JP3472929B2

JP3472929B2 - 抗体産生の検出

Info

Publication number: JP3472929B2
Application number: JP52549296A
Authority: JP
Inventors: ハーハイム，ラース，ラインハルト
Original assignee: ハーハイム，ラース，ラインハルト
Priority date: 1995-02-21
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 2003-12-02
Anticipated expiration: 2016-02-21
Also published as: RU2197733C2; HUP9801448A2; ATE188551T1; GR3032740T3; GB9503406D0; AU709591B2; CA2213083C; PL322209A1; NO317151B1; EP0811165A1; WO1996026443A1; US6080552A; FI973418A0; PL182061B1; HUP9801448A3; JPH11500226A; AU4726896A; ES2140821T3; CN1098460C; CA2213083A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗体産生の検出に関し、詳しくは、改変し
た酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、感染
または予防接種などに応答した血液サンプル中での能動
抗体合成を検出することに関する。

ELISAは、抗体（または抗原）を検出および測定する
ために以前から使用されている。最も一般的には、ELIS
Aは血清学的アッセイに用いられるが、抗原または抗体
の免疫学的特性の研究にも用いられ、例えば免疫応答の
評価および特性決定、細胞培養による抗体産生の調査、
ハイブリドーマ技術などにしばしば使用されている。

その感度、簡便さ及び容易性により、および操作が迅
速なため、この技術は診断手段として広く採用されてお
り、今では臨床実験室においてルーチンに使用され、感
染または予防摂取に続いて産生される、感染性物質に対
する血清またはプラズマ中の抗体を検出している。すな
わち、例えばHIV感染の多くの試験は、被験者（または
患者）の血清またはプラズマ中のウイルスに対する抗体
を従来のELISAアッセイを用いて検出することに基づい
ている。

しかしながら、このような簡単な血清学的ELISA試験
は、サンプル中の標的抗体の存在を測定するだけなの
で、抗原に応答した進行中の抗体合成と、過去の感染か
ら既に存在している抗体または受身移入による抗体など
とを区別することができない。幾つかの場合には、抗体
の存在についての情報を得るだけで充分であろうが、他
の場合には、検出された抗体が、試験したときに、例え
ば予防接種コース中に、リンパ球により実際に合成され
たのかどうかを決定できるか、あるいは乳児の感染の診
断において、受動移入した母性抗体と区別できることが
望ましい。これは古典的ELISA方法では達成できない。

従って、進行中の抗体合成の検出を可能にする他の方
法が開発されてきた。これに関しては、例えばCzerkins
ky et al.によりELISA and other Solid Phase Immunoa
ssays,Ed.D.M.Kenneny and S.J.Challacombe,1988,Chap
ter 10,217−239に概説されているような酵素結合免疫
スポット（ELISPOT）アッセイ（スポットELISAまたはEL
ISA−プラークアッセイとしても知られている）を特に
挙げることができる。ELISA法に基づいたこの技術は、
１以上の標的抗原に対する抗体を分泌するリンパ球の計
数を可能にする。基本的には、ELISPOTはELISA法の変更
法であり、こうして、標的抗原を塗布した特別に改変さ
れたELISAウェル中でリンパ球を培養することにより、
かつ、標準的ELISA試薬を、分泌細胞付近で着色した沈
澱（スポット）を生じさせる酵素−基質複合体で置き換
えることにより、抗体分泌細胞（ASC）を示すことがで
きる。次いでスポットを計数して、抗体産生細胞数の測
定値を得ることができる。タンパク質合成阻害剤を培養
培地に含ませて、検出されたスポットがインビトロイン
キュベーション期間中の新たな（de novo）抗体合成に
よることを確認することができる。

ELISPOT技術は体液性免疫応答の動力学の研究におい
て極めて有用であることが証明されており、また、免疫
された被験者の末梢循環中に過渡的に現れる自発的ASC
を検出するのに使用されてきたが、この方法の幾つかの
特徴により、臨床診断セッティングにおけるその使用は
制約されている。第一に、各サンプルについて個々のス
ポットを計数する必要があり、時間の浪費と苦労を伴う
ことがあるので、この方法は、臨床診断実験室において
生じるような多数のサンプルの分析のために特に適した
ものではない。第二に、各サンプル中の抗体分泌細胞の
数のみが計数され、また一般的にいって、これにはかな
り大きなサンプル体積、例えば数mlが必要である。ま
た、ELISPOTプレートは高価であり、アッセイは容易に
オートメーション化できない。

従って、抗体検出技術の進歩にもかかわらず、実施す
るのが簡単、迅速かつコスト上有効であり、自発的に分
泌された抗体の正確な定量を高信頼度で可能にし、新た
な抗体合成を識別することができ、そして特に、診断の
目的で血液サンプルについて実施することができるアッ
セイに対する要求があることが判るであろう。本発明
は、この要求を取り扱うものである。

従って一つの観点において、本発明は、血液サンプル
中で標的抗原に応答した能動抗体産生を検出する方法を
提供し、この方法は、タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下におい
て、血液サンプルのアリコート、または所望により該サ
ンプルから直接単離されたリンパ球のアリコートを、リ
ンパ球による抗体の産生および分泌を許容する条件下で
固体相と接触させ、固体相上での上記抗原（１以上）への抗体結合を溶液
中で検出し、そしてタンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下におけ
る上記抗体結合を比較し、これにより該抗原（１以上）
に応答した能動抗体分泌の量の測定値を得ることからな
る。

本明細書中で使用するように、「能動抗体産生」は、
能動的な進行中の免疫応答の結果として、アッセイの経
過中に能動的に抗体を産生しているサンプル中のリンパ
球により産生される自発的に分泌された抗体を指す。全
ての場合、抗体は、本発明のアッセイ方法の前またはそ
の間にインビトロではなくインビボで提示された抗原に
向けられる。

ここで使用するように、「該抗原に応答した能動抗体
分泌」という表現は、使用した抗原が初めから免疫応答
を刺激する免疫原ではなかったとしても、能動的に分泌
された抗体が、使用した抗原に結合することを意味する
ことを意図している。すなわち、アッセイに使用した抗
原、およびインビボで抗体の産生を刺激したかまたは刺
激しつつある免疫原の両方は、同一または非常に類似し
たエピトープのために、検出すべき抗体に結合するであ
ろうが、他の点では、抗原および免疫原は同一でなくて
もよい。すなわち、本発明の方法に用いられる抗原は、
関連する免疫原、例えば感染した個体に由来する免疫原
の全部または一部を含有する材料、あるいは同一または
類似の材料から精製した部分であってもよいが、抗原は
同様に合成的に、例えば化学的合成または組み換え発現
により、自然抗原と比較して付加部分または欠失部分を
有するように調製することもできる。従って、適切なエ
ピトープ（１以上）のみを発現する融合タンパク質また
は分子を使用できる。

一般的にいって、本発明の方法は、血液サンプルから
のリンパ球を、リンパ球による抗体の産生および分泌を
許容する条件下で、適切な固体表面と接触させて検出す
べき抗体を固定化させ、次いで、細胞を除去し、固体相
上での抗原への抗体結合を検出することを伴う。タンパ
ク質合成阻害剤の存在または不在において、検出された
抗体結合のレベルを比較することにより、新たな抗体合
成を識別および定量することができる。

驚くべきことに、本発明の方法は、小さい血液サンプ
ル体積（例えば、数μl,1ml未満）を用いて、リンパ球
を固体相とともにインキュベーとする前の前培養工程な
しに、刺激されないリンパ球による自発的抗体産生を直
接的に検出することを可能にする。換言すれば、サンプ
ルからのリンパ球は、前処理または刺激、例えば抗原に
よるインビボ刺激を行わずに、本発明のアッセイ方法に
直接使用される。従って、サンプル採取時にリンパ球に
より分泌された抗体を検出することができる。こうし
て、このように小さいサンプル体積を用いても、試験抗
原に応答した自発的な進行中の抗体合成を、リンパ球の
傍観者（bystander）活性化と有利に区別することがで
きる。また、リンパ球は、細胞を刺激していかなる記憶
をも現すことなく自発的に抗体を分泌する状況でアッセ
イされる。これは、インビボ抗原刺激による試験感度の
上昇を利用した他の公開された方法とは著しく異なる。
他方において、本発明は、自発的な抗体分泌を利用し
て、進行中の感染の徴候である血液中での抗体産生を試
験抗原により検出するのを可能にする。プラズマリンパ
球は、感染または予防接種などの後の最初の２〜３週間
に抗原に対する抗体を分泌するであろう。本発明の方法
によるこのような抗体の検出は、感染の診断または決
定、あるいは予防接種に対する抗体応答のモニターなど
を可能にする。これは、新たに合成された抗体を、受動
移入した母性抗体から区別することが重要である乳児お
よび新生児において特に有用である。同一の血液サンプ
ルは、幾つかの別個の感染性物質に対する抗体につい
て、関連する複数の抗原を用いた別のアッセイまたは同
じアッセイで分析することができる。こうして、患者が
示す臨床的症状と調和した関連接触抗原を使用すること
ができる。感染を診断する際には、進行中の抗体合成
を、以前の感染から既に存在している抗体と区別できる
ことも重要である。インビトロでの抗原刺激により免疫
学的記憶を回復させることは、進行中の急性感染の同定
を目的としたアッセイとは調和せず、それ故に抗原刺激
に基づく従来法は、この利点を共有しない。また、抗原
刺激工程を含むことは、従来技術の方法と比較して極め
て迅速に実施される本発明のアッセイの有利な時間ファ
クターを傷つけるであろう。

本発明の方法により検出するために抗体が向けられる
抗原には、バクテリアおよびウイルスの両方の抗原が包
含される。臨床的に重要な抗原としては、例えば単純疱
疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV）および全ての肝炎ウイルスが挙げられる
が、これらに限定されない。このような抗原の検出は、
例えば血液スクリーニングの目的で、あるいは感染の証
明および／またはモニターの目的で、被験者が感染して
いるかどうかを迅速に確証する。本方法は、これが簡単
であるために特に有用であり、例えばフィールドの局面
において精巧な装置を利用できない場合に使用すること
ができる。

本明細書で使用するように、「検出する」および「量
を測定する」という用語は、サンプル中で産生された抗
体の量についての絶対値、そしてまた、抗体産生レベル
の指数、比率、パーセントまたは同様の指示を得るとい
う意味で、抗体産生レベルを定量的および定性的に評価
することの両方を、半定量的および／または定性的な評
価とともに包含する。

本発明の主な利点は、一般的に数mlの血清体積に基づ
く古典的診断試験と対比して、小さいサンプル体積、例
えば50〜500μｌ、好ましくは100〜300μｌ、普通は100
〜200μｌの血液、または全血液源に匹敵する血液製剤
体積しか必要としないことである。これは、本発明の方
法にはμｌ台の体積しか必要でないので、新生児から採
血する場合に特に有用である。

血液サンプル、一般的に末梢血液サンプルをそのまま
使用できるが、サンプルから最初にリンパ球を単離する
のが好ましい場合がある。これは、この分野において公
知の標準的技術を用いて行うことができる。すなわち例
えば、臨床実験室でルーチンに調製されるような様々な
血液製剤、例えばヘパリン処理血液、EDTA−血液などを
好都合に使用できる。不可欠ではないが、サンプル中に
存在する赤血球は、蒸留水または塩化アンモニウムに短
時間暴露させる普通の方法を用いることにより、あるい
は他のよく知られた溶血技術を用いることにより、溶解
させてもよい。全ての濃縮調製物または精製調製物は、
自発的抗体産生の検出を可能にするように、由来する全
血液中に存在したリンパ球を含有する必要があることが
判るであろう。望ましいならば、例えばLymphoprep（Ny
egaard Co.Oslo,Norway）などの標準的リンパ球分離媒
体を用いるか、あるいは免疫磁性分離（IMS）または同
様の固体相に基づく分離システムまたは他の普通の技術
を用いて、リンパ球を分離してもよい。IMSまたは同様
の分離技術の場合、例えば特定セットの白血球に対して
特異的な抗体で塗布した磁性ビーズなどの固体相を用い
て、有用なリンパ球を選択的に分離することができる。
分離されたリンパ球を用いる場合、細胞は、使用前にス
タンディング洗浄法を用いて洗浄してもよい。しかしな
がら、細胞を徹底的に洗浄する必要はないことが認めら
れた。実に、徹底的に洗浄しないことにより、細胞の生
存率を改善することができ、かつ方法をスピードアップ
できる。

必要に応じて上記のように処理した血液サンプル、ま
たは分離されたリンパ球は、次いで好都合には、適切な
結合パートナーを担持した固体相と接触させられ、検出
すべき１以上の抗体が固定化される。結合パートナー
は、１以上の検出すべき抗体により認識される１以上の
試験抗原であることが好都合である。従って、一つの態
様において、本発明は、血液サンプル中での能動抗体産
生を検出する方法を提供し、この方法は、タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下におい
て、上記サンプルのアリコート、または所望により該サ
ンプルから直接に単離されたリンパ球のアリコートを、
検出すべき１以上の抗体により認識される１以上の抗原
を担持する固相と接触させ、上記抗原（１以上）への抗体の結合を溶液中で検出
し、そしてタンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下で該抗
体結合を比較し、これにより抗原（１以上）に応答した
能動抗体分泌の量の測定値を得ることからなる。

他の結合パートナー、例えばプロテインＡ、プロテイ
ンＧ、または検出すべき抗体を認識して結合する抗体を
用いることもできる。後者の場合、高度に特異的な結合
は必要でない。なぜならば、この態様のアッセイ方法に
は以後に抗原結合が組み込まれ、この抗原が検出すべき
抗体と特異的に結合するからである。こうして、全ての
態様において、特定の抗原−抗体複合体が創製される。
このような複合体が固体支持体に固定化されて存在する
ことは、本発明の検出工程で確認される。固体相は、固
定化、分離などのために現在広く用いられているかまた
は提案されている公知の支持体またはマトリックスであ
ってよい。これらは粒子、シート、ゲル、フィルター、
膜、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブま
たはプレートなどの形態であってよく、好都合には、重
合体材料製であってよい。しかしながら、操作が容易で
簡単なためには、標準的マイクロタイタープレートおよ
びウェル、好ましくは標準的ELISAプレートを用いるこ
とが便利である。

固体相を改変して、ある範囲の異なった抗原に対して
特異的な抗体の検出を可能にすることができる。すなわ
ち例えば、好適な固体相材料例えばニトロセルロースそ
の他のディスクまたはストリップなどは、異なる抗原で
塗布されてもよく、また、接触試薬を含まないマイクロ
タイターウェルまたは他の好適な容器に同時に添加され
てもよい。次いで抗体結合検出方法を用いて、異なった
抗原間を識別することができる。疑わしい作用物質の中
のどれが病気の原因であるのかを同定するために、各々
が特定の臨床的状態または症状と調和する関連抗原で塗
布されたディスクのセットを使用することができる。次
いでディスクは、別個のウェル中で個々に処理される。
これは特に材料節約手法である。なぜならば、複数の異
なった抗原（それぞれの場合に臨床的症状または状態に
関連した、同じまたは異なった感染性物質から）の同時
試験を、同じ小体積の血液を用いて実施できるからであ
る。もう一つのアプローチは、各々が異なった結合パー
トナー、例えば抗原又は抗体で塗布された別個のウェル
中で複数の血液サンプルを使用し、これにより試験を展
開させることである。

結合パートナー、例えば抗原を固体相に結合させる技
術もまた、非常によく知られかつ広範な文献に記載され
ている。多くの標準的抗原塗布手法は、例えばELISA an
d other solid phase Immunoassays,Theoretical and P
ractical Aspects;1988,ed.D.M.Kemeny ＆ S.J.Challac
ombe,John Wiley ＆ Sonsに記載されている。所望によ
りプレートは洗浄してブロックすることもでき、ここで
もまた、標準的技術が用いられる。従って例えば、標準
的マイクロタイタープレート、例えばELISAプレート
を、例えば0.01〜150μg/mlタンパク質の濃度で結合パ
ートナーを含有する好適な緩衝液、例えば燐酸塩緩衝塩
水（PBS）中で４℃にてインキュベートすることによ
り、結合パートナーで簡単に塗布し、次いで適切なブロ
ッキング媒体（一般的に細胞培養培地）を用いてブロッ
クし、例えば37℃で１〜５時間インキュベートすること
ができる。ブロッキング溶液を除去した後、プレートそ
のまま使用できる。

しかしながら、有利には、本発明の方法を実施するた
めに必要な材料はキットの形態で提供することができ、
この場合、固体支持体は、既に結合パートナーで塗布さ
れ、かつ適切にブロックされた状態で供給される。

上記のように、接触工程は、一般的に、固体相の存在
下に抗体の合成および分泌を許容する条件下でサンプル
または分離されたリンパ球をインキュベートすることを
伴う。便利には、例えばCzerkinsky et al.,1988（上
記）に記載された標準的ELISPOTインキュベーション条
件を使用できる。一般的にサンプルまたは細胞は、細胞
がインキュベートされる培地が緩衝システムの一部とし
てCO₂に基づく場合は、空気中５％CO₂とともに37℃でイ
ンキュベートされる。公知のHEPES成分を用いた培地の
ような、別の緩衝システムが作用するCO₂−非依存性培
地を使用することもできる。これらの場合、細胞は37℃
で簡単にインキュベートされ、こうしてアッセイおよび
精巧な装置に対するその必要性はさらに単純化される。
インキュベート時間は変化してよいが、一般的に少なく
とも１〜２時間である。２〜６時間、例えば２〜４時間
のインキュベート時間が良好な結果を生じることが見出
されたが、場合によっては例えば12または24時間、また
は一夜までのより長いインキュベート期間が望ましいこ
とがある。インキュベーションのための適切な培地は、
当該技術においてよく知られており、その例としては、
全ての標準的細胞培養培地、例えばダルベッコ改変イー
グル培地（DMEM）またはRPMI、またはCO₂−非依存性緩
衝システムとしてHEPESを用い、必要ならば適切な血
清、例えば子ウシ血清（FCS）または他の成分、例えば
グルタミンを含有する公知の培養培地が挙げられる。培
地中の任意の添加成分としては、抗生物質、例えばゲン
タマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなど、他
のアミノ酸、成長因子などが挙げられる。

接触工程の前に、サンプル／細胞懸濁液を希釈するこ
とが望ましい場合があり、ある範囲のサンプル／細胞希
釈液を好都合に使用できる。希釈は一般的に希釈剤とし
て培養培地を用いて行われる。

進行中の抗体合成を識別するために、インキュベーシ
ョンはタンパク質合成阻害剤の存在下および非存在下に
おいて行われる。すなわち、インキュベーションの前
に、サンプル／細胞アリコートの部分に阻害剤を加え
て、タンパク質、従って抗体の合成をブロックし、そし
て他の部分を阻害剤なしでインキュベートする。普通公
知の全てのタンパク質合成阻害剤、例えばシクロヘキシ
ミドを使用できる。10〜5000μg/ml、例えば50〜500μg
/mlの濃度のシクロヘキシミドを使用できる。

細胞代謝を迅速かつ完全に停止させるために、タンパ
ク質合成阻害剤とともにアデノシントリホスファターゼ
（ATPase）阻害剤、例えばナトリウムアジドまたは他の
類似の阻害剤を含ませることもまた好ましい。

インキュベーションに続いて、サンプル／細胞は固体
相から除去される。これは一般的に、好適な培地、例え
ばPBSのような緩衝液を用いて簡単に洗浄することによ
り行うことができる。しかしながら、徹底的な洗浄の必
要はないことが見出された。

次いで固体相は抗体結合の検出工程に付される。検出
工程は、シグナルを読み取るという点から、溶液中で行
われる。溶液中で読み取り可能なシグナルが生じる限
り、全ての公知の抗体結合検出手段を使用でき、これは
例えば蛍光、化学ルミネッセンス、比色、あるいは検出
可能なシグナルを生成する酵素反応による。しかしなが
ら、検出手段として免疫アッセイ、および好ましくは酵
素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を使用できることが
便利である。

免疫アッセイ技術および特にELISA技術は、当該技術
において公知であり、文献（例えばELISA and other so
lid phase Immunoassays,Theoretical and Practical A
spects;1988,ed.D.M.Kemeny ＆ S.J.Challacombe,John
Wiley ＆ Sons参照）に記載されている。

サンプル／細胞の分離に続いて、酵素−抗体接合物
を、例えばELISA検出方法に添加することができ、これ
は固体相上の抗原に結合された抗体に結合する。同様
に、検出すべき抗体が結合パートナーを介して、例えば
異なった種の抗体に対する抗体により非特異的に固体相
に結合されているならば、検出すべき固定化抗体に特異
的に結合する酵素−抗体接合物を添加することができ
る。検出可能な信号を発生させるために、次いで酵素基
質が加えられる。本発明においては、可溶性基質を用い
て、溶液中で検出可能なシグナルを生じさせることが好
ましい。これは、多数のサンプルの取扱いおよび処理を
容易かつ簡単にし、また、抗体産生の評価を可能にする
ので、前記のような絶対的定量が必要でないために好ま
しく、所望により定性的または半定量的結果を得ること
ができる。便利のために基質を選択して分光光度法で検
出可能なシグナルを生成させることができ、これは例え
ば標準的ELISAプレートリーダーを用いて、吸光度によ
り簡単に読み取ることができる。実に、標準的ELISA試
薬を使用でき、これは本発明のアッセイを、臨床実験室
でルーチンに採用される現存の方法および技術と比較可
能にするという利点を有する。しかしながら、他の検出
／シグナル生成システムを使用して、蛍光、化学ルミネ
ッセンスなどで検出可能なシグナルを生じさせることが
できる。

また、免疫酵素的増幅方法を用いて、例えばSigmaか
ら入手可能なExtravidinシステムなどのようなアビジン
−ビオチン方法を用いて、シグナルを改善し、かつ感度
を上昇させることもできる。ビオチニル化第二抗体は、
パーオキシダーゼアビジン複合体と組み合わせてELISA
試薬として使用できる。１分子のアビジンは数個のビオ
チン分子と結合可能なので、アビジン−ビオチンパーオ
キシダーゼ複合体の使用は、パーオキシダーゼ分子の表
面濃度を増大させ、本方法によりいっそう高い感度を与
える。

細胞インキュベーション（接触）工程および抗体結合
検出工程に必要な材料および手段はまた、結合パートナ
ーが塗布された固体相と一緒に、便利にはキット形態に
おいても適用できる。本発明の方法から得られた情報
は、他のアッセイ方法を用いることにより補足すること
ができる。既存の血清／プラズマ抗体に関する付加的お
よび有用なデータは、古典的ELISA試験において得るこ
とができる。加えて、血液サンプルからリンパ球を分離
した後にこれを行う場合は、残りのプラズマ液体は、本
発明のアッセイ方法に用いたのと同じ結合パートナーが
塗布された固体相を用いて、既存の抗体の検出に使用す
ることができる。

本発明のアッセイ方法が確実に実用的であることを保
証するために、適切なコントロールを含めることができ
る。第一に、タンパク質合成がブロックされたウェルと
ブロックされないウェルとの比較は、本発明が試験細胞
による急性タンパク質産生を記録するのであって、単に
末梢血からの既存の抗体を記録しているのではないこと
を保証する。サンプルとして精製リンパ球調製物を用い
る場合、これは、リンパ球サンプル中の末梢血から捕獲
された痕跡量の抗体が試験を傷つけないことを保証す
る。第二に、ブロックされたウェルとブロックされない
ウェルとの間の記録された差が、特異的におよび非特異
的に（傍観者で）活性化されたリンパ球によるものでは
ないことを確認するために、陰性コントロールが使用さ
れる。この抗原は、患者の急性疾患の原因とは最もなり
そうにない感染性物質、例えば破傷風トキソイドからの
抗原であろう。このような傍観者活性化リンパ球の数
は、いずれの場合にも全ての状況において、本発明の方
法を用いた陽性試験結果のために要求されるよりもずっ
と少ないであろう。本発明の意図はこの点を考慮に入れ
ている。

上記のように、その容易さ、操作のスピードおよび簡
単さのために、本発明のアッセイは、診断的または他の
臨床的用途あるいは動物学的用途、例えば魚の養殖に役
立つ。小さいサンプル体積に加えて、もう一つの利点
は、従来のほとんどの血清学的試験において必要である
ような、２〜３週間の間隔で採取された血清のペアより
はむしろ、ただ一つのサンプルを必要とすることであ
る。精巧な装置は必要でなく、アッセイは容易に自動化
することができる。加えて、必要ならば異なった免疫グ
ロブリンアイソタイプについて容易に試験することがで
きる。

本発明の前記アッセイ方法は、特定の抗原に対して特
異的な抗体の自発的発現を分析することにより、進行中
の感染の存在または程度を評価するための方法を提供す
る。このような方法は、疾患の状態（これは既知であ
り、かつこの状態に対して適切な免疫原に関する抗原を
利用できる）を評価するために適用できることが明らか
であり、従って感染の特異的マーカーを提供する。しか
しながら、ある臨床的状況においては、特定の疾患また
は感染は同定されないことがあり、そして／またはアッ
セイに使用するのに適切な抗原が入手できないことがあ
る。このような場合、アッセイを改変して、感染の非特
異的インディケーターの存在または程度を評価してもよ
い。従って例えば、リンパ球含有サンプル、例えば全血
液、あるいはそれからの精製または濃化リンパ球調製物
を、これらサンプルが感染マーカー、例えばサイトカイ
ンまたはインターフェロン、例えばインターフェロン−
γを産生することについて検査してもよい。

従って、もう一つの観点からみて、本発明は、血液サ
ンプル中の非特異的感染インディケーターの存在を検出
する方法を提供し、この方法は、タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下におい
て、血液サンプルのアリコート、または所望により該サ
ンプルから直接単離されたリンパ球のアリコートを、リ
ンパ球による感染インディケーターの産生および分泌を
許容する条件下で固体相と接触させ、固体相上での結合パートナーへの感染インディケータ
ーの結合を溶液中で検出し、そしてタンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下におけ
る該感染インディケーター結合を比較し、これにより該
サンプル中の感染インディケーターの量の測定値を得る
ことからなる。

この方法を実施するために、固体相には適切な捕獲分
子、例えば検出のための感染インディケーターに対する
抗体を備えることができる。固体相上に固定化された該
感染インディケーターを検出するために、例えば標識さ
れた抗体またはリガンドを用いて、前記の方法を使用す
ることができる。この方法において、固定化部分または
検出分子を適切に選択することにより、特異的マーカー
を同定できる。すなわち例えば、サンプル中の全てのタ
ンパク質を固体相上に固定化することができ、そして標
識された特異的抗体またはリガンドを用いて検出を行う
ことができる。あるいは、特異的結合パートナーを用い
て、関連する感染インディケーターを固定化してもよ
く、これを次いで陽性または陰性に適切に標識すること
ができ、例えば前者の場合は、感染インディケーター上
に存在するが、その分子を除いたドメインに結合させる
ことによるか、あるいは二番目は、固体相上に結合して
いない結合パートナーを標識することによる。この方法
を実施するためのキットもまた、本発明の一部を形成す
る。

以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに詳
細に説明する。実施例において、本発明のアッセイ方法
は、プラズマキュート（Plasmacute）アッセイと呼ばれ
る。

実施例１一般的手順細胞：不活化インフルエンザワクチンを与えたボランテ
ィアから、ワクチン接種後の様々な時点で採取したヘパ
リン処理血液。血液を同体積のPBSと混合する。Lymphop
rep（Nyegaaed ＆ Co.,Oslo）によりリンパ球を分離す
る。細胞をPBS中で２回洗浄し、20％のFCS、2mMのＬ−
グルタミン、100IU/mlのペニシリンおよび100μg/mlの
ストレプトマイシン（Pen＋Strep）を補充したダルベッ
コ改変イーグル培地＝MEDIUM中に再懸濁させる（希釈
液）。

STOP溶液:10％のナトリウムアジドを含有するPBS中で調
製した1mg/mlのシクロヘキシミド。

ELISAおよびインフルエンザ抗原：インフルエンザワク
チン中の三つのウイルス株からの精製表面抗原が臨床的
トライアルに用いられる。ここでは短縮してH3N2、H1N1
およびＢと称する。

ELISAプレート:Greiner EIAプレート655001 F−形、ま
たはCostar EIAプレート3590。PBS中の10μg/mlタンパ
ク質溶液を用い、100μl/ウェルで４℃にて一夜塗布す
る。MEDIUMを用いて室温で１時間ブロックする。PBSで
１回洗浄する。

試験：三つのインフルエンザ抗原の各々について平行な
二組において、三重ウェルに、MEDIUM中の細胞懸濁液の
希釈液100μｌを添加する。一組の三重ウェルは、最初
の工程で50mlのSTOP溶液を添加してブロックする。イン
キュベーター内において、空気中５％CO₂で37℃にて様
々な時間インキュベートする。ELISAプレートをPBSで１
回洗浄し、次いでTween 20を0.05％添加した。PBSで２
回洗浄する。50μl/ウェルの適切に希釈したウサギ抗−
ヒトIgパーオキシダーゼ接合物（Sigma）を添加し、室
温で１時間放置する。続いてｏ−フェニレンジアミン
（OPD）基質を用いてプレートを展開し、492nmでの吸光
度を読み取る。

ワクチン接種後11日に採取した血液細胞インキュベーション時間:4時間、０時間＝ブロック
したウェル細胞数 H3N2 H1N1 Ｂ 0/4 hrs 6.6 10⁴ 264/522 199/490 352/527 0/4 hrs 6.610³ 238/290 143/194 331/353 全てのエントリーは、吸光度×1000としての三重ウェ
ルの平均。範囲±10％。

結果:6.6 10⁴＝66,000個の細胞は、４時間のインキュベ
ーションで著しいシグナル増加を与える。吸光度は、H3
N2では98％まで、H1N1では153％まで、Ｂでは50％まで
となる。

これは代表的な実験である。追加の試験は、細胞の一
夜インキュベーションが、ブロックされたウェルとブロ
ックされないウェルとの間で、1000個を越える吸光度に
関して、よりいっそう明確な区別を与えることを示し
た。このシステムはまた、より短いインキュベーション
時間、例えば２〜３時間でもうまくいく。十分の一の細
胞、例えば6.6 10³個の細胞／ウェルでも、常にではな
いが、より明確な区別を与えることができる。

実施例２一般的手順細胞：不活化インフルエンザワクチンを与えたボランテ
ィアからの、ワクチン接種後７日に採取したヘパリン処
理血液。血液を同体積のPBSと混合する。Lymphoprep（N
yegaaed ＆ Co.,Oslo）によりリンパ球を分離する。細
胞をPBS中で２回洗浄し、20％のFCS、2mMのＬ−グルタ
ミン、Pen＋Strep（上記のとおり）を補充したダルベッ
コ改変イーグル培地＝MEDIUM中に再懸濁させる。

試験抗原：インフルエンザワクチン中の三つのウイルス
株からの精製表面抗原が臨床的トライアルに用いられ
る。ここでは短縮してH3N2、H1N1およびＢと称する。

コントロール抗原：破傷風トキソイド（非−アルミニウ
ム吸収;Lederle）。

ELISAプレート:Greiner EIAプレート655001 F−形、ま
たはCostar EIAプレート3590。PBS中の10μg/mlタンパ
ク質溶液を用い、100μl/ウェルで４℃にて一夜塗布す
る（破傷風:10Lf/ml）。MEDIUMを用いて室温で１時間ブ
ロックする。PBSで１回洗浄する。

試験：三つのインフルエンザ抗原の各々と破傷風コント
ロール抗原について平行な二組において、三重ウェル
に、MEDIUM中の細胞懸濁液の希釈液100μｌを添加す
る。一組の三重ウェルは、最初の工程で50μｌのSTOP溶
液を添加してブロックする。インキュベーター内におい
て、空気中５％CO₂で37℃にて３時間インキュベートす
る。インキュベーションの後、ELISAプレートをPBSで１
回洗浄し、次いでTween 20を0.05％添加したPBSで２回
洗浄する。適切に希釈したウサギ抗−ヒト Igパーオキ
シダーゼ接合物（Sigma）を50μl/ウェルで添加し、室
温で１時間放置する。続いてｏ−フェニレンジアミン
（OPD;Sigma）基質を用いてプレートを展開し、492nmで
の吸光度を読み取る。［この試験は、１時間のExtravid
in/パーオキシダーゼ工程（Sigma）の使用による基質の
前の追加工程によって改変して、感度を上昇させること
ができる。これは、パーオキシダーゼ接合物（Sigma）
の代わりにビオチン化接合物の使用を必要とする。］代表的実験結果（extravidinなし）：ワクチン接種後７日（被験者２人；＃１および＃２）細胞インキュベーション時間:3時間、０時間＝ブロック
したウェル細胞数 H3N2 H1N1 Ｂ破傷風 0/3 hrs 10⁵ ＃１ 063/410 055/269 206/258 046/050 ＃２ 045/077 048/242 182/207 040/046 全てのエントリーは、吸光度としての三重ウェルの平
均×1000。範囲±16％。

被験者は十代（16才）である。若者がA/H1N1インフル
エンザワクチンに特によく応答することは公知である。
これは上記において明確に認められ、両方の被験者＃１
および＃２がよく応答している。しかしながら、ワクチ
ン接種者は通常、様々なワクチン成分に異なる応答をす
るので、吸光度増加の差が予期されねばならない。これ
は、ここで被験者＃１がＢウイルスに対して劣った応答
を示したが、被験者＃２がH1N1ウイルスにのみ著しく応
答した場合に示される。期待したとおり、どの被験者も
破傷風トキソイドには応答しなかった。しかしながら、
細胞がトキソイドによりインビトロで数日間の時間、刺
激されていたならば、それらの免疫学的な初期記憶（幼
児期のワクチン接種による）が、結果として破傷風抗体
を産生させたかもしれない。実際の感染の場合に本発明
を用いて診断実験室でアッセイすると、一の試験物質／
抗原のみが陽性シグナルを与えるであろう。

実施例３一般的手順細胞：不活化サブユニットインフルエンザワクチンを与
えた成人（24才の男性）および子供（３才の男児）から
の、ワクチン接種後６日に採取したヘパリン処理血液。
リンパ球は実施例１および２に記載したように分離され
た。実施例１および２に記載したように、抗原H3N2、H1
N2およびＢを担持した固体相とともに、細胞を37℃で３
時間インキュベートし、試験を記載したように展開した
（この実験では、STOP溶液またはコントロール抗原は使
用しなかった）。

表１は、２人の固体からの結果を示す。表中、各抗原
についての読み取り値は、吸光度×1000としての三重ウ
ェルの平均である。

これらの結果は、以前のインフルエンザエピソードで
あるA/H3N2感染を１回だけ有する小さな小児が、３価ワ
クチン中のA/H3N2成分に対して非常に強い免疫応答を与
えたことを示している。この小児については期待された
とおり、H1N2およびＢ成分に対する応答はなかった。こ
のような小さな小児達には、充分な免疫応答を与えるの
に、通常、数週間の間隔をおいた２回のワクチン投与を
必要とする。約７μｌ体積の全血液に対応する約70,000
個のリンパ球は、陽性の結果を得るのに充分であった。
複数回のインフルエンザエピソードを有する成人被験者
については、ワクチンの三成分全てに対して応答は激し
いほどではないが、それにもかかわらず、程度は異なる
ものの有意であった。Ｂ−成分については、陽性応答を
得るのに100,000個のリンパ球が必要であったが、二つ
のＡ−成分には、同様に100,000個、好ましくは200,000
個の細胞が必要であった。

実験4:古典的およびPharmacuteアッセイ方法による単純
疱疹タイプ２の検出一般的手順細胞培養および血清学的分析陰部疱疹ウイルス感染を示唆する症状を呈している５
人の患者の性器からの材料を、ルーチン組織培養手法に
付し、ウイルスの複製を検体から検出しようと試みた
（Virus Laboratory,Haukeland University Hospital,B
ergenで実施）。同じ研究室では、HSVを含有する市販の
ELISAキット（Behringer,GermanyからのBehringer Enzy
gnost）を用いた血清サンプルのルーチンの血清学的分
析を行い、IgGおよびIgMを検出した。

リンパ球の分離病院サンプルと同時に採取した、陰部疱疹ウイルス感
染を示唆する症状を呈している５人の患者からのヘパリ
ン処理血液をlymphoprep（Nycomed）密度勾配遠心分離
することにより、リンパ球を単離した。細胞をPBS中で
３回洗浄し、20％のFCS、1mMのＬ−グルタミン、50IU/m
lのペニシリンおよび50μg/mlのストレプトマイシンを
含有するDMEMの培養培地（DMEM/FCS）中に再懸濁させ
た。生育可能な細胞を、トリパンブルー排除（0.2％）
により計数した。

Behringer Enzygnost 抗−HSV IgMおよびIgG ELISAを
用いたPlasmacuteアッセイ Behringer Enzygnost 抗−HSV IgMおよびIgGは、HSV
に感染した永久サル腎臓細胞に由来する抗原で塗布され
た８個のウェル、および未感染細胞からのコントロール
抗原で塗布された８個のウェルを含むストリップとして
供給される。200μl/ウェルのDMEM/FCSを用い、５％CO₂
中で37℃にて１時間、ストリップをブロックした。リン
パ球の適切な希釈液をウェル当たり100μｌ添加し、５
％CO₂中で37℃にて３時間インキュベートした。これ以
後の全ての手順は、キット供給者の指示に厳密に従っ
た。同じ供給者により供給された接合物、試薬および緩
衝液を用いてプレートを展開した。テトラメチルベンジ
ジン塩酸塩（TMB）基質は、入手可能なTitertek Multis
kan MCC/340プレートリーダー（Flow Laboratories）を
用いて450nmで光学密度（OD）を読み取る必要があっ
た。

Bioelisa HSV−2 IgGを用いたPlasmacuteアッセイ Bioelisa IgG HSV−2 ELISA（BIOKIT,Spain）は、不
活性化HSV−２抗原で塗布された８個のウェルを含むス
トリップとして供給される。200μl/ウェルのDMEM/FCS
を用い、５％CO₂中で37℃にて１時間、ストリップをブ
ロックした。リンパ球の適切な希釈液をウェル当たり10
0μｌ添加し、５％CO₂中で37℃にて３時間インキュベー
トした。これ以後の全ての手順は、キット供給者の指示
に厳密に従った。同じ供給者により供給された接合物、
試薬および緩衝液を用いてプレートを展開した。テトラ
メチルベンジジン塩酸塩（TMB）基質は、入手可能なTit
ertek Multiskan MCC/340プレートリーダー（Flow Labo
ratories）を用いて450nmで光学密度（OD）を読み取る
必要があった。

Bioelisa HSV IgM（immunocapture）アッセイを用いたP
lasmacuteアッセイ Bioelisa HSV IgM（Immunocapture）アッセイ（BIOKI
T,Spain）は、ウサギ抗−ヒトIgM抗体で塗布された８個
のウェルを含むストリップとして供給される。200μl/
ウェルのDMEM/FCSを用い、５％CO₂中で37℃にて１時
間、ストリップをブロックした。リンパ球の適切な希釈
液をウェル当たり100μｌ添加し、５％CO₂中で37℃にて
３時間インキュベートした。全ての手順は、キット供給
者の指示に厳密に従った。詳しくは、100μl/ウェルのH
SV抗原で標識されたホースラディッシュパーオキシダー
ゼ（ヒト繊維芽細胞中でインビトロにて増殖させた、精
製および不活性化HSV）、および非特異的反応を最小限
にするための未標識コントロール抗原を用いて、結合し
た抗体を検出し、この未標識コントロール抗原は、未感
染細胞成分（キットにて供給される）、ストリップ当た
り10μｌのHSV抗原および10μｌのコントロール抗原か
らなる。プレートは、Titertek Multiskan MCC/340プレ
ートリーダー（Flow Laboratories）で450nmにて読み取
られた。

実験結果を表２に示す。

表２には、患者１〜５のデータがまとめられている。
Haukeland University Hospitalの診断実験室では、臨
床検体からウイルスを単離しようと試み、また、Behrin
ger Enzygnost ELISAキットを用いた血清IgGおよびIgM
についてのルーチンELISA試験も行われた。単離された
ウイルスの型が述べられ、−veは陰性単離を意味する。
血清ELISAカットオフ値はキット製造業者により定義さ
れ；＋＝OD＞0.2であり、ボーダーライン＝OD 0.1〜0.2
であり、アッセイ製造業者によって不明確な結果と定義
され；−−＝OD＜0.1である。

我々は、PlasmacuteアッセイのためにOD＞0.2を陽性
として用い、このような応答を与えるのに必要なリンパ
球の数を表に示した。

Bioelisa IgG試験のみがHSV2抗体の同定を要求する
が、他のものはHSV（１および／または２）感染を示す
であろう。

結果患者１は初回HSV−２感染の臨床的症状を有した。病
院試験では臨床サンプルからウイルスを単離することが
できず、標準的ELISAアッセイによりIgGは見出されなか
った。ボーダーライン血清IgG抗体が標準的病院ELISA試
験により見出された。これらの結果の確認として、Plas
macuteアッセイでは、どの細胞もIgM抗体を産生しない
ことが見出された。Behringer IgGおよびBehringer IgM
Plasmacuteアッセイの両方は、HSVに対するIgG抗体を
産生する細胞を検出した。Behringer Plasmacuteアッセ
イでカットオフ吸光度を与えるのに205,000個のリンパ
球が必要であり、Bioelisa IgGでカットオフ吸光度を与
えるのに103,000個のリンパ球が必要であった。

患者２は初回感染中であり、これはHSV型−１として
単離されたウイルスによって確認された。病院実験室で
は、どの血清IgGも検出されなかったが、IgG抗体が検出
された。Plasmacuteアッセイでは、IgMを産生する細胞
は検出されなかったが、BehringerおよびBioelisa Plas
macuteアッセイの両方はIgG産生細胞を検出し、それぞ
れ223,000および111,000個の細胞が必要であった。

患者３は回帰HSV−２感染を有し、これは臨床検体か
らHSV−２を単離することにより確認された。臨床的症
状の発生後２日目に採取した血清サンプル中にIgGが存
在したが、この時点で血清IgMは検出されなかった。Pla
smacuteアッセイでは、臨床的症状の発生後２日目にIgM
は検出されなかったが、BehringerおよびBioelisa Plas
macuteアッセイの両方はIgG産生細胞を検出した（48,00
0〜96,000個の細胞が必要）。IgM血清抗体は、病院で臨
床的症状の発生後20日目に採取した血清サンプル中で検
出された。Plasmacute Behringer IgMアッセイでカット
オフ吸光度を与えるのに182,000個のリンパ球が必要で
あったが、Bioelisa IgM Plasmacuteアッセイでは細胞
が検出されなかった。

患者４は初回HSV感染を有した。病院実験室に送った
臨床サンプル中にはウイルスは検出されなかった。ボー
ダーライン血清IgM抗体が検出され、陽性レベルの血清I
gG抗体が見出された。IgMおよびIgG抗体の両方が、Behr
ingerおよびBioelisaキットの両方を用いたPlasmacute
アッセイで、臨床的症状の発生後５日目および19日目
（Behringer IgMは検出されず）に採取した血液サンプ
ル中に検出された。Plasmacuteアッセイにおいて、Bioe
lisa IgMアッセイには8,000個未満の細胞が必要であ
り、Behringer IgMには60,500個の細胞であった。両方
とも、100μｌ未満のヘパリン処理血液が必要であろ
う。

患者５は初回HSV感染の疑いがあった。しかしなが
ら、実験室ではウイルスが単離されず、かつ血清抗体は
検出されなかった。Plasmacuteアッセイでは、HSVに対
するIgGまたはIgMを産生する細胞は検出されなかった。

検討 Plasmacuteアッセイは、初回および回帰ヘルペスウイ
ルス感染の両方に対して有効であることが実証された。
全ての場合に、Plasmacuteアッセイは、ここで用いた伝
統的なELISA手法と少なくとも同等によい性能を示し
た。特に、患者１については、臨床サンプルからウイル
スが単離されず、病院のルーチンアッセイでボーダーラ
イン陽性（すなわち、決定的でない）を記録したにすぎ
なかったけれども、Plasmacuteアッセイ（Bioelisa IgG
およびBehringer IgG）は、それぞれ約100,000個の細胞
および200,000個の細胞が疑いのない陽性結果を与えた
ことを示した。この患者は二重感染（HSV1およびHSV2）
の可能性があり、そのうちHSV1だけが、ウイルス単離に
よりその場から回収された。しかしながら、陽性HSV2結
果（Bioelisa IgG）が血清学的交叉反応により生じたこ
とを無視することはできない。ウイルスが単離されなか
った患者４からの、二つの時間的間隔を開けたサンプル
については、Plasmacuteアッセイは、ヘルペス特異的Ig
M−およびIgG−産生リンパ球の数が、感染の早期相から
後期相にかけてシフトしたことを示し、これは、初回感
染後に起こる公知の動力学とよく調和し、能動免疫応答
の明らかな確証であった。Bioelisa IgM Plasmacute試
験は、二つのサンプルのうち最初のサンプル中で陽性シ
グナルを与えるのに8,000個未満のリンパ球を必要とし
たので、特に高感度であった。

我々は、この実験において、Plasmacute方法が男性の
ウイルス感染の臨床ケースに対して有効であることを示
した。

実験5:複数のディスク−IgA、IgGおよびIgM抗体に特異
的な捕獲抗体でのニトロセルロースディスクの塗布この実験は、複数のディスクシステムをPlasmacuteア
ッセイに使用して特異性の異なる抗体を検出できるかど
うかを証明するために行われた。

一般的手順２人の健康な成人被験者から、ヘパリン処理全血液サ
ンプルを採取した。これらの被験者はどの感染について
も急性相になかったので、IgA、IgGおよびIgM自発的抗
体産生を、それらの（未知の）抗原特異性とは無関係に
分析することをめざした。

患者１は、三つの異なる抗原で塗布されたディスクを
用いたシステムを、Plasmacuteアッセイにおいて単一ウ
ェル中で使用できるかどうかを証明するために用いられ
た。一つのウェル（No.1）。

患者２は、同じ抗原で塗布された多数のディスクの存
在下において、シグナルが弱まるかどうかを証明するた
めに用いられた。Plasmacuteアッセイにおける三つの別
個のウェル（ウェルNo.2、３および４）。

リンパ球の分離ヘパリン処理血液をlymphoprep（Nycomed）密度勾配
遠心分離することにより、リンパ球を単離した。細胞を
PBS中で３回洗浄し、20％のFCS、1mMのＬ−グルタミ
ン、50IU/mlのペニシリンおよび50μg/mlのストレプト
マイシンを含有するDMEMの培養培地（DMEM/FCS）中に再
懸濁させた。生育可能な細胞を、トリパンブルー排除
（0.2％）により計数した。

固体相としてのディスクを用いたPlasmacuteアッセイ８μＭの孔径を有するセルロースの混合エステルのデ
ィスク（Millipore SCWP 013 00）を、PBSアジド中に希
釈された（0.001％）、ヤギ抗−ヒトクラス特異的抗体
（Sigma,anti−IgG I−3382;anti−IgA I−0884;anti−
IgM I−0759）を用いて、室温にて一夜塗布した。DMEM/
FCSを用い、５％CO₂中で37℃にて１時間、ディスクをブ
ロックした。0.4μＭの孔径を有する12mmの透明な移動
ウェル（Costar 3460）にリンパ球を添加し、その下に
ディスクを置き、５％CO₂中で37℃にて３時間インキュ
ベートした。個々のディスクを24ウェルプレート（Cost
ar）の別個のウェルに移し、PBSで３回およびPBS Tween
（0.05％）で３回洗浄した。DMEM/FCS中に希釈された20
0μl/ウェルのヤギ抗−ヒトクラス特異的パーオキシダ
ーゼ接合抗体（Sigma IgG A−6029,IgA A−4165,IgM A
−4290）を用いて、結合した抗体を検出し、室温で２時
間インキュベートした。前記のようにディスクを洗浄し
て結合しなかった抗体を除去し、0.05Mの燐酸クエン酸
緩衝液（pH5.0）中のｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
（OPD）（Sigma P−7288）を200μl/ウェルで用いて展
開した。基質添加の30分後に、1M H₂SO₄を100μl/ウェ
ルで用いて展開を停止させた。ウェル当たり100μｌを9
6ウェルELISAプレート（Greiner EIAプレート655001 F
−形）に移し、Titertek Multiskan MCC/340プレートリ
ーダー（Flow Laboratories）を用いて492nmでODを読み
取った。

実験結果を表３に示す。表中、各捕獲抗体についての
読み取り値は、吸光度×1000としての三重ウェルの平均
である。

ウェル１は２百万個のリンパ球を含有し、ウェル２〜
４は百万個のリンパ球を含有していた。「細胞」という
表示は、どのディスク番号が細胞レイヤーの最も近くに
位置していたかを示すためである。

結果：被験者１を用いた試験は、リンパ球を含有するウェル
において９個ものディスクを容易に使用できたことを示
した。三つのIgGディスク、三つのIgAディスクおよび三
つのIgMディスクに対する応答は、全ての実際的な目的
のために各試験について同一であり、従って、抗体分泌
リンパ球に対するディスクの実際の位置は臨界的でない
ことを示した。患者２からのリンパ球を用いた試験は、
少なくとも８個の同じく塗布されたウェルを一つのリン
パ球含有ウェル中に置いて、実際上同一の読み取り値を
得ることができたことを示した。従って、本発明は、一
つのウェル中で同じリンパ球調製物について複数回アッ
セイすることを可能にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−70761（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＶｏｌ．76，（1985）ｐ．365−373 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）タンパク質合成阻害剤の存在下およ
び非存在下において、血液サンプルのアリコート、また
は所望により該サンプルから直接単離されたリンパ球の
アリコートを、リンパ球による抗体の産生および分泌を
許容する条件下で固体相と接触させ、ｂ）固体相上での該抗原（１以上）への抗体結合を溶
液中で検出し、そしてｃ）タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下に
おける該抗体結合を比較し、これにより上記抗原（１以
上）に応答した能動抗体分泌の量の測定値を得ることか
らなる、血液サンプル中で標的抗原に応答した能動抗体産生を検
出する方法。
【請求項２】前記固体相が、検出すべき１以上の抗体に
より認識される１以上の抗原を担持している、請求項１
に記載の方法。
【請求項３】前記固体相が、検出すべき１以上の抗体を
認識する１以上の抗体を担持している、請求項１に記載
の方法。
【請求項４】前記方法に用いられる前記血液サンプルま
たは前記方法に用いられるリンパ球を調製するための前
記血液サンプルが、1ml未満の体積を有する、請求項１
〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記方法が、新たに合成された抗体と受動
移入した母性抗体とを区別するために新生児または乳児
の血液サンプルにおいて行われる、請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。
【請求項６】前記血液サンプルが、患者から直接採取し
た血液の精製または濃化手法により得られる、請求項１
〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記サンプルから直接単離したリンパ球
が、前記方法に用いられる、請求項１〜６のいずれかに
記載の方法。
【請求項８】請求項１の接触工程の前に、前記固体相が
ブロックされる、請求項１〜７のいずれかに記載の方
法。
【請求項９】タンパク質合成阻害剤が、50〜500μg/ml
の濃度で用いられるシクロヘキシミドである、請求項１
〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】タンパク質合成阻害剤と組み合わせて、
アデノシントリホスファターゼ（ATPase）阻害剤が用い
られる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】請求項１の検出工程が、免疫アッセイに
より行われる、請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】免疫アッセイがELISAである、請求項11
に記載の方法。
【請求項１３】前記固体相上に固定化された、検出すべ
き１以上の抗体により認識される１以上の抗原が、前記
固体相と接触させられる、請求項３〜12のいずれかに記
載の方法。
【請求項１４】前記固体相上に固定化された１以上の抗
体を認識する１以上の抗体が、前記固体相と接触させら
れる、請求項２および４〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】請求項１の検出工程のために可溶性基質
が用いられ、その可溶性基質が分光光度法により検出可
能なシグナルを生じさせる、請求項１〜14のいずれかに
記載の方法。
【請求項１６】陰性コントロール抗原が用いられる、請
求項１〜15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】ヘルペスウイルスに対する能動抗体産生
が検出される、請求項１〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】各々が異なった標的抗原を担持している
複数の固体相が用いられる、請求項２および４〜17のい
ずれかに記載の方法。
【請求項１９】タンパク質合成阻害剤の存在下および非
存在下において、血液サンプルのアリコート、または所
望により該サンプルから直接単離されたリンパ球のアリ
コートを、リンパ球による感染インディケーターの産生
および分泌を許容する条件下で固体相と接触させ、固体相上での結合パートナーへの感染インディケーター
の結合を溶液中で検出し、そしてタンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における
該感染インディケーター結合を比較し、これにより該サ
ンプル中の感染インディケーターの量の測定値を得るこ
とからなる、血液サンプル中の非特異的感染インディケーターの存在
を検出する方法。