CN106153905A

CN106153905A - 一种检测艾滋病病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN106153905A
Application number: CN201610449972.8A
Authority: CN
Inventors: 邓鑫
Original assignee: RUIKANG HOSPITAL AFFILIATED TO GUANGXI UNIVERSITY OF CHINESE MEDICINE
Current assignee: RUIKANG HOSPITAL AFFILIATED TO GUANGXI UNIVERSITY OF CHINESE MEDICINE
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2016-06-21
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明涉及体外诊断检测技术领域，提供了一种检测艾滋病病毒的试剂盒，其包括：包被的微孔反应板、铕标记的HIV标记抗原、分析缓冲液、荧光增强液、清洗液，阴阳性对照品。本发明实施例提供了一种操作简便、价格低廉的检测艾滋病病毒的试剂盒。

Description

一种检测艾滋病病毒的试剂盒

【技术领域】

本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测艾滋病病毒的试剂盒。

【背景技术】

艾滋病(AIDS，Acquired Immune Deficiency Syndrome)也被称为获得性免疫缺陷综合征，是一种危害性极大的传染病，由艾滋病病毒(HIV，Human ImmunodeficiencyVirus)。初次感染后，一个人可能没有任何症状或可能会经历一个短暂时期的流感样疾病。随着感染的进展，它会干扰人体免疫系统，并增加感染的风险，常见的如肺结核以及其他机会性感染，最终可能导致患者死于与艾滋病相关的并发症。截止到2014年，全球大约有3690万人感染过艾滋病病毒，并且1200万死于艾滋病并发症，因此艾滋病病毒的检测对控制、治疗艾滋病具有重大意义。

但是现有技术中，艾滋病病毒的试剂盒对艾滋病病毒的检测都存在成本较高、不够方便的问题。鉴于此，克服该现有技术所存在的缺陷是本技术领域亟待解决的问题。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、价格低廉的检测艾滋病病毒的试剂盒。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，该检测艾滋病病毒的试剂盒包括：

包被的微孔反应板、铕标记的HIV标记抗原、分析缓冲液、荧光增强液、清洗液，阴阳性对照品。

优选地，包被的微孔反应板的制作过程为：

用包被液将基因工程重组HIV抗原稀释，获得稀释液；

将稀释液加入微孔反应板中，静置24小时；

按照包被抗原还原剂与基因工程重组HIV抗原按体积比9:1，将包被抗原还原剂与稀释液混合，在4℃处理30分钟；

去除多余的包被液，用清洗液洗涤，加入封闭液，静置24小时；

去除多余的封闭液真空抽干后冷藏。

优选地，包被液包括0.015mol/L Na₂CO₃，0.035mol/L NaHCO₃，0.1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.05％聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯。

优选地，封闭液为50ml/L Tris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、3％海藻糖过滤后调PH值至7.2而获得。

优选地，包被抗原还原剂为1％β-疏基乙醇。

优选地，铕标记的HIV标记抗原的制备方法为：

将HIV抗原加入的离心管；

在离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液；

重复上一步骤两次以上，获得浓缩的抗原原料；

按照质量比HIV抗原/标记试剂＝2:1向离心管加入的铕标记试剂，密封后，4℃低温静置保存，获得铕标记的HIV标记抗原；

将离心管内的铕标记的HIV标记抗原纯化，加入保护液后冷藏。

优选地，标记缓冲液为将Na₂CO₃溶液过滤并调整PH值至9.5获得。

优选地，保护液为0.1％的BSA溶液。

优选地，分析缓冲液是由0.01％Tween-20、0.9％NaCl、0.5％BSA加入Tris-HCl缓冲液中溶解、过滤获得的。

优选地，清洗液为0.9％NaCl，0.02％NaN₃，0.03％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液中制备而成。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中，检测艾滋病病毒的试剂盒其重复性好、精密度高、特异性好，而且操作快速简便、价格相对较低、具有易实现自动化等优点。

【附图说明】

图1为本发明一种检测艾滋病病毒的试剂盒的一个实施例的结构示意图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不限定本发明。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1:

本发明实施例1提供了一种检测艾滋病病毒的试剂盒。图1为本发明一种检测艾滋病病毒的试剂盒的一个实施例的结构示意图，如图1所示，检测艾滋病病毒的试剂盒包括：包被的微孔反应板、铕标记的HIV标记抗原、分析缓冲液、荧光增强液、清洗液，阴阳性对照品。

微孔反应板是一种事先包被而专用于放置待测样本的透明塑料板，透明塑料板上有多排大小均匀一致的小孔，每个小孔内都包埋着相应的HIV抗体，从而形成包被的微孔反应板。微孔板上每个小孔可盛放零点几毫升的溶液，其常见规格有96孔板，48孔板，32孔板等多种。优选地，微孔反应板可以是聚苯乙烯等材料构成，其具有透明性好，无毒无味等优点。

有研究结果表明，HIV感染后前期(4至6周)抗体检测可为阴性，因此HIV抗体检测能够较早的发现HIV感染，对控制HIV感染的传播起到了重要作用。

具体地，在本发明实施例中，包被的微孔反应板的制作过程包括以下5步：

用包被液将基因工程重组HIV抗原稀释，获得稀释液。这里可以按照基因工程重组HIV抗原与包被液的体积比为1:100、1:200、1:300等比例稀释。优选地，包被液由0.015mol/L Na₂CO₃，0.035mol/L NaHCO₃，0.1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.05％聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯组成，经试验发现该包被液的包被效果较好。

基因工程抗原分为原核表达和真核表达，一般是将想要表达的抗原插入表达载体中，导入工程菌如大肠杆菌BL21等，通过大量的表达可以获得非常大量的抗原蛋白，具有可控制，易提纯，易检测的优点，因此这里采用的是基因工程重组HIV抗原。

2)将稀释液加入微孔反应板中，静置24小时。

3)按照包被抗原还原剂与基因工程重组HIV抗原按体积比9:1的关系，将包被抗原还原剂与稀释液混合，在4℃处理30分钟。包被抗原还原剂可以在基因工程重组HIV抗原的处理过程防止基因工程重组HIV抗原被氧化，优选地，包被抗原还原剂为1％β-疏基乙醇，β-疏基乙醇能够溶解于水中，同时降低自身的挥发性，且具有较低的蒸汽压。

4)去除多余的包被液，用清洗液洗涤，加入封闭液，静置24小时。为了实现较好的洗涤效果，优选地，清洗液为将0.9％NaCl，0.02％NaN₃，0.03％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯加入50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液中制备而成。

由于抗体和抗原之间的结合是有一定的识别位点的，不是随便结合的，这就是所谓的特异性。但是也可能因为一些特殊的原因而导致本来不应该结合的一对抗体与抗原相互结合了，那么这就是非特异性的结合，因此，没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合。封闭液应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭液是BSA(BullSerum Albumi，牛血清蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶。优选地，本实施例中，封闭液为50ml/L Tris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、3％海藻糖过滤后调PH值至7.2获得，将其在4℃保存，经实验验证具有良好的效果。

5)去除多余封闭液真空抽干后冷藏。

本实施例中，检测艾滋病病毒的试剂盒包括铕标记的HIV标记抗原，其制备方法为：

1)将HIV抗原加入离心管。

2)在离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液。优选地，标记缓冲液为将Na₂CO₃溶液过滤并调整PH值至9.5获得。

3)重复上一步骤两次以上，获得浓缩的抗原原料。由于保存抗体的缓冲液中常含有叠氮钠或一级胺，需要去除此类物质，另外抗体要达到一定的浓度才有良好的标记效果，故需对抗体进行浓缩、去除杂质处理。

4)按照质量比HIV抗原/铕标记试剂＝2:1向离心管加入一定量的铕标记试剂，密封后，4℃低温静置保存，获得铕标记的HIV标记抗原。

5)将离心管内的铕标记的HIV标记抗原纯化，加入保护液后冷藏。这里的纯化方法可以采用层析分离纯化技术等方式。这里的保护液可以对铕标记的HIV标记抗原具有保护作用，优选地，保护液为0.1％的BSA溶液。

另外，分析缓冲液可以模拟生物体内环境，有保证的结果稳定性。本实施例中，分析缓冲液是由0.01％聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、0.9％NaCl、0.5％BSA加入Tris-HCl缓冲液中溶解、过滤获得的。

以HIV检测为阳性的血清作为阳性对照品，经HIV检测均为阴性的血清为阴性对照品。阴阳性对照品的作用在于作为检测待测血清的对照组。

使用时，将包被的微孔反应板置于室温下平衡。将分析缓冲液，阴、阳性对照品或待测样品依次加入包被的微孔反应板上的小孔中。在室温振动孵育1小时，这样待测样品中的抗体与已包被的HIV重组抗原结合成抗原-抗体复合物。再加入铕标记的HIV标记抗原，形成抗原-HIV抗体-Eu标记抗原免疫复合物。再加入荧光增强液，振荡孵育几分钟，铕在荧光增强液中从免疫复合物上解离后发出强的荧光，荧光强度与样品中的抗体浓度成正比，在荧光检测仪上可以检测出荧光值。经试验发现，本发明实施例中检测艾滋病病毒的试剂盒重复性好、精密度高、特异性好，而且操作快速简便、价格相对较低、具有易实现自动化等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，该检测艾滋病病毒的试剂盒包括：

2.如权利要求1所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述包被的微孔反应板的制作过程为：

用包被液将基因工程重组HIV抗原稀释，获得稀释液；

将所述稀释液加入微孔反应板中，静置24小时；

按照包被抗原还原剂与所述基因工程重组HIV抗原按体积比9:1的关系，将所述包被抗原还原剂与所述稀释液混合，在4℃处理30分钟；

去除多余的所述包被液，用清洗液洗涤，加入封闭液，静置24小时；

去除多余的所述封闭液，真空抽干后冷藏。

3.如权利要求2所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述包被液包括0.015mol/L Na₂CO₃，0.035mol/L NaHCO₃，0.1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.05％聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯。

4.如权利要求2所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为50ml/LTris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、3％海藻糖过滤后调PH值至7.2而获得。

5.如权利要求2所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原还原剂为1％β-疏基乙醇。

6.如权利要求1所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述铕标记的HIV标记抗原的制备方法为：

将HIV抗原加入离心管；

在所述离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液；

重复上一步骤两次以上，获得浓缩的抗原原料；

按照质量比HIV抗原/标记试剂＝2:1向所述离心管加入的铕标记试剂，密封后，4℃低温静置保存，获得铕标记的HIV标记抗原；

将所述离心管内的所述铕标记的HIV标记抗原纯化，加入保护液后冷藏。

7.如权利要求6所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述标记缓冲液为将Na₂CO₃溶液过滤并调整PH值至9.5获得。

8.如权利要求6所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述保护液为0.1％的BSA溶液。

9.如权利要求1所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于：所述分析缓冲液是由0.01％聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、0.9％NaCl、0.5％BSA加入Tris-HCl缓冲液中溶解、过滤获得的。

10.如权利要求1所述的检测艾滋病病毒的试剂盒，其特征在于，所述清洗液为0.9％NaCl，0.02％NaN₃，0.03％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液中制备而成。