CN1176000A - 抗体生产的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测血液样品中主动抗体生产的方法,所说的方法包含在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时,在使淋巴细胞生产和分泌抗体的条件下将所说的样品的等分试样与固相接触;检测溶液中固相上所说的抗原与抗体的结合;并比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时所说的抗体结合,从而获得与所说抗原反应的主动抗体分泌的测定量;且提供了实施该方法的试剂盒。也可以修改该方法使能够进行对非特异性感染指示物的检测。
Description
本发明涉及抗体生产的检测,特别是涉及借助于修改的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测与感染或接种等反应时血液样品中的主动抗体合成。
ELISA长期用于检测和测定抗体(或抗原)。最常见的是,ELISA用作血清学试验,但也用于研究抗原或抗体的免疫化学特征,例如,经常发现将它应用于评价和鉴定免疫反应,在杂交瘤技术等中经细胞培养研究抗体生产。
由于其灵敏性,简单性及操作的简便和快速,该技术已广泛用作诊断工具且现在常规用于临床实验室以检测感染或接种后血清或血浆中抗感染原的抗体。因此,例如,HIV感染的许多试验取决于使用常规ELISA试验检测血清或血浆中抗该病毒的抗体。
然而,由于这种简单的血清学ELISA试验仅仅测量了样品中靶抗体的存在,它不能区分与抗原反应的进行中的抗体合成与感染后或经被动传递等已经存在的抗体。同时在有些情况下,可足以简单地获得关于抗体存在的信息,在其它情况下需要能确定检测的靶抗体是否是在试验时,例如在接种过程中或在婴儿感染的诊断中由淋巴细胞急性合成的以区别被动传递的母体抗体。这在传统的ELISA方法中不能实现。
因此已建立了其它方法,使得能够检测进行中的抗体合成。可具体提及的有酶联免疫斑点(ELISPOT)试验(也称为斑点ELISA或ELISA斑点试验),例如由Czerkinsky等在《ELISA和其它固相免疫试验》,D.M.Kenneny和S.J.Challacomb编辑,1988,第10章217-239中所作的综述。基于ELISA方法,该技术能计数分泌抗一种或多种靶抗原的抗体的淋巴细胞。ELISPOT基本上是ELISA方法的一种变化,其中经过培养在用靶抗原覆盖的特别修饰的ELISA孔中的淋巴细胞并经过用在分泌细胞周围产生有色沉淀(斑点)的酶底物复合物取代标准ELISA试剂显示分泌抗体的细胞(ASC)。然后计数斑点得到生产抗体的细胞数测量值。在体外培养期间,蛋白质合成抑制剂可包含于培养基中以证实检测到的斑点是由于从头抗体合成引起。
已证实ELISPOT技术在研究体液免疫反应的动态中非常有用,且已用于检测免疫过的受试者外周循环中瞬时出现的自发ASC,该方法的某些特征限制了其在临床诊断情况中的应用。首先,由于对每个样品需要计数单独的斑点,这是费时且费力的,因此该方法不特别适合于分析大量的样品,如在临床诊断实验室中的样品。第二,在每个样品中仅计数分泌抗体的细胞数,一般来说,这需要合理大小的样品体积例如,几毫升。ELISPOT板也较昂贵且该试验不易于自动化。
由此可见,尽管在抗体检测技术上有进展,但仍需要一种简单,快速且实施时花费有效的试验,它能可信地精确定量自发分泌的抗体,能区分从头抗体合成,特别是能在血液样品上实施以达到诊断目的。本发明阐述了该需要。
因此,在一个方面,本发明提供了一种在血液样品中检测与靶抗原反应的主动抗体生产的方法,所说的方法包括:
在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时,在允许淋巴细胞生产和分泌抗体的条件下,将所说的样品或另选从所说样品中直接分离的淋巴细胞的等分试样与固相接触;
检测溶液中与固相上所说的抗原结合的抗体;及
在蛋白质合成抑制剂存在或不存时比较所说的抗体结合,从而获得与所说的抗原反应的主动抗体分泌的测定量。
本文使用的“主动抗体生产”指由样品中淋巴细胞生产的自发分泌的抗体,该淋巴细胞在试验过程中作为主动进行免疫反应的结果而主动产生抗体。在所有情况下该抗体指本发明的试验方法前或期间存在于体内但不存在于体外的抗原。
本文使用的短语“与所说抗原反应的主动抗体分泌”试图指与在该试验中使用的抗原结合的主动分泌的抗体,尽管使用的抗原可以不是开始刺激免疫反应的免疫原。因此,该试验中所用的抗原和在体内已刺激和正刺激抗体生产的免液原由于其相同或非常相似的抗原决定簇可能都结合待检测的抗体,在其它方面抗原和免疫原可以是不相同的。因此,本发明的方法中使用的抗原可以是含有相关免疫原全部或一些部分的物质,例如,来自感染的个体,或从相同或相似材料纯化的部分,同样抗原可经合成来制备,例如,经化学合成或重组表达比天然抗原增加或缺少部分的抗原。因此,可使用融合蛋白质或仅表达合适抗原决定基(或簇)的分子。
一般来说,本发明的方法涉及在允许淋巴细胞产生和分泌抗体的条件下培养与合适的固体表面接触的血液样品中的淋巴细胞以固定待检测的抗体,然后回收细胞,并检测抗体与固相上抗原的结合。经过比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时检测的抗体结合水平,可区分和定量从头抗体合成。
令人惊奇的是,本发明的方法允许使用较小的血液样品体积(例如,μl体积,不超过1ml),直接检测未刺激的淋巴细胞的自发抗体生产,而不用在与固相培养前预培养淋巴细胞的前面步骤。换句话说,样品的淋巴细胞直接用于本发明的试验方法而不经过任何预处理或刺激,例如,经抗原体外刺激。从而可检测取样时淋巴细胞分泌的抗体。以这种方式,即使使用这种较小的样品体积,也能具有优势地将与试验抗原反应的自发进行的抗体合成与淋巴细胞的旁观者激活区分开。也分析了不刺激细胞引起任何记忆时它们自发分泌抗体的情况下的淋巴细胞。这与其它所公开的利用体外抗原刺激以增强试验灵敏性的方法成对比。另一方面,本发明利用自发抗体分泌允许检测指示试验抗原正在进行的感染的血液中的抗体;在感染或接种等后的前几周,血浆淋巴细胞分泌抗试验抗原的抗体。以本发明的方法检测该抗体使人们能够诊断或测定该感染或监测与接种反应的抗体等。这在婴儿和新生儿中特别有用,其中区分新合成的抗体与被动传递的母体抗体是重要的。可在分开的试验中或在使用多个相关抗原的相同试验中分析相同的血液样品中抗一些不同的感染原的抗体。从而允许使用与病人存在的临床症状一致的有关接触抗原。在诊断感染中,区分正在进行的抗体合成与因以前感染已经存在的抗体也是重要的。经体外抗原刺激引起免疫记忆与试图鉴定正在进行的急性感染的试验不一致,因此以前基于抗原刺激的方法不具有这种优势。另外,包括抗原刺激的步骤可能减少本发明的试验的有利性时间因素,与背景技术的方法相比,本发明的方法操作非常快。
根据本发明的方法检测的抗体所针对的抗原包括细菌和病毒抗原。临床上重要的抗原包括但不限于来自诸如单纯疱疹病毒,巨细胞病毒,人免疫缺陷病毒(HIV)和任一肝炎病毒的抗原。该抗原的检测可用于迅速确定病人是否被感染,例如用于血液筛选目的或用于确定和/或监测感染。由于其简单性,该方法特别有用,且当不能得到复杂的设备时,例如在野外情况下可使用。
本文使用的术语“检测”和“测定其量”包括抗体生产水平的定量和定性测定,其意义为获得样品中所产生的抗体总量的绝对值,也包括抗体生产水平的指数,比率,百分数或相似指标以及半定量或定性测量。
本发明的主要优势是仅需要较小的样品体积,例如50-500μl,优选100-300μl,且通常是100-200μl血液或可与全血来源体积相比的血产物,它与一般依赖几毫升体积血清的传统诊断试验成对比。这在从新生儿取血样的情况中特别有用,因为本发明的方法仅需要μl体积。
可直接使用血液样品,一般是外周血液样品,尽管可优选首先从样品中分离淋巴细胞。这可使用本领域熟知的标准技术进行。因此,例如,可常规使用各种全血制品,如加有肝素的血液,加有EDTA的血液等,如临床实验室所常规制备的。尽管不是必需的,存在于样品中的红细胞可被裂解,例如,经过使用短期接触蒸馏水或氯化铵的常规方法,或经过使用其它熟知的溶血技术。可预料到所有富集或纯化的制品必须含有存在于产生制品的全血中的淋巴细胞以便检测自发性抗体生产。如果需要,可分离淋巴细胞,例如使用标准淋巴细胞分离培养基,如Lymphoprep(Nyegaard Co.Oslo,Norway),或使用免疫磁性分离(IMS)或相似的以固相为基础的分离系统或其它常规技术。在IMS或相似分离技术的情况下,固相,例如用对某些类白细胞具有特异性的抗体覆盖的磁珠可用于选择性地分离有用的淋巴细胞。如果使用分离的淋巴细胞,这些细胞在使用前可使用标准的洗涤方法进行洗涤。然而已观察到,充分洗涤细胞是不必要的。事实上,经过不充分洗涤,可提高细胞的可利用率且加速该方法。
如果需要,按上述处理的血液样品或分离的淋巴细胞然后按常规与携带合适结合配体的固相接触以固定待检测的一种或多种抗体。通常结合配体是被待测的一种或几种抗体识别的试验的一种或几种抗原。在一个实施方案中,本发明因而提供了一种检测血液样品中活性抗体生产的方法,所说的方法包含:
在存在和不存在蛋白质合成抑制剂时将所说样品或另选直接从所说样品中分离的淋巴细胞的等分试样与携带被待检测的一种或多种抗体识别的一种或多种抗原的固相接触;
在溶液中检测抗体与所说抗原的结合;且
比较在存在或不存在蛋白质合成抑制剂时所说的抗体结合,由此获得与所说抗原反应的主动抗体分泌的测定量。
也可使用另外的结合配体,例如,识别和结合待检测的抗体的蛋白A,蛋白G或抗体。在后一种情况下,不需要高度特异性的结合,因为在本试验方法的该实施方案中经过随后接合特异性地结合待测抗体的抗原而导入了特异性。从而在所有实施方案中产生了特异性抗原-抗体复合物。在本发明方法的检测步骤中,确定固定于该固相支持物上的该复合物的存在。该固相可以是任意熟知的支持物或通常广泛使用的或建议用于固定,分离等的基质。它们可以采用颗粒,片状,凝胶,滤膜,膜或微量滴度条,管或板等的形式且通常可由聚合体材料制成。然而,为了易于操作和简单,通常使用标准微滴度板和孔,优选标准ELISA平板。
固相也可修饰成允许检测对某一范围内的不同抗原具有特异性的抗体。因此,例如,合适的固相材料如硝酸纤维素等的盘或条等可用不同抗原覆盖,并同时加入不含任何接触抗原的微滴度孔或其它合适的装置中。然后可用结合抗体的检测方法区分不同的抗原。可使用分别用与某些临床症状或综合症一致的相关抗原覆盖的一系列盘来鉴定哪一种猜想的病原体引起该疾病。然后在分开的孔中分别处理这些盘。这是一种特别节省材料的方法,因为可使用同样小的血液体积进行试验以同时测定许多不同的抗原(来自相同感染原或来自各病例中与临床综合症或症状相关的不同病原体)。另一方法是使用存在于不同孔中的多个血液样品,各孔用不同的结合配体例如,抗原或抗体,覆盖从而进行试验。
将结合配体,例如抗原结合到固相上的技术也是非常熟知的并在文献中有广泛的描述。许多标准抗原覆盖程序在例如《ELISA和其它固相免疫测定,理论和实践方面》,1988,D.M.Kemeny和S.J.Challacombe,John Wiley和Sons编辑中描述。如果需要,可使用标准技术再洗涤和封闭开板。经过在含有结合配体,例如浓度为0.01至150μg/ml蛋白的合适缓冲液,例如,磷酸盐缓冲溶液(PBS)中4℃培养平板过夜,接着使用合适的封闭培养基(一般是一种细胞培养基)封闭并在例如37℃下培养1至5小时可简单地用结合配体覆盖标准微滴度平板,例如ELISA板。去掉封闭溶液后,平板即可使用。
然而,通常情况下,实施本发明方法所需的物质可以试剂盒的形式提供,其中提供的固体支持物已用结合配体覆盖并适当封闭。
如上所述,接触步骤一般包含在固相存在时,在允许抗体合成和分泌的条件下培养样品或分离的淋巴细胞。通常情况下,可使用标准ELISPOT培养条件,如Czerkinsky等1988(出处同上)所述。一般来说,当培养细胞的培养基依赖于CO2作为部分缓冲系统时,样品或细胞在37℃下在含5% CO2的空气中培养。也可使用不依赖CO2的培养基,其中实施另一缓冲系统,例如使用熟知的HEPES组份的培养基。在这些例子中,细胞简单地在37℃培养,从而进一步简化了该试验及其对复杂的设备的需要。培养时间可以变化,但一般需要至少1-2小时。已发现2至6小时的培养时间,例如2到4小时产生较好的结果,尽管在某些情况下可能需要更长的培养时间,例如高达12或24小时或过夜。合适的培养基是本领域熟知的且包括许多标准细胞培养基,例如,Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)或RPMI或使用HEPES作为不依赖CO2的缓冲系统,含合适的血清,例如胎牛血清(FCS)或按需要加入其它成份例如谷氨酰胺的熟知的细胞培养基。培养基中选择的添加成份可包括抗生素,例如,庆大霉素,青霉素,链霉素等,其它氨基酸,生长因子等。
在接触步骤前可能需要稀释样品/细胞悬液,可使用常规的细胞/样品稀释范围。一般使用培养基作稀释剂进行稀释。
为了区分正在进行的抗体合成,在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时进行培养。因此,培养前,向部分样品细胞等分试样中加入抑制剂以阻止蛋白质(也即抗体)的合成,部分不加抑制剂进行培养。可使用任何常规已知的蛋白质合成抑制剂,例如,亚胺环己酮。可使用10-5000μg/ml的浓度,例如50-500μg/ml亚胺环己酮。
还优选包括诸如叠氮化钠的ATP酶抑制剂或其它与蛋白质合成抑制剂相似的抑制剂以便迅速且完全终止细胞代谢。
培养后,从固相上去掉样品/细胞。这一般可经过使用合适的介质,例如诸如PBS的缓冲液洗涤来简单地实现。然而已发现不需要充分洗涤。
然后以固相进行检测抗体结合的步骤。关于读取信号而言,检测步骤在溶液中发生。可使用检测抗体结合的任何已知方法,只要能产生溶液中的可读信号,例如,依靠荧光,化学发光,比色或产生可检测信号的酶反应。然而,通常使用免疫测定作为检测方法,优选酶联免疫吸附试验(ELISA)。
免疫测定,特别是ELISA的技术是本领域中熟知的并已在文献中描述(例如见《ELISA和其它固相免疫测定,理论和实践方面》,1988,D.M.Kemeny和S.J.Challacombe,John Wiley和Sons编辑)。
去掉样品/细胞后,例如在ELISA检测方法中可加入酶-抗体连接物,它结合与固相上的抗原结合的抗体。同样,如果待测抗体经结合配体,例如,经过抗不同种类的抗体的一种抗体非特异性地结合于固相上,则可加入酶抗原连接物,它将特异性地结合待检测的固定抗体。然后加入一种酶底物以形成可检测的信号。在本发明中,常规使用可溶性底物,在溶液中产生可检测的信号。这具有优势,因为它利于且简化了对大量样品的处理和加工,允许估测抗体生产,尽管如上所述,绝对定量是不必要的,但如果需要,可获得定性或半定量结果。为了方便,可选择产生分光光度术上可检测的信号的底物,它可以经过阅读吸光率简便地读数,例如,使用标准ELISA平板阅读器。事实上,可使用标准ELISA试剂,其优势在于能使本发明的试验与现存方法和常规用于临床实验室的技术相配伍。然而,可使用其它的检测/信号产生系统,经荧光,化学发光等产生可检测的信号。
免疫-酶放大方法也可用于增强信号和增加灵敏度,例如,使用抗生物素蛋白-生物素方法,如Extravidin系统可从Sigma获得。生物素标记的二级抗体与过氧化物酶抗生物素蛋白复合物结合用作ELISA试剂。由于一个抗生物素蛋白分子能结合几个生物素分子,使用抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物增加了过氧化物酶分子的表面浓度,使该方法产生更大灵敏性。
细胞培养(接触)步骤和结合抗体的检测步骤所需的物质和工具也可按常规以试剂盒的形式与结合配体覆盖的固相一起提供。可使用其它试验方法补充本发明的试验所获得的信息。在传统的ELISA试验中可获得对以前存在的血清/血浆抗体的其它有用的数据。另外,从血液样品中分离淋巴细胞后,在进行这一步时,可使用本发明的试验中所用的相同的结合配体覆盖的固相将剩下的血浆液体用于检测以前存在的抗体。
为了保证本发明的试验方法可信地实施,可包括合适的对照。首先,比较蛋白质合成被抑制的孔与未抑制的孔可保证本发明记录下了试验细胞的精确的抗体生产而不仅仅是记录了外周血以前存在的抗体。在使用纯化的淋巴细胞制品作样品的例子中,可保证淋巴细胞样品中来自外周血的痕量截留抗体不会影响试验。其次,为了确定从抑制和未抑制的孔中的信号所记录的差别不是由于偶然和非特异性地(旁观者)激活淋巴细胞,可使用阴性对照抗原。该抗原可以是来自很可能引起病人急性疾病的感染原,例如,破伤风类毒素。该旁观者激活的淋巴细胞数目无论如何在所有情况下都远低于使用本发明的方法产生阳性试验结果所需要的数目。本发明的设计考虑到了这一点。
如上所述,由于其操作简便和快速及其简单性,本发明的试验使其具有诊断或其它临床或兽医用途,例如,鱼类养殖。除了较小的样品体积外,另一个优势在于仅需要一个样品,而不必象大多数常规血清学试验所要求的以2到3周间隔取血清对。不需要复杂的仪器,且该试验易于自动化。另外,如果需要,可能易于试验不同的免疫球蛋白同模标本。
本发明的上述试验方法提供了一种经过分析抗限定抗原的特异性抗体的自发表达来评价正在进行的感染的存在或程度的方法。很清楚该方法可应用于确定已知的疾病症状,且其中与有关免疫原相关的抗原可获得,从而提供了一种感染的特异性标记。然而在一些临床情况中,不能鉴定具体的疾病或感染,和/或合适的抗原不能获得以用于该试验。在这些情况下,该试验可修改成评价感染的非特异性指示物的存在或程度。因此,例如,含淋巴细胞的样品,例如全血或由其纯化或富集的淋巴细胞制品可检查其感染标记,例如,细胞因子或干扰素,例如γ-干扰素的生产。
因此,从本发明的另一个方面来看,提供了一种检测血液样品吕非特异性感染指示物存在的方法,所说的方法包含:
在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时,在允许淋巴细胞生产和分泌感染指示物的条件下将所说的样品或另选从所说的样品直接分离的淋巴细胞的等分试样与固相接触;
检测溶液中感染指示物与固相上结合的配体的结合;且
比较在存在或缺乏蛋白质合成抑制剂时所说的感染指示物的结合,从而获得所说样品中感染指示物的测定量。
为了实施该方法,可提供具有合适的捕获分子(例如抗检测的感染指示物的抗体)的固相。为了检测固定于固相上的所说的感染指示物的存在,可使用上文所述的方法,例如经过使用标记的抗体或配体。在该方法中,经过选择合适的固定基团或检测分子可鉴定特定标记。因此,例如,样品中的所有蛋白质可固定于固相支持物上并使用标记的特异性抗体或配体进行检测。另外,特异性的结合配体可用于固定恰当的感染指示物,然后可以阳性或阴性合适地标记指示物,例如在前一种情况下,经过与存在于感染指示物上但对该分子不专一的区域结合,或在第二种情况下,经过标记固相上未结合的结合配体来进行。实施该方法的试剂盒也形成本发明的一个部分。
现在参考下面非限制性的实施例更详细地描述本发明,其中本发明的试验方法称为血浆急性试验(Plasmacute assay)。实施例1一般方法:细胞:在接种后的不同时间从接受灭活流感疫苗的自愿者取肝素处理的血液。血液与等体积的PBS混合物。用Lymphoprep(Nyegaard & Co.Oslo)分离淋巴细胞。细胞在PBS中洗涤2次,重悬于(稀释)补充了20%FCS,2mML-谷氨酰胺,100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Pen+Strep)的Dylbecco氏修饰的Eagle氏培养基=MEDIUM中。终止溶液:在含10%叠氮化钠的PBS中配制1mg/ml的亚胺环己酮。ELISA和流感抗原:从用于临床试验的流感疫苗的3个病毒株(本文简称为H3N2,H1N1和B)纯化表面抗原。ELISA板:Greiner EIA平板655001 F-型或Costar EIA板3590。用10μg/ml蛋白的PBS溶液以100μl/孔在4℃覆盖过夜。在室温下用MEDIUM封闭1小时。用PBS洗涤一次。试验:对于3个流感抗原的每一个在两个平行组中将100μl细胞悬浮于MEDIUM中的稀释液加入3份孔中。一组中的3个孔在起始步骤中加入50μl终止溶液进行。在37℃下在含5% CO2的空气的培养箱中培养不同的时间。ELISA板用PBS洗涤一次,然后用含0.05%Tween 20的PBS洗涤2次。加入50μl/孔的合适稀释的免抗人Ig过氧化物酶连接物(Sigma),室温放置1小时。随后使用邻苯二胺(OPD)底物使平板显色并在492nm下读数吸光率。接种后11天取的血液样品
细胞培养时间;4小时,0小时=封闭的孔
细胞数 H3N2 H1N1 B0/4小时 6.6×104 264/522 199/490 352/5270/4小时 6.6×103 238/290 143/194 331/353
所有项目是三个孔中吸光率×1000的平均值,变动范围±10%。结论:6.6×104=66,000个细胞在培养4小时时产生显著的信号增加。H3N2吸光率上升98%,H1N1上升153%,B上升50%。
这是代表性实验。其它的试验显示出细胞过夜培养在封闭和未封闭的孔中产生吸光率超过1000的更明显的区别。对于更短的培养时间,例如2-3小时,该系统也有效。对于多10倍的细胞,例如6.6×103个细胞/孔也可产生清楚的区别,但并不总能产生该区别。实施例2一般方法
细胞;在接种后的第7天从接受灭活流感疫苗的自愿者取加有肝素的血液。血液与等体积的PBS混合。以Lymphoprep(Nyegaard& Co.Oslo)分离淋巴细胞。细胞在PBS中洗涤2次,重悬于加有20% FCS,2mML-谷氨酰胺,Pen+Strep的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(如前所述)=MEDIUM中。终止溶液:1mg/ml亚胺环己酮在含10%叠氮化钠的PBS中配制。试验抗原:纯化的表面抗原来自临床试验中使用的流感疫苗的3个病毒株,本文简称为H3N2,H1N1和B。对照抗原:破伤风类毒素(非铝吸附的;Lederle)。ELISA板:Greiner EIA板655001 F-型,或Costar EIA板3590。用含10μg/ml蛋白的PBS溶液以100μl/孔4℃覆盖过夜,破伤风:10Lf/ml。用MEDIUM在室温下封闭1小时。用PBS洗涤一次。试验:
对于3个流感抗原中的每一个和破伤风对照抗原以2个平行组向3份孔中加入100μl悬浮于MEDIUM中细胞稀释液。一组孔在起始步骤加入50μl终止溶液进行抑制。在含5% CO2的空气的培养箱中37℃培养3小时。培养后,ELISA板用PBS洗涤一次,用含0.05%Tween 20的PBS洗涤2次。加入50μl/孔的合适稀释的免抗人Ig过氧化物酶连接物(Sigma)并在室温下静置1小时。平板随后使用邻苯二胺(OPD;Sigma)底物显色并在492nm下读数吸光率。[可经过使用1小时Extravidin/过氧化物酶步骤(Sigma)在底物前增加一个步骤来修改试验以增强敏感性。这需要使用生物素标记的连接物来代替过氧化物酶连接物(Sigma)]。代表性实验结果(无extravidin):
接种7天后(2个受试者,#1和#2)
细胞培养时间:3小时,0小时=抑制的孔。
细胞数 H3N2 H1N1 B 破伤风0/3小时 105#1 063/410 055/269 206/258 046/050
#2 045/077 048/242 182/207 040/046
所有项目是三个孔吸光率×1000的平均值,变动范围±16%
受试者是青少年(16岁)。已知年轻人对A/H1N1流感疫苗的反应特别好。从上面可清楚地看到,受试者#1和#2反应较好。然而,通常接种者对各种疫苗成份的反应不同,因此可预期吸光率的差别增加。这从受试者#1与B病毒发生微弱反应,而#2仅与H1N1病毒发生明显的反应可得到证实。正如预期的,他们中没有一个与破伤风类毒素发生反应。然而,如果用类毒素在体外刺激细胞几天时间,其免疫学早期记忆(通过儿童时接种)可能导致破伤风抗体产生。在使用本发明的诊断实验室试验中的一个真实的感染例子中,只有一个试验感染原/抗原产生了阳性信号。实施例3一般方法:
细胞:在接种6天后从接受灭活的流感疫苗亚基的成人(24岁的男性)和儿童(3岁的男孩)取加有肝素的血液。按实施例1和2所述分离淋巴细胞。将细胞与实施例1和2所述的携带抗原H3N2,H1N1和B的固相在37℃下接触3小时,按上面所述进行试验(在本实验中不使用终止溶液或对照抗原)。
表1显示了2个个体的结果,其中各抗原的读数是三个孔中吸光率×1000的平均值。表1
成年受试者 | 儿童受试者 | ||||||
细胞数(千个) | A/H3N2 | A/H1N1 | B | 细胞数(升个) | A/H3N2 | A/H1N1 | B |
224 | 475 | 322 | 913 | 275 | 1268 | 97 | 10 |
112 | 189 | 193 | 567 | 138 | 951 | 65 | 10 |
56 | 93 | 62 | 162 | 69 | 672 | 51 | 20 |
这些结果表明:仅接受过一次早期流感抗原决定基,A/H3N2感染的年幼儿童对三种成份的疫苗中的A/H3N2成份产生非常强的免疫反应。正如对该儿童所预期的,对A/H1N1和B成份无反应。这类年幼的儿童通常需要以几周的间隔接受2个剂量的疫苗以产生满意的免疫反应。大约70,000个淋巴细胞(相应于大约70μl体积的全血)是以产生明显的阳性反应。对于接受了多种流感抗原决定基的成年受试者,反应虽然不如上面强烈,但对该疫苗的三种成份都有明显的反应,尽管程度有所变化。对于B成份,大约100,000个淋巴细胞对于产生阳性反应是必须的,而2种A成份最少需要100,000个细胞,优选200,000个细胞。实施例4:以经典的和血浆急性试验方法检测单疱纯疹2型病毒一般方法:组织培养和血清学分析
从具有认为是生殖疱疹病毒感染的症状的5个受试者生殖器取材进行常规组织培养程序以打算从样品中检测复制病毒(由Bergen;Haukeland大学医院病毒实验室进行)。使用检测IgG和IgM的含HSV抗原的通用ELISA试剂盒(Behringer Enzygnost,Behringer,德国)在相同的实验室对血清样品进行常规血清学分析。淋巴细胞的分离
对与医院样品同时取样的具有认为是生殖疱疹病毒感染的症状的5个受试者的加有肝素的血液进行Lymphoprep(Nycomed)密度梯度离心分离淋巴细胞。在PBS中洗涤细胞三次并重悬于含20%FCS,1mM L-谷氨酰胺,50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基(DMEM/FCS)中。经苔盼蓝排斥(0.2%)计数活细胞。使用Behringer Enzygnost抗HSV IgM和IgG ELISA的血浆急性试验
以含有用来自HSV感染的永久性猴肾细胞的抗原覆盖的8个孔及用来自未感染的细胞的对照抗原覆盖的8个孔的平板提供BehringerEnzygnost抗HSV IgM和IgG。用200μl/孔的DMEM/FCS在5%CO2中37℃封闭平板1小时。加入100μl/孔的适当稀释的淋巴细胞并在37℃5% CO2中培养3小时。所有下面的程序严格按照试剂盒供应商提供的说明书进行。使用同一供应商提供的连接物,试剂和缓冲液使平板显色。底物四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)需要使用可获得的TitertekMultiskan Mcc/340平板阅读器(Flow实验室)在450nm下读数OD。使用Bioelisa HSV-2 IgG进行血浆急性试验
以含有用灭活HSV-2抗原覆盖的8个孔的平板提供Bioelisa IgGHSV-2 ELISA(BIOKIT,Spain)。平板用200μl/孔的DMEM/FCS在37℃下5% CO2中封闭1小时。加入100μl/孔的适当稀释的淋巴细胞,37℃下5% CO2中培养3小时。所有的下面程序严格按试剂盒供应商提供的说明书进行。使用相同供应商提供的连接物,试剂和缓冲液对平板显色。底物四甲基联苯胺盐酸(TMB)需要使用可获得的TitertekMultiskan MCC/340平板阅读器(Flow实验室)在450nm下读数OD值。使用Bioelisa HSV IgM(免疫捕获)试验的血浆急性试验:
以含有用兔抗人IgM抗体覆盖的8个孔的平板提供Bioelisa HSVIgM(免疫捕获)试验(BIOKIT,Spain)。平板用200μl/孔的DMEM/FCS在37℃5% CO2中封闭1小时。加入100μl/孔的适当稀释的淋巴细胞并在37℃5% CO2中培养3小时。所有程序按厂家说明书进行。具体地说,用100μl/孔的辣根过氧化物酶标记的HSV抗原(已在人成纤维细胞中体外增殖的纯化且灭活的HSV)检测结合的抗体,为了减少非特异性反应,使用由未感染的细胞成份(以试剂盒提供),10μl HSV抗原和10μl对照抗原/平板组成的未标记的对照抗原。平板在TitertekMultiskan MCC/340平板阅读器中在450nm下阅读(Flow实验室)。
实验结果在表2中显示。
表2
病人 | 症状发作后的时间(天)性别/年龄 | 怀疑的初次/复发感染 | 病毒分离 | 血清抗体 | 血浆急性 试验 捕获抗体血浆急性度验 |
IgM IgG | Behringer Behringer Bioelisa BioelisaIgm IgG IgG IgM | ||||
12345 | 6 F/406 F212 M/47205 F/22197 F/21 | 初次感染初次感染复发感染初次感染初次感染 | -veHSV-1HSV-2HSV-2-ve-ve | - Borderline- +- ++ ntBorderline +nt nt- - | - 205000 103000 -- 223000 111000 -- 48000 96000 -182000 nt - -60500 15000 121000 <8000- 40500 20250 40500- - - - |
nt=未检测
表2概括了病人1-5的数据。Haukeland大学医院的诊断实验室尝试从临床标本中分离了该病毒并使用Behringer Enzygnost ELISA试剂盒也进行了血清IgG和IgM的常规ELISA试验。注明了分离的病类型,-ve指阴性分离物。血清ELISA临界值由试剂盒的厂家限定;+=OD>0.2,界线=OD 0.1-0.2,由试验厂家定义为可疑结果,--=OD<0.1。
对于血浆急性试验,我们使用OD>0.2作为阳性,并将产生该反应所必需的淋巴细胞数在表中列出。
只有Bioelisa IgG试验要求鉴定HSV2抗体,而其它表示用HSV(1和/或2)感染。结果:
病人1具有初始HSV-2感染的临床症状。在医院试验中未能从临床样品分离出病毒且经标准ELISA试验发现无IgM。经标准医院ELISA试验发现临界值的血清IgG抗体。为证实这些结果,在血浆急性试验中发现没有细胞产生IgM抗体。在Behringer IgG和Bioelisa IgG血浆急性试验中检测到生产抗HSV的IgG抗体的细胞。在Behringer血浆急性试验中产生临界吸光率需要205000个淋巴细胞,而在Bioelisa IgG中产生临界吸光率需要103000个淋巴细胞。
病人2进行初次感染,这经过以HSV-1型分离病毒得到证实。医院实验室未检测到血清IgM,但检测到IgG抗体。在血浆急性试验中未检测到产生IgM的细胞,而Behringer和Bioelisa血浆急性试验检测到产生IgG的细胞,且分别需要223000和111000个细胞。
病人3具有回复HSV-2感染,这经过从临床标本中分离出了HSV-2病毒得到证实。IgG存在于临床症状发作2天后取的血清样品中,然而此时检测不到血清IgM。在血浆急性试验中临床症状发作2天后检测不到IgM,而Behringer和Bioelisa血浆急性试验检测到产生IgG的细胞(需要48000-96000个细胞)。医院在临床症状发作20天后取的血清样品中检测到IgM血清抗体。在血浆急性Behringer IgM试验中需要182000个细胞产生临界吸光率,然而以Bioelisa IgM血浆急性试验检测不到细胞。
病人4被HSV初次感染。在送到医院实验室的临床样品中检测不到病毒。检测到临界值血清IgM抗体且发现阳性水平的血清IgG抗体。使用Behringer和Bioelisa试剂盒在临床症状发作后5和19(未检测到Behringer IgM)天取的血液样品中进行血浆急性试验时都检测到IgM和IgG抗体。在血浆急性试验中,BioelisaIgM试验需要不超过8000个细胞,Behringer IgM试验需要60500个细胞,两者都需要不超过100μl加肝素的血液。
病人5怀疑被HSV初次感染。然而从实验室未分离出病毒,且检测不到血清抗体。在血浆急性试验中检测不到产生抗HSV的IgG或IgM抗体的细胞。讨论:
已证实血浆急性试验对初次和复发疱疹病毒感染均有效。在所有情况下实施血浆急性试验至少与本文使用的传统ELISA方法一样好。特别是对于病人1,尽管从临床样品中未分离出病毒,以医院常规试验仅评价为临界阳性(即,不确定),但血浆急性试验(Bioelisa IgG和BehringerIgG)显示出大约100,000个细胞和200,000个细胞分别产生不容质疑的阳性结果。可能该病人具有双重感染(HSV1和HSV2),其中从病毒分离位点只回收到HSV1。然而,这不能排除阳性HSV结果(Bioelisa IgG)由血清学交叉反应引起。对于病人4的2个时间间陨样品,从中未分离出病毒,血浆急性试验显示从感染早期到晚期生产疱疹特异性IgM和IgG的淋巴细胞数的变化与熟知的初次感染后的动态一致,这清楚地证实为主动免疫反应。Bioelisa IgM血浆急性试验特别敏感,在前2个样品中需要不超过8000个淋巴细胞产生阳性信号。
在本实验中,我们显示了血浆急性方法对人类病毒感染的临床病例有效。实施例5:多重盘-用对IgG,IgA和IgM抗体特异性的捕获抗体覆盖硝酸纤维素盘。
实施本实验以确定多盘系统是否能用于血浆急性试验以检测不同特异性的抗体。一般方法:
从2个健康的成年受试者抽取加有肝素的全血样品。由于这些受试者不处于任何感染的急性期,我们打算分析与其(未知)抗原特异性无关的IgG,IgM和IgA自发性抗体分泌。
受试者1用于确定使用以3种不同抗原覆盖的盘系统是否能用于血浆急性试验的单个孔中。一个孔(No.1)。
受试者2用于确定在存在许多用相同抗原覆盖的盘时是否会削弱信号。在血浆急性试验中有3个分离的孔(孔号No.2,3和4)。淋巴细胞的分离:
经过对加有肝素的血液进行Lymphoprep(Nycomed)密度梯度离心分离淋巴细胞。这些细胞在PBS中洗涤3次并重悬于含20% FCS,1mM L-谷氨酰胺,50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基(DMEM/FCS)中。以台盼蓝排斥(0.2%)计数活细胞。使用盘作为固相的血浆急性试验
具有8μM孔径的混合酯的纤维素盘(Millipore SCWP 01300)用10μg/ml在PBS叠氮化物(0.001%)中稀释的山羊抗人类特异性抗体(Sigma,抗-IgG I-3382,抗-IgA I-0884,抗-IgM I-0759)在室温下覆盖过夜。在37℃下5% CO2中用DMEM/FCS封闭盘1小时。将淋巴细胞加入到具有0.4μM孔径的12mm清晰的穿透孔(Costar 3460)中,盘放于其下面,并在37℃下5% CO2中培养3小时。将单个盘转移到24孔平板(Costar)的分开的孔中并用PBS洗3次,用PBS Tween(0.05%)洗3次。用在DMEM/FCS中稀释的200μl/孔的山羊抗人类特异性过氧化物酶连接的抗体(Sigma IgG A-6029,IgA A-4165,IgM A-4290)检测结合的抗体并在室温下培养2小时。如前所述洗涤盘以去掉未结合的抗体并使用溶于0.05M磷酸盐柠檬酸缓冲液(PH5.0)中的200μl/孔邻苯二胺二盐酸(OPD)(Sigma P-7288)显色。加入底物30分钟后,使用100μl/孔的1M H2SO4终止显色。将100μl/孔转移到96孔ELISA平板(Greiner EIA平板655001 F-型)并在Titertek Multiskan MCC/340平板阅读器(Flow实验室)上在492nm下读OD值。
实验结果在表3中显示,其中各捕获抗体的读数是以吸光率×100表示的三个孔中的平均值。
表3
受试者1 | 受试者2 | ||
孔1 | 孔2 | 孔3 | 孔4 |
盘号 抗人捕 OD获抗体 (492nm)1 IgG 4052 IgA 1403 IgM 854 IgG 4105 IgA 1256 IgM 647 IgG 3758 IgA 1689 IgM 61细胞 | 盘号 抗人捕 OD获抗体 (492nm)1 IgG 1482 IgG 1823 IgG 1124 IgG 1575 IgG 1426 IgG 1237 IgG 1448 IgG 125细胞 | 盘号 抗人捕 OD获抗体 (492nm)1 IgA 1822 IgA 2023 IgA 2214 IgA 2635 IgA 1906 IgA 2097 IgA 1728 IgA 151细胞 | 盘号 抗人捕 OD获抗体 (492nm)1 IgM 822 IgM 1073 IgM 1244 IgM 1455 IgM 1196 IgM 1277 IgM 1388 IgM 134细胞 |
孔1含2百万个淋巴细胞,孔2-4含1百万个淋巴细胞。“细胞”参考是为了表明盘号位于与细胞层最近处。结果:
用受试者1进行的试验表明甚至9个盘可容易地用于含淋巴细胞的孔。对3个IgG盘,3个IgA盘和3个IgM盘的反应用于与各组相同的实际目的,从而显示了盘相对于分泌抗体的淋巴细胞的实际位置不是关键的。用受试者2的淋巴细胞进行的试验表明至少8个相同覆盖的孔可放在一个含淋巴细胞的孔中以产生实际上相同的读数。因此,本发明允许在一个孔中对相同的淋巴细胞制品进行多个试验。
Claims (23)
1.一种检测血液样品中与靶抗原反应的主动抗体生产的方法,所说的方法包含:
a)在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时,在允许淋巴细胞生产和分泌抗体的条件下将所说样品,或另选直接从所说样品中分离的淋巴细胞的等份试样与固相接触;
b)检测溶液中与固相上所说抗原结合的抗体;及
c)比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时所说的抗体结合,从而获得与所说抗原反应的主动抗体分泌的测定量。
2.权利要求1所要求的方法,其中所说的固相携带一种或多种被待测的一种或多种抗体识别的抗原。
3.权利要求1所要求的方法,其中所说的固相携带被待测的一种或多种抗体识别的一种或多种抗体。
4.权利要求1至3中任意一项所要求的方法,其中用于该方法的所说的血液样品或淋巴细胞制品具有不超过1ml的体积。
5.权利要求1至4中任意一项所要求的方法,其中对新生儿或婴儿血液样品实施该方法以区分新合成的抗体和被动传递的母体抗体。
6.权利要求1至5中任意一项所要求的方法,其中所说的血液样品经过从病人直接取的血液进行纯化或富集程序而获得。
7.权利要求1至6中任意一项所要求的方法,其中直接从所说样品中分离的淋巴细胞用于该方法。
8.权利要求1至7中任意一项所要求的方法,其中在权利要求1的接触步骤前封闭固体支持物。
9.权利要求1至8中任意一项所要求的方法,其中的蛋白质合成抑制剂是以50-500μg/ml浓度使用的亚胺环己酮。
10.权利要求1至9中任意一项所要求的方法,其中ATP酶抑制剂用于与蛋白质合成抑制剂连接。
11.权利要求1至10中任意一项所要求的方法,其中权利要求1的检测步骤以免疫测定进行。
12.权利要求11中所要求的方法,其中的免疫测定是ELISA。
13.权利要求3至12中任意一项所要求的方法,其中被固定于所说固相上的待测一种或多种抗体识别的一种或多种抗原与所说的固相接触。
14.权利要求2和4至12中任意一项所要求的方法,其中识别固定于所说固相上的一种或多种抗体的一种或多种抗体与所说的固相接触。
15.权利要求1至14中任意一项所要求的方法,其中可溶性底物用于权利要求1的检测步骤,且产生分光光度术上可检测的信号。
16.权利要求1至15中任意一项所要求的方法,其中使用阴性参照抗原。
17.权利要求1至16中任意一项所要求的方法,其中检测针对疱疹病毒的主动抗体生产。
18.权利要求2和4至17中任意一项所要求的方法,其中采用分别携带不同靶抗原的多个固相。
19.一种实施权利要求2和4至18中任意一项所要求的方法的试剂盒,包含至少一种用抗原覆盖并适当封闭的固相支持物。
20.一种实施权利要求3至18中任意一项所要求的方法的试剂盒,包含至少一种用抗体覆盖并适当封闭的固相支持物。
21.权利要求19或20所要求的试剂盒,它另外还包含至少一种下列成份:
a)蛋白质合成抑制剂;
b)ATP酶抑制剂;
c)用于检测抗体的酶-抗体连接物;
d)用于检测抗体的酶-抗原连接物;
e)、c)或d)的酶的可溶性底物;和
f)阴性对照抗原,
细胞培养(接触)步骤和结合抗体的检测步骤中所需的材料和工具。
22.一种检测血液样品中非特异性感染指示物存在的方法,所说的方法包含:
在蛋白质抑制剂存在和不存在时,在允许淋巴细胞生产和分泌感染指示物的条件下将所说的样品或另选直接从所说样品分离的淋巴细胞的等分试样与固相接触;
检测溶液中与固相上结合配体结合的感染指示物;及
比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时所说的感染指示物的结合,从而获得在所说的样品中感染指示物的测定量。
23.一种实施权利要求22所要求的方法的试剂盒,包含至少一种用所说的感染指示物的结合配体覆盖的和适当封闭的固相支持物。
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