CN101287989B

CN101287989B - 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101287989B
Application number: CN200580047627.1A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏
Original assignee: Fei Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Fei Peng Biological Co., Ltd.
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2005-02-02
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2025-02-02
Also published as: US7658930B2; CN101287989A; EP1845378A1; WO2006081718A1; EP1845378A4; CN101160413B; CN101160413A; JP2008529015A; US20080193955A1; US20090029348A1; WO2006081701A1

Abstract

一种双抗原夹心法检测HCV抗体的试剂盒及其制备方法，其检测形式为“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-标记物-可识别信号”。该试剂盒及其制备方法的特征在于，其中的第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物。

Description

一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体来说，本发明涉及HCV抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的严重肝脏疾病。全世界现有1.7亿的HCV感染者，我国的感染人数超过了4000万，在HCV感染者中约有50-85％会发展成慢性肝炎，约10-15％会发展为肝硬化。丙型肝炎病毒给人类健康带来极大的危害，给社会经济造成极大的负担。

自1989年Choo等成功克隆HCV基因以来，HCV的诊断检测技术已取得了巨大进展。目前检测丙型肝炎主要有三个途径：用PCR检测HCVRNA；用单克隆抗体检测HCV抗原；用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白印染法等检测HCV抗体。

ELISA检测HCV抗体的试剂已经发展了三代，第一代ELISA-1试剂盒于1990年由英国Ortho诊断公司开发，抗原是利用美国Chiron公司提供的HCVNS4基因重组抗原C100-3，但是其敏感性及特异性不理想。之后第二代ELISA-2取代了ELISA-1，ELISA-2试剂盒由英国Ortho诊断公司和美国Abbott诊断公司分别开发，使用抗原包括CORE、NS3和NS4抗原，其敏感性和特异性有所改善，在慢性丙肝病人中用ELISA-2检测，其阳性率为92-95％。由于采用CORE及NS3抗原使HCV血清阳转的平均窗口期由16周缩短为10周。第三代ELISA-3试剂盒由英国Ortho诊断公司、美国Abbott诊断公司、法国Sanofi诊断公司率先开发生产，使用抗原包含CORE、NS3、NS4和NS5抗原。采用ELISA-3检测献血员及高危人群的HCV，其敏感性均有增加，约为97％，HCV血清阳转的平均窗口期缩短至7-8周。

由于ELISA在诊断上具有易于自动化、使用方便、重复性好、成本低并且有利于实验数据的分析整理和保存，所以目前国际上筛查HCV抗体的商品化试剂主要是利用间接法开发的第二代或第三代ELISA试剂盒，虽然ELISA试剂已经经过了三代改进，但仍有不足之处。主要体现为漏检、假阳性、不确定结果仍较多。这主要是由于间接法试剂在方法学上存在的缺陷引起的，具体表现如下：

1.特异性差：由于间接法采用了非特异性识别的第二抗体(以下简称二抗)标记，这种非特异性的识别导致其较低的特异性；

2.灵敏度低：由于特异性差，试剂盒中包被抗原、标记二抗的使用浓度被迫降低，待测样品量减少，样品稀释倍数增加又进一步导致了灵敏度的降低；

3.窗口期长：一般使用的二抗为抗IgG抗体，只能检测抗体中的IgG组分，对其它类型抗体尤其是早期出现的IgM抗体无法检出，致使灵敏度低并且延长了窗口期。

目前，丙型肝炎的输血后感染占输血后肝炎病例的70％，而在丙型肝炎感染者中更有80-90％是属于输血后感染。这在很大程度上是由于现有间接法试剂的上述缺陷造成的，因此需要开发出高灵敏度、高特异性的HCV抗体诊断试剂。

双抗原夹心法是利用标记抗原代替间接法中的标记二抗，从方法学上解决了间接法的上述缺陷。但是，在双抗原夹心方法广泛应用于抗体检测的今天，之所以筛查HCV抗体的试剂盒仍没有采用较为先进的双抗原夹心法，主要是因为：

1.HCV蛋白标记后活性损失问题

目前抗原标记主要将标记物如辣根过氧化物酶(HRP)直接标记到抗原上，但这种方法在HCV抗原的标记过程中遇到了问题。首先，由于HCV的主要抗原表位区段NS3抗原是对构象依赖性较强的抗原，当被分子量较大的“柔性”标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记后，其构象变化较大，且活性表位不易暴露，标记后NS3抗原的活性大为降低；其次，HCV的另一主要抗原表位区段CORE的主要活性区富含赖氨酸，这些赖氨酸对CORE的活性至关重要，而赖氨酸侧链上的游离氨基又往往是标记反应(如NaIO₄氧化法标记HRP)的主要靶基团，所以标记后CORE抗原的活性更是大大降低，最终使试剂盒的灵敏度还不如间接法，存在着严重漏检。

2.高本底问题

CORE区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能力(Matsumoto，M.等，Virology，218：P43-51，1996；Kunkel，M.等，Virology，294：P239-245，2002；Majeau，N.等，JournalofGeneralVirology，85：P971-981，2004)，在双抗原夹心法中标记抗原(第二抗原)利用此种结合能力与包被抗原(第一抗原)同源结合造成试剂盒的高本底。

目前国内外也有不少关于双抗原夹心法HCV抗体检测试剂的报道，但均存在一定的缺陷，具体如下：

公开号为CN1548958A的专利申请介绍的方法没有考虑到外源蛋白的大小对维持HCV抗原尤其是NS3抗原活性的重要性而没有对其桥蛋白进行筛选，即没有使用分子量尽可能小的桥蛋白以保证HCV抗原的活性，进而保证试剂盒的灵敏度；其次，没有在包被液中加入一定比例的巯基试剂(如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇等)或变性剂(如十二烷基磺酸钠)(详见专利US6270960和US6261764)，没有在封闭液中加入一定比例的巯基试剂，从而导致包被抗原的活性无法完全体现，致使试剂盒的灵敏度降低；第三，没有在第二抗原的稀释液中加入一定比例的巯基试剂，从而导致第二抗原的活性无法完全体现，致使试剂盒的灵敏度降低；第四，没有提出针对CORE区抗原的各种结合倾向而引起的高本底问题的解决办法。另外，其实施例采用的pET-32a(+)空载体表达的蛋白含有HisTag，其多克隆抗体标记物中也就含有抗HisTag抗体标记物，而其包被抗原含有HisTag，这样抗HisTag抗体标记物可以直接与包被抗原结合而显色，使得所有血清无论阴性、阳性均会呈现阳性反应。

李保昌等，中国实验血液学杂志，12(3)：P359-362，2004介绍的方法虽然研究了生物素化HCV抗原，但该文章仅停留在抗原水平的研究上，没有提出对双抗原夹心法HCV抗体诊断试剂在开发中会遇到的上述难题的具体解决办法。而且该文章中利用大肠杆菌体内原始的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶对HCV蛋白进行生物素化的方法生物素化效率很低，大约仅为10％左右(Paul，A.S.等，NucleicAcidsResearch，26(6)：P1414-1420，1998；Tsao，K.L.等，Gene，169：P59-64，1996)，为了尽可能消除作为第二抗原参加反应时未生物素化抗原对已生物素化抗原的竞争对灵敏度的影响，此种生物素化方法必须另外分离出已生物素化抗原，这就使得生物素化抗原得率低，并增加了后续纯化的难度和成本。

专利US6096319、US6270960、US6306579虽然提到了HCV双抗原桥式夹心法，但并未提出对上述难点的实质性解决办法，只提出了将在其它领域应用已较为成熟的各种双抗原夹心诊断方法应用于HCV诊断上的理论。

专利US6613530提到HCV双抗原桥式夹心法，其所用的抗原(包括第一抗原和第二抗原)为HCV蛋白与载体蛋白的偶联物，分子量较大的蛋白载体(BSA，69KD；β-Gal，465KD；Bovine-Fab，75KD)只适用于HCV短肽的偶联，构象依赖性HCV抗原尤其是NS3区段抗原采用此方法时其活性明显降低，进而影响试剂盒的灵敏度。

曹诚等，中华医学检验杂志，19(4)：P205-207，1996所提到的HCV双抗原夹心法是将在其它领域应用已较为成熟的双抗原夹心诊断方法直接移植于HCV诊断上的初步尝试，由于没有考虑到HCV蛋白的上述特殊性，其采用将HRP直接标记到未经改造的HCV蛋白的游离赖氨酸上，使得标记抗原活性大幅下降，制成的试剂盒存在着严重的漏检。

本发明是利用双抗原夹心法开发的HCV抗体检测试剂盒，从方法学角度在根本上克服了间接法的种种弊端，也解决了目前双抗原夹心法试剂盒存在的技术问题，开发出了可以应用于临床检测的HCV抗体检测试剂盒，为HCV的筛查提供了更有力的工具。

发明的目的

本发明的目的在于解决HCV双抗原夹心法试剂盒中因CORE区抗原引起的高本底问题，解决HCV蛋白标记后的活性损失问题，进一步结合生物素-亲和素放大系统，提供灵敏度、特异性均较目前商品化试剂有较大提高的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒。

发明概述

本发明提供一种HCV抗体检测试剂盒，该试剂盒以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-标记物-可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步结合反应，该试剂盒的特征在于所述第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物。

在本发明实施方案中，其中所述标签为肽类标签或非肽类标签。

在本发明进一步的实施方案中，所述非肽类标签为化合物、半抗原、维生素、类固醇、染料、激素、抗生素、核酸、或它们与肽或蛋白的组合物。

在本发明优选实施方案中，所述化合物为二硝基苯酚、溴脱氧尿苷；维生素为生物素或其衍生物；类固醇为地高辛；染料为吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、OregonGreen、Luciferyellow、AlexaFluor、CascadeBlue。

在本发明进一步优选实施方案中，所述非肽类标签为生物素或其衍生物、生物素或其衍生物与肽或蛋白的组合物。

在本发明进一步实施方案中，所述肽类标签为含有HisTag、T7Tag、STag、FlagTag、HATag或HCV肽片段的肽或蛋白。

在本发明优选实施方案中，所述肽类标签为外源蛋白时，其分子量小于30KD，优选小于20KD，进一步优选小于15KD，再进一步优选小于10KD，更进一步优选小于5KD。

在本发明优选实施方案中，所述肽类外源蛋白标签位于HCV蛋白的N端时，分子量小于5KD；位于HCV蛋白的C端时，分子量小于20KD。

在本发明实施方案中，所述第一抗原和第二抗原包括HCVNS3及CORE蛋白区段，而且NS3蛋白区段为从a.a.1201±5处起始至a.a.1465±8处终止的任一区段，该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性不变；CORE蛋白为含有a.a.10-17全序列的区段，进一步为含有a.a.7-21全序列的区段，更进一步为含有a.a.6-23全序列的区段，而且不包括a.a.29-90全序列的区段，进一步为不包括a.a.29-70全序列的区段，再进一步为不包括a.a.29-59全序列的区段，更进一步为不包括a.a.32-48全序列的区段，该蛋白区段可以存在存在突变而保持其抗原性和结合能力不变。

在本发明优选实施方案中，所述第一抗原的CORE蛋白区段为a.a.2-59；所述第二抗原的CORE蛋白区段为a.a.1-28；所述第一抗原和第二抗原的NS3蛋白区段均为a.a.1201-1465。

在本发明的实施方案中，所述标签的结合配偶体为标签的抗体或受体。

在本发明进一步实施方案中，当选用生物素或其衍生物、生物素或其衍生物与肽或蛋白的结合物为标签时，其结合配偶体为亲和素、链霉亲和素、中性链亲和素、它们的类似物、抗生物素或其衍生物抗体；当选用肽类标签时，其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供一种制备所述试剂盒的方法，其中包括HCV蛋白与标签结合的步骤，所述结合方法包括：

1.HCV蛋白的生物素化：包括体内酶促生物素化、体外生物素化、间接生物素化、氨基酸的生物素化；

2.HCV蛋白与肽的嵌合表达。

在本发明进一步的实施方案中，所述体内酶促生物素化的方法为：

使编码HCV蛋白与生物素接受蛋白的嵌合基因(简称X)同编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因(简称Y)共同在宿主体内表达，在表达宿主体内利用表达的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素，具体表达方法包括：

1)多顺反子表达；

2)共转化表达；

3)多启动子表达；

4)单顺反子表达；

5)与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达。

在本发明其它实施方案中，所述体外生物素化为通过偶联活化生物素或体外酶促反应来完成对HCV蛋白的生物素化。

在本发明实施方案中，所述生物素接受蛋白为生物素羧基载体蛋白家族或其功能区段、SEQIDNO.3多肽或其功能类似物。

在本发明实施方案中，所述生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶是分类号为EC6.3.4.15的酶或其功能区段、功能类似物。

附图简述

图1为标记物直接识别第二抗原的检测方法示意图。

图2为标记物间接识别第二抗原的检测方法示意图。

图3为表达载体P2的质粒图谱。

图4为第一抗原的表达质粒P2-HCVAgl的质粒图谱。

图5为第二抗原的双顺反子表达表达质粒P2-X-Y的质粒图谱。

发明内容

定义

本发明中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义。

本发明中使用的术语“第一抗原”为包被抗原。

本发明中使用的术语“第二抗原”是HCV蛋白与标签的结合物，第二抗原可以为一个或几个，其各自的标签满足本发明限定条件。

本发明中使用的术语“标记物”为标记有可检测物质的物质，其中可检测物质包括但不限于酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等；化学发光物质，例如吖啶酯；荧光物质，例如异硫氰酸荧光素、铕、铕纳米颗粒等；放射性物质，例如¹²⁵I等；胶体，例如胶体金、乳胶等，本发明的可检测物质可以是上述一个或几个物质的组合。

本发明中使用的术语“外源蛋白”为与HCV蛋白嵌合表达的非HCV编码蛋白的肽或蛋白质部分。

本发明中使用的术语“生物素或其衍生物”为生物素或其功能性衍生物，包括但不限于D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素、脱硫生物素等，其共同特征为含有可与亲合素结合的咪唑酮环或其功能类似结构。

本发明中使用的术语“肽”和“蛋白”具有本领域技术人员所理解的一般含义，而且可以互换使用。

本发明中使用的术语“CORE”和“NS3”分别指HCV核心蛋白和非结构蛋白3。其中前者指HCV全基因编码蛋白的a.a.1-191(a.a.为氨基酸的简写，本发明中a.a.A-B表示HCV全基因编码蛋白的第A个氨基酸到第B个氨基酸的区段，其中B＞A)区段，后者指HCV全基因编码蛋白的a.a.1027-1657区段。

本发明中使用的术语“生物素接受蛋白”(BiotinAcceptorProtein)为生物素羧基载体蛋白(biotincarboxyl-carrierprotein，BCCP)家族或其功能区段、SEQIDNO.3多肽或其功能类似物(详见Peter，J.S.等，Biotechnology，11：1138-1143，1993)，本发明选择的生物素接受蛋白可以为上述肽或蛋白的一个、几个或几个的组合。

本发明中使用的术语“生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶”(Biotin-[acetyl-CoA-carboxylase]synthetase)包括分类号为EC6.3.4.15的酶或其功能区段、功能类似物。

本发明中使用的术语“结合配偶体”为可以和标签相互结合的配体或受体，当选用非肽类标签时，其结合配偶体为该标签的特异性受体或抗体，如选用生物素或其衍生物或它们与肽或蛋白的结合物为标签时，其结合配偶体为亲和素、链霉亲和素、中性链亲和素、它们的类似物、抗生物素或其衍生物抗体；当选用肽类标签时，其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中使用的术语“高本底”指HCV阴性样品的检测OD值超出本发明试剂盒的正常本底范围，甚至可以达到正常情况下强阳性样品的检测OD值。

本发明中使用的术语“柔性”和“刚性”主要指物质的结构易变性，如HR等大分子蛋白质与HCV抗原交联时，其会与HCV抗原“纠缠”在一起致使后者结构改变进而影响其活性，此类物质即为“柔性”物质；相反，如聚苯乙烯、胶体金等与HCV抗原交联时，双方并不会“纠缠”在一起，这时HCV抗原的构象变化不大，此类物质即为“刚性”物质。

本发明中使用的术语“表达宿主”包括原核、真核表达系统宿主，包括但不限于细菌，例如大肠杆菌、枯草杆菌等；酵母例如甲醇酵母、酿酒酵母等；真核细胞例如昆虫细胞、哺乳动物细胞等；病毒；组织、器官或生物活体反应器等。

本发明中使用的术语“支持物”包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、玻片、芯片、塑料、薄膜等。

本发明中使用的术语“待检测样品”为所有可被HCV感染的物种的体液，包括但不限于全血、血清、血浆、分泌物、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、组织液，粪便浸出液，细胞培养液或细胞、组织、器官匀浆液等。

标签

本发明使用术语“标签”为与HCV蛋白连接的并且可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的物质，包括肽类标签和非肽类标签。

所述肽类标签为肽或蛋白质，包括包含有HisTag、T7Tag、STag、FlagTag、HATag(有多种肽可以选择，详见Abcam公司epitopetags章节的产品介绍http://www.abcam.com)或第一抗原中所没有的且其结合能力不至于引起高本底的HCV肽片段等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或蛋白，其主要特征为“可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的”核心物质为肽或蛋白。所述HisTag指6个连续组氨酸，即6×His。

所述肽类标签为外源蛋白时，其分子量小于30KD，优选小于20KD，进一步优选小于15KD，再进一步优选小于10KD，更进一步优选小于5KD。

所述肽类外源蛋白标签位于HCV蛋白的N端时，分子量小于5KD；位于HCV蛋白的C端时，分子量小于20KD。

所述非肽类标签为化合物(如二硝基苯酚、溴脱氧尿苷)、半抗原、维生素(如生物素或其衍生物)、类固醇(如地高辛)、染料(如吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、OregonGreen、Luciferyellow、AlexaFluor、CascadeBlue)、激素、抗生素、核酸等(有多种非肽类物质可以选择，详见Invitrogen公司分子探针的产品介绍http://www.probes.com)所有存在或可制备出相应结合配偶体的非肽类物质。其主要特征为“可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的”核心物质为非肽或蛋白类物质。

标签可以是一个、几个或几个的组合，可以在HCV抗原的N端、C端、两端或内部。

标签应尽可能小，以减少对HCV抗原活性的损伤。

本发明试剂盒的制备、检测原理

本发明试剂盒以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-标记物-可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步结合反应，其主要制备及检测流程如下：

包被：将第一抗原包被到支持物上。

封闭：将支持物上没有包被上第一抗原的空位点用惰性蛋白封闭，以免后续反应中的非特异性吸附。

第一抗原捕获抗体：加入待测样品后孵育，第一抗原捕获样品中的HCV抗体。

抗体捕获第二抗原：加入第二抗原后孵育，HCV抗体捕获第二抗原。

检测：利用标签通过一步或几步孵育引入标记物进行检测。

本发明试剂盒主要优势如下：

1.实现HCV蛋白的高活性标记：针对HCV蛋白标记后的活性损失问题，特别优选采用了生物素化HCV蛋白或HCV蛋白与肽类标签嵌合表达的方法来完成HCV蛋白的间接标记，由于生物素类或肽类标签分子量小，间接标记后对抗原的空间结构影响很小，而且通过酶促反应的生物素化可以将生物素定点加到与HCV蛋白嵌合的生物素接受蛋白的特定赖氨酸上，肽通过与HCV蛋白的嵌合表达也可以定向地插入HCV蛋白的特定位置，这样就更能保存HCV第二抗原的活性。

2.解决双抗原夹心法HCV抗体诊断试剂的高本底：针对CORE区抗原的上述结合特性，筛选出了活性高、非特异性结合能力弱的CORE区抗原区段，解决了高本底问题。

3.生物素-亲合素放大系统：提高灵敏度

亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka：10¹⁵mol^-1)比抗原与抗体的亲和常数(Ka：10^5-11mol^-1)至少高1万倍以上，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰。该系统是70年代后期应用于免疫学的高效生物反应放大系统，本发明试剂盒的优选制备方法是将链霉亲合素进行辣根过氧化物酶的标记，采用该标记物识别生物素化的HCV第二抗原，即借助生物素-亲合素放大系统作为桥梁来实现标记物对第二抗原的间接识别，该系统的介入使本发明试剂盒的灵敏度大大提高。

4.三步特异性识别提高特异性：本发明检测过程中的三步反应均为特异性识别反应：样品中HCV抗体对第一抗原的特异性识别；第二抗原对HCV抗体的特异性识别；标记物对第二抗原的特异性识别。这使得本发明试剂的特异性相对于两步特异性识别的传统双抗原夹心法试剂有了明显改善，相对于只有一步特异识别的间接法试剂更是有了极大的提高。

另外，本发明的检测原理适用于酶联免疫、发光免疫、荧光免疫、放射免疫、微粒子免疫或金标免疫等多种免疫检测方法，应用范围广泛。

第一抗原与第二抗原中的HCV蛋白优选区段

本发明中使用的HCV基因型为HCV1b，针对不同地区的基因型分布情况可以采用不同基因型的基因片断或几种基因型基因片断的组合，但选用的氨基酸区段不变，此点本领域普通技术人员按现有常规方法可以推导。

在HCV蛋白中，CORE及NS3为HCV主要抗原表位区段，二者的表位区分别集中在其N端和C端，即CORE的a.a.1-90和NS3的a.a.1192-1657，对上述区段进行分析和筛选后确定了其中的核心表位区段为CORE的a.a.7-21、29-48、49-90及NS3的a.a.1359-1454。我们经过筛选，最终选择了a.a.1201-1465(以下简称G)作为NS3区段抗原。

另外，经研究发现引起CORE蛋白结合倾向的主要区段为a.a.1-90。为了解决双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒中由于CORE抗原引起的高本底问题，我们设计了数个不同CORE区段与NS3G区段的嵌合表达抗原分别作为第一抗原和第二抗原，以求筛选出既保持CORE区抗原的高灵敏度，又保证其结合能力不影响双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒开发的CORE区抗原的基因区段范围，并得出满足双抗原夹心法的HCV抗原中CORE区段的特征为：含有a.a.10-17全序列的区段，进一步为含有a.a.7-21全序列的区段，更进一步为含有a.a.6-23全序列的区段，而且不包括a.a.29-90全序列的区段，进一步为不包括a.a.29-70全序列的区段，再进一步为不包括a.a.29-59全序列的区段，更进一步为不包括a.a.32-48全序列的区段，所述蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性和结合能力不变。

上述条件是本发明试剂盒，同时也是其它使用包含CORE区段抗原的HCV双抗原夹心法检测试剂盒研制的重要条件。

最终我们选择第一抗原的CORE区段为a.a.2-59，第二抗原的CORE区段为a.a.1-28。

第二抗原中HCV蛋白与标签的结合

本发明引入标签及其结合配偶体来完成对HCV蛋白的间接标记，在选择标签时的一个重要标准是标签尽可能小以减小对HCV抗原活性的损伤。标签可以是一个、几个或几个的组合，可以结合在HCV蛋白的N端、C端、两端或内部。

非肽类物质如化合物(二硝基苯酚或溴脱氧尿苷)；维生素(生物素或其衍生物)；类固醇(地高辛)；染料(吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、OregonGreen、luciferyellow、AlexaFluor、CascadeBlue)等所有存在或可制备出相应结合配偶体的非肽类物质、或它们与肽或蛋白的组合物均可作为本发明的标签。

肽类如HisTag等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或蛋白也可作为本发明的标签。

某些小分子可检测化学发光物质(如吖啶酯)、荧光物质(如异硫氰酸荧光素、铕)、放射性同位素(如¹²⁵I)等，或“刚性”大分子可检测物质如：胶体金、乳胶颗粒、偶联有标记物的纳米颗粒等还可以直接标记HCV蛋白制成标记抗原用于双抗原夹心检测，这些可检测物在某种程度上也可以看作是本发明特指的标签。

至于标签的选择，本领域普通技术人员可以根据以上原则按照现有实验方法去推导，在此不再详述。这里我们仅以HisTag代表肽类，生物素或其衍生物代表非肽类物质进行说明。

本发明优选的HCV蛋白与标签的结合方法为：HCV蛋白的生物素化；HCV蛋白与肽的嵌合表达。

1、HCV蛋白的生物素化

HCV蛋白生物素化的具体方法包括：

a)体内酶促生物素化；

b)体外生物素化；

c)间接生物素化；

d)氨基酸的生物素化。

1.1体内酶促生物素化

本发明主要是使编码生物素接受蛋白与编码HCV蛋白的嵌合基因X同编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因Y共同在宿主体内表达，在表达宿主体内利用生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素，制成生物素化HCV蛋白。

天然的生物素接受蛋白主要存在于生物素羧基载体蛋白家族中，其核心部分是含有与生物素结合的特定位点赖氨酸的蛋白或肽。多肽SEQIDNO.3是合成的，具有同生物素羧基载体蛋白一样的结合生物素的能力。两类生物素接受蛋白的共同特征为在生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶作用下可以与生物素结合，二者均可在本检测系统中应用。本发明选取SEQIDNO.3基因编码产物作为生物素接受蛋白进行说明。

具有催化蛋白生物素化的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶来源广泛，包括但不限于细菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、流感杆菌(Haemophilusinfluenzae)、根瘤菌(Rhizobium)、乳酸菌(Lactobacillus)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphimuriumn)、粘囊菌(Synechocystissp.)、链球菌(streptococcus)和脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificane)的BirA基因编码产物，伤寒立克次氏体(Rickettsiamooseri)的BirA基因编码产物，甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的MJ1619基因编码产物，梅毒螺旋体(TreponemaPallidum)的TP0357基因编码产物；酵母，如分裂酵母(Schizosaccharomycespombe)的SPBC30D10.07c基因编码产物、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的BPL1基因编码产物；植物，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)的BirA基因编码产物；动物，如人(Homosapiens)或小鼠(Musmusculus)的HLCS基因编码产物等。生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶还包括上述酶的功能区段或其功能类似物。本发明选取大肠杆菌ER2566的BirA基因编码产物进行说明。

1.1.1多顺反子表达

即基因X、Y在表达载体同一启动子作用下以多顺反子形式在宿主体内表达以完成生物素化的方法。

操纵元是原核基因表达调控的一种重要组织形式，大肠杆菌基因多数以操纵元形式组成基因表达调控的单元。操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因。一个操纵元中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框，5′端有翻译起始码，3′端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。至少在第一个结构基因5′侧具有核糖体结合位点，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合，并起始翻译。核糖体沿mRNA移动；在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。

上述多顺反子表达形式在多种生物体内均存在，根据以上原理，我们将X、Y以双顺反子的形式连接到表达载体上，转入表达宿主后利用宿主体内的物质和环境并通过Y表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将已加入培养基中的生物素添加至与HCV蛋白嵌合表达的生物素接受蛋白的特定赖氨酸位点上，从而完成对HCV蛋白的定点生物素化。

这里所讲的多顺反子，可以将X放在N端或C端，也可以是一个X与几个Y，一个Y与几个X，几个X与几个Y等所有排列组合形式的多顺反子。

在本发明的所有抗原生物素化方法中，“多顺反子表达”为最稳定、最方便、成本最低的方法，我们以此方法作为生物素化抗原及本发明HCV蛋白与标签结合的优选方法。

1.1.2共转化表达

即将分别克隆有基因X和Y的两个不同表达载体共同转入表达宿主内进行共表达以完成生物素化的方法。

将X、Y分别克隆到两个不同的表达载体中，这两个表达载体可以具有相同或不同的性质，只要在相应的抗性选择压力下可以分别表达出嵌合有生物素接受蛋白的HCV抗原和生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶，并保证生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶可以将HCV抗原最大程度的生物素化即可。

1.1.3多启动子表达

即基因X、Y分别利用同一表达载体的不同启动子启动转录进而在表达宿主内共表达以完成生物素化的方法。

将基因X和基因Y克隆到同一表达载体的不同操纵元件调控的两个启动子下进行有效的转录和翻译，以实现嵌合有生物素接受蛋白的HCV抗原和生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在同一宿主中的共表达并完成HCV抗原的生物素化。

1.1.4单顺反子表达

即将基因X、Y以单顺反子的形式进行不同方式的嵌合表达以完成生物素化的方法。

将基因X、Y以不同的方式进行嵌合表达，表达的嵌合蛋白既有合成酶的功能又有生物素接受能力，可以在嵌合蛋白之间完成其相互的生物素化。这里所讲的不同方式，可以将X放在N端或C端，也可以是一个X与几个Y，一个Y与几个X，几个X与几个Y等所有排列组合的形式。

1.1.5与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达

即利用表达宿主体内的与基因Y功能类似的基因表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将基因X编码蛋白最大程度地生物素化。

我们可以利用基因工程方法将内源或外源的编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因整合到表达宿主体内或将表达宿主体内原始存在的类似生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因以一定的方式活化以提高其表达水平，使其表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将HCV蛋白与生物素接受蛋白的融合蛋白达到最大程度的生物素化。或者利用表达宿主体内原有的与Y功能类似的基因表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶完成对HCV蛋白的部分生物素化，一般情况下宿主体内原有的与Y功能类似的基因表达水平很低，以至于未经改造的该类原始宿主只能低效率地对可结合生物素的蛋白或多肽进行体内生物素化，所以后一种方法在纯化抗原时需要将大部分未生物素化抗原去除，以便尽可能消除作为第二抗原参加反应时未生物素化抗原对已生物素化抗原的竞争，其它生物素化方法也最好将未生物素化抗原去除干净已提高灵敏度。

1.2体外生物素化

1.2.1活化生物素标记HCV蛋白

通过偶联的方法将活化生物素直接偶联到HCV蛋白上，与HCV蛋白的何种基团偶联及具体活化生物素的选择和偶联方法可参考美国PIERCE公司产品目录。

1.2.2利用体外酶促反应将生物素添加到HCV蛋白上

体外酶促反应主要指将X编码产物与生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在体外混合并提供一定的酶促反应环境，使生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在体外通过酶促反应完成对HCV蛋白的生物素化。

1.3间接生物素化

间接生物素化指将HCV蛋白与物质A相连，用物质B去结合物质A，再用物质C去结合物质B，依此类推可以实现对A的一级或多级识别，在最后一级的结合物质上利用上述生物素化方法连接生物素，最终以HCV蛋白-A(-B-C......)-生物素的形式实现HCV蛋白的间接生物素化。

1.4氨基酸的生物素化

氨基酸的生物素化是将某种或某几种氨基酸经过生物素化(沈宗旋等，合成化学，10(4)：359-361，2002)后作为宿主培养基成分加入表达体系中，利用宿主的蛋白质翻译过程将生物素添加到HCV蛋白的肽链中制成生物素化第二抗原。

2、HCV蛋白与肽的嵌合表达

除生物素类标签外，肽类物质也可以作为第二抗原的标签，肽类标签可以利用基因工程嵌合表达的方法融合在HCV蛋白的N端、C端、两端或内部。这时标签的结合配偶体为肽类物质的特异性识别物，如单克隆抗体或多克隆抗体。

由于HCV抗原具有一定的特殊性，表现在其活性随着外源蛋白分子量的增加而减弱，这种情况在N端融合中体现更为明显，所以本发明选择分子量尽可能小的肽作为标签。

本发明选择的肽类标签为HisTag。

2.1非HCV肽标签

这里我们选择的非HCV肽标签为HisTag标签，通过基因工程方法将编码HisTag的基因与编码HCV蛋白基因嵌合表达制成第二抗原，用标记的抗HisTag单克隆抗体对第二抗原进行识别完成检测。

2.2HCV肽标签

当选择HCV肽作为标签时，要注意以下两点：

1)该HCV肽片段应为其相应抗体与第一抗原不具有特异性亲和力的区段，以防止标记物与第一抗原结合。

2)该HCV肽片段最好避开有严重结合倾向的HCV蛋白区段以避免试剂盒的高本底。

其具体制备和检测过程同上。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

实施例1第一抗原的制备

本发明参考罗文新等，生物工程学报，16(5)：P578-581，2000，得到改造载体pTO-T7，合成引物扩增其NdeI和BamHI之间的基因序列，上游引物带有NdeI和BamHI位点，下游引物带有BamHI和EcoRI位点。片段回收后(本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司)经NdeI/EcoRI(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)酶切后克隆到同样酶切处理的pTO-T7载体上。阳性克隆经BamHI单酶切后回收载体再自身连接，即除去了pTO-T7载体上NdeI和BamHI之间的T7Tag基因，得到的载体命名为P1。

由于载体P1的T7启动子的上游有一个BglII位点，不利于本发明的克隆。因此合成引物扩增载体P1的BglII和XbaI之间的基因片段，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有XbaI位点。片段经BamHI/XbaI酶切后克隆到BglII/XbaI酶切后的载体P1上，得到的阳性克隆即为BglII位点被封闭的表达质粒P2，也就是本发明所使用的克隆载体，在实施本发明的过程中P1和P2并不是必须表达载体，其上游的增强子在本发明中也不起实质作用，构建此载体只是为了克隆方便，其它许多表达载体如pET-24a(+)(美国Novagen公司，货号69749-3)均可用于实施本发明。

PCR扩增a.a.1201-1465基因，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。PCR扩增a.a.2-59基因，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点。通过BamHI/EcoRI酶切将片段a.a.1201-1465基因克隆到同样酶切处理的表达载体P2上得到P2-G。将该克隆载体BglII/EcoRI酶切后插入经BamHI/EcoRI酶切的片段a.a.2-59基因，得到的阳性克隆为P2-G-CORE(a.a.2-59)，也即本发明第一抗原的表达质粒，命名为P2-HCVAg1，含有该质粒的ER2566菌株(EscherichiacoliER2566/P2-HCVAg1)已经于2005年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为：CCTCCM205009，其表达抗原命名为HCVAg1。本发明在筛选第一抗原时设计的克隆采用相同方法进行构建。

将P2-HCVAg1转化大肠杆菌ER2566(美国NewEnglandBiolabs公司)，涂布于含100ug/ml卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KE170)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度卡那霉素的500mlLB培养基37℃振荡培养至OD₆₀₀1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号IB0168)进行诱导，诱导条件为：37℃，200rpm，4小时。4℃5000rpm离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl)重悬，超声破碎，4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体，用含2％TritonX-100(生工货号T0694)的溶液I(20mMTirs-HCl，pH8.5，5mMEDTA，100mMNaCl)重悬，4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体，用溶液I配置的4M尿素溶解后对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0，20mM)透析，换液3次，4℃12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原，用同一PB缓冲液平衡SephacrylS-200凝胶柱(美国AmershamBiosciences公司)后将上述粗抗原过柱，收集并合并含目的蛋白的溶液，再过CM琼脂糖离子交换柱(美国AmershamBiosciences公司)，HCV抗原可被吸附，用PBS缓冲液(pH7.0，20mMPB，50mMNaCCl)洗涤以去除未被吸附的杂蛋白，再以PBS缓冲液(pH7.0，20mMPB，500mMNaCl)洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，4℃或-20℃保存备用。

实施例2第二抗原的制备

1.生物素化第二抗原的制备

1.1体内酶促生物素化

1.1.1共转化表达

PCR扩增编码HCV抗原a.a.1-28基因，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。PCR扩增编码生物素接受蛋白的基因片段L(SEQIDNO.3)，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。

通过BamHI/EcoRI酶切将片段a.a.1-28基因克隆到BglII/EcoRI酶切处理的表达载体P2-G上，得到的阳性克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)命名为P2-HCVAg2，其表达抗原命名为HCVAg2。通过BamHI/EcoRI酶切将基因L克隆到BglII/EcoRI酶切处理的表达载体P2-G-CORE(a.a.1-28)上，得到的阳性克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-L命名为P2-X。

本发明使用的生物素接受蛋白除了SEQIDNO.3编码的多肽或其功能类似物外，还可以是生物素羧基载体蛋白家族或其功能区段。设计引物PCR扩增生物素羧基载体蛋白编码基因，可以之代替基因L完成克隆。引物如下：

上游引物1：5’-CGCGGATCCATGAAACTAAAGGTAACAGTCAACGGCA-3’

上游引物2：5’-GGCAGGATCCCCGGGTAAGGCAGGAGAGGGCGAGATTC-3’

下游引物：5’-CGCGAATTCTTAAGATCTACCACCTTCTATTAACTCTAAATCCCCGATCTTGATGAG-3’

上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。以Pinpoiht^TMXa-1(美国Promega公司，货号V2031)为模板，以上游引物1和下游引物PCR扩增得到128个氨基酸的生物素羧基载体蛋白区段编码基因Xal；以上游引物2和下游引物PCR扩增得到81个氨基酸的生物素羧基载体蛋白区段编码基因Xas。它们与基因L一样，其编码产物都含有可结合生物素的特定赖氨酸位点。我们对上述三种不同的生物素接受蛋白做了比较发现：三者结合生物素的能力为Xal＞Xas＞L，即区段完整的大分子量生物素接受蛋白结合生物素能力强，但由于分子量增加对HCV抗原的损伤也增加，所以三者作为生物素接受蛋白嵌合于HCV蛋白C端时，经生物素化后作为第二抗原的活性相当，本发明以下的实验主要以基因L作为生物素接受蛋白编码基因来说明。

提取大肠杆菌ER2566总基因组，以其作为模板对大肠杆菌K12生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶BirA基因Y进行PCR扩增。扩增引物如下：

引物1：5′-CCCGAATTCATGAAGGATAACACCGTGCC-3′

引物2：5′-GGGAAGCTTTTATTTTTCGGCACTACGCAGGGATATTTCACC-3′

其上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有HindIII位点。扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到经同样酶切处理的质粒载体pET-32a(+)(美国Novagen公司，货号70785-3)上得到pET-32a-Y。

表达质粒P2-X带有卡那霉素抗性基因，pET-32a-Y带有氨苄青霉素抗性基因。将这两种表达质粒分别通过转化共同转入表达宿主ER2566中，用含100ug/ml卡那霉素和100ug/ml氨苄青霉素(生工，货号A0741)的双抗性LB平板筛选出两个蛋白均有明显表达的克隆，将该克隆用含同一浓度卡那霉素和氨苄青霉素双抗性且含终浓度20uMD-生物素(美国Sigma-Aldrich公司，货号B-4501)的500mlLB培养基37℃振荡培养至OD₆₀₀1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：37℃，200rpm，4小时。离心收集菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液重悬，超声破碎，4℃12000rpm离心20分钟的上清经10％-30％饱和硫酸铵沉淀，用PB缓冲液(100mM，pH7.0)复溶，4℃12000rpm离心10分钟除去不溶物后，再经过含SoftLinkSoftReleaseAvidin树脂的亲和素层析柱纯化(纯化过程详见美国Promega公司，货号V2012说明书)，以含有5mMD-生物素的PB缓冲液(100mM，pH7.0)洗脱即得纯化的生物素化抗原，然后对100倍体积的PB缓冲液透析以去除游离生物素，换液3次，离心上清测定蛋白浓度，4℃或-20℃保存备用。

1.1.2多顺反子表达

本发明将扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到同样酶切处理的质粒载体P2-X中，得到的阳性克隆命名为P2-X-Y，也即本发明优选第二抗原的表达质粒，含有该质粒的ER2566菌株(EscherichiacoliER2566/P2-HCVAg1)已经于2005年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为：CCTCCM205010。基因X和Y之间有一个终止密码TAA，因此在P2-X-Y中，基因X和Y组成了在同一表达调控元件作用下的双顺反子。本发明以该表达方式筛选第二抗原时设计的克隆均采用相同方法进行构建。

将P2-X-Y转化大肠杆菌ER2566，按上述方法表达纯化得到抗原HCVAg。

在本生物素化方法中，我们又进一步尝试了在X的终止密码和Y的起始密码之间加入SD序列(具体方法为基因工程现有常规技术，详细可参考Tsao，K.L.等，Gene，169；P59-64，1996)，使基因Y编码蛋白的表达量增加，可以在一定程度上提高生物素化效率进而提高本发明试剂盒的灵敏度。

1.1.3多启动子表达

PCR扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到同样酶切处理的质粒载体P1中，得到的表达质粒命名为P1-Y。在P2-X的T7启动子的上游和终止子的下游设计一对正反引物如下：

引物1：5′-GGCAGATCTTAATACGACTCACTATAGGG-3′

引物2：5′-CCCAGATCTTGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′

上下游引物均含有BglII位点，以P2-X质粒为模板扩增出带有基因X的整个T7操纵元件。然后将该片段经BglII酶切克隆到相同酶切处理的表达载体P1-Y中，即得到双启动子表达载体P1-X/Y，基因X和基因Y可以在各自的操纵元件的调控下进行转录和翻译。

将P1-X/Y转化大肠杆菌ER2566进行目的蛋白的表达和纯化。

1.1.4.单顺反子表达

以ER2566总基因组作为模板对基因Y进行PCR扩增。扩增引物如下：

引物1：5′-CCCAGATCTATGAAGGATAACACCGTGCC-3′

引物2：5′-GGGGAATTCTTATTTTTCGGCACTACGCAGGGATATTTCACC-3′

其上游引物带有BglII位点，下游引物带有EcoRI位点。扩增出的基因片段Y经BglII/EcoRI酶切后克隆入相同酶切处理的质粒载体P2-X中，得到表达质粒命名为P2-XY。由于基因X的3’端的酶切位点为BglII和EcoRI，两位点间有一终止密码子TAA，因此P2-X以BglII/EcoRI酶切作为载体时，终止密码子已被切掉，连接入的基因Y与基因X组成了单一顺反子，即组成了嵌合表达基因XY。

将P2-XY转化大肠杆菌ER2566进行目的蛋白的表达和纯化。

1.1.5与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达

将P2-X转化大肠杆菌ER2566进行目的蛋白的表达。利用ER2566体内原始表达的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶对HCV抗原进行部分生物素化。利用上述SoftLinkSoftReleaseAvidin树脂亲和纯化。

在以上体内酶促生物素化各方法中，我们又进一步尝试利用低温诱导表达、引入分子伴侣作为目的蛋白的上游顺反子或外源蛋白等一系列方法尽力使HCV嵌合抗原及生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶以可溶形式表达，这使得生物素化效率有一定的提高，至于采用的促进基因工程蛋白可溶性表达的方法为本领域普通技术人员应该掌握的常规方法，在此不再详述。

1.2体外生物素化

1.2.1通过偶联实现的HCV抗原体外生物素化

在此我们以sulfo-NHS-LC-生物素标记HCV抗原氨基进行说明，其标记过程如下：

1)取HCVAg2抗原1mg对含2M尿素的PBS(100mMPB，150mMNaCl，pH7.2)透析过夜；

2)生物素溶液：2.2mgsulfo-NHS-LC-生物素(美国PIERCE公司，货号21335)溶解在0.4ml超纯水(本发明中所有用水均为超纯水)中，现用现配；

3)将蛋白溶液和生物素溶液以摩尔比1∶10-20混合，0-4℃交联2小时或者室温交联30分钟；

4)将反应液对含有0.05％SDS的PB(100mMPB，pH7.2)缓冲液透析，除去游离生物素；

5)加入终浓度50％的甘油后储存于-20℃备用。

还可以选择不同的活化生物素标记HCV抗原的不同基团(如巯基、羧基等)，具体可参考美国PIERCE公司产品目录。

1.2.2通过酶促反应实现的HCV抗原体外生物素化

在含有ATP和D-生物素的特定缓冲体系中，生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶同样可以发挥出其在体内的作用，使带有生物素接受蛋白的HCV抗原标记上生物素。

我们将生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因Y克隆到pET-32a(+)进行表达，然后经Co-金属亲和层析柱纯化出一定量的合成酶，并利用它对含生物素接受蛋白的HCV抗原进行体外生物素化。将纯化的HCV抗原和适量的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶加入含10mMATP(生工，货号AB0020)、50μMD-生物素、50mMBicine(生工，货号BB0266)、10mMMgOAc(生工，货号MB0326)，pH8.3生物素化缓冲液中进行生物素化反应，室温反应12小时即可。反应后将抗原对100倍体积的PB缓冲液(100mM，pH7.0)进行透析以去除游离的生物素，换液3次，离心上清经SoftLinkSoftReleaseAvidin树脂的亲和素层析柱纯化，以5mMD-生物素的PB洗脱即得纯化的生物素化抗原，纯化后的抗原再一次透析即可。

1.3间接生物素化

我们以HisTag代表物质A，以抗HisTag单克隆抗体(美国Novagen公司，货号70796-3)代表物质B，物质B上连接生物素为例来说明HCV抗原的间接生物素化。

按前述方法得到克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-His命名为P2-HCVAg3，将其转化后表达并纯化出相应抗原HCVAg3，其中的His表示HisTag，采用其它多肽嵌合时的表示方法相同。

抗HisTag单克隆抗体的生物素标记通过与活化生物素的偶联反应来实现，方法同上。酶标单克隆抗体可以与HCV抗原特异性地结合，从而实现了HCV抗原的间接生物素化。

生物素的结合配偶体即链霉亲和素的酶标记方法为NaIO₄氧化法。称取10mgHRP溶解于1ml超纯水中，再缓慢滴加1ml超纯水新鲜配制的5mg/mlNaIO₄(生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后加入20％乙二醇(生工，货号E0582)溶液0.05ml，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入事先对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析2小时，2.5mg/ml的链霉亲和素(生工，货号SE497)溶液1ml，4℃避光对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析过夜。次日，向混合物中滴加0.1ml新鲜配制的4mg/mlNaBH₄(生工，货号ST1268)溶液，混匀，4℃静置2小时。将上述液装入透析袋中，对PBS缓冲液(150mM，pH7.4)透析，4℃过夜。加入酶保护剂及终浓度50％的甘油混匀后-20℃避光保存备用。

第二抗原为生物素化HCV蛋白时，本试剂盒的检测模式为：

1)直接生物素化模式“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-生物素化第二抗原-HRP标记的链酶亲和素-HRP底物显色形成可识别信号”；

2)间接生物素化模式“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原(HisTag与HCV蛋白嵌合表达物)-生物素标记抗HisTag单克隆抗体-

HRP标记的链霉亲和素-HRP底物显色形成可识别信号”。

2.带有肽类标签的第二抗原的制备

我们以HisTag为例进行说明。在上面的实施例中，本发明已经构建了HCV抗原C端带有HisTag的克隆P2-HCVAg3并制备了相应抗原HCVAg3，我们还尝试了利用上述方法在HCV蛋白的N端、两端或在NS3与CORE之间嵌合上HisTag，四者均被证实可在本发明中用作第二抗原。同理上述的生物素接受蛋白也可以采用这四种嵌合方法的任意一种。其中同种或不同种标签的多次嵌合在一定程度上还可以提高灵敏度，这在本发明中也得到了证实。上述各方法涉及到的基因嵌合及表达技术为本领域普通技术人员应该掌握的常规现有技术，在此不再详述。

肽类标签也可以为第一抗原中不含有的且结合倾向不强的HCV肽片段，其原理和方法与以HisTag作为肽类标签类似，不再详述。

HRP标记单克隆抗体的方法与上述HRP标记链霉亲和素的方法类似，主要区别为：单克隆抗体与HRP的质量标记比为1：1-2；标记时间为3-6小时。

第二抗原为肽类标签与HCV蛋白嵌合表达物时，本试剂盒的检测模式为：“支持物-第一抗原-抗体-第二抗原(肽与HCV蛋白嵌合表达物)-HRP标记的抗肽单克隆抗体-HRP底物显色形成可识别信号”。

除了HRP外，供选择的可检测物质还有很多种，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等酶类；吖啶酯等化学发光物质；异硫氰酸荧光素、铕、铕纳米颗粒等荧光物质；¹²⁵I等放射性物质；胶体金、乳胶等胶体。选择不同的可检测物也就选择了不同的免疫诊断方法即酶联免疫、化学发光免疫、荧光免疫、时间分辨荧光免疫、放射免疫或金标免疫等。这些可检测物质标记链霉亲和素或单克隆抗体的方法以及各种免疫诊断方法虽各不相同，但均属于本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法，在此不再详述。

我们还对第一抗原和第二抗原尝试采用了不同的基因嵌合方式，不同的表达载体，不同的纯化方法来加大二者的“差距”，以便进一步提高本发明试剂盒的特异性，均取得了一定效果。这些方法为本领域普通技术人员应该掌握的常规现有方法，在此不再详述。

实施例3第一抗原和第二抗原中HCV蛋白区段的筛选

我们首先对NS3区段抗原进行筛选，按前述方法得到克隆P2-G(含NS3区段a.a.1201-1465)，将其表达纯化后的抗原NS3G利用间接ELISA进行活性检测，与Chiron公司专利EP-A-0450931的C33C(NS3a.a.1192-1457)及Roche公司专利US6096319的D26(NS3a.a.1207-1488)相比，发现NS3G的特异性有所改进(见表1)，灵敏度相当。我们又进一步在a.a.1201±5处及a.a.1465±8处分别设计引物并得到克隆P2-NS3(a.a.1196-1473)、P2-NS3(a.a.1206-1457)、P2-NS3(a.a.1196-1457)、P2-NS3(a.a.1206-1473)，上述克隆经表达纯化后分别进行活性检测，其反应性与NS3G相当。最终我们选择了a.a.1201-1465(以下简称G)作为本发明NS3区段抗原，筛选过程使用的均为本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法，具体可参考专利US6096319所述方法，在此不再详述。

表1NS3G与C33C、D26特异性比较

为从根本上解决CORE区段蛋白引起的非特异性反应，本发明就第二抗原的CORE区段按前述方法设计了不同克隆，以HCVAg1作为第一抗原进行灵敏度检测得到第二抗原不同CORE区段试剂盒灵敏度的差异，结果见表2。

表2第二抗原不同CORE区段试剂盒灵敏度的差异

注：1)a.a.1-23表示克隆P2-G-CORE(a.a.1-23)-L-Y表达产物，其它同；

2)灵敏度可以达到现有商品化间接法试剂(本发明中如无特殊说明，均指MurexAnti-HCV4.0)标准的表示为“√”，否则为“×”。

我们就第一抗原的CORE区段设计了上述类似克隆，以HCVAg作为第二抗原进行灵敏度检测时也得到了与表2类似的结果。

上述实验结果表明，在夹心法中，当HCV第一抗原或第二抗原的CORE区缺失a.a.6-23全序列区段，进一步为缺失a.a.7-21全序列区段，更进一步为缺失a.a.10-17全序列区段时，试剂盒灵敏度较低。

我们就第二抗原的CORE区段设计了不同克隆，以HCVAg1作为第一抗原，以相同的试剂盒系统进行检测，得到第二抗原不同CORE区段试剂盒本底的差异，结果见表3。

表3第二抗原不同CORE区段试剂盒本底的差异

注：1)a.a.1-90表示克隆P2-G-CORE(a.a.1-90)-L-Y表达产物，其它同；

2)3×(a.a.1-28)表示克隆P2-G-3×CORE(a.a.1-28)-L-Y表达产物；3×表示将a.a.1-28基因重复嵌合三次；

3)Na.a.49-70表示克隆P2-L-CORE(a.a.49-70)-G-Y表达产物；

4)++表示本底高，+表示本底较高，-表示本底正常

上述结果显示：HCVCORE区第一表位a.a.1-28(简称a)、第二表位a.a.32-48(简称b)、第三表位a.a.49-70(简称c)均有结合倾向，其中b的结合倾向最强，当第二抗原中同时存在上述三个区段的两个或两个以上区段，并且存在区段暴露较为充分时，试剂盒本底高。

我们又对第一抗原的CORE区段做了与上述类似的实验，试剂盒本底也有上述随着CORE区C端的加长而升高的趋势，但并不向第二抗原那么明显，说明HCV夹心法试剂盒的高本底主要是由于第二抗原的CORE蛋白区段引起。

上述实验的结果表明，当HCV抗原尤其是第二抗原的CORE区包含有a.a.32-48全序列区段，进一步为包含有a.a.29-59全序列区段，再进一步为包含有a.a.29-70全序列区段，更进一步为包含有a.a.29-90全序列区段时，试剂盒本底较高。

因此本发明中HCVCORE蛋白特征为：含有a.a.10-17全序列的区段，进一步为含有a.a.7-21全序列的区段，更进一步为含有a.a.6-23全序列的区段，而且不包括a.a.29-90全序列的区段，进一步为不包括a.a.29-70全序列的区段，再进一步为不包括a.a.29-59全序列的区段，更进一步为不包括a.a.32-48全序列的区段，该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性和结合能力不变。

为了进一步确证高本底是由CORE区抗原的结合能力引起的，我们还做了以下实验：

1)验证同源结合：我们选择了HCVAg1作为第一抗原。

2)验证异源结合：我们选择了HIVgp41抗原、梅毒螺旋体Tp17抗原、牛血清白蛋白(第五组分)(BSA，上海纬群生物技术有限公司)分别作为第一抗原。

选择P2-G-CORE(a.a1-70)-L-Y表达产物作为第二抗原，待测样品我们分别选取了人类HCV阴性血清(本发明所用各种HCV阴性或阳性血清均来自正常人群)，20％新生牛血清，1％BSA，无待测样品(样品稀释液代替样品)进行检测，实验结果见表4。

表4CORE区抗原的同源和异源结合倾向确证实验

注：++表示本底高，+表示本底较高

当我们仅以P2-G表达产物作为第一抗原，P2-G-L-BirA表达产物或P2-G-CORE(a.a.1-70)-L-Y表达产物分别作为第二抗原，前者即仅以NS3抗原夹心时上述高本底问题不再存在，而后者同样存在高本底。

以上结果说明双抗原夹心法检测HCV抗体试剂盒的高本底是由CORE区抗原的同源结合和异源结合倾向引起，其反应模式为：“支持物-第一抗原-第二抗原-标记物-可识别信号”。

所以本发明得出在选择夹心法HCV抗原CORE区段的原则是：在保证活性要求的前提下，区段越短越好，且首选N端。

通过上述筛选，本发明确定了第一抗原的CORE区段为a.a.2-59，第二抗原的CORE区段为a.a.1-28。

我们又进一步尝试在保证活性的前提下将第一抗原和第二抗原的CORE区段进一步缩短，使试剂盒的本底有了一定的改善，且NS3抗原的活性有了一定的提高。

实施例4作为外源蛋白的肽类标签分子量的确定

为了比较肽类标签作为外源蛋白对HCV抗原活性的影响，本发明设计了在HCV蛋白N端和C端融合不同大小肽类标签的克隆。克隆的构建、蛋白的表达及纯化可参考实施例1和2中的方法。以HCVAg1作为第一抗原，上述克隆的各纯化抗原作为第二抗原，以HRP标记抗HisTag单克隆抗体作为标记物对两份正常人阴性血清分别稀释的各100份HCV阳性血清进行检测，对照选用英科新创(厦门)科技有限公司HCV间接法诊断试剂及Abbott公司MurexAnti-HCV4.0。结果见表5和表6。

表5N端肽类标签对HCV抗原活性的影响

注：HCVAg-N1为克隆P2-His-G-CORE(a.a.1-28)的表达产物；

HCVAg-N2为克隆P2-His-T7-G-CORE(a.a.1-28)的表达产物；

HCVAg-N3为克隆pET-30a-G-CORE(a.a.1-28)的表达产物；

HCVAg-N4为克隆P2-His-Xas-G-CORE(a.a.1-28)的表达产物；

HCVAg-N5为克隆P2-His-Xal-G-CORE(a.a.1-28)的表达产物；

HCVAg-N6为克隆p2-His-Xas-Xas-G-CORE(a.a1-28)的表达产物。

表6C端肽类标签对HCV抗原活性的影响

注：HCVAg-C1为克隆P2-G-CORE(a.a1-28)-His的表达产物；

HCVAg-C2为克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-T7-His的表达产物；

HCVAg-C3为克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-L-L-His的表达产物；

HCVAg-C4为克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-Xas-His的表达产物；

HCVAg-C5为克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-Xal-His的表达产物；

HCVAg-C6为克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-Xas-Xas-His的表达产物；

HCVAg-C7为克隆P2-G-CORE(a.a1-28)-Xas-Xas-Xas-His的表达产物。

本实验证实了外源蛋白引起的HCV抗原活性损失。由结果可以看出，外源蛋白越大，HCV抗原的活性损失越大，这一点在N端融合时体现尤为突出，我们随后证实这种情况在第一抗原中也同样存在。因此本发明对HCV第一抗原及第二抗原的外源蛋白的选择标准为：外源蛋白分子量越小越好，其分子量标准可逐级优化为小于30KD、20KD、15KD、10KD至5KD。

但在选择以生物素与生物素接受蛋白组合物为标签的第二抗原时，还应同时考虑生物素接受蛋白的生物素结合能力，即在保证生物素化不受影响的前提下，生物素接受蛋白的分子量尽可能小，所以生物素接受蛋白的分子量不完全受上述限制。

实施例5本发明试剂盒的生产及使用

1.生物素化HCV抗原作为第二抗原

将HCV第一抗原以一定比例用碳酸盐缓冲液(50mM，pH9.51，含0.2‰SDS)稀释，100ul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)，4℃包被24小时，次日用PBST(10mMPB，150mMNaCl，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干，120ul/孔加入含30％新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，8％蔗糖，5‰酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司，货号C-8645)，1‰β-巯基乙醇(生工，货号M0482)，150mMNaCl的pH7.4，10mMPB封闭液，37℃封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25℃、湿度55％-65％、有通风设备的房间内风干。封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。检测时可分两步和三步两种方法进行。

1.1两步法：

在包被酶标板中先加入50ul待测标品、阴性(正常人阴性血清)、阳性(HCV抗体阳性血清)对照，再50ul/孔加入含1‰β-巯基乙醇，0.5‰TritonX-100，20％新生牛血清，5‰酪蛋白，150mMNaCl及以一定比例稀释生物素化HCV第二抗原(临用前稀释)的pH7.4的20mMPB缓冲液，37℃温育90分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干；用含1‰酪蛋白，20％新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物(临用前稀释)的pH7.4的20mMPB缓冲液，100ul/孔加入反应板，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干，加入含0.5‰过氧化氢尿素(生工，货号UB1753)、4.76‰三水合乙酸钠、0.9‰冰醋酸的显色剂A及含0.32‰TMB(生工，货号TB0514)、5mM柠檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5％甲醇、2‰二甲基甲酰氨的显色剂B各50ul，37℃避光显色30分钟。每孔加50ul，含2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值，CutoffValue计算：COV＝阴性对照平均OD值×2.0(阴性对照OD值低于0.075作0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值＜COV为阴性。

1.2三步法：

在包被板中先加入标本稀释液(含1‰β-巯基乙醇，1‰TritonX-100，20％新生牛血清，pH7.4的20mMPB)50ul，再加入50ul待检标本、阴性、阳性对照，37℃温育60分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干，100ul/孔加入含1‰β-巯基乙醇，1‰TritonX-100，20％新生牛血清，150mMNaCl及以一定比例稀释的生物素化HCV抗原(临用前稀释)的pH7.4的20mMPB缓冲液37℃温育30分钟，后续过程同前述两步法。

上述生物素化HCV抗原及链霉亲和素酶标记物的稀释比例应根据实际情况具体摸索已达到最佳效果，反应物稀释比例及各步反应时间也可以根据需要在实际生产中进行调整以便在保证检测效果的同时缩短检测时间提高工作效率，这种摸索和调整为本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法，在此不再详述。

本发明的检测方法优选三步法。

2.以带有HisTag标签的HCVAg3抗原作为第二抗原

具体方法参照上述生物素化HCV抗原作为第二抗原时试剂盒的生产及使用。

实施例6本发明试剂盒的性能评价

(一)、灵敏度

我们将生物素化HCV蛋白作为第二抗原的夹心法试剂盒与现有商品化间接ELISA试剂盒的灵敏度做了比较，得到了与表6类似的结果，结果表明本发明的试剂盒和商品化间接ELISA试剂盒对各稀释度血清反应的灵敏度差异均具有统计意义(P＜0.05)。由此可见，本发明试剂较现有间接法试剂的灵敏度有较大的提高。

(二)、特异性

本发明采用了三步特异性识别，所以较只有一步特异性识别的间接法试剂有了极大改善。我们用本发明试剂盒和英科新创(厦门)科技有限公司的HCV间接法试剂分别检测了3000份临床阴性血清，本试剂假阳性率为0.067％，而该间接法为0.67％，我们又进一步将后者的假阳性经MurexAnti-HCV4.0间接ELISA试剂盒检测，其假阳性率仍为0.4％。

(三)、可疑血清

我们经过筛选，得到如下12份本室间接法试剂判定为阳性，HCVRIBA确证试剂(新加坡Genelabs公司，货号11130-018)检测为可疑，PCR检测(瑞士ROCHE公司COBASAmpliscreen^TMHCV2.0)为阴性，其提供者在临床上不具有任何肝炎症状的可疑血清(数据见表7)，除C5之外的11份血夹心法为阴性，用夹心法所使用的第一抗原和第二抗原包被的间接法检测均为阳性，RIBA结果为NS4单独阳性，但上述两抗原均无NS4区段，综上可推知这11份血应为本室间接法试剂的假阳性。C5与上述11份血类似，虽然其在夹心法检测中为阳性，但夹心法反应OD值明显低于间接法，推测其应为间接与夹心的共同假阳性。同理可推导除C4、C6外的其它10份应为MurexAnti-HCV4.0试剂盒的假阳性。综上，本发明试剂盒对可疑血清判定的准确性较现有商品化试剂和本室内部的间接法试剂均有较大提高。

表7本发明试剂盒检测可疑血清(均为阴性)情况

注：+表示阳性，-表示阴性

(四)、重复性

对阴、阳性待测样品各240份，采用不同时不同批次不同操作者进行多次检测，考查本发明试剂盒判定结果的重复性，结果显示本发明试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性为100％。这表明本方法检测结果的再现性好，结果判定可靠。

(五)、稳定性

将整套试剂(包括包被酶标板、待测样品稀释液、第二抗原、第二抗原稀释液、链霉亲和素酶标记物、酶稀释液、阴性对照、阳性对照、显色剂A和B、终止液)37℃考核72小时，取出后与同时4℃存放的试剂在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，其结果见表8。实验表明，本发明试剂盒稳定性好。

表8本试剂盒稳定性实验结果

(六)、精密性

在同一反应板上对同一份已知阳性标本，多次平行做大于等于10孔重复检测，得到各孔的检测OD值，计算其CV值均低于15％，说明本试剂盒精密性较好。

序列表

<110>崔鹏

<120>一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>270

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)

<220>

<223>丙型肝炎病毒全基因编码蛋白第1-90个氨基酸的编码序列

<400>1

ATGAGCACGAACCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAG60

GACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGG120

GGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCACAACCTCGTGGA180

AGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGTCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCTGG240

TACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGC270

<210>2

<211>834

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)

<220>

<223>丙型肝炎病毒全基因编码蛋白第1196-1473个氨基酸的编码序列

<400>2

ATCCCTGTGGAGAACCTAGAAACTACCACGCGGTCTCCGGTTTTCACAGACAACTCATCC60

CCCCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCTCCTACTGGCAGCGGC120

AAGAGCACTAAAGTGCCGGCTGCATATGCGGCCCAAGGGTACAAGGTGCTCGTCCTGAAC180

CCGTCCGTTGCCGCCACCTTAGGTTTTGGGGCGTATATGTCTAAGGCACATGGTATCGAC240

CCTAGCGTCAGGACCGGGGTAAGGACCATCACCACGGGTAGCCCCATCACGTACTCCACC300

TATGGCAAGTTCCTTGCTGATGGTGGTTGCTCTGGGGGTGCCTATGACATTATAATATGT360

GATGAGTGCCATTCAACTGACTCGACTACTATCTTGGGCATCGGCACGGTCCTGGACCAA420

GCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACCGCTACGCCTCCGGGATCGGTC480

ACCGTGCCACATCCCAACATCCAGGAGGTGGCCCTGTCCAATACTGGAGAGATCCCCTTC540

TATGGTAAAGCCATCCCCATCGAGGCCATCAGGGGGGGAAGGCATCTCATTTTCTGCCAC600

TCCAAGAAGAAGTGTGACGAGCTCGCTGCAAAGCTATCATCCCTCGGACTCAACGCTGTG660

GCGTACTACCGGGGTCTTGATGTGTCCGTCATACCATCTAGCGGAGACGTCGTTGTCGTG720

GCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAAC780

ACGTGCGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAG834

<210>3

<211>69

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>生物素接受蛋白的编码序列

<400>3

ATGGCTGGTGGTTTAAACGACATCTTTGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCATGAAGACACC60

GGTGGCTCT69

<210>4

<211>966

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichacoli)

<220>

<223>大肠杆菌生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的编码序列

<400>4

ATGAAGGATAACACCGTGCCACTGAAATTGATTGCCCTGTTAGCGAACGGTGAATTTCAC60

TCTGGCGAGCAGTTGGGTGAAACGCTGGGAATGAGCCGGGCGGCTATTAATAAACACATT120

CAGACACTGCGTGACTGGGGCGTTGATGTCTTTACCGTTCCGGGTAAAGGATACAGCCTG180

CCTGAGCCTATCCAGTTACTTAATGCTAAACAGATATTGGGTCAGCTGGATGGCGGTAGT240

GTAGCCGTGCTGCCAGTGATTGACTCCACGAATCAGTACCTTCTTGATCGTATCGGAGAG300

CTTAAATCGGGCGATGCTTGCATTGCAGAATACCAGCAGGCTGGCCGTGGTCGCCGGGGT360

CGGAAATGGTTTTCGCCTTTTGGCGCAAACTTATATTTGTCGATGTTCTGGCGTCTGGAA420

CAAGGCCCGGCGGCGGCGATTGGTTTAAGTCTGGTTATCGGTATCGTGATGGCGGAAGTA480

TTACGCAAGCTGGGTGCAGATAAAGTTCGTGTTAAATGGCCTAATGACCTCTATCTGCAG540

GATCGCAAGCTGGCAGGCATTCTGGTGGAGCTGACTGGCAAAACTGGCGATGCGGCGCAA600

ATAGTCATTGGAGCCGGGATCAACATGGCAATGCGCCGTGTTGAAGAGAGTGTCGTTAAT660

CAGGGGTGGATCACGCTGCAGGAAGCGGGGATCAATCTCGATCGTAATACGTTGGCGGCC720

ATGCTAATACGTGAATTACGTGCTGCGTTGGAACTCTTCGAACAAGAAGGATTGGCACCT780

TATCTGTCGCGCTGGGAAAAGCTGGATAATTTTATTAATCGCCCAGTGAAACTTATCATT840

GGTGATAAAGAAATATTTGGCATTTCACGCGGAATAGACAAACAGGGGGCTTTATTACTT900

GAGCAGGATGGAATAATAAAACCCTGGATGGGCGGTGAAATATCCCTGCGTAGTGCAGAA960

AAATAA966

Claims

1.一种检测HCV抗体的试剂盒，所述试剂盒包含第一抗原和第二抗原，并且该试剂盒以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-标记物-可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步的结合反应，其特征在于所述第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物，所述标签为肽类标签或非肽类标签；

其中第一抗原和第二抗原仅包括HCVNS3及CORE蛋白区段，第一抗原的CORE蛋白区段为a.a.2-59；第二抗原的CORE蛋白区段为a.a.1-28；第一抗原和第二抗原的NS3蛋白区段均为a.a.1201-1465。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述非肽类标签为半抗原、维生素、类固醇、染料、激素、抗生素、核酸或者为它们与肽的组合物。

3.权利要求2的试剂盒，其中所述染料为二硝基苯酚或溴脱氧尿苷；维生素为生物素或其衍生物，其中所述衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素或脱硫生物素；类固醇为地高辛；染料为吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯或荧光素。

4.权利要求1的试剂盒，其中所述肽类标签为含有HisTag、T7Tag、STag、FlagTag、HATag或HCV肽片段的肽。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述肽类标签为外源蛋白时，其分子量小于30KD。

6.权利要求5的试剂盒，其中所述外源蛋白分子量小于20KD。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述外源蛋白分子量小于15KD。

8.权利要求7的试剂盒，其中所述外源蛋白分子量小于10KD。

9.权利要求8的试剂盒，其中所述外源蛋白分子量小于5KD。

10.权利要求5的试剂盒，其中所述外源蛋白位于HCV蛋白的N端时，其分子量小于5KD；位于HCV蛋白的C端时，其分子量小于20KD。

11.权利要求1-10任一项的试剂盒，其中所述标签为生物素、D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素或脱硫生物素、或者它们与肽的结合物时，其结合配偶体为亲和素、或抗生物素的抗体；所述标签为肽时，其结合配偶体为抗该肽的单克隆抗体或多克隆抗体。

12.权利要求11的试剂盒，其中亲和素为链霉亲和素或中性链亲和素。

13.一种制备权利要求1-12任一项的试剂盒的方法，其中包括HCV蛋白与标签结合的步骤，所述结合方法包括：

1)HCV蛋白的生物素化；或

2)HCV蛋白与肽的嵌合表达。

14.权利要求13的方法，其中HCV蛋白生物素化的方法包括：

1)体内酶促生物素化；

2)体外生物素化；

3)间接生物素化；或

4)氨基酸的生物素化。

15.权利要求14的方法，其中体内酶促生物素化的方法为：

使编码HCV蛋白与生物素接受蛋白的嵌合基因X同编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因Y共同在宿主体内表达，在表达宿主体内利用生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素，具体方法包括：

1)多顺反子表达；

2)共转化表达；

3)多启动子表达；

4)单顺反子表达；或

5)与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达。

16.权利要求14的方法，其中体外生物素化为通过偶联活化生物素或体外酶促反应来完成对HCV蛋白的生物素化。

17.权利要求15的方法，其中所述生物素接受蛋白为生物素羧基载体蛋白家族或其功能区段。

18.权利要求15的方法，其中所述生物素接受蛋白为SEQIDNO.3编码的多肽。

19.权利要求15的方法，其中所述生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶是分类号为EC6.3.4.15的酶或其功能区段。