 9 9 9 9 ·· · ·· ··· · *
- 34 řetězce aminokyselin, který se nevyskytuje v přírodě. Proto je lineární pořadí epitopů odlišné od jejich lineárního pořadí v genomu, ve kterém se vyskytují. Lineární pořadí sekvencí MEFA pro použití v tomto vynálezu je přednostně uspořádané pro dosažení optimálního antigenního působení. V preferovaných způsobech pocházejí epitopy od více než jednoho kmene HCV, čímž se zajišťuje přídavná schopnost detekovat vícečetné kmeny HCV v jedné eseji. Proto mohou MEFA pro použití v tomto vynálezu obsahovat různé immunogenní oblasti odvozené od výše popsaného polyproteinu. Navíc protein obdržený z posunu rámce v oblasti jádra polyproteinu, jak se popisuje v mezinárodní publikaci č. WO 99/63941, je použitelný v MEFA. V případě požadavku se v hybridním proteinu může vyskytnout alespoň 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 či více epitopů odvozených od polyproteinu HCV.
Například epitopy odvozené od hypervariabilní oblasti E2, jako je oblast aminokyselin 384 až 410 nebo 390 až 410, mohou být součástí antigenu MEFA. Zvláště účinným epitopem E2 je takový, který zahrnuje sekvenci konsensu odvozenou z této oblasti, jako je sekvence konsensu Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, která představuje sekvenci konsensu pro aminokyseliny 390 až 410 genomu HCV typu 1. Reprezentativní epitop E2 přítomný v MEFA podle tohoto vynálezu může obsahovat hybridní epitop v rozmezí aminokyselin 390 až 444. Tento hybridní epitop E2 může zahrnovat sekvenci konsensu představovanou kyselinami 390 až 410 připojenou k nativní aminokyselinové sekvenci pro aminokyseliny 411 až 444 HCV E2.
Navíc se mohou antigeny odvozovat od různých kmenů HCV. Jsou známy vícečetné virové kmeny HCV a epitopy odvozené od kterýchkoliv z těchto kmenů lze používat ve spojeném
4
4··
4
- 35 44 proteinu. Je dobře známo, že v jakémkoliv druhu organismu existuje individuální proměnlivost a dále, že daný organismus, jako je virus, může mít řadu různých kmenů. Například, jak se popisuje výše, zahrnuje HCV alespoň 6 genotypů. Každý z těchto genotypů zahrnuje ekvivalentní antigenní determinanty. Konkrétněji zahrnuje každý kmen řadu antigenních determinantů, které jsou přítomné ve všech kmenech viru, avšak jsou mírné rozdíly mezi jednotlivými kmeny viru. HCV například zahrnuje antigenní determinant známý jako 5-1-1 (viz obrázek 1). Tento konkrétní antigenní determinant je ve třech různých formách na třech různých virových kmenech HCV,
V souladu s tím se v preferovaném ztělesnění podle tohoto vynálezu vyskytují všechny tři formy 5-1-1 na antigenu obdrženém spojením více epitopů použitém v imunoesejích prováděných na subjektu. Podobně mohou být též přítomny ekvivalentní antigenní determinanty z oblasti jádra různých kmenů HCV. Obecně mají ekvivalentní antigenní determinanty vysoký stupeň homologie ve smyslu aminokyselinové sekvence, který je obecně 30 % či více, přednostně 40 % či více při seřazení. Epitop víceČetné kopie podle tohoto vynálezu může též zahrnovat více kopií, které jsou přesnými kopiemi téhož epitopů.
Reprezentativní MEFA pro použití v těchto analýzách se popisuje v mezinárodní publikaci č. WO 97/44469. Další reprezentativní MEFA pro toto použití zahrnují MEFA 12, MEFA 13 a MEFA 13.1. Je třeba si uvědomit, že tyto MEFA jsou čistě reprezentativní a v těchto analýzách lze používat další epitopy odvozené od genomu HCV a lze je inkorporovat do těchto nebo jiných MEFA.
Sekvenci DNA a odpovídající aminokyselinovou sekvenci MEFA 12 znázorňují obrázky 7A až 7F. Obecný strukturní vzorec MEFA 12 znázorňuje obrázek 6 a je následující: hSOD-El (typ * · • · ··· • · · · · «· ··♦ »· ··
1) -Ε2 HVR konsensus(typ la)-E2 HVR konsensus (typy 1 a
2) -c33c krátký(typ 1)-5-1-1(typ 1)-5-1-1(typ 3)-5-1-1(typ 2)-cl00(typ l)-NS5(typ l)-NS5(typ 1)-jádro(typy 1+2)-jádro(typy 1+2). Tento epitop s vícečetnými kopiemi zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci, číslováno vzhledem k HCV-1 (číslování aminokyselin popsané níže vyplývá z určení číslování podle Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88. 2451-2455 (1991), kde aminokyselina 1 je první methionin kódovaný kódovací sekvencí oblasti jádra): aminokyseliny 1 až 69 superoxid dismutasy (SOD se používá pro zvýšení rekombinantní exprese proteinu), aminokyseliny 303 až 320 polyproteinu z oblasti El, aminokyseliny 390 až 410 polyproteinu představujícího sekvenci konsensu pro hypervariabilní oblast HCV-la a E2, aminokyseliny 384 až 414 polyproteinu z oblasti E2, představující sekvenci konsensu pro hypervariabilní oblasti E2 HCV-1 a HCV-2, aminokyseliny 1211 až 1457 polyproteinu HCV-i definující helikasu, tři kopie epitopu z 5-1-1, aminokyseliny 1689 až 1735, jedna z HCV-1, jedna z HCV-3 a jedna z HCV-2, kde tyto kopie jsou ekvivalentní antigenním determinantům ze tří různých virových kmenů HCV, HCV polypeptid C100 HCV-1, aminokyseliny 1901-1936 polyproteinu, dvě přesné kopie epitopu z oblasti NS5 HCV-1, každá z aminokyselin 2278 až 2313 HCV polyproteinu, a dvě kopie tří epitopů z oblasti jádra, dvě z HCV-1 a jedna z HCV-2, které jsou ekvivalentní antigenním determinantům představovaným aminokyselinami 9 až 53 a 64 až 88 HCV-1 a 67 až 84 HCV-2.
Tabulka 2 ukazuje polohy aminokyselin různých epitopů v MEFA 12 s odkazem na obrázky 7A až 7F. Číslování v tabulkách se vztahuje k HCV-1. Viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, ££, 2451-2455 (1991). MEFA 13 a 13.1 rovněž sdílejí obecný vzorec popsaný výše pro MEFA 12 s modifikacemi znázorněnými v tabulkách 3 a 4.
• 4
4 444 • 4 · ·· 4 • · « · • 4 444 44 44
Tabulka 2
MEFA 12
I mefa aa# 1 | 1 toncové místo 5' | epitope | hcvaa# | kmen |
1-69* | Ncol | hSOD | ||
72-89 | Mlul | El | 303-320 | 1 |
92-112 | tfzWlll | E2HVRla konsensus | 390-410 | 1 |
113-143 | E2HVR1+2 konsensus | 384-414 | 1,2 | |
146-392 | C33C krátký' | 1211-1457 | 1 | |
395-441 | Sphl | 5-1-1 | 1689-1735 | 1 |
444-490 | Nrul | 5-1-1 | 1689-1735 | 3 |
493-539 | Clal | 5-1-1 | 1389-1735 | 2 |
542-577 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
580-615 | Xbal | NS5 | 2278-2313 | 1 |
618-653 | Bghl | NS5 | 2278-2313 | 1 . |
654-741 | Ncol | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
742-829 | Balí | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
*Protein SOD je zkrácený tak, že detekční konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, se neváže na MEFA. Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek proti jádru HCV použitých v detekci s MEFA.
• · • · ··· • * • · · · · « ♦ ·♦ ··» ·» ··
Tabulka 3
MEFA 13
mefaaa# | 5' end site | epitop | hcv aa# | kmen |
1-156 | Nco\ | mutovaný hSOD(aa7072, ALA) | ||
161-178 | Mlůl | El | 303-320 | 1 |
181-201 | Hindlll | E2HVRla konsensus | 390-410 | 1 |
202-232 | E2HVR1+2 konsensus | 384-414 | 1,2 | |
235-451 | C33C krátký’ | 1211-1457 | 1 | |
454-500 | Hindlll | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 1 |
503-549 | Nrul | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 3 |
552-598 | Clal | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 2 |
601-636 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
639-674 | Xbal | NS5 | 2278-2313 | 1 |
677-712 | BglU | NS5 | 2278-2313 | 1 |
713-800 | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
801-888 | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
* Epitopy 5-1-1 se modifikují eliminací možných míst štěpení (CS nebo CA) cílených NS3/4a rekombinantním proteinem. Místo CS nebo CA se sekvence mění na PI. Navíc se protein SOD mutuje takovým způsobem, že se detekční konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neváže na MEFA, Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek jádra HCV použitých při detekci na MEFA.
• 9 » »
9· ·*· ·· ·
Tabulka 4
MEFA 13.1
— mefa aa# | -r koncové místo 5 | epitop | hcv aa# | kmen |
1-86 | Ncol | mutovaný hSOD(aa7072, ALA) | ||
89-106 | Mlul | El | 303-320 | 1 |
109-129 | HindRl | E2HVRla konsensus | 390-410 | 1 |
130-160 | E2HVR1+2 konsensus | 384-414 | 1,2 | |
163-379 | C33C králky | 1211-1457 | 1 | |
382-428 | HindlQ | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 1 |
431-477 | Nrul | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 3 |
480-526 | Clal | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 2 |
529-564 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
567-602 | Xbal | NS5 | 2278-2313 | 1 |
605-640 | BglU | NS5 | 2278-2313 | 1 |
641-728 | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
729-816 | epitopy jádra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
*Epitopy 5-1-1 se modifikují eliminací možných míst štěpení (CS nebo CA) cílených NS3/4a rekombinantním proteinem. Místo CS nebo CA se sekvence mění na PI. Navíc se protein SOD mutuje takovým způsobem, že se detekční konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neváže na MEFA. Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek jádra HCV použitých při detekci na MEFA.
• · « • · • · · «« • · » · ·· «»
V jednom formátu eseje se vzorek kombinuje s pevným nosičem, jak se dále popisuje níže. Pokud se vzorek infikuje HCV, budou se antigeny jádra, stejně tak jako protilátky proti těmto epitopům přítomné na pevném nosiči, vázat na složky pevného nosiče. Poté se přidá detekovatelné značená protilátka proti jádru. Značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu než protilátka proti jádru, která se váže na pevný nosič. Tato protilátka proti jádru se váže na antigen jádra zachycený protilátkami proti jádru na pevném nosiči.
Rovněž se přidává antigen reagující se zachycenou protilátkou HCV z biologického vzorku, která je reaktivní s NS3/4a epitopem. Tento antigen je přednostně epitop odvozený od oblasti NS3 polyproteinu HCV. Tento antigen váže zachycenou protilátku HCV ze vzorku. Je známá řada antigenů včetně těchto epitopů, avšak bez omezení, odvozených z oblastí c33c a clOO stejně tak jako hybridních proteinů zahrnujících epitop NS3, jako je c25. Tyto a další epitopy NS3 jsou použitelné v těchto esejích a jsou známy v oboru a popisují je například Houghton a kol., US patent č.
350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89. 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., £, S33-39 (1993). mezinárodní publikace Č. WO 93/00365,
D. Y. Chien, mezinárodní publikace č. WO 94/01778 a US patentové přihlášky přijaté do obecného vlastnictví č.
08/403 590 a 08/444 818.
Přidá se druhá značená protilátka směrovaná proti výše popsanému antigenů. Tuto protilátku lze směrovat proti kterémukoliv epitopu obsaženému v antigenů. Například lze tuto protilátku směrovat proti oblasti NS3 přítomné v antigenu. Alternativně, pokud se antigen výše exprimuje jako
- 41 spojený protein, lze druhou značenou protilátku směrovat proti partneru fúze. Další antigeny a protilátky lze přidávat do eseje, zvláště pokud pevný nosič obsahuje MEFA. Tyto formáty eseje se vysvětlují dále níže.
Reprezentativní esej podle tohoto vynálezu se znázorňuje na obrázku 2. Jak ukazuje obrázek, zahrnuje pevný nosič dvě monoklonální protilátky proti jádru nazvané cil-3 a cll-7. Tyto protilátky se směrují proti epitopu přítomnému v N-terminální oblasti proteinu jádra při aminokyselinách 10 až 53, Číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1. Pevný nosič též zahrnuje epitop NS3/4a. K pevnému nosiči se přidá biologický vzorek. Antigen jádra HCV, stejně tak jako protilátky směrované proti epitopu NS3/4a rovněž přítomné ve vzorku, vážou prostředky pro zachycení na pevném nosiči.
Monoklonální protilátka značená křenovou peroxidasou cll-14 směrovaná proti C-terminální oblasti jádra při polohách aminokyselin 120 až 130, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, se následně přidá. Spojený protein zahrnující sekvenci z lidské SOD (hSOD) a epitop z oblasti c33c se přidá a je druhou protilátkou značenou křenovou peroxidasou směrovanou proti části SOD spojeného proteinu. Spojení SOD-c33c se váže na protilátku proti NS3 a protilátka proti SOD se váže na spojený protein SOD-c33c. Detekce značky indikuje přítomnost infekce HCV.
Další reprezentativní esej podle tohoto vynálezu se znázorňuje na obrázku 8. Konfigurací protilátkové eseje je sendvičová esej antigen-protilátka-antigen s použitím NS3/4a a MEFA 12. Pevný nosič zahrnuje dvě monoklonální protilátky proti jádru popsané výše, epitop NS3/4a a reprezen- 42
A · · • A ··· • · · · AA · tativní MEFA, MEFA 12, zahrnující zkrácenou verzi lidské SOD. Podobně jako při eseji popsané výše se přidá biologický vzorek k pevnému nosiči. Antigen jádra HCV stejně tak jako protilátky proti epitopu NS3/4a a epitopům MEFA přítomné ve vzorku se vážou na zachycovací prostředky na pevném nosiči. Přidají se dva antigeny, jeden reaktivní s protilátkami vzorku, který váže NS3/4a (jak se popisuje výše) a jeden reaktivní s protilátkami vzorku, který váže MEFA 12. Na obrázku je antigen reaktivní s komplexem MEFA 12/protilátka vzorku spojením mezi molekulu SOD a c22ks delta47-L44W. Antigen c22ks je z oblasti jádra a zahrnuje aminokyseliny Lysio až Serss polyproteinu stejně tak jako deleci Arg47 normálně přítomné a substituci Leu místo Trp v poloze 44. Detekčním konjugátem protilátky je druhá monoklonální protilátka proti SOD značená HRP popsaná výše.
Výše popsané kombinační eseje antigen/protilátka jsou zvláště výhodné, neboř lze detekovat antigen jádra HCV i protilátky proti NS3/4a a/nebo jádru stejným nosičem v téže eseji. Navíc, jak se popisuje výše, lze použít další HCV epitopy, jako je SOD připojená k clOO, 5-1-1, NS5 antigenům stejně tak jako protein z posunu rámce v oblasti jádra polyproteinu, který se popisuje v mezinárodní publikaci č. WO 99/63941, v kombinační směsi pro pokrytí jiných nestrukturních epitopů HCV.
Pro další pochopení tohoto vynálezu se níže poskytuje podrobná diskuse ohledně tvorby protilátek pro použití v oblasti imunoesejí, tvorby polypeptidů pro užití v imunoesejích a způsobů provádění imunoesejí.
Tvorba protilátek pro použití v imunoesejích HCV
Jak se popisuje výše, využívá esej různých protilátek, které se vážou na pevný nosič (například jedné či více protilátek proti jádru) a které detekují komplexy antigen/protilátka tvořené při přítomnosti infekce HCV ve vzorku. Tyto protilátky mohou být polyklonálními či monoklonálními protilátkovými přípravky, monospecifickými antiséry, lidskými protilátkami nebo to mohou být hybridní či chimérické protilátky, jako jsou humanizované protilátky, pozměněné protilátky, fragmenty F(ab') , fragmenty F(ab), fragmenty Fv, jednodoménové protilátky, dimerní a trimerní protilátkové konstrukty fragmentů, miniprotilátky nebo jejich funkční fragmenty, které se vážou s daným antigenem.
Protilátky se tvoří způsoby dobře známými tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisují se například v US patentech Č. 4 011 308, 4 722 890 , 4 016 043, 3 876 504, 3 770 380 a 4 372 745. Například polyklonální protilátky se tvoří imunizací vhodného zvířete, jako je myš, krysa, králík, ovce či koza, daným antigenem. Pro zvýšení imunogenity se antigen může spojovat před imunizací s nosičem. Tyto nosiče jsou dobře známy tomu, kdo má běžnou zkušenost v oboru. Imunizace se obecně provádí míšením či emulgací antigenu ve fyziologickém roztoku, přednostně v adjuvantním prostředku, jako je Freundův úplný adjuvant a injekcí směsi či emulze parenterálně (obecně subkutánně nebo intramuskulárně). Zvíře se obecně vystaví o 2 až 6 týdnů později jedné či více posilovacím injekcím antigenu ve fyziologickém roztoku, přednostně s použitím Freundova neúplného adjuvantu. Protilátky se též mohou vytvářet imunizací in vitro způsoby známými v oboru. Polyklonální antisérum se poté obdrží z imunizovaného zvířete. Viz například Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohledně popisu tvorby polyklonální protilátky proti HCV.
·
0*
Monoklonální protilátky se obecně připraví způsobem Kohlera a Milsteina, Nátuře, 256. 495-497 (1975) nebo jeho modifikací. Obvykle se myš nebo krysa imunizuje, jak se popisuje výše. Avšak spíše než odebrání krve zvířeti pro obdržení séra se vyjme slezina {a případně několik velkých lymfatických uzlin) a rozdělí se na jednotlivé buňky. V případě požadavku se mohou buňky sleziny rozdělit (po odstranění nespecificky adherujících buněk) aplikací buněčné suspenze na misku či jamku potaženou antigenem. B-buňky exprimující imunoglobulin vázaný na membránu specifický pro antigen se vážou na misku a nevymyjí se se zbytkem suspenze. Výsledné B-buňky neboli všechny disociované slezinné buňky se poté indukují pro spojení s buňkami myelomu pro vytvoření hybridomů a pěstují se v selektivním médiu (například v hypoxanthinovém, aminopterinovém, thymidinovém médiu HAT). Výsledné hybridomy se přenesou na misky omezujícím zředěním a analyzují ohledně tvorby protilátek, které se specificky vážou na imunizující antigen (a které se nevážou na nepřibuzné antigeny). Zvolené monoklonální hybridomy vylučující protilátku se poté pěstují bud' in vitro {například v baňkách pro tkáňové kultury nebo reaktorech s dutými vlákny) nebo in vivo (například jako ascity u myši).
Tvorba různých monoklonálních protilátek proti HCV se popisuje například v Houghton a kol., US patent č.
350 671, Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365, US patentová přihláška přijatá do obecného vlastnictví č. 08/403 590 a 08/444 818 a Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904.
Jak se popisuje výše, protilátkové fragmenty zachovávající schopnost rozpoznávat daný antigen rovněž nalézají použití při imunoesejích subjektů. V oboru je známa řada • · · • * · ·« · • · · · · • · · ·· ♦·· • · » • · · · ·· ·· protilátkových fragmentů, které obsahují antigenová vazebná místa schopná vykazovat imunologické vazebné vlastnosti intaktní protilátkové molekuly. Například lze funkční protilátkové fragmenty vytvářet štěpením konstantní oblasti neodpovědné za vazbu antigenu z protilátkové molekuly s použitím například pepsinu s obdržením fragmentů F(ab’)2. Tyto fragmenty obsahují dvě antigenová vazebná místa, avšak postrádají část konstantní oblasti od každého z těžkých řetězců. Podobně lze též v případě požadavku obdržet Fab fragmenty obsahující jednotlivé antigenové vazebné místo například digescí polyklonálních či monoklonálních protilátek papainem. Lze též obdržet funkční fragmenty obsahující pouze variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců s použitím standardních způsobů, jako je rekombinantní tvorba preferenčního proteolytického štěpení imunoglobulinových molekul. Tyto fragmenty se popisují jako F . Viz například Xnbar a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, £2, 2659-2662 (1972), Hochman a kol., Biochem, 15. 2706-2710 (1976) a Ehrich a kol., Biochem., 19. 4091-4096 (1980).
Jednořetězcový Fv (sFv nebo scFv) polypeptid je kovalentně spojený Vh-Vl heterodimer, který se exprimuje spojením genů včetně V - a V^-kódovacích genů spojených linkerem kódujícím peptid. Huston a kol., Proč. Nat. Acad.
Sci., USA, ££, 5879-5883 (1988). Popisuje se řada způsobů pro rozlišení a tvorbu chemických struktur (linkerů) pro konverzi přirozeně agregovaných avšak chemicky oddělených lehkých a těžkých polypeptidových řetězců z protilátkové V oblasti do sFv molekuly, které se skládají do trojrozměrné struktury v podstatě podobné struktuře místa vazby antigenu. Viz například US patent č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Molekuly sFv lze tvořit s použitím způsobů popsaných v oboru. Viz například Huston a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, • A ·Α A
8£, 5879-5883 (1988), US patent Č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Kritéria konstrukce zahrnují stanovení příslušné délky pro přemostění vzdálenosti mezi koncem C jednoho řetězce a koncem N druhého řetězce, kde linker obecně tvoří malé hydrofilní aminokyselinové zbytky, které nejeví snahu ke svinování či tvorbě sekundárních struktur. Takové způsoby se popisují v oboru, viz například US patent č. 5 091 513,
132 405 a 4 946 778. Vhodné linkery obecně zahrnují polypeptidové řetězce střídavých seskupení glycinových a serinových zbytků a mohou zahrnovat glutamovou kyselinu a lysinové zbytky vložené pro zvýšení rozpustnosti.
Miniprotilátky nebo minilátky rovněž nacházejí použití v tomto vynálezu. Miniprotilátky jsou sFv polypeptidové řetězce zahrnující domény oligomerizace a jejich konce C oddělené od sFv oblastí zavěšení. Pack a kol., Biochem.,
31. 1579-1584 (1992) . Doména oligomerizace zahrnuje samoasociační α-helixy, například leucinové zippery, které lze dále stabilizovat přídavnými disulfidickými vazbami. Oligomerizační doména se navrhuje tak, aby byla kompatibilní s vektorovým skládáním napříč membránou, způsobem uvažovaným pro skládání polypeptidu in vivo na funkční vazební protein. Obecně se tvoří miniprotilátky s použitím rekombinantních metod dobře známých v oboru. Viz například Pack a kol., Biochem., 31. 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B. 120-126 (1992) .
Tvorba antigenů pro použití v imunoeseji HCV
Jak se popisuje výše, tvoří se molekuly podle tohoto vynálezu obecně rekombinantním způsobem. Polynukleotidy kódující antigen HCV pro použití v tomto vynálezu lze tedy připravit standardními způsoby molekulární biologie. Napři• · • 4 · «· 44 • 4 ·
- 47 klad polynukleotidové sekvence kódující výše popsané molekuly lze obdržet rekombinantními způsoby, jako je screening cDNA agenomové knihovny z buněk exprimujících gen nebo odvozením genu z vektoru, který je obsahuje. Dále lze požadovaný gen izolovat přímo z molekul virové nukleové kyseliny způsoby známými v oboru, jako popisuje Houghton a kol., US patent č. 5 350 671. Daný gen l2e též obdržet synteticky místo klonováním. Molekuly lze konstruovat s příslušnými kodony pro danou sekvenci. Úplná sekvence se poté vytvoří z překrývajících se oligonukleotidů připravených standardními způsoby a uspořádaných do úplné kódovací sekvence. Viz například Edge, Nátuře, 292. 756 (1981), Nambair a kol., Science,
223. 1299 (1984) a Jay a kol., J. Biol. Chem., 259. 6311 (1984) .
Konkrétní nukleotidové sekvence lze tedy obdržet z vektorů nesoucích požadované sekvence nebo je lze připravit synteticky, úplně či částečně s použitím různých způsobů přípravy oligonukleotidů známých v oboru, jako je mutageneze směrovaná na místo a polymerasová řetězová reakce (PCR). Viz například Sambrook, výše. Zejména je jeden ze způsobů obdržení nukleotidových sekvencí kódujících požadované sekvence anelací komplementárních souborů přesahujících syntetických oligonukleotidů obdržených v konvenčním automatickém polynukleotidovém syntetizátoru s následující ligací příslušnou DNA ligasou a amplifikací ligované nukleotidové sekvence prostřednictvím PVR. Viz například Jayaraman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 4084-4088 (1991).
Navíc lze v rámci tohoto vynálezu použít syntézu směrovanou na oligonukleotidy [Jones a kol., Nátuře, £4, 75-82 (1986)], mutagenezi předem existujících nukleotidových oblastí směrovanou na oligonukleotidy [Riechmann a kol., Natu- 48 » » · 1 • · ·· re, 332. 323-327 (1988) a Verhoeyen a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988)] a enzymatické zaplňování oligonukleotidů s mezerami s použitím T^DNA polymerasy [Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, ££, 10029-10033 (1989)] s obdržením molekul vykazující pozměněné či zvýšené schopnosti vazby antigenu a/nebo sníženou imunogenitu.
Jakmile se kódovací sekvence připraví či izolují, mohou se klonovat do jakéhokoliv vhodného vektoru či replikonu. Četné klonovací vektory jsou známé pro toho, kdo má zkušenost v oboru, a výběr příslušného klonovacího vektoru je věcí volby. Vhodné vektory zahrnují, avšak bez omezení, plasmidy, fágy, transposony, kosmidy, chromosomy či viry schopné replikace při spojení s vhodnými kontrolními prvky.
Kódovací sekvence se potom umístí pod kontrolu vhodnými kontrolními prvky v závislosti na systému užitém pro expresi. Kódovací sekvenci lze tedy umístit pod kontrolu promotoru, vazebného místa ribosomů (pro bakteriální expresi) a případně operátoru, takže se daná sekvence deoxyribonukleové kyseliny přepisuje do ribonukleové kyseliny vhodným transformantem. Kódovací sekvence může a nemusí obsahovat signální peptid nebo vedoucí sekvenci, která může být později odstraněna hostitelem posttranslačním zpracováním. Viz například US patent č. 4 431 739, 4 425 437, 4 338 397.
Navíc ke kontrolním sekvencím se může požadovat přidání regulačních sekvencí umožňujících regulaci exprese sekvencí vzhledem k růstu hostitelské buňky. Regulační sekvence jsou známé tomu, kdo má zkušenost v oboru, a příklady zahrnují takové sekvence, které způsobují expresi genu pro zapnutí či vypnutí jako odpověď na chemický či fyzikální podnět včetně přítomnosti regulační sloučeniny. Ve vektoru též • * ·· • · · » • · »
4·
- 49 • ♦ · · ♦ · • 4 · · · · · «* ··· ·· ·· mohou být přítomné další regulační prvky. Například enhancerové prvky lze použít pro zvýšení hladin exprese konstruktů. Příklady zahrnují časný genový enhancer SV40 [Dijkema a kol., EMBO J., 4, 761 (1985)], enhancer/promotor odvozený od LTR viru Rousova sarkomu [Gorman a kol,, Proč. Nati.
Acad. Sci., USA, 79. 6777 (1982)] a prvky odvozené od lidského CMV [Boshart a kol., Cell, 41. 521 (1985)] jako prvky obsažené v sekvenci CMV intronu A (US patent č. 5 688 688). Expresní kazeta může dále zahrnovat původ replikace pro autonomní replikaci ve vhodné hostitelské buňce, jeden či více volitelných markérů, jedno či více restrikčních míst, možnost vysokého počtu kopií a silný promotor.
Expresní vektor se konstruuje tak, aby byly dané kódovací sekvence uložené ve vektoru s příslušnými regulačními sekvencemi, a aby umístění a orientace kódovacích sekvencí vzhledem ke kódovacím sekvencím bylo takové, že se kódovací sekvence přepisují za kontroly kontrolních sekvencí (to jest RNA polymerasa, která se váže k molekule RNA při kontrolních sekvencích přepisuje kódovací sekvenci). Modifikace sekvencí kódujících danou molekulu se může požadovat k tomuto účelu. Například může být v některých případech nezbytné modifikovat sekvenci takovým způsobem, aby se připojovala ke kontrolním sekvencím v příslušné orientaci, to jest udržovat čtecí rámec. Kontrolní sekvence a další regulační sekvence se mohou připojovat ke kódovací sekvenci před vložením do vektoru. Alternativně lze kódovací sekvenci klonovat přímo do expresního vektoru, který již obsahuje kontrolní sekvence a příslušné restrikční místo.
Jak se popisuje výše, lze požadovat tvorbu mutantů či analogů daného antigenů. To platí zejména pro NS3/4a. Způsoby, jakými to lze dosáhnout, se popisují například v Dasma• 44 «44
4» 4
- 50 44 44« hapatra a kol., US patent č. 5 843 752 a Zhang a kol., US patent č. 5 990 276. Mutanty Či analogy tohoto a dalších HCV proteinů pro použití v esejích subjektu lze připravit delecí části sekvence kódující daný polypeptid, inzercí sekvence, a/nebo substitucí jednoho či více nukleotidů v sekvenci. Způsoby modifikace nukleotidových sekvencí, jako je mutageneze směrovaná na místo a podobně, jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, T. A. Kunkel, Proč. Nati. Acad, Sci, USA. 82, 448 (1985), Geisselsoder a kol., BioTechniques, 1, 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol. 100. 468 (1983),
Dalbie-McFarland a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 79.
6409 (1982).
Molekuly lze exprimovat širokým rozmezím systémů včetně hmyzích, savčích, bakteriálních, virových a kvasinkových expresních systémů, jak se popisují v oboru.
Například systémy exprese hmyzích buněk, jako jsou bakulovirové systémy, jsou dobře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisují se například v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiály a způsoby pro systémy exprese bakulovirus/hmyzí buňka jsou komerčně dostupné v soupravě, mimo jiné od Invitrogen, San Diego CA (MaxBac kit). Podobně systémy exprese bakteriálních a savčích buněk jsou v oboru dobře známy a popisují se například v Sambrook a kol. výše. Kvasinkové systémy expresí jsou rovněž v oboru dobře známy a popisují se například v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., redakce, 1989) Butterworths, London.
Řada příslušných hostitelských buněk pro použití s výše popsanými systémy je rovněž známa. Například jsou ···
444
4« ·
- 51 v oboru známy savčí buněčné linie a zahrnují immortalizované buněčné linie od American Type Culture Collection (ATCC), jako jsou, avšak bez omezení, buňky vaječníku čínského křečka (CHO), HeLa buňky, ledvinové buňky mláďat křečků (BHK), opičí ledvinové buňky (COS), lidské embryonální ledvinové buňky, buňky lidského hepatocelulárního karcinomu (například Hep G2), buňky hovězích ledvin Madin-Darby (MDBK) a další. Podobně bakteriální hostitelé, jako je E. coli, Bacillus subtilis a Streptococcus spp., naleznou použití s uvažovanými konstrukty exprese. Kvasinkoví hostitelé použitelní v tomto vynálezu zahrnují mimo jiné Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzí buňky pro použití s vektory exprese bakuloviru zahrnují mimo jiné Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx moři, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ni.
Molekuly nukleových kyselin zahrnující dané nukleotidové sekvence se mohou stabilně integrovat do genomu hostitelské buňky nebo udržovat na stabilním episomálním elementu ve vhodné hostitelské buňce s použitím různých způsobů dodání genu dobře známých v oboru. Viz například US patent č.
399 346.
V závislosti na systému exprese a zvoleném hostiteli se tyto molekuly obdrží pěstováním hostitelských buněk transformovaných výše popsaným vektorem exprese za podmínek, při kterých se exprimuje protein. Exprimovaný protein se poté izoluje z hostitelských buněk a purifikuje. Pokud systém exprese vylučuje protein do média, lze produkt purifikovat přímo z média. Pokud se nevylučuje, může se izolovat z lyzá- 52
V t « • · * • · ·· · tů buněk. Volba vhodných růstových podmínek a způsobů získávání spadá do oblasti zkušeností v oboru.
Popisuje se rekombinační tvorba různých HCV antigenů. Viz například Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., £, S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365, D. Y. Chien, mezinárodní patentová přihláška č. WO 94/01778.
Imunodiagnostické eseje
Připravené protilátky proti jádru a antigeny NS3/4a popsané výše se umístí na vhodný pevný nosič pro použití při imunoeseji subjektů. Pevný nosič pro účely podle tohoto vynálezu může být jakákoliv látka, která má nerozpustnou matrici a může vykazovat tuhý či polotuhý povrch. Příklady pevných nosičů zahrnují, avšak bez omezení, substráty, jako je nitrocelulosa (například v membráně ve formě mikrotitrační jamky), polyvinylchlorid (například listy nebo mikrotitrační jamky), polystyrénový latex (například kuličky nebo mikrotitrační misky), polyvinylidinfluorid, diazotovaný papír, nylonové membrány, aktivované kuličky, magnetické kuličky a podobně. Konkrétní nosiče zahrnují desky, pelety, disky, kapiláry, dutá vlákna, jehly, kolíčky, tuhá vlákna, celulosové kuličky, kuličky z pórovitého skla, silikagely, polystyrénové kuličky případně zesilované divinylbenzenem, kopolymerové kuličky, polyakrylamidové kuličky, latexové kuličky, dimethylakrylamidové kuličky případně zesíúované N,Ν'-bis-akryloylethylendiaminem a skleněné částice potažené hydrofobním polymerem.
V případě požadavku lze molekuly přidávané k pevnému nosiči snadno opatřit funkčními skupinami s vytvořením sty• · ···
- 53 renových či akrylátových zbytků, čímž se umožňuje inkorporace molekul do polystyrenu, polyakrylátu či dalších polymerů, jako je polyimid, polyakrylamid, polyethylen, polyvinyl, polydiacetylen, polyfenylen-vinylen, polypeptid, polysacharid, polysulfon, polypyrrol, polyimidazol, polythiofen, polyether, epoxidové polymery, křemičité sklo, silikagel, siloxan, pólyfosfát, hydrogel, agarosa, celulosa a podobně.
V jednom z případů se pevný nosič nechá nejprve reagovat s protilátkami proti jádru HCV a epitopem NS3/4a (zde společně nazývané komponenty pevné fáze) a případně s jednou nebo více MEFA za vhodných podmínek vazby tak, aby se molekuly dostatečně immobilizovaly na nosiči. Někdy lze immobilizaci na nosiči zvýšit nejprve připojením antigenu a/nebo protilátky k proteinu s lepšími vazebnými vlastnostmi vůči tuhé fázi. Vhodné spojovací proteiny zahrnují, avšak bez omezení, molekuly, jako jsou serumalbuminy včetně bovinního sérumalbuminu (BSA), keyhole limpet hemocyaninu, molekul imunoglobulinu, thyroglobulinu, ovalbuminu a dalších proteinů dobře známých v oboru. Lze použít další prostředky pro vazbu molekul na nosič včetně pólysacharidů, polymléčných kyselin, polyglykolových kyselin, polymerních aminokyselin, aminokyselinových kopolymerů a podobně. Tyto molekuly a způsoby připojování těchto molekul k antigenům znají dobře ti, kdo mají zkušenost v oboru. Viz například M. A. Brinkley, Bioconjugate Chem., 2, 2-13 (1992), Hashida a kol., J. Appl. Biochem., £, 56-63 (1984) a Anjaneyulu a Staros, International J. of Peptide and Protein Res., 30. 117-124 (1987) .
Po reakci tuhého nosiče se složkami tuhé fáze se jakékoliv neimmobilizované komponenty tuhé fáze odstraní z nosiče promytím a komponenty navázané na nosič se poté přivé* A • A A A
A A
- 54 I A A » · A A
A A AA : podezřením na protilátdou do styku s biologickým vzorkem ky a antigeny HCV {zde společně nazývané molekuly ligandů) za vhodných vazebných podmínek. Po promytí pro odstranění nenavázaných molekul ligandu se za vhodných podmínek vazby přidá druhá protilátka proti jádru zaměřená proti jinému epitopu než protilátka proti jádru navázaná na nosič. Přidaná protilátka proti jádru obsahuje detekovatelnou značku, jak se popisuje výše, a působí ve smyslu vazby jakéhokoliv antigenů jádra, který může být přítomen ve vzorku, který reagoval s protilátkou proti jádru navázanou na nosič. Také se přidá jeden či více antigenů, které mohou reagovat s protilátkami přítomnými ve vzorku a které reagovaly s epitopem NS3/4a. Jak se popisuje výše, odvozuje se antigen obvykle od oblasti NS3 polyproteinu HCV a zejména od oblasti c33c HCV. Viz Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 10011-10015 (1989), mezinárodní přihláška č. WO 93/00365 US patentová přihláška přijatá do obecného vlastnictví č. 08/403 590 a 08/444 818 ohledně popisu této oblasti a epitopů, které se od ní odvozují. Přidá se též značená protilátka zaměřená proti tomuto antigenů. Tato protilátka bude tedy vázat antigen, který reagoval s protilátkami proti NS3 přítomnými ve vzorku. Pro tento účel lze zajistit výhodně epitop c33c jako spojení mezi c33c a lidskou superoxid dismutasou (hSOD) obdrženou rekombinantně, například způsoby popsanými v Houghton a kol., US patent č. 5 350 671. Nukleotidové a minokyselinové sekvence pro lidskou SOD jsou známé a popisují se v Hallewell a kol. US patent č. 5 710 033. Značenou protilátku zaměřenou proti lidské SOD lze tedy použít pro detekci přítomnosti komplexů tvořených mezi epitopem NS3/4a, jakýmikoliv protilátkami ve vzorku reagujícími s tímto epitopem a polypeptidy HCV, které se vážou na protilátku ve vzorku.
··· ©
··© © 9 • · • * • · · »« · «© ·©
V případě přítomnosti MEFA na pevném nosiči lze k eseji též přidat jeden či více dalších antigenů reaktivních s protilátkami z biologického vzorku, které jsou vázané na antigeny přítomné na MEFA. Zvláště užitečný je v této souvislosti antigen odvozený od oblasti jádra HCV a zejména od c22 antigenu, který zahrnuje 119 N terminální aminokyseliny jádra HCV polyproteinu. Jeden konkrétní antigen odvozený od c22 je c22ks delta47-L44W, který obsahuje aminokyseliny Lysio až Ser9p polyproteinu, stejně tak jako deleci Arg47 normálně přítomného a substituci Leu místo Trp v poloze 44. Podobně jako epitop c33c popsaný výše lze tento antigen obdržet jako spojení s hSOD a stejnou značenou protilátkou zaměřenou proti lidské SOD a lze jej použít pro detekci přítomnosti komplexů tvořených mezi protilátkami přítomnými ve vzorku a epitopem NS3/4a a/nebo MEFA, jehož komplexy jsou též vázané s antigeny HCV {například c33c a c22).
Konkrétněji lze použít metodu ELISA, kde jsou jamky mikrotitrační desky potažené komponenty pevné fáze. Biologický vzorek obsahující molekuly ligandu nebo vzorek, u kterého je podezření na obsah těchto molekul, se poté přidá do těchto potažených jamek. Po době inkubace dostatečné pro umožnění vazby molekuly ligandu s immobilizovanou složkou pevné fáze se miska (misky) promyje (promyjí) pro odstranění nevázaných zbytků a přidá se detekovatelně značená molekula sekundární vazby (značená protilátka proti jádru), molekula obsahující NS3 epitop a protilátka zaměřená proti molekule obsahující NS3 epitop. Tyto molekuly se ponechají reagovat s jakýmkoliv zachyceným antigenem a protilátkou ve vzorku, miska se promyje a přítomnost značených protilátek se detekuje způsoby dobře známými v oboru.
Výše popsané reakční prostředky pro esej včetně pev56 ného nosiče imunoeseje s navázanými protilátkami a antigeny, stejně tak jako s protilátkami a antigeny, které mají reagovat se zachyceným vzorkem, lze obdržet v soupravách s vhodnými pokyny a dalšími nezbytnými reakčními prostředky pro provedení imunoesejí podle popisu výše. Tato souprava může též obsahovat, v závislosti na konkrétní imunoesejí, vhodné značky a další balené chemikálie a látky (například promývací pufry a podobně). Standardní imunoeseje, jako jsou ty, které se popisují výše, lze provádět s použitím těchto souprav.
III. Experimentální část
Příklady provedení vynálezu
Následují příklady specifických ztělesnění provedení tohoto vynálezu. Tyto příklady slouží pouze pro ilustrativní účely a žádným způsobem se neuvažují jako omezení obsahu tohoto vynálezu.
Je snahou zajistit správnost ohledně použitých hodnot (například množství, teplot atd), avšak je třeba připustit určitou experimentální chybu a odchylku.
Příklad 1
Kombinační imunoesej HCV antigen/protilátka
Kombinační imunoesej HCV antigen/protilátka, která se zde popisuje, se srovnává s jinými esejemi HCV pro testování detekčních mezí serokonverze a srovnání těchto mezí s mezemi obdrženými v jiných komerčně dostupných esejích následujícím způsobem.
• · · * * e • · · ·
« · · · ·· ·#
A. Materiály a způsoby provedení
Vzorky krve
Používají se komerčně dostupné soubory vzorků lidské krve. Tyto soubory lze obdržet například od Boston Biomedica, lne., West Bridgewater ΜΑ (BBI), Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) a North American Biologics, lne., BocoRatan, FL (NABI). Dny v tabulkách 5 a 6 jsou dny, ve kterých byly vzorky krve odebrány od osob.
Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky cll-3, cll-7 a cll-14 se obdrží od Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. Protilátky cll-3 a cll-7 jsou zaměřené proti N-terminální části jádra (aminokyseliny 10 až 53, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1). Monoklonální protilátka cll-14 je zaměřená proti C-terminální části jádra {aminokyseliny 120 až 130, číslováno vzhledem k HCVl polyproteinu). Protilátka cll-14 se konjuguje s křenovou peroxidasou (HRP) standardními způsoby.
Monoklonální protilátka 5A-3 je protilátka proti SOD, zaměřená proti aminokyselinám 1 až 65 SOD a připravuje se standardními způsoby. Tato protilátka se konjuguje s HRP, jak se popisuje výše.
B. Antigeny
Antigen c33c (266 aminokyselin, aminokyseliny 1192 až 1457 HCVl polyproteinu) se exprimuje jako vnitřní SOD spoje• 4
4 4
4 ný polypeptid v E. coli způsoby popsanými pro přípravu antigenu 5-1-1 {Choo a kol.,Science, 244. 359-362 (1989). Rekombinantní antigen se purifikuje podle popisu v Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, 82, 10011-10015 (1989). Viz Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohledně způsobů přípravy SOD-C33C.
Epitop NS3/4a použitý v eseji je konformační epitop mající sekvenci znázorněnou na obrázku 3.
C. Způsoby uspořádání imunoeseje
Esej Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) je komerčně dostupná a je to detekční esej založená na protilátce. Tato esej se provádí podle instrukcí výrobce.
ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (nazývaná Ortho 3,0 esej v tomto patentu, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekční esej založená na protilátce. Analýza se provádí podle instrukcí výrobce.
Souprava Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) je komerčně dostupná souprava založená na PCR. Esej se provádí podle instrukcí výrobce.
Souprava Gen-Probe TMA (San Diego, CA) je komerčně dostupná transkripčně zprostředkovaná amplifikační souprava. Esej se provádí podle instrukcí výrobce.
Souprava pro antigenovou esej Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekční souprava založená na antigenů. Esej se provádí podle návodů výrobce.
(náhradní straha*)· « * *
- 59 I · · 1
9· ·♦
Kombinační imunoesej HCV antigen subjektu/protilátka se provádí následujícím způsobem. 4 mg/ml každé z purifikovaných monoklonálních protilátek Cll-7 a Cll-3 v lx fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), pH 7,4, se kombinuje a dobře promísí. K témuž potahovacímu pufru se přidá 90 ng rekombinantního antigenu NS3/4a. Roztok se míchá před potažením po dobu 30 min. 200 μΐ výše popsaného roztoku se přidá na jamku v 96-jamkových mikrotitračních miskách s médiem Costar (Corning, lne.). Misky se inkubují při teplotě 15 až 30 °C po dobu 16 až 24 h. Promyjí se dvakrát dH2O, poté 300 μΐ na jamku pufru po potažení (1% bovinní serum-albumin, BSA, 1 x PBS) po dobu lha stabilitním pufrem 300 μΐ na jamku (lx PBS, 1 % BSA, mannitol, polyethylenglykol, želatina) v průběhu 1 h. Roztoky se aspirují a suší při teplotě 4 °C v lyofilizačním zařízení po dobu 24 h. Misky se naplní desikačním prostředkem.
Pro provedení kombinační imunoeseje antigen/protilátka se do misky přidá 100 μΐ obohaceného pufru pro cytolýzu [1 % N-laurylsarkosinu, 0,65 M chlorid sodný, 50 mg/ml IgG čistoty pro technické použití (Sigma, St. Louis, MO), % BSA s modifikovanými thioskupinami (Bayer), 0,1 % kaseinu]. Poté se přidá 100 μΐ vzorku. Ten se inkubuje na třepacím zařízení při teplotě 40 °C po dobu 1 h. Misky se promyjí šestkrát lx PBS, 0,1% Tween-20 na zařízení Ortho Plate Washer. 200 μΐ roztoku konjugátu [zředění 1:75 cll-14-HRP s 250 ng/esej SOD-c33c antigenu plus zředění 1:5000 myší protilátky proti SOD-HRP v HCV 3.0 zřeďovacím prostředku pro vzorky (od ORTHO HCV verze 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostice, Raritan, New Jersey) bez SOD extraktu, vše se připraví 30 min před přidáním]. Roztok se inkubuje 45 min za třepání při teplotě 40 °C. Promyje se šestkrát jako výše a přidá se 200 μΐ roztoku substrátu (1 tableta • · ·· ·· ♦ ·· ·* ··
0PD/10 ml). Tableta OPD obsahuje dihydrochlorid o-fenylendiaminu a peroxid vodíku pro tvorbu zbarvení křenovou peroxidasou a obdrží se od Sigma, St. Louis, MO. Směs se inkubuje po dobu 30 min při teplotě 15 až 30 °C ve tmě. Reakce se zastaví přídavkem 50 ml 4N roztoku kyseliny sírové a misky se odečítají při vlnové délce 492 nm vzhledem k absorbanci při 690 nm jako kontrole.
D. Výsledky
Výsledky různých eseji ukazují tabulky 5 a 6 znázorňující samostatné experimenty provedené na vzorcích krve exponovaných infekci HCV. Šrafováné plochy ukazují detekci viru. Jak se ukazuje výše, kombinační esej antigen/protilátka detekuje serokonverzi ve všech vzorcích, zatímco všechny ostatní eseje založené na protilátce a antigenu alespoň v jednom ze vzorků nedetekují serokonverzi. Konkrétně žádná z eseji založených na protilátce nedetekuje serokonverzi alespoň do 18. dne (tabulka 5). Tabulka 6 ukazuje, že žádná z eseji založených na protilátce nedetekuje přítomnost HCV infekce v den 22. Navíc esej založená na antigenu Ortho není schopná detekovat serokonverzi od dnů 85 dále.
Proto je na základě výše popsaných výsledků zřejmé, že nová kombinační esej protilátka/antigen snižuje počet falešně negativních výsledků obdržených s použitím jiných konvenčních eseji založených na protilátce a antigenu.
·« ··
Tabulka 5
Serekonverze HCV
Days | Abbott PRISM | Ortho 3.0 | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho Ag | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | >5'x ÍOV. | |||
4 - | 0,1 | 0,0 | .'>5χώ | -19,o- | '/m- | |
7 | 0,0 | •/>5 xfO5/ | » J · . . i. ' AWSB | šOí | . *?í'’,‘4tí .í'.'. ' -x #4¾ C t '4 | |
13 | 0,3 | 0,1 | . ' ..'T ' *·'..· . Jíl 1 - . . > !l. >5íís 1QSA, | //MSO | \2<5,2Α' | : r. :- J,;. j*}?: . A-Wb' |
18 | 0,4 | - | ||||
21 | '.F | w | ||||
164 | 'Λ2' | ¢//4,4. | :449,28/ Í;; | 0,11 | Sá&sbb |
Tabulka 6
Serokonverze HCV
Days | Abbott PRISM | Ortho 3.0 | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho Ag | Chiron Ag/Ab |
0 | OJ | 0,0 | BLD | 0,11 | 0,5 | |
13 | 0,1 | 0,0 | β | ^ΑΑ,ΟΛ/Γ | ||
20 | o,i | 0,0 | íMsó | ;W: | liW.il | |
22 | 0,3 | 0,0 | A?i?s | PSIS. | ||
85 | lí#© | BQR | 0,06 | ,iΆ ΪΊ 'v ίΐ ,ΰ/Ε-ώ.. .:Λ~-.— | ||
131 | BQR | 0,09 | jt ^•^.•tririzv -sbj · | |||
135 | -•<1 | !;·--! „--.A | 0,09 | ': ·.. ···!». KOíKKi | ||
138 | OB- | * ·· *: - «>λ·λ | BLD | 0,08 | _! : : . ».<fB|.-i-'A· IMÍ ,Ά· A/WA | |
146 | 1%W | BLD | 0,11 | /- S^í^Ae^/A4:· J-«>. :«:·.!{· ť.· | ||
152 | • WS | .//4^7/-/ | BQR | 0,07 | 3 rBjfgWW |
« ·
- 62 A ·
Α· ♦··
Příklad 2
Tvorba konformačního epitopu NS3/4a se substitucemi Thr na Pro a Ser na Ile
Konformační epitop NS3/4a se obdrží následujícím způ sobem. Tento epitop má sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a liší se od nativní sekvence by poskytlo klonovací místo 5' HindlII následované sekvencí ACAAACAAA, iniciátor ATG a kodony HCVla počínaje aminokyselinou 1027 s pokračováním k místu BglI aminokyseliny 1046, (b) restrikční fragment 683 bp BglI-Clal (kódovací aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI a (c) vektor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL č. X65332, který byl zpracován HindlII a Clal, defosforylován a podroben gelové purifikaci, Plasmid pAcHLTns3ns4aPI se odvozuje od pAcHLT, « · « « « ·
- 63 * * ; ··· vektoru bakulovirové exprese komerčně dostupného od BD Pharmingen (San Diego, CA). Konkrétně se připraví vektor pAcHLT EcoRI-Pstl a následující fragmenty: EcoRI-Alwnl, 935 bp odpovídající aminokyselinám 1027 až 1336 genomu HCV-1, Alwnl-SacII, 247 bp odpovídající aminokyselinám 1336 až 1419 genomu HCV-1, Hinfl-BglI, 175 bp odpovídající aminokyselinám 1449 až 1509 genomu HCV-1, BglI-Pstl, 619 bp odpovídající aminokyselinám 1510 až 1711 genomu HCV-l plus transkripční terminační kodon. SacII-Hinfl odvozený fragment 91 bp odpovídající aminokyselinám 1420 až 1448 genomu HCV-1 a obsahující mutace PI (Thr-1428 mutovaný na Pro, Ser-1429 mutovaný na Ile) se liguje s fragmentem 175 bp Hinfl-BglI a fragmentem 619 bp BglI-Pstl popsaným výše a subklonuje do vektoru pGEM-5Zf(+) zpracovaného SacII a Pstl. pGEM-5Zf{+) je komerčně dostupný vektor E. coli {Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308). Po transformaci kompetentních buněk HB101, se provádí miniscreening jednotlivých klonů a verifikace sekvence, fragment 885 bp SacII-Pstl z pGEM5.PI klonu 2 se Čistí gelovou purifikací. Tento fragment se liguje s EcoRI-Alwnl 935 bp fragmentem, Alwnl SacII 247 bp fragmentem a pAcHLT EcoRI-Pstl vektorem popsaným výše. Výsledný konstrukt se nazývá pAcHLTns3ns4aPI.
Ligační směs popsaná výše se transformuje do HB101 kompetentních buněk a nanese na agarové desky Luria obsahující 100 ^g/ml ampicilinu. Analýzy miniprep jednotlivých klonů vedou k identifikaci předpokládaných pozitivních vzorků, z nichž dva se amplifikují. Plasmid DNA pro pSP72 laHC, klony 1 a 2, se připraví s použitím soupravy Qiagen Maxiprep a sekvenuje.
Poté se spolu ligují následující fragmenty (a) 761 bp HindlII-Clal z pSP721aHC 1 [pSP72.1aHC se tvoří ligací spolu s následujícími: pSP72 zpracovaný HindlII a Clal, syntetické oligonukleotidy poskytující klonovací místo 5' HindlII, následované sekvencí ACAAACAAA, iniciační kodon ATG a kodony HCVla, počínaje aminokyselinou 1027 s pokračováním k místu BglII při aminokyselině 1046 a 683 bp BglII-Clal restrikční fragment (kódovací aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI], (b) 1353 bp BamHI-HindlII fragment pro kvasinkový hybridní promotor ADH2/GAPDH, (c) 1320 bp Clal-Sall fragment (kódující HCVla aminokyseliny 1046 až 1711 s Thr 1428 mutovaným na Pro a Ser 1429 mutovaným na Ile) z pAcHLTns3ns4aPI a (d) pBS24.1 kvasinkový expresní vektor, který je zpracovaný BamHI a Sáli, defosforylovaný a čištěný gelovou purifikací. LigaČní směs se transformuje na kompetentní HB101 a nanáší na agarové desky Luria obsahující 100 pig/ml ampicilinu. Analýzy miniprep jednotlivých kolonií vedou k identifikaci klonů s očekávanou vloženou částí 3446 bp BamHI-SalI, která obsahuje ADH2/GAPDH promotor, iniciátorový kodon ATG a HCVla NS3/4a z aminokyselin 1027 až 1711 (znázorněné jako aminokyseliny 1 až 686 na obrázcích 4A až 4D) s Thr 1428 (poloha aminokyseliny 403 na obrázcích 4A až 4D) mutovaným na Pro a Ser 1429 (poloha aminokyseliny 404 na obrázcích 4A až 4D) mutovaným na Ile. Konstrukt se nazývá pd.HCVla.ns3ns4aPI (viz obrázek 5),
S. cerevisiae, kmen AD3, se transformuje pd.HCVla.ns3ns4aPI a jednotlivé transformanty se ověří ohledně exprese po vyčerpání glukózy v médiu. Rekombinantní protein se exprimuje při vysokých hladinách v kvasinkách jak se detekuje barvením modří Coomassie a ověří imunoblotovací analýzou s použitím polyklonální protilátky proti helikasové doméně NS3.
Příklad 3 • · *· ·»· ··
- 65 Purifikace konformačního epitopu NS3/4a
Konformační epitop NS3/4a se purifikuje následujícím způsobem. Buňky S. cerevisiae popsané výše exprimující epitop NS3/4a se sbírají, jak se popisuje výše. Buňky se suspendují v pufru pro cytolýzu (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM chloridu sodného, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatinu, μΜ leupeptinu) a podrobí se cytolýze v zařízení Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Švýcarsko) nebo ekvivalentní aparatuře s použitím skleněných kuliček v poměru 1:1:1 buňky:pufr:skleněné kuličky 0,5 mm. Lyzát se centrifuguje při 30100 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C a peleta obsahující nerozpustnou proteinovou frakci se přidá k promývacímu pufru (6 ml/g výchozí hmotnosti pelety buněk) a směs se pomalu míchá nakláněním při teplotě místnosti po dobu 15 min. Promývací pufr obsahuje koncentrace 50 mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, 0,3 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu, 0,05 % oktylglukosidu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatinu, 1 μΜ leupeptinu. Zbytky z rozpadlých buněk se odstraní centrifugací při 30100 g v průběhu 30 min při teplotě 4 “C. Supernatant se odstraní do odpadu a peleta se zachová.
Z pelety se extrahuje protein následujícím způsobem. Přidá se 6 mg/g extrakčního pufru a směs se naklání při teplotě místnosti po dobu 15 min. Extrakční pufr obsahuje koncentrace 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF,
0,1 μΜ pepstatinu, 1 μΜ leupeptinu. Tato směs se centrifuguje při 30100 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C. Supernatant se zachová a přidá se síran amonný do koncentrace 17,5 % s použitím následujícího vzorce: objem supernatantu (ml) ná4 ·
- 66 • · • · sobený χ % síranu amonného/(1-χ % síranu amonného) = ml 4,1 M nasyceného síranu amonného pro přidání k supernatantu. Síran amonný se přidává po kapkách za míchání na ledu a roztok se míchá na ledu po dobu 10 min. Roztok se centrifuguje při 17700 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C a peleta se zachová a ukládá při teplotě 2 až 8 °C po dobu až 48 h.
Peleta se resuspenduje a aplikuje na kolonu Póly U (Póly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) při teplotě 4 °C následujícím způsobem. Peleta se resuspenduje v 6 ml Póly U ekvilibračního pufru na gram hmotnosti pelety. Ekvilibrační pufr obsahuje 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM chloridu sodného, 5 mM DTT (přidává se čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukosidu. Roztok se míchá nakláněním při teplotě 4 °C po dobu 15 min a centrifuguje při 31000 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C.
Připraví se sloupec Póly U (1 ml pryskyřice na gram výchozí hmotnosti pelety). Lineární průtok je 60 cm/h a průtok náplně 133 % z 60 cm/h. Sloupec se upraví ekvilibračním pufrem a supernatant resuspendované amonium-sulfátové pelety se nanese na ekvilibrovanou kolonu. Kolona se promyje na výchozí hodnotu ekvilibračním pufrem a protein se eluuje stupňovou elucí v následujícím elučním pufru Póly U: 25 mM HEPES pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM DTT (přidává se čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukosidu. Eluát z kolony se nanese na SDS-PAGE (barvený Coomassie) a alikvóty se zamrazí a uloží při teplotě -80 °C. Přítomnost epitopu NS3/4a se ověří Westernovým blotováním s použitím polyklonální protilátky zaměřené proti NS3 proteasové doméně a monoklonální protilátky proti 5-1-1 epitopu (HCV 4a).
Navíc se monitoruje proteasové enzymatická aktivita v průběhu purifikace následujícím způsobem. Peptid NS4A (KKGSWIVGRIVLSGKPAIIPKK) a vzorek obsahující konformační epitop NS3/4a se zředí v 90 μΐ reakčního pufru (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 10 % glycerolu, 0,05 % n-dodecyl B-D-maltosidu, 5 mM DTT) a ponechá se míchat po dobu 30 min při teplotě místnosti. 90 μΐ směsi se přidá do mikrotitrační misky (Costar, lne., Corning, NY) a přidá se 10 μΐ HCV substrátu (AnaSpec, lne., San Jose CA). Miska se míchá a odečítá na čtecím zařízení Fluostar. Výsledky se vyjadřují jako relativní fluorescenční jednotky (RFU) za minutu.
Při použití těchto způsobů obsahuje produkt extrakce 1 M roztokem chloridu sodného aktivitu 3,7 RFU/min, sraženina síranu amonného má aktivitu 7,5 RFU/min a produkt purifikace Póly U má aktivitu 18,5 RFU/min.
Příklad 4
Kompetiční studie
Následující kompetiční studie se provádí pro vyhodnocení, zda konformační epitop NS3/4a detekuje různé protilátky nebo různé antigeny HCV. Konkrétně se srovnává antigen NS3/4a s antigenem c200 následujícím způsobem.
0,5 μς a 1,0 gg NS3/4a obdrženého, jak se popisuje výše, nebo c200 (Hepatology, 15, 19-25 (1992) od ORTHO HCV, Version 3.0 ELISA Test System, OrthoClinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) se smísí s 20 μΐ vzorku PHV914-5 (časný serokonverzní odběr krve obdržený z krve infikovaného jednotlivce) v celkovém objemu 220 μΐ (1 x PBS). Směs se inkubuje po dobu 1 h v mikrojamkách při teplotě 37 °C. Směs se t · · ·« ··· přenese na misky potažené NS3/4a a inkubuje po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Misky se promývají a analyzují následujícím způsobem.
μ<3 antigenu C200 se přidá k 10 μΐ vzorku PHV914-5 v celkovém objemu zhruba 220 μΐ. Směs se inkubuje po dobu 1 h v mikrojamce při teplotě 37 °C a 200 μΐ se přenese na misku potaženou NS3/4a (100 ng/esej) a inkubuje po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Misky se promyjí pětkrát l x PBS,
0,1% Tween-20. 200 μΐ roztoku konjugátu (podle popisu výše) se přidá a misky se inkubují a analyzují. Kontroly obsahující PHV914-5 a 1 x PBS (bez antigenu) se rovněž zpracují, jak se popisuje výše.
Výsledky ukazuje tabulka 7. výsledky procenta inhibice ve sloupci 4 se vypočítají jako hodnoty sloupce 3 minus (sloupec 2 dělený sloupcem 3 krát 100) . Jak lze vidět, údaje ukazují, že NS34a se neutralizuje protilátkami časné serokonverze a c200 nikoliv. Silný signál se obdrží při reakci protilátek v členu souboru časné serokonverze PHV914-5 c33c s potahem NS34a na misce. Antigen c200 se neneutralizuje těmito protilátkami. To lze vidět ve vrchní části tabulky 7. Když se NS34a smísí se vzorkem PHV914-5, neutralizuje se a proto nejsou ve vzorku přítomné žádné protilátky, které by reagovaly s NS34a naneseným na mikromisce. Údaje ukazují, že NS34a může detekovat jinou skupinu protilátek než c200.
« 4
4 4 • 4 44 ·· · 44
Tabulka 7
Kompetiční studie ukazující detekci různých protilátek v souboru časné serokonverze c33c antigenem NS34a ve srovnání s antigenem c200
$$ Kontrola raSBswBfflsBe | ||
• c2oa ' + * | BHV91.4-5 1 | θ//° iHhibiCč |
s | ÍjÍínhÍ:íiÍ<*iÍrnÍ-^?f | |
íug | 1,450 | 1,645 ' 12 1 |
iqg | 1/87 8. B| | |
• O/ug | 1/57 | 1,913 19 H |
O/ug | 1,719 :L | 1 jp4 5______B |
hNS3/4a· | ||
s | <S;ý 7/·/® | |
: 1ug | 0/54 | 1,59.9 W Λ |
·:: lug | . $037 | ' 1,677 A98?'/|1 |
Fp/ug · | 0/66. | 1,672 '·<;·;9βΑ:|1 |
Ó,5ug | A | 1,524 \NA SI ^AýKíÍw^ÍHpWi <·»Ýftr J+iiňteWfWMitaM^iQSiřJ*3! |
A A A A
A « A AA 4
AA AA* » A A « • A AA
Příklad 5
Studie stability konformačního epitopu NS3/4a
Pro vyhodnocení úlohy stability epitopu NS3/4a při provedení eseje se provádí následující studie zjišřující imunoreaktivitu NS3/4a proti času při teplotě místnosti. Malé alikvóty zásobního roztoku NS3/4a se ponechají v klidu při teplotě místnosti a poté se zamrazí v časových intervalech udaných v tabulce 8. Všechny lahvičky se současně potáhnou a testují proti dvěma NS3 serokonverzním souborům.
Jak ukazuje tabulka 8, není zásobní NS3/4a stabilní a imunoreaktivita s časem klesá. Navíc je pro imunoreaktivitu nezbytné udržet konformaci NS3/4a.
Další stabilitní studie se provádějí následujícím způsobem. Dvě konformační monoklonální protilátky připravené proti NS3/4a standardními způsoby se substituují pro časné serokonverzní soubory proti HCV. Zásobní lahvičky NS3/4a se uchovávají při teplotě místnosti v časových intervalech 3, a 24 h. NS3/4a ze zamrazených lahviček se potahuje při 90 ng/ml a podrobí analýze způsobem popsaným výše. Výsledky ukazují, že tyto dvě monoklonální látky jsou skutečně konformační a jejich reaktivita je citlivá na zacházení se zásobním antigenem NS3/4a při teplotě místnosti. Reaktivita pozitivní kontroly monoklonální protilátky se nemění.
• ··· ·· · ·· ·Μ ·· ··
- 71 Tabulka
RFU/min 8,75 l 4.14 I 3.08 J 1,88 I 1,75 i 1,75 0,75 • · ··· © © © · · · © · · ·· « ©· ·«· ·© ··
- 72 Příklad 6
Imunoreaktivita konformaČního epitopů NS3/4a ve srovnání s denaturovaným NS3/4a
Imunoreaktivita konformaČního epitopů NS3/4a obdrženého podle popisu výše se srovnává s NS3/4a denaturovaným přídavkem SDS do přípravku konformaČního epitopů NS3/4a do konečné koncentrace 2 %. Denaturovaný NS3/4a a konformační NS3/4a se nanáší na mikrotitrační misky, jak se popisuje výše. Na mikrotitrační misky se rovněž nanáší antigen c200 [Hepatology, 12, 19-25 (1992) ORTHO, HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey] , Antigen c200 se používá pro srovnání a předpokládá se, že je nekonformační vzhledem k přítomnosti redukujícího činidla (DTT) a detergentu (SDS).
Imunoreaktivita se testuje proti dvěma souborům časné HCV serokonverze, PHV 904 a PHV 914 (komerčně dostupné vzorky lidské krve od Boston Biomedica, lne., West Bridgewater, MA) . Výsledky ukazuje tabulka 9. Údaje ukazují, že denaturovaná či linearizovaná forma NS3/4a (stejně tak jako c200) nedetekuje časné serokonverzní soubory tak časně jako konformační epitop NS3/4a.
73’ • ··· • · · · 9
999 ·· ·*
Tabulka 9
NbJAa proti denat. NS3/4a — | |||||||||
*N5J/4a + 2 % SDS | ---- | ||||||||
NS3/4a | dfi§3/4aT | c200 | NS3/4a | dNS3/4a* | c200 | ||||
OD | OD | OD | s/co | s/co | s/co | ||||
HCV | PHV 904-1 | 0,012 | 0,012 | 0,009 | 0,02 | 0,02 | 0,01 0,01 | ||
Serokonverze | PHV 904-2 | 0,011 | 0,009 | 0,008 | 0.02 | 0,01 | |||
PHV 904-3 | 1,124 | 0,071 | 0,045 | SSiÉSEB | ι*.· | 0,11 | 0,07 | ||
PHV 904-4 | 2,401 | 0,273 | 0,129 | ;,t | 0,44 | 0,21 | |||
PHV 904-5 | 3,022 | 0,793 | 0,347 | ||||||
p | 0,57 | ||||||||
PHV 904-6 | 2,711 | 1,472 | 0,774 | ||||||
í- | |||||||||
PHV 904-7 | 3,294 | 1,860 | 0,943 | ||||||
PHV 914-1 | 0,006 | 0,004 | 0,001 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | |||
PHV 914-2 | 0,005 | 0,004 | 0,002 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | |||
PHV 914-3 | 0,098 . | 0,003 | 0.001 | 0,16 | 0,00 | 0,00 | |||
PHV 914-4 | 1,118 | 0,006 | 0,004 | 0,01 | 0,01 | ||||
PHV 914-5 | 2,035 | 0,044 | |||||||
0,022 | 0,07 | 0,04 | |||||||
PHV 914-6 | 2,092 | 0,074 | 0,025 | 0,12 | J - I 0,04 | ||||
PHV 914-7 | 2,519 | 0,281 | 0,132 | SO | 0,45 | 0,22 | |||
PHV 914-8 | 2,746 | 0,907 | |||||||
0,500 | - « | 0,82 | |||||||
PHV 914-9 | 3,084 | 1,730 | 0,931 | •t. | * £^íTr-t*.T» -«j | ||||
HCV 3.0 | Neg. kont. | 0,023 | 0/324 | 0,008 | |||||
Kontroly | Neg. kont. | 0,027 | 0,024 | 0,007 | |||||
Neg. kont. | 0^021 | 0,017 | 0,005 | ||||||
průměr | 0,024 | 0,022 | 0,007 | ||||||
odříznutí | 0,624 | 0,622 | 0,607 | ||||||
Poz. kont. | 1,239 | 0,903 | 0,575 | 1,99 | 1,45 | 0,95 | |||
Poz. kont. | 1,445 | 0,916 | 0,614 | 2,32 | 1,47 | 1,01 | |||
• 4 144
- 74 a 4
4 4 4
44
Imunoreaktivita konformačního epitopu se též testuje s použitím monoklonálních protilátek proti NS3/4a standardními způsoby. Tyto monoklonální protilátky se poté testují v uspořádání ELISA proti NS3/4a a denaturovanému NS3/4a a antigenu c200. Údaje ukazují, že monoklonální protilátky proti NS3/4a reagují s NS3/4a a denaturovaným NS3/4a podobným způsobem jako se serokonverzními soubory, jak ukazuje tabulka 10. Tento výsledek též poskytuje další důkaz toho, že NS3/4a je svou povahou konformační, jak se mohou stát mo noklonální protilátky, které jsou svou reaktivitou podobné časným serokonverzním souborům c33c.
Tabulka 10
Miska NS3/4a dNS3/4a c200 | ||||
Monoklonální | OD | OD | OD | |
4B9/E3 | 1:100 | 1.820 | 0.616 | 0.369 |
1:1000 | 1.397 | 0.380 | 0.246 | |
1:10000 | 0.864 | 0.173 | 0.070 | |
1:20000 | 0.607 | 0.116 | 0.085 | |
5B7/D7 | 1:100 | 2.885 | 0.898 | 0.436 |
1:1000 | 2.866 | 0.541 | 0.267 | |
1:10000 | 1.672 | 0.215 | 0.086 | |
1:20000 | 1.053 | 0.124 | 0.059 | |
1A8/H2 | 1:100 | 1.020 | 0.169 | 0.080 |
1:1000 | 0.921 | 0,101 | 0.043 | |
1:10000 | 0.653 | 0.037 | 0.013 | |
1:20000 | 0.337 | 0.027 | 0.011 |
• »44* a 4
4 4
4
4 4 4 4 4 4
444 44 44
Popisují se nové eseje pro detekci HCV. Z popisu výše je třeba si uvědomit, že specifická ztělesnění tohoto vynálezu zde slouží pouze pro účely ilustrace. Lze uskutečnit různé modifikace bez odchylky od myšlenky a obsahu vynálezu, který se zde popisuje.
Claims (46)
1. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačuj ící se t í m, že se k němu připojuje alespoň jedna protilátka proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a.
2. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že se k němu připojují alespoň dvě protilátky proti jádru HCV.
3. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
4. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 3, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
5. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jednou protilátkou proti jádru je monoklonální protilátka.
6. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že epitop NS3/4a je konformační epitop a obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou na obrázcích 4A až 4D,
7. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje připojený antigen vzniklý spojením více epitopů.
4 *
4 4 ···
4·· ·· 4 4444
44 4 44 444 44 44
- 77
8. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 7, vyznačující se tím, že antigen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.
9. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačuj ící se t í m, že se k němu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a HCV NS3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.
10. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 9, vyznačující se tím, že jsou tyto dvě protilátky proti jádru zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
11. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 10, vyznačující se tím, že jsou tyto dvě protilátky proti jádru zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
12. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačuj ící se tím, že se k němu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru C (HCV), HCV NS3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a antigen vzniklý spojením více epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.
13. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
*· ♦·· ·· ·· (a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku l, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru respektive s epitopem NS3/4a, (c) přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigenem (ii), (d) detekci komplexů vytvořených protilátkami a antigeny, pokud k jejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, Že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 az 53 HCV, číslováno vzhledem « · « ♦*· · ♦ ·· « • 9 ·· · ·♦ « 9 • 9 9
99 99 k polyproteinové sekvenci HCV1 a detekovatelné značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCVl.
16. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se epitop c33c spojuje s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.
18. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že epitop NS3/4a je konformační epitop a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.
19. Způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 2, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive epitop NS3/4a, * ·
9 « 00«
0 0
4 0 · 0 0 0 0
4« 000 *« ·· (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že epitop NS3/4a je konformační epitop a obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.
21. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 9, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive konformační epitop NS3/4a, • 4 I · (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
22, Způsob podle nároku 21, vyznačující se t í m, že tyto alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačuj ící se t i m, že alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
24. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím,
4 4··
4 ·· ··* *· ··
- 82 že zahrnuje následující kroky:
(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 7, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru, epitopem NS3/4a a antigenem vzniklým spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) prvního a druhého antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a respektive s antigenem vzniklým spojením více epitopů a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigeny (ii), (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud k jejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se t í m, že tato alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
* A • A A A • A
- 83 » A <
» A A 4
AA AA
26. Způsob podle nároku 25, vyznačuj íc í se t í m, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
27. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se t í m, že tento první antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačuj ící se t í m, že tento epitop c33c je spojený s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.
29. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se t í m, že tento druhý antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c22 polyproteinu HCV.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se t í m, že epitop z oblasti c22 obsahuje aminokyseliny Lysio až Serg£ř polyproteinu HCV s deleci Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, kde se tento epitop spojuje s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.
9 9 Λ ·· «· ©
- 84
31. Způsob podle nároku 24, vyznačující se t í m, že tento antigen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.
32, Způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 12, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru, konformační epitop NS3/4a, respektive antigen vzniklý spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopů z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a epitopů z oblasti c22 polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami • · · » *· · ·« ·· · a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.
33. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se t í m, že tyto alespoň dvě protilátky proti jádru se zaměřuje proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV se zaměřuje proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.
34. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se t í m, že alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
35. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se t í m, že epitop z oblasti c22 zahrnuje aminokyseliny Lysxo až Seras polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.
36. Souprava pro imunodiagnostické zkoušky, v yznačující se tím, že obsahuje pevný nosič pro imunoeseje podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a pokyny pro provádění imunodiagnostické zkoušky.
37. Způsob přípravy pevného nosiče, vyznačující se tím, že zahrnuje.(a) zajištění pevného nosiče a • 4 · • 4 (b) vazbu alespoň jedné protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jednoho izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopů.
38. Způsob přípravy pevného nosiče pro imunoeseje, vyznačující se tím, že zahrnuje:
(a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbu dvou protilátek proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopů.
39. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 37 nebo 38, vyznačující se tím, že zahrnuje vazbu alespoň jednoho antigenů vzniklého spojením více epitopů s pevným nosičem.
40. Antigen vzniklý spojením více epitopů, vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F nebo aminokyselinovou sekvenci s alespoň 80% sekvenční identitou s touto sekvencí, která reaguje specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku od jednotlivce infikovaného HCV.
41. Antigen vzniklý spojením více epitopů podle nároku 40,vyznačující se tím, že tento antigen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F nebo aminokyselinovou sekvenci s alespoň 90% sekvenční identitou s touto sekvencí, která reaguje specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku od jednotlivce infikovaného HCV.
· · ·· *
40 vzniklý spojením více se t í m, že tento anti
42. Antigen podle nároku epitopů, vyznačuj ící gen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 5A až 5F.
43. Polynukleotid obsahující kódovací sekvenci pro antigen vzniklý spojením více epitopů podle kteréhokoliv z nároků 40 až 42.
44. Rekobinantní vektor, vyznačující se tím, že obsa huje:
(a) polynukleotid podle nároku 43, (b) a kontrolní elementy operabilně připojené k tomu to polynukleotidu, kterými lze přepisovat a překládat kódovací sekvenci v hostitelské buňce.
45. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformovaná rekombinantním vektorem podle nároku 44.
46. Způsob přípravy antigenu vzniklého spojením více epitopů, vyznačující se tím, že zahrnuje:
(a) zajištění populace hostitelských buněk podle nároku 45 a (b) pěstování této populace buněk za podmínek, při kterých se exprimuje antigen vzniklý spojením více epitopů kódovaný sekvencí přítomnou v tomto rekombinantním vektoru.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US21208200P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
US28081101P | 2001-04-02 | 2001-04-02 | |
US28086701P | 2001-04-02 | 2001-04-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20024058A3 true CZ20024058A3 (cs) | 2003-09-17 |
CZ304185B6 CZ304185B6 (cs) | 2013-12-11 |
Family
ID=27395684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20024058A CZ304185B6 (cs) | 2000-06-15 | 2001-06-14 | Pevný nosic pro imunoeseje a zpusob jeho prípravy, zpusob detekce infekce HIV a souprava pro imunodiagnostickou zkousku |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6632601B2 (cs) |
EP (2) | EP1354204B2 (cs) |
JP (3) | JP4837229B2 (cs) |
CN (3) | CN1256591C (cs) |
AT (2) | ATE368221T1 (cs) |
AU (2) | AU2001272945A1 (cs) |
BG (1) | BG66205B1 (cs) |
BR (2) | BRPI0111682B8 (cs) |
CA (2) | CA2413003C (cs) |
CY (2) | CY1107537T1 (cs) |
CZ (1) | CZ304185B6 (cs) |
DE (2) | DE60125240T3 (cs) |
DK (2) | DK1354204T4 (cs) |
ES (2) | ES2288969T3 (cs) |
HK (2) | HK1061861A1 (cs) |
HU (1) | HU228873B1 (cs) |
MX (2) | MXPA02012424A (cs) |
NO (1) | NO332275B1 (cs) |
PL (1) | PL213363B1 (cs) |
PT (2) | PT1350105E (cs) |
SI (1) | SI1354204T2 (cs) |
SK (1) | SK287694B6 (cs) |
WO (2) | WO2001096875A2 (cs) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08510240A (ja) * | 1993-05-12 | 1996-10-29 | カイロン コーポレイション | C型肝炎ウイルスe2/ns1領域の保存モチーフ |
MXPA02012424A (es) * | 2000-06-15 | 2003-04-25 | Chiron Corp | Ensayo de combinacion de antigenos/anticuerpos para el virus de hepatitis c. |
US7491808B2 (en) * | 2000-06-15 | 2009-02-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HCV non-structural protein mutants and uses thereof |
ES2296803T3 (es) | 2000-08-17 | 2008-05-01 | Tripep Ab | Vacunas que contienen ribavirina. |
US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
DE10106295C1 (de) * | 2001-02-02 | 2002-08-22 | Gaifar German American Inst Fo | Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist |
AR033448A1 (es) * | 2001-03-28 | 2003-12-17 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Prueba de combinacion antigeno-anticuerpo para hepatitis c para una deteccion temprana de la infeccion |
JP4353793B2 (ja) | 2001-06-26 | 2009-10-28 | アボット・ラボラトリーズ | Hcv抗原とhcv抗体との同時検出のための方法 |
US7101683B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
US7049060B2 (en) * | 2001-11-05 | 2006-05-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV anti-core monoclonal antibodies |
US7332269B2 (en) * | 2001-11-11 | 2008-02-19 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV core protein sequences |
FR2839555B1 (fr) | 2002-05-10 | 2007-07-27 | Bio Rad Pasteur | Procede de detection simultanee d'un antigene et d'un anticorps d'un microorganisme infectieux |
WO2004021871A2 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Chiron Corporation | Hcv assay |
US20040152070A1 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-05 | Shah Dinesh O. | Method of detection of HCV antibodies in combination assay or sole antibody assay |
WO2005019828A1 (en) | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Epitope protection assay and method for detecting protein conformations |
EP1802778B1 (en) * | 2004-08-27 | 2011-10-05 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Hcv multiple epitope fusion antigens with modified proteolytic cleavage sites and uses thereof |
CN101287989B (zh) * | 2005-02-02 | 2016-04-13 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 |
AU2006335256B2 (en) | 2005-11-22 | 2012-10-18 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Norovirus and sapovirus antigens |
US7794692B2 (en) * | 2005-12-02 | 2010-09-14 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis |
US7887803B2 (en) | 2005-12-02 | 2011-02-15 | Amorfix Life Sciences | Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases |
WO2007098607A1 (en) | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-sod1 mediated diseases |
CN1908666B (zh) * | 2006-08-14 | 2010-05-12 | 武汉大学 | 一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒及应用 |
EP2185195A2 (en) | 2007-08-16 | 2010-05-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
EP2414839B1 (fr) * | 2009-03-30 | 2014-06-25 | Biomérieux | Support solide de détection du vhc |
US20100297607A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Jian Zheng | Reagents For HCV Antigen-Antibody Combination Assays |
WO2011127316A1 (en) | 2010-04-07 | 2011-10-13 | Novartis Ag | Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle |
CN106771219B (zh) * | 2010-06-17 | 2020-04-07 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多表位测定 |
EP2591097A1 (en) | 2010-07-06 | 2013-05-15 | Novartis AG | Norovirus derived immunogenic compositions and methods |
WO2012006500A2 (en) * | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
JP5911889B2 (ja) * | 2011-01-13 | 2016-04-27 | オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドOrtho−Clinical Diagnostics, Inc. | 梅毒トレポネーマトリプレット抗原 |
FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
CA2906417C (en) | 2013-03-14 | 2022-06-21 | Robert Ziemann | Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies |
MX362075B (es) | 2013-03-14 | 2019-01-07 | Abbott Lab | Ensayo de combinación de antígeno-anticuerpo del virus de la hepatitis c (vhc) y métodos y composiciones para usarlo. |
CN105209616A (zh) | 2013-03-14 | 2015-12-30 | 雅培制药有限公司 | 用于改进的抗体检测的hcv ns3重组抗原及其突变体 |
CN103630690B (zh) * | 2013-12-17 | 2014-08-20 | 朱之炜 | 丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其检测方法 |
CA2980718C (en) | 2015-03-27 | 2021-06-01 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Hcv ns4a/modified ns3 polypeptides and uses thereof |
EP3285806A4 (en) * | 2015-04-20 | 2019-03-27 | Qoolabs, Inc. | SINGLE DOMAIN CAMELID HCV ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
US11639933B2 (en) * | 2017-09-27 | 2023-05-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital affinity linkage assay |
CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
CN115838420B (zh) * | 2022-10-31 | 2023-05-05 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种可溶性hcv重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5683864A (en) * | 1987-11-18 | 1997-11-04 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies |
GB2212511B (en) * | 1987-11-18 | 1992-01-22 | Chiron Corp | Hepatitis c virus |
US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
IE62868B1 (en) * | 1987-11-18 | 1995-03-08 | Chiron Corp | Hepatitis C virus |
US5350671A (en) | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
JP2730153B2 (ja) | 1989-03-16 | 1998-03-25 | 日本合成ゴム株式会社 | 熱可塑性樹脂組成物およびその製造方法 |
UA50829C2 (uk) * | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
RO113059B1 (ro) * | 1989-05-18 | 1998-03-30 | Chiron Corp | Polinucleotida capabila de hibridizare pe o secventa hcv, metoda pentru detectarea unei secvente hcv si procedeu de eliminare a hcv din sange |
US6194140B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
HU217025B (hu) * | 1990-04-04 | 1999-11-29 | Chiron Corp. | Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben |
US5712087A (en) | 1990-04-04 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens |
CA2049679C (en) | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
PT97247B (pt) * | 1991-04-03 | 1997-10-31 | Chiron Corp | Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv |
HU227547B1 (en) | 1991-06-24 | 2011-08-29 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
UA39944C2 (uk) | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
WO1994025601A2 (en) * | 1993-04-27 | 1994-11-10 | N.V. Innogenetics S.A. | New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
JP3217600B2 (ja) | 1994-07-12 | 2001-10-09 | 株式会社先端生命科学研究所 | 非a非b型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ |
DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
US5843752A (en) | 1995-05-12 | 1998-12-01 | Schering Corporation | Soluble active hepatitis C virus protease |
US5990276A (en) | 1996-05-10 | 1999-11-23 | Schering Corporation | Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease |
US6514731B1 (en) * | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
NZ333431A (en) * | 1996-05-24 | 2000-05-26 | Chiron Corp | Multiple epitope fusion protein selected from HIV or HCV, method of immunoassay and assay device |
EP0870830A3 (en) * | 1997-02-10 | 2004-02-25 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Chimera hepatitis C virus antigen |
EP1021719B1 (en) * | 1997-09-22 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method for detecting antibodies in a sample |
US7316905B1 (en) * | 1998-07-30 | 2008-01-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
MXPA02012424A (es) * | 2000-06-15 | 2003-04-25 | Chiron Corp | Ensayo de combinacion de antigenos/anticuerpos para el virus de hepatitis c. |
-
2001
- 2001-06-14 MX MXPA02012424A patent/MXPA02012424A/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 CN CNB018112439A patent/CN1256591C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 EP EP01952160A patent/EP1354204B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 SI SI200130682T patent/SI1354204T2/sl unknown
- 2001-06-14 DK DK01952160.8T patent/DK1354204T4/da active
- 2001-06-14 CN CNB2004100116606A patent/CN100463922C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 HU HU0500444A patent/HU228873B1/hu unknown
- 2001-06-14 ES ES01952156T patent/ES2288969T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CA CA2413003A patent/CA2413003C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 MX MXPA02012401A patent/MXPA02012401A/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 US US09/881,654 patent/US6632601B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019369 patent/WO2001096875A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 DK DK01952156T patent/DK1350105T3/da active
- 2001-06-14 DE DE60125240T patent/DE60125240T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 DE DE60129598T patent/DE60129598T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AU AU2001272945A patent/AU2001272945A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 EP EP01952156A patent/EP1350105B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 SK SK1777-2002A patent/SK287694B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 CN CNB018112463A patent/CN1214244C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CZ CZ20024058A patent/CZ304185B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 US US09/881,239 patent/US6630298B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AU AU2001272948A patent/AU2001272948A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 AT AT01952156T patent/ATE368221T1/de active
- 2001-06-14 CA CA2412035A patent/CA2412035C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 PL PL365599A patent/PL213363B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 BR BRPI0111682A patent/BRPI0111682B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019156 patent/WO2001096870A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 AT AT01952160T patent/ATE348337T1/de active
- 2001-06-14 JP JP2002510948A patent/JP4837229B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 PT PT01952156T patent/PT1350105E/pt unknown
- 2001-06-14 BR BRPI0111731A patent/BRPI0111731C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 PT PT01952160T patent/PT1354204E/pt unknown
- 2001-06-14 JP JP2002510953A patent/JP4834279B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 ES ES01952160T patent/ES2277932T5/es not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-06 NO NO20025878A patent/NO332275B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-07 BG BG107441A patent/BG66205B1/bg unknown
- 2003-08-08 US US10/637,323 patent/US6797809B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-19 US US10/643,853 patent/US7319144B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-06 HK HK04104878A patent/HK1061861A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-07-26 US US10/899,715 patent/US7241879B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-12-21 HK HK05111793.1A patent/HK1079796A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-07 CY CY20071100319T patent/CY1107537T1/el unknown
- 2007-08-20 CY CY20071101092T patent/CY1106820T1/el unknown
-
2011
- 2011-03-28 JP JP2011071150A patent/JP2011125350A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7319144B2 (en) | Polynucleotides encoding a multiple epitope fusion antigen for use in an HCV antigen/antibody combination assay | |
EP1799868B1 (en) | Hcv non-structural protein mutants and uses thereof | |
US7166426B2 (en) | HCV assay | |
US10753939B2 (en) | HCV NS4a/modified NS3 polypeptides and uses thereof | |
US20060051745A1 (en) | HCV non-structural protein mutants and uses thereof | |
RU2274863C2 (ru) | Определение комплекса hcv-антиген/антитело | |
EP1829891B1 (en) | Immunoassays for Anti-HCV Antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210614 |