CZ289582B6 - Způsob pro detekování aktivní produkce protilátek - Google Patents

Abstract

Zp sob pro detekov n aktivn produkce protil tek v odpov di na c lov² antigen v krevn m vzorku spo v v tom, e se a) kontaktuje v p° tomnosti a za absence inhibitoru proteinov synt zy aliquot uveden ho vzorku, nebo pop° pad lymfocyt p° mo izolovan²ch z uveden ho vzorku, s pevnou f z s vazebn²m partnerem pro imobilizaci protil tky za podm nek, kter umo uj produkci protil tek a jejich sekreci lymfocyty; b) detekuje se vazba protil tky na uveden² antigen(y) na pevn f zi v roztoku; a c) srovn v se vazba uveden protil tky v p° tomnosti nebo za absence inhibitoru proteinov synt zy, m se stanov mno stv aktivn sekrece protil tky v odpov di na uveden² antigen(y).\

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu pro detekování aktivní produkce protilátek a zejména po detekci aktivní syntézy protilátek v krevních vzorcích v odpovědi na infekci nebo na vakcinaci atd., prostřednictvím modifikovaného enzymově vázaného imunosorbentního testu (ELISA).

Dosavadní stav techniky

ELISA je dlouho používána pro detekci a měření protilátek (nebo antigenů). Nejčastěji je ELISA používána jako serologický test, ale je také používána pro studium imunochemických vlastností antigenů nebo protilátek, a často nachází uplatnění v, například, hodnocení a charakterizaci imunitních odpovědí, pro zkoumání produkce protilátek v buněčných kulturách, v hybridomní technologii, atd.

Díky své senzitivitě, jednoduchosti a snadnosti a rychlosti výkonu byla tato technika široce přijata jako diagnostický prostředek a je nyní rutinně používána v klinických laboratořích pro detekci protilátek k infekčním agens v séru nebo plasmě, po infekci nebo po vakcinaci. Tak například, mnoho testů na HIV infekci v závislosti na detekci protilátek k viru v plasmě nebo séru pacientů využívá běžného ELISA testu.

Nicméně, protože takový jednoduchý serologický ELISA test pouze měří přítomnost cílové protilátky ve vzorku, nemůže rozlišit mezi nastupující syntézou protilátek v odpovědi na antigen a protilátkami již přítomnými od minulé infekce, nebo od pasivního přenosu atd. Ačkoliv v některých případech může být dostačující získat prostou informaci o přítomnosti protilátek, v jiných případech je žádoucí určit, zda je detekovaná cílová protilátka akutně syntetizována lymfocyty v době testování či nikoliv, například během vakcinace nebo v diagnostice infekce u dětí rozlišit ji od pasivně přenesených protilátek matky. Tohoto nemůže být dosaženo klasickou ELISA metodou.

Byly proto vyvinuty jiné metody, které umožňují detekci nastupující syntézy protilátek. V tomto směru může být uveden enzymově vázaný imunospot (ELISPOT) test (také známý jako spot ELISA nebo ELISA-plaque test), jak jej popisuje například Czerkinsky et al., v ELISA and other Solid Phase Immunoassays, Ed. D. M. Kenneny and S. J. Challacombe, 1988, kapitola 10, 217 - 239. Tato technika, založená na ELISA metodě, umožňuje počítání lymfocytů secemujících protilátky proti jednomu nebo více cílovým antigenům. Stručně, ELISPOT je variantou ELISA metody, kde mohou být protilátky secemující buňky (ASC) odhaleny kultivací lymfocytů ve speciálních modifikovaných ELISA jamkách potažených cílovým antigenem a nahrazením standardních ELISA reagens komplexem enzym-substrát, který dává barevný precipitát (skvrny) okolo secemujících buněk. Skvrny mohou být počítány za získání počtu protilátku secemujících buněk. Inhibitory proteinové syntézy mohou být obsaženy v kultivačním médiu, pro potvrzení toho, že skvrny jsou detekovány díky aktuální syntéze protilátek v průběhu in vitro inkubační periody.

Zatímco se ELISPOT ukázala jako velmi užitečná ve studiu dynamiky humorální imunitní odpovědi a byla používána pro detekci spontánních ASC, které se přechodně objevují v periferní cirkulaci imunizovaných subjektů, jisté vlastnosti metody jsou na obtíž použití v klinické diagnostice. Za prvé, je nutné počítat každou jednotlivou skvrnu, což je časově náročné a pracné, proto není metoda vhodná pro analýzu většího množství vzorků tak, jak je tomu v klinických diagnostických laboratořích. Za druhé, je počítán a uváděn pouze počet buněk secemujících protilátku, což vyžaduje významně vyšší objemy vzorku, např. několik ml. ELISPOT plotny jsou také nákladné a test nelze snadno přizpůsobit automatizaci.

-1 CZ 289582 B6

Je zde možné vidět, že i přes pokroky v technikách detekce protilátek zde existuje potřeba testu, který je jednoduchý, rychlý a nenákladný pro provedení, který spolehlivě umožní přesnou kvantifikaci spontánně secemovaných protilátek, který je schopen rozlišit de novo syntézu protilátek, a zejména, který může být proveden na krevních vzorcích pro diagnostické účely. Předkládaný vynález se týká této potřeby.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob pro detekování aktivní produkce protilátek v odpovědi na cílový antigen v krevním vzorku, postup spočívá v tom, že se

a) kontaktuje v přítomnosti a za absence inhibitoru proteinové syntézy aliquot uvedeného vzorku, nebo popřípadě lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází s vazebným partnerem pro imobilizaci protilátky za podmínek, které umožňují produkci protilátek a jejich sekreci lymfocyty;

b) detekuje se vazba protilátky na uvedený antigen(y) na pevné fázi v roztoku; a

c) srovnává se vazba uvedené protilátky v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, čímž se stanoví množství aktivní sekrece protilátky v odpovědi na uvedený antigen(y).

Podle jednoho z výhodných provedení pevná fáze nese jeden nebo více antigenů rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, které mají být detekovány.

Podle dalšího z výhodných provedení pevná fáze nese jednu nebo více protilátek, které rozpoznávají protilátku nebo protilátky, které mají být detekovány.

Jak je zde použito, „aktivní produkce protilátek“ označuje spontánně secemované protilátky produkované lymfocyty ve vzorku, které aktivně produkují protilátky v průběhu testu v důsledku aktivního nástupu imunitní odpovědi. Ve všech případech jsou protilátky namířené proti antigenům, které jsou přítomny in vivo a nikoliv in vitro, ani před ani během způsobu testování podle vynálezu.

Jak je zde použito znamená výraz „aktivní sekrece protilátek v odpovědi na uvedený antigen“ to, že aktivně secemované protilátky se vážou na antigen použitý v testu, ačkoliv použitý antigen nebyl imunogen, stimulující imunitní odpovědi na prvním místě. Zatímco oba antigeny použité v testu a imunogen, který stimuloval nebo stimuluje produkci protilátek in vivo se budou vázat na detekované protilátky prostřednictvím stejných nebo velmi podobných epitopů, v jiných ohledech nemusí být antigen a imunogen identické. Antigen použitý ve způsobu podle vynálezu může být materiál obsahující všechny nebo některé části relevantního imunogenu, např. odvozeného od infikovaných jedinců, nebo purifikovaných částic ze stejného nebo podobného materiálu a může být připraven také synteticky, např. chemickou syntézou nebo rekombinantní expresí, s připojením nebo delecí částí vzhledem k nativnímu antigenu. Mohou být použity fuzní proteiny, nebo molekuly exprivující pouze vhodný epitop(y).

Obecně řečeno, způsob podle vynálezu zahrnuje inkubaci lymfocytů z krevního vzorku v kontaktu se vhodným pevným povrchem pro imobilizaci detekovaných protilátek za podmínek, které umožňují produkci a sekreci protilátek lymfocyty, a potom odstranění buněk a detekování vazby protilátek na antigen na pevné fázi. Srovnáním hladiny navázaných protilátek, za přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, může být probíhající syntéza protilátek odlišena a kvantifikována.

-2CZ 289582 B6

Překvapivě, způsob podle vynálezu umožňuje použití malých objemů krevních vzorků (např. μΐ objemů menších než 1 ml), přímo pro detekci spontánní produkce protilátek nestimulovanými lymfocyty, bez předchozího kroku prekultivace lymfocytů před inkubací s pevnou fázi. Jinými slovy, lymfocyty ve vzorku jsou použity přímo v testovacím způsobu podle vynálezu bez jakéhokoliv předcházejícího ošetření nebo stimulace, např. in vitro stimulace antigenem. Tak mohou být detekovány protilátky produkované lymfocyty v době odběru vzorku. Tímto způsobem, i za použití malých objemů vzorku, spontánní nástup syntézy protilátek v odpovědi na testovaný antigen může být výhodně odlišen od okolních aktivací lymfocytů. Také jsou lymfocyty testovány v situaci, kdy spontánně secemují protilátky bez stimulace buněk pro odhalení jakékoliv paměti. Toto je v kontrastu k jiným publikovaným způsobům, které využívají výhody in vitro antigenní stimulace pro zvýšení senzitivity testu. Předkládaný vynález oproti tomu využívá výhody spontánní sekrece protilátek pro umožnění detekce protilátek v krvi, které jsou ukazatelem nástupu infekce testovaným antigenem; plazmatické lymfocyty budou secemovat protilátku proti testovanému antigenů v prvních několika týdnech po infekci, nebo vakcinaci atd. Detekce takových protilátek způsobem podle předkládaného vynálezu umožňuje diagnosu nebo určení infekce, nebo monitorování protilátkové odpovědi na vakcinaci atd. Toto je zejména užitečné u dětí a u novorozenců, kde je důležité odlišit nově vytvářené protilátky od pasivně přenesených mateřských protilátek. Stejný vzorek krve může být analyzován na protilátky proti několika odlišným infekčním agens buď v separátním testu, nebo ve stejném testu za použití mnohočetných relevantních antigenů. Tak umožňuje použití relevantních kontaktních antigenů podle klinického syndromu, který se u pacienta projevuje. V diagnostice infekcí je také důležité být schopen rozlišit mezi nástupem syntézy protilátek a mezi protilátkami již existujícími od dřívější infekce. Vyvolání imunologické paměti antigenní stimulací in vitro není slučitelné s testem zaměřeným na nástup akutní infekce a proto předchozí metody založené na antigenní stimulaci nenesou tuto výhodu. Také, zahrnutí kroku antigenní stimulace bude nepříznivě ovlivňovat výhodný časový faktor testu podle předkládaného vynálezu, jehož provedení je velmi rychlé ve srovnání s předchozími v oboru známými způsoby.

Antigeny, ke kterým jsou protilátky pro detekci podle způsobu podle předkládaného vynálezu namířeny, zahrnují jak bakteriální, tak virové antigeny. Klinicky významné antigeny zahrnují, ale nejsou omezeny na, například antigeny Herpes Simplex viru, Cytomegaloviru, viru lidské imunodeficience (HIV) a virů hepatitidy. Detekce takových může být použita pro rychlé stanovení toho, zdaje pacient infikován např. pro účely skríningu krve nebo pro stanovení a/nebo monitorování infekce. Způsob je zejména užitečný vzhledem ke své jednoduchosti a může být použit tam, kde laboratorní vybavení není dostupné, např. v polních podmínkách.

Jak je zde použito, termín „detekování“ a „určení množství“ znamenají jak kvantitativní, tak kvalitativní zhodnocení hladiny produkce protilátek, ve smyslu získání absolutní hodnoty množství protilátek produkovaných ve vzorku a také index, poměr, procento nebo podobný ukazatel produkce protilátek, stejně jako semikvantitativní nebo kvalitativní zhodnocení.

Hlavní výhodou předkládaného vynálezu je potřeba pouze malého objemu vzorku, např. 50 - 500 μΐ, lépe 100 - 300 μΐ a běžně 100 - 200 μΐ krve nebo krevního produktu ve srovnatelném objemu k plné krvi, oproti klasickým diagnostickým testům, které obyčejně vyžadují objem několika ml séra. Toto je zejména užitečné v případě odběru vzorků od novorozenců, protože způsob podle předkládaného vynálezu vyžaduje objem pouze několik μΐ.

Vzorky krve, obecně vzorky periferní krve, mohou být použity přímo, ačkoliv mohou být nejprve preferovaně izolovány lymfocyty ze vzorku. Toto může být provedeno za použití standardních technik v oboru dobře známých. Tak, například, mohou být běžně použity různé přípravky plné krve, například, heparinizovaná krev, EDTA-krev atd., jak jsou běžně připravovány v klinických laboratořích. Ačkoliv to není zásadní, erytrocyty přítomné ve vzorku mohou být lisovány, např. za použití běžných metod krátkodobou expozicí destilované vodě nebo chloridu amonnému, nebo za použití jiných dobře známých technik hernolýzy. Musí být dáno, že všechny obohacené nebo čištěné přípravky musí obsahovat lymfocyty přítomné v plné krvi, ze které je přípravek odvozen,

-3CZ 289582 B6 aby bylo možné detekovat spontánní produkci protilátek. Pokud je to žádoucí, mohou být lymfocyty separovány, například za použití standardního lymfocytámího separačního média, např. Lymphoprep (Nyegaard Co. Oslo, Norsko), nebo za použití imunomagnetické separace (IMS) nebo podobného na pevné fázi založeného separačního systému nebo jiných běžných technik. V případě IMS nebo podobných separačních technik může být použita pevná fáze, např. magnetické korálky, potažená protilátkou specifickou pro jistou sadu leukocytů pro selektivní separování použitelných lymfocytů. Pokud jsou použity separované lymfocyty, pak mohou být buňky před použitím promyty, za použití standardních technik promytí. Bylo nicméně pozorováno, že extensivní promývání buněk není žádoucí. Kromě toho, pokud není použito rozsáhlé promývání, může být přežívání buněk zlepšeno a způsob může být urychlen.

Vzorek krve, ošetřený jak uvedeno výše, pokud je to žádoucí, nebo separované lymfocyty, jsou potom vhodně uvedeny do kontaktu s pevnou fází nesoucí vhodného vazebného partnera pro imobilizování protilátek nebo protilátky, které mají být detekovány. Běžně je vazebným partnerem testovaný antigen nebo antigeny, rozpoznávaný protilátkou nebo protilátkami, které mají být detekovány.

Podle jednoho dalšího provedení tvoří podstatu vynálezu způsob pro detekování přítomnosti nespecifických ukazatelů infekce ve vzorku krve, postup spočívá v tom, že se:

kontaktuje v přítomnosti a za absence inhibitoru proteinové syntézy, aliquot uvedeného vzorku, nebo popřípadě vzorek lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází za podmínek, které umožňují produkci sekreci ukazatelů infekce lymfocyty;

detekuje se vazba ukazatele infekce na vazebný partner na pevné fázi; a srovnává se vazba uvedeného ukazatele infekce v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, čímž se stanoví množství ukazatele infekce v uvedeném vzorku.

Je možno použít také alternativní vazebné partnery, například protein A, protein G nebo protilátky, které rozpoznávají a vážou protilátku, která má být detekována. V posledním případě vysoce specifická vazba není žádoucí, protože specifičnost je v tomto provedení testovací metody zajištěna následnou vazbou antigenů, které se vážou specificky na protilátky, které mají být detekovány. Tak je ve všech provedeních tvořen komplex antigen-protilátka. Přítomnost takových komplexů na pevném nosiči je zjištěna detekcí způsobem podle předkládaného vynálezu. Pevnou fází může být jakýkoliv z dobře známých nosičů nebo matrice, které jsou nyní běžně používány nebo navrženy pro imobilizaci, separaci atd. Tyto mohou mít formu částic, listů, gelů, membrán nebo mikrotitračních proužků, zkumavek nebo ploten atd. a vhodně mohou být vyrobeny z polymemího materiálu. Nicméně, pro snadnou manipulaci a jednoduchost mohou být použity standardní mikrotitrační plotny a jamky, preferovaně standardní ELIS A plotny.

Pevná fáze může být také modifikována tak, aby umožnila detekci protilátek specifických pro řadu různých antigenů. Tak například, disky nebo proužky atd. ze vhodného materiálu pevné fáze, např. nitrocelulózy a podobně, mohou být potaženy různými antigeny a přidány simultánně do mikrotitrační jamky nebo jiné vhodné nádobky, která neobsahuje žádný kontaktní antigen. Způsob detekce navázaných protilátek může potom být použit pro odlišení mezi různými antigeny. Sady disků, které jsou každý potažen relevantními antigeny pro jisté klinické stavy nebo syndromy mohou být použity pro identifikaci toho, které z podezřelých agens způsobuje infekci. Disky budou potom jednotlivě zpracovány v separátních jamkách. Toto je zejména postup šetřící materiál, protože testy mohou být provedeny pro simultánní testování mnoha různých agens (buď od stejného infekčního agens, nebo od různých agens relevantních pro klinický syndrom nebo stav v určitém případě) za použití stejného malého objemu krve. Alternativním přístupem je použití mnoha vzorků krve v separátních jamkách, která je každá potažena jiným vazebným partnerem, např. antigenem nebo protilátkou, a provedením testu.

-4CZ 289582 B6

Techniky pro vazbu vazebného partnera, např. antigenu, na pevnou fázi, jsou také v oboru velmi dobře známé a jsou rozsáhle popsány v literatuře. Mnoho standardních postupů pro potažení antigenem je popsáno například v ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed. D. M. Kemeny and S. J. Challacombe, John Wiley and sons. Pokud je to žádoucí, mohou být plotny promyty a blokovány, opět za použití standardních technik. Tak například, standardní mikrotitrační plotny, např. ELISA plotny, mohou být jednoduše potaženy vazebným partnerem inkubací přes noc při 4 °C ve vhodném pufru, například fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), obsahujícím vazebný partner, např. v koncentraci 0,01 až 150pg/ml proteinu, po čemž následuje blokování vhodným blokovacím médiem (obecně buněčným kultivačním médiem) a inkubace např. při 37 °C po 1 až 5 hodin. Po odstranění blokovacího roztoku jsou plotny připraveny pro použití.

Nicméně, je vhodné, aby materiály potřebné k provedení způsobu podle předkládaného vynálezu byly poskytnuty ve formě kitu, kde je dodán pevný nosič potažený vazebným partnerem a vhodně blokován.

Jak je uvedeno výše, krok kontaktování obecně vyžaduje inkubaci vzorku nebo separovaných lymfocytů v přítomnosti pevné fáze za podmínek, které umožňují syntézu protilátek a jejich sekreci. Mohou být použity standardní ELISPOT inkubační podmínky, jak je popsal například Czerkinsky et al., 1988 (výše). Obecně, vzorek nebo buňky jsou inkubovány při 37 °C s 5 % CO₂ ve vzduchu, kde médium, ve kterém jsou buňky inkubovány, počítá s CO₂ jako se součástí pufrovacího systému. CO₂ médium může také být použito s pufrovacím systémem HEPES. V tomto případě jsou buňky jednoduše inkubovány při 37 °C, což dále zjednodušuje test a jeho požadavek na laboratorní vybavení. Inkubační doba se může lišit, ale obecně jsou požadovány alespoň 1 - 2 hodiny. Inkubační doba okolo 2-6 hodin, např. 2 až 4 hodiny, může dávat dobré výsledky, ačkoliv delší inkubační doba, např. více než 13 nebo 24 hodin, nebo přes noc, může být také žádoucí. Vhodná média pro inkubaci jsou v oboru dobře známá a zahrnují jakákoliv standardní kultivační média, např. Dulbecco modifikované Eaglovo médium (DMEM) nebo RPMI nebo jiná dobře známá kultivační média užívající HEPES jako CO₂ nezávislý pufrovací systém, obsahující vhodné sérum, např. fetální telecí sérum (FCS) nebo jiné složky, např. glutamin, podle potřeby. Další volitelné složky v médiu mohou zahrnovat antibiotika, např. gentamycin, penicilín, streptomycin, atd., jiné aminokyseliny, růstové faktory atd.

Může být žádoucí ředit suspenzi vzorek/buňka před krokem kontaktování na vhodný rozsah buňka/vzorek. Ředění bude obvykle použito za použití kultivačního média jako ředidla.

Pro odlišení nastupující syntézy protilátek je inkubace provedena za přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy. Tak je před inkubací přidán inhibitor kaliquotní části vzorku/buněk, pro blokování syntézy proteinů, a tedy protilátek a část je inkubována bez inhibitoru. Mohou být použity jakékoliv známé inhibitory syntézy proteinů, např. cykloheximid. Může být použita koncentrace 10 - 5000 pg/ml, např. 50 - 500 pg/ml cykloheximidu.

Také je preferováno, aby byl obsažen inhibitor adenosintrifosfatasy (ATPasy), jakoje azid sodný, nebo jiné podobné inhibitory spolu s inhibitorem proteinové syntézy, aby se rychle a úplně zastavil metabolismus buněk.

Po inkubaci jsou vzorky/buňky odstraněny z pevné fáze. Toto může obecně být provedeno jednoduše promytím za použití vhodného média, např. pufru jako je PBS. Nicméně, bylo shledáno, že extensivní promývání není žádoucí.

Pevná fáze je potom podrobena kroku detekce vazby protilátky. Krok detekce, ve smyslu čtení signálu, probíhá v roztoku. Mohou být použity jakékoliv známé prostředky pro detekování vazby protilátky, podle toho, jaký signál je generován v roztoku; například v závislosti na fluorescenci, chemiluminiscenci, kolorimetrii nebo enzymové reakci k produkování detekovatelného signálu.

-5CZ 289582 B6

Nicméně, je vhodné použít imunotest jako prostředek detekce, preferovaně enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA).

Techniky pro imunotesty, a zejména pro ELISA, jsou dobře známé v oboru a jsou popsané v literatuře (například v ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed. D. M. Kemeny and S. J. Challacombe, John Wiley and sons).

Po odstranění vzorku/buněk může být přidán konjugát enzym - protilátka, například v ELISA detekčním způsobu, který se váže na protilátku navázanou na antigen na pevné fázi. Obdobně, pokud je protilátka, která má být detekována, navázána na pevnou fázi nespecificky, cestou vazebného partnera, například protilátkou proti protilátkám různých druhů, pak může být přidán konjugát enzym - antigen, který se bude specificky vázat na imobilizovanou protilátku, která má být detekována. Potom je přidán substrát pro enzym, aby se mohl vyvinout detekovatelný signál.

V předkládaném vynálezu je vhodně použit solubilní substrát, který dává signál detekovatelný v roztoku. Toto je výhodné, protože to zjednodušuje a usnadňuje manipulaci a zpracování velkého množství vzorků a umožňuje to hodnocení produkce protilátek, ačkoliv, jak je zmíněno výše, absolutní hodnocení kvantity není nezbytné, a pokud je to žádoucí, mohou být získány kvalitativní nebo semikvantitativní výsledky. Výhodně, substrát může být vybrán tak, aby dával spektrofotometricky detekovatelný signál, který může být snadno určen přečtením absorbance, například za použití standardní čtečky ELISA mikroploten. Kromě toho, mohou být použita standardní ELISA reagens, což má tu výhodu, že se test podle předkládaného vynálezu stane kompatibilním s existujícími metodami a technikami rutinně používanými v klinických laboratořích. Nicméně, jiné detekční/signál generující signály mohou být použity, které činí signál detekovatelným za použití fluorescence, chemiluminiscence atd.

Imunoenzymatické amplifikační metody mohou také být použity pro vylepšení signálu nebo pro zvýšení sensitivity, například za použití avidin biotinové metody jako je Extravidin systém dostupný od Sigma. Biotinylované sekundární protilátky jsou použity jako ELISA reagens, v kombinaci s komplexem peroxidáza-avidin. Protože jednak molekula avidinu je schopna vázat několik molekul biotinu, zvyšuje použití avidin-biotin peroxidázového komplexu povrchovou koncentraci peroxidázových molekul, což dává způsobu větší sensitivitu.

Materiály a metody potřebné pro krok inkubace (kontaktování) buněk a pro krok detekce vazby protilátek mohou také být vhodně dodány ve formě kitu s pevnou fází potaženou vazebným partnerem. Informace získaná z testu podle předkládaného vynálezu může být doplněna použitím jiných testovacích metod. Další a užitečná data o pře existujících sérových/plazmatických protilátkách mohou být získána v klasickém ELISA testu. Dále, po separaci lymfocytů z krevního vzorku, pokud je toto provedeno, zbylá plazmatická tekutina může být použita pro detekci již existujících protilátek za použití stejné pevné fáze potažené vazebným partnerem jako je použit v testu podle předkládaného vynálezu.

Pro zjištění toho, zda způsob podle předkládaného vynálezu pracuje spolehlivě může být obsažena vhodná kontrola. Za prvé, srovnání jamek s blokovanou syntézou proteinu a jamek s neblokovanou syntézou proteinů ověří, že vynález je zaměřen na akutní produkci protilátek testovanými buňkami a že není zaměřen pouze na již existující protilátky z periferní krve.

V případě použití purifikovaných lymfocytámích přípravků jako vzorku je zajištěno, že stopové množství stanovované protilátky z periferní krve ve vzorku lymfocytů neovlivní test. Za druhé, pro zajištění toho, aby zaznamenaný rozdíl mezi signály z blokovaných a z neblokovaných jamek nebyl způsoben sporadicky okolními nespecificky aktivovanými lymfocyty, je použit negativní kontrolní antigen. Tento antigen bude od infekčního agens, které s největší pravděpodobností nezpůsobuje akutní onemocnění pacienta, např. tetanický toxoid. Počet takových okolních aktivovaných lymfocytů bude za jakýchkoliv okolností o mnoho nižší než je potřeba pro pozitivní testovací výsledky za použití způsobu podle předkládaného vynálezu. Provedení vynálezu bere tuto skutečnost v úvahu.

-6CZ 289582 B6

Jak bylo zmíněno výše, vzhledem ke snadnosti a rychlosti provedení a jednoduchosti je test podle vynálezu vhodný pro diagnostické nebo jiné klinické nebo veterinární použití, např. při chovu ryb. Kromě malého objemu vzorku je další výhodou to, že je potřeba pouze jeden vzorek a ne vzorky séra odebírané ve 2 až 3 týdenním intervalu, jak je to vyžadováno pro většinu serologických testů. Pracné zpracování není potřebné a test je snadno automatizován. Kromě toho, je možné testovat různé imunoglobulinové izotypy, pokud je to potřeba.

Výše uvedená testovací metoda podle předkládaného vynálezu poskytuje jednu metodu pro hodnocení přítomnosti nebo rozsahu nastupující infekce prostřednictvím analýzy spontánní exprese specifických protilátek k definovanému antigenu. Taková metoda je jednoduše aplikovatelná na hodnocení chorobných stavů, která jsou známá a ke kterým jsou antigeny týkající se relevantních imunogenů dostupné a tak poskytují specifický markér infekce. V některých klinických situacích, nicméně, nemůže být specifická choroba nebo infekce identifikována a/nebo vhodný antigen nemusí být dostupný pro použití v testu. V takovém případě může být test modifikován na hodnocení přítomnosti nebo rozsahu nespecifických ukazatelů infekce. Tak například, lymfocyty obsahující vzorky, např. plná krev nebo její purifikované nebo obohacené lymfocytámí přípravky mohou být vyšetřovány s ohledem na jejich produkci infekčních markérů, např. cytokinů nebo interferonů, například interferonu gamma.

Z tohoto pohledu poskytuje ještě další aspekt vynálezu způsob pro detekci přítomnosti nespecifických ukazatelů infekce ve vzorku krve, kde uvedený způsob obsahuje:

kontaktování v přítomnosti a za absence inhibitoru proteinové syntézy aliquot uvedeného vzorku, nebo lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází za podmínek, které umožňují produkci a sekreci ukazatelů infekce lymfocyty;

detekování v roztoku vazby ukazatele infekce na vazebný partner pevné fáze; a srovnání vazby uvedeného ukazatele infekce v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy pomocí určení množství ukazatele infekce v uvedeném vzorku.

Pro provedení této metody může být pevná fáze poskytnuta s vhodnými zachycovacími molekulami, například protilátkami k ukazatelům infekce po detekci. Pro detekci přítomnosti uvedených ukazatelů infekce imobilizovaných na pevné fázi mohou být použity způsoby jak byly popsány dříve, například použití značených protilátek nebo ligandů. V této metodě mohou být specifické markéry identifikovány vhodnou volbou imobilizující skupiny nebo detekční molekuly. Tak, například, všechny proteiny ve vzorku mohou být imobilizovány na pevném nosiči a detekce může být provedena za použití značené specifické protilátky nebo ligandů. Alternativně, specifický vazebný partner může být použit pro imobilizaci týkající se ukazatelů infekce a může být potom vhodně značen, buď pozitivně, nebo negativně, například v prvním případě vazbou na doménu přítomnou na ukazateli infekce, ale ne výlučně na této molekule, nebo v druhém případě značením nenavázaného vazebného partnera na pevné fázi. Kity pro provedení tohoto způsobu tvoří také část tohoto vynálezu.

Vynález bude nyní popsán podrobněji s odkazem na následující nelimitující příklady, ve kterých je testovací způsob podle předkládaného vynálezu označován jako Plazmacute test.

-7CZ 289582 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Obecný postup

Buňky: Heparinizovaná krev byla odebrána různou dobu po vakcinaci od dobrovolníků, kterým byla podána inaktivovaná vakcína proti chřipce. Krev byla smísena se stejným objemem PBS. Lymfocyty byly separovány s použitím Lymphoprep (Nyegaard and Co., Oslo). Buňky byly promyty dvakrát v PBS, resuspendovány (ředění) v Dulbecco modifikovaném Eaglově médiu doplněném 20% FCS, 2 mM L-glutaminu, 100 IU/ml penicilinem a 100 pg/ml streptomycinem (Pen + Střep) = MEDIUM.

Stop roztok: 1 mg/ml cykloheximidu v PBS obsahujícím 10% azid sodný.

ELISA a chřipkové antigeny: Purifikované povrchové antigeny ze tří kmenů viru v chřipkové vakcíně byly použité v klinickém pokusu a zde jsou označeny krátce H3N2, H1N1 a B.

ELISA plotny: Greiner EIA plotny 655001 F-forma, nebo Costar EIA plotny 3590. Potažené 100 μΐ/jamku roztokem 10 μg/ml proteinu v PBS přes noc při 4 °C. Blokovány v MEDIUM po 1 hodinu při pokojové teplotě. Promyty jedenkrát v PBS.

Test: 100 μΐ ředění buněčné suspense v MEDIUM přidáno do trojích jamek ve dvou paralelních sadách pro každý ze tří chřipkových antigenů. Jedna sada trojích jamek je blokována v počátečním kroku přidáním 50 μΐ STOP roztoku. Jsou inkubovány po různou dobu při 37 °C na vzduchu 5% CO₂. ELISA plotna je promyta jedenkrát PBS, potom dvakrát PBS s 0,05% Tweenem 20. 50 μΐ/jamku vhodně ředěného králičího proti lidského Ig-peroxidáza konjugátu (Sigma) je přidáno a ponecháno při pokojové teplotě po 1 hodinu. Plotna je potom vyvíjena za použití o-fenylendiaminu (OPD) substrátu a je čtena absorbance při 492 nm.

Vzorky odebrané 11 dní po vakcinaci

Doba inkubace buněk: 4 hodiny, 0 hodin = blokované jamky
	Počet buněk	H3N2	H1N1	B
0/4 h	6,6 x 104	264/522	199/490	352/327
0/4 h	6,6x103	238/290	143/194	331/353

Všechny hodnoty jsou průměrem trojích jamek jako absorbance x lOOO.průměr ± 10%

Závěr: 6,6 x 10⁴ = 66 000 buněk dávalo signifikantní zvýšení signálu po 4 hodinové inkubaci. H3N2 absorbance stoupla na 98 %, H1N1 na 153 % a B na 50 %.

Toto je reprezentativní pokus. Další testy ukázaly, že inkubace buněk přes noc dala zřetelnější rozlišení mezi blokovanými a neblokovanými jamkami s absorbancí více než 1000. Systém také pracoval při kratší inkubační době, např. 2-3 hodiny. 10 krát více buněk, např. 6,6x10³ buněk/jamku může také, ale ne vždy, dát jasnější rozlišení.

-8CZ 289582 B6

Příklad 2

Obecné postupy

Buňky: Heparinizovaná krev byla odebrána 7 dní po vakcinaci od dobrovolníků, kterým byla podána inaktivovaná vakcína proti chřipce. Krev byla smísena se stejným objemem PBS. Lymfocyty byly separovány s použitím Lymphoprep (Nyegaard and Co., Oslo). Buňky byly promyty dvakrát v PBS, resuspendovány (ředění) v Dulbecco modifikovaném Eaglově médiu ío doplněném 20% FCS, 2 mM L-glutaminu, Pen + Střep (jako v předchozím) = MEDIUM.

Stop roztok: 1 mg/ml cykloheximidu v PBS obsahujícím 10% azid sodný.

Testovací antigeny: Purifikované povrchové antigeny ze tří kmenů viru v chřipkové vakcíně byly 15 použité v klinickém pokusu a zde jsou označeny krátce H3N2, H1N1 a B.

Kontrolní antigen: Tetanový toxoid (neadsorbovaný na hliník; Lederle).

ELISA plotny: Greiner ELA plotny 655001 F-forma, nebo Costar EIA plotny 3590. Potažené 20 1 00 μΐ/jamku roztokem 10 pg/ml proteinu v PBS přes noc při 4 °C, tetanus: 10 Lf/ml. Blokovány v MEDIUM po 1 hodinu při pokojové teplotě. Promyty jedenkrát v PBS.

Test: 100 μΐ ředění buněčné suspense v MEDIUM bylo přidáno do trojích jamek ve dvou paralelních sadách pro každý ze tří chřipkových antigenů a tetanový kontrolní antigen. Jedna sada 25 trojích jamek je blokována v počátečním kroku přidáním 50 μΐ STOP roztoku. Jsou inkubovány při 37 °C v inkubátoru s 5 % CO₂ ve vzduchu po 3 hodiny. Po inkubaci je ELISA plotna promyta jedenkrát PBS, potom dvakrát PBS s 0,05% Tweenem 20. 50 μΐ/jamku vhodně ředěného králičího proti lidského Ig-peroxidáza konjugátu (Sigma) je přidáno a ponecháno při pokojové teplotě po 1 hodinu. Plotna je potom vyvíjena za použití o-fenylendiaminového (OPD) substrátu 30 a je čtena absorbance při 492 nm. (Test může být modifikován pro zvýšení sensitivity dalším krokem za použití 1 hodinového kroku Extravidin/peroxidáza (Sigma)). Toto vyžaduje použití biotynylovaného konjugátu místo peroxidázového konjugátu (Sigma)).

Representativní experimentální výsledky dní po vakcinaci (subjekty; č. 1 a č. 2)

Doba inkubace buněk: 3 hodiny, 0 hodin = blokované jamky

Počet buněk		H3N2	H1N1	B	Tetanus
0/3 h 105	č. 1	063/410	055/269	206/258	046/050
	č.2	045/077	048/242	182/207	040/046

Všechny hodnoty jsou průměrem trojích jamek jako absorbance x lOOO.průměr ± 16 %

Subjekty jsou náctiletí (16 let). Je dobře známé, že mladí lidé odpovídají lépe na A/H1N1 chřipkovou vakcínu. To je jasně vidět výše, oba subjekty č. 1 a č. 2 odpovídají dobře. Nicméně, 45 obvyklé vakcíny odpovídají různě na různé složky vakcín, takže musí být očekáván rozdíl v absorbanci. Toto je zde demonstrováno, když subjekt č. 1 odpovídá slabě na B virus, zatímco č. 2 odpovídá signifikantně pouze na H1N1 virus. Jak je očekáváno, žádný z nich neodpovídá na tetanový toxoid. Pokud nicméně byly buňky stimulovány in vitro toxoidem po dobu několika dní, jejich časná imunologická paměť (díky dětské vakcinaci) může vést k produkci tetanových 50 protilátek. V reálném případu infekce testovaném v diagnostické laboratoři za použití metody podle předkládaného vynálezu bude pouze testované agens/antigen dávat pozitivní signál.

-9CZ 289582 B6

Příklad 3

Obecné postupy:

Buňky: Heparinizovaná krev byla odebrána 6 dní po vakcinaci od dospělých (muži ve věku 24 let) a dětí (muži ve věku 3 let), kteří dostali inaktivovanou podjednotkovou chřipkovou vakcínu. Lymfocyty byly separovány jak je popsáno v příkladech 1 a 2. Buňky byly uvedeny do kontaktu s pevnou fází nesoucí antigen H3N2, H1N1 a B jak je popsáno v příkladech 1 a 2 po 3 hodiny při 37 °C, a potom test probíhal jak je popsáno (žádný stop roztok nebo kontrolní antigen nebyl použit v tomto pokusu).

Tabulka 1 ukazuje výsledky od dvou jedinců, u kterých jsou výsledky pro každý antigen průměrem trojích jamek jako absorbance x 1000.

Tabulka 1

dospělý subjekt	dětský subjekt
počet buněk (tisíce)	A/H3N2 A/H1N1	B	počet buněk (tisíce)	A/H3N2 A/H1N1	B
224	475 322	913	275	1268	97	10
112	189 193	567	138	951	65	10
56	93 62	162	69	672	51	20

Výsledky ukazují, že malé dítě, mající pouze jednu časnou epizodu chřipky, A/H3N2 infekci, má velmi silnou imunitní odpověď na A/H3N2 složku v trivalentní vakcíně. Jak bylo očekáváno pro toto dítě, nebyla zde žádná odpověď na A/H1N1 nebo B složku. Takto malé dítě obvykle potřebuje 2 dávky vakcíny pro vyvolání dostatečné imunitní odpovědi. Okolo 70 000 lymfocytů, což koresponduje asi 70 μΐ objemu plné krve, bylo dostačující pro definitivně pozitivní výsledek. Pro dospělý subjekt, který měl mnoho epizod chřipky, nebyla odpověď takto silná, přesto však byla signifikantní pro všechny tři složky vakcíny, i když v různém stupni. Pro B složku bylo potřeba asi 100 000 lymfocytů pro pozitivní výsledek, zatímco pro dvě A složky bylo potřeba minimálně 100 000 buněk a lépe 200 000 buněk.

Příklad 4: Detekce Herpes simplex typ 2 klasickou testovací metodou a Plazmacute testovací metodou

Obecné postupy

Tkáňová kultura a serologické analýzy

Materiál z genitálií pěti subjektů majících příznaky podezřelé z genitální infekce virem herpes byly podrobeny rutinnímu postupu tkáňové kultivace s cílem detekovat virus ze vzorku (provedeno Virus Laboratory, Haukeland University Hospital, Bergen). Stejná laboratoř provedla rutinní serologické analýzy sérových vzorků za použití komerčních ELISA kitů (Behringer Enzygnost od Behringer, Germany obsahujících HSV antigeny pro detekci IgG a IgM.

Separace lymfocytů

Lymfocyty byly separovány za použití lymphoprepu (Nycomed) tzn. centrifugací podle gradientu hustoty heparinizované krve od pěti subjektů, majících příznaky genitální infekce virem herpes, odebrané simultánně se vzorky pro analýzu v laboratoři. Buňky byly promyty třikrát v PBS, resuspendovány v kultivačním médiu DMEM obsahujícím 20% FCS, 1 mM L-glutaminu,

-10CZ 289582 B6

IU/ml penicilinu a 50 pg/ml streptomycinu (DMEM/FCS). Přežívající buňky byly počítány vylučováním trypanové modři (0,2%).

Plazmacute test za použití Behringer Enzygnost anti-HSV IgM a IgG ELISA

Behrenger Enzygnost anti HSV IgM a IgG jsou dodávány jako proužky obsahující 8 jamek potažených antigenem odvozeným od permanentních opičích buněk ledvin infikovaných HSV a 8 jamek potažených kontrolním antigenem od neinfikovaných buněk. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% CO₂ po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo přidáno a inkubováno po 3 hodiny při 37 °C v 5% CO₂. Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Plotny byly vyvíjeny za použití konjugátu, reagens a pufrů dodaných stejným dodavatelem. Substrát, tetramethylbenzidin hydrochlorid (TMB), vyžadoval čtení OD při 450 nm, za použití dostupné Titertek Multiskan MCC/340 čtečky ploten (Flow Laboratories).

Plazmacute test za použití Bioelisa HSV-2 IgG

Bioelisa IgG HSV-2 (Biokit, Spain) je dodán jako proužky obsahující 8 jamek potažených inaktivovaným HSV-2 antigenem. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% CO₂ po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo přidáno a inkubováno po 3 hodiny při 37 °C v 5% CO₂. Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Plotny byly vyvíjeny za použití konjugátů, reagens a pufrů dodaných stejným dodavatelem. Substrát, tetramethylbenzidin hydrochlorid (TMB), vyžadoval čtení OD při 450 nm, za použití dostupné Titertek Multiskan MCC/340 čtečky ploten (Flow Laboratories).

Plazmacute test za použití Bioelisa HSV IgM

Bioelisa HSV IgM (Immunocapture) test (Biokit, Spain) je dodán jako proužky obsahující 8 jamek potažených králičími protilidskými IgM protilátkami. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% CO₂ po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo přidáno a inkubováno po 3 hodiny při 37 °C v 5% CO₂. Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Přesněji, navázaná protilátka byla detekována 100 μΐ/jamku HSV antigenů značeného křenovou peroxidázou (purifíkovaný a inaktivovaný HSV, který byl množen in vitro v lidských fíbroblastech) a pro minimalizaci nespecifických reakcí neznačeného kontrolního antigenů, skládajícího se z neinfikovaných buněčných složek (dodaných s kitem), 10 μΐ HSV antigenů a 10 μΐ kontrolního antigenů na jamku. Plotny byly čteny na Titertek Multiskan MCC/340 čtečce ploten (Flow Laboratories).

Výsledky pokusu jsou ukázány v tabulce 2.

-11 CZ 289582 B6

Tabulka 2

ni = netestováno

-12CZ 289582 B6

Tabulka 2 shrnuje data pro pacienty 1 - 5. Diagnostická laboratoř v Haukeland University Hospital se pokusila izolovat virus z klinických vzorků a také provedla rutinní ELISA testy na sérové IgG a IgM za použití Behringer Enzygnost ELISA kitů. Je uveden typ izolovaného viru, -ve znamená negativní izolaci. Sérové ELISA hraniční hodnoty jsou definovány výrobcem kitu; + = OD >0,2, hraniční-OD 0,1/0,2, definováno jako neurčitý výsledek výrobcem kitu; a- = OD <0,1.

Pro Plazmacute test jsme použili OD > 0,2 jako pozitivní a v tabulce jsme uvedli počet lymfocytů nezbytných pro vyvolání takové odpovědi.

Pouze Bioelisa IgG test si nárokuje identifikaci HSV2 protilátek, zatímco ostatní ukazují infekci HSV (1 a/nebo 2}.

Výsledky

Pacient 1 měl klinické příznaky primární HSV-2 infekce. Nemocniční testy selhaly při izolaci viru z klinického vzorku a žádný IgM nebyl nalezen při standardním ELISA testu. Hraniční sérové IgG protilátky byly nalezeny standardními nemocničními ELISA testy. V potvrzení těchto výsledků zde nebyly nalezeny žádné buňky, které by produkovaly IgM protilátky v Plazmacute testu. Jak Behringer IgG, tak Bioelisa IgG Plazmacute testy detekovaly buňky produkující IgG protilátku k HSV. 205 000 lymfocytů bylo potřeba pro pozitivní hodnotu absorbance v Plazmacute testu a v Bioelisa IgG bylo vyžadováno 103 000 lymfocytů pro dosažení pozitivní absorbance.

U pacienta 2 proběhla primární infekce, což bylo potvrzeno izolací viru HSV typ 1. Žádný sérový IgM nebyl detekován v nemocniční laboratoři, ale IgG protilátka byla detekována. V Plazmacute testu nebyly detekovány žádné buňky produkující IgM, nicméně, jak Behringer, tak Bioelisa Plazmacute test detekoval IgG produkující buňky, 223 000 a 111 000 buněk bylo potřeba, v příslušném pořadí.

Pacient 3 měl rekurentní HSV-2 infekci, která byla potvrzena izolací HSV-2 viru z klinických vzorků. IgG byl přítomen v klinickém vzorku odebraném 2 dny po nástupu klinických příznaků, nicméně žádný sérový IgM nebyl v tuto dobu detekován. V Plazmacute testu nebyl žádný IgM detekován 2 dny po nástupu klinických příznaků, nicméně jak Behringer, tak Bioelisa Plazmacute test detekoval IgG produkující buňky (bylo požadováno 48 000-96 000 buněk)). IgM sérové protilátky byly detekovány nemocnicí v sérovém vzorku odebraném 20 dní po nástupu klinických příznaků. 182 000 bylo požadováno pro produkci pozitivní absorbance v Plazmacute Behringer IgM testu, nicméně žádné buňky nebyly detekovány v Bioelisa IgM Plazmacute testu.

Pacient 4 měl primární infekci HSV. Žádný virus nebyl detekován v klinickém vzorku zaslaném do nemocniční laboratoře. Hraniční sérové IgM protilátky byly detekovány a byly nalezeny pozitivní hladiny sérových IgG protilátek. Jak IgG, tak IgM protilátky byly detekovány v Plazmacute testu za použití jak Behringer, tak Bioelisa kitů ve vzorcích krve odebraných 5 a 19 (žádný Behringer IgM nebyl detekován) dní po nástupu klinických příznaků. V Plazmacute testu bylo vyžadováno méně než 8000 buněk pro Bioelisa IgM test a 60500 buněk bylo vyžadováno pro Behringer IgM test a oba tyto vyžadovaly méně než 100 μΐ heparinizované krve.

U pacienta 5 bylo podezření na primární infekci HSV. Nicméně, laboratoří nebyl izolován žádný virus a nebyly detekovány žádné sérové protilátky. V Plazmacute testu nebyly detekovány žádné buňky produkující IgG nebo IgM protilátky k HSV.

-13CZ 289582 B6

Diskuse

Plazmacute test byl ukázán jako funkční jak pro primární, tak pro rekurentní infekci herpes simplex. Ve všech případech byl Plazmacute test alespoň stejně účinný jako tradiční ELISA postupy zde použité. Jednotlivě, pro pacienta 1, ačkoliv nebyl z klinického vzorku izolován žádný virus, a skorování bylo pouze hraniční (tj. nesměrodatné) v rutinním nemocničním testu, Plazmacute test (Bioelisa IgG a Behringer IgG) ukázal, že přibližně 100 000 buněk a 200 000 buněk, v příslušném pořadí, dává jednoznačně pozitivní výsledky. Je možné, že tento pacient má dvojitou infekci (HSV1 a HSV2), ze které byl pouze HSV1 zaznamenán v místě izolace viru. Nemůže být nicméně vyloučeno, že pozitivní HSV2 výsledek (Bioelisa IgG) byl způsoben serologickou zkříženou reakcí. Pro dva časově vzdálené vzorky od pacienta 4, od kterého nebyl izolován žádný virus, ukázal Plazmacute test posun počtu herpes specifických IgM a IgG produkujících lymfocytů od časné fáze k pozdní fázi infekce, což je slučitelné s dobře známou dynamikou po primární infekci a jasně to potvrzuje aktivní imunitní odpověď. Bioelisa IgM Plazmacute test byl zejména sensitivní, protože méně než 8000 lymfocytů bylo požadováno pro vyvolání pozitivního signálu v prvním ze dvou vzorků.

V tomto pokusu jsme ukázali, že Plazmacute metoda je účinná pro klinické případy virových infekci u lidí.

Příklad 5: Mnohonásobné disky - Potažení nitrocelulosových disků protilátkami specifickými pro IgG, IgA a IgM protilátky.

Tento pokus byl proveden pro stanovení toho, zda systém mnohonásobných disků může být použit v Plazmacute testu pro detekování protilátek různých specificit.

Obecné postupy:

Vzorky heparinizované plné krve byly odebrány od dvou zdravých dospělých subjektů. Protože tyto subjekty nebyly v akutní fázi jakékoliv infekce, dali jsme si za cíl analyzovat IgG, IgA a IgM spontánní protilátkovou sekrecí bez ohledu na jejich (neznámou) antigenní specificitu.

Subjekt 1 byl použit pro stanovení toho, zda může být použit systém používající disků potažených 3 různými antigeny v jedné jamce v Plazmacute testu. Jedna jamka (č. 1).

Subjekt 2 byl použit pro stanovení toho, zda existuje oslabení signálu za přítomnosti počtu disků potažených stejným antigenem. Tři separátní jamky v Plazmacute testu (jamky č. 2,3 a 4).

Separace lymfocytů

Lymfocyty byly separovány za použití lymphoprepu (Nycomed) centrifugace podle gradientu hustoty heparinizované krve. Buňky byly promyty třikrát v PBS a resuspendovány v kultivačním médiu DMEM obsahujícím 20% FCS, 1 mM L-glutaminu, 50 IU/ml penicilinu a 50 pg/ml streptomycinu (DMEM/FCS). Přežívající buňky byly počítány vylučováním trypanové modři (0,2%).

Plazmacute test používající disků jako pevné fáze

Směsné estery celulosových disků s velikostí pórů 8 μΜ (Millipore SCWP 01300) byly potaženy 10 pg/ml kozími protilidskými, pro jednotlivé třídy specifickými protilátkami (Sigma, anti-IgG I3382; anti-IgA 1-0884; anti-IgM 1-0759) ředěnými v PBS s obsahem azidu (0,001%) přes noc při pokojové teplotě. Disky byly blokovány DMEM/FCS při 37 °C v 5% CO₂ po 1 hodinu. Lymfocyty byly přidány do 12 mm čirých jamek (clear transwell) s velikostí pórů 0,4 μΜ (Costar 3460) a disky byly umístěny na spodní stranu a inkubovány po dobu 3 hodin při 37 °C v 5% CO₂.

-14CZ 289582 B6

Jednotlivé disky byly přeneseny do separátních jamek 24 jamkové plotny (Costar) a byly 3x promyty v PBS a 3x v PBS s Tweenem (0,05%). Navázaná protilátka byla detekována 200 μΐ/jamku kozími protilidskými pro třídu specifickými, s peroxidázou konjugovanými protilátkami (Sigma, IgG A-6029; IgA A-4165; IgM A-4290), ředěnými v DMEM/FCS 5 a inkubovanými 2 hodiny při pokojové teplotě. Disky byly promyty pro odstranění nenavázané protilátky, jak bylo popsáno dříve a vyvíjeny za použití 200 μΐ/jamku o-fenylendiamin dihydrochloridu (OPD) (Sigma P-7288) v 0,05 M fosforečnano-citrátovém pufru (pH 5,0). Třicet minut po přidání substrátu byl vývoj ukončen za použití 100 μΐ/jamku 1M H2SO4. Jedno sto μΐ na jamku bylo přeneseno do 96 jamkové ELISA plotny (Greineer ELA plotny 65501 F-forma) a OD 10 byly čteny na Titertek Multiskan MCC/340 čtečce ploten (Flow Laboratories) při 492 nm.

Výsledky pokusů jsou ukázány v tabulce 3, ve které jsou výsledky pro každou zachycovací protilátku průměrem ze tří jamek jako absorbance x 1000.

-15CZ 289582 B6

Tabulka 3

buňky

-16CZ 289582 B6

Jamka 1 obsahovala 2 miliony lymfocytů, jamky 2-4 obsahovaly 1 milion lymfocytů. „buňka“ ukazuje, které číslo disku bylo umístěno nejblíže k vrstvě buněk.

Výsledky:

Test se subjektem 1 ukázal, že i 9 disků může být snadno použito v jamce obsahující lymfocyty. Odpověď pro tři IgG disky, tři IgA disky a tři IgM disky byly pro všechny praktické účely identické pro každou sadu, což ukazuje, že aktuální umístění disku vzhledem k protilátce není zásadní. Test s lymfocyty od subjektu 2 ukázal, že alespoň 8 identicky potažených jamek může být umístěno v jedné lymfocyty obsahující jamce za vzniku prakticky shodných výsledků. Tak vynález umožňuje mnohonásobné testy pro stejné přípravky lymfocytů v jedné jamce.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (19)

1. Způsob pro detekování aktivní produkce protilátek v odpovědi na cílový antigen v krevním vzorku, vyznačující se tím, že se

a) kontaktuje v přítomnosti a za absence inhibitoru proteinové syntézy aliquot uvedeného vzorku, popřípadě lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází s vazebným partnerem pro imobilizaci protilátky za podmínek, které umožňují produkci protilátek a jejich sekreci lymfocyty,

b) detekuje se vazba protilátky na uvedený antigen(y) na pevné fázi v roztoku, a

c) srovnává se vazba uvedené protilátky v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, čímž se stanoví množství aktivní sekrece protilátky v odpovědi na uvedený antigen(y).

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že pevná fáze nese jeden nebo více antigenů rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, které mají být detekovány.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že pevná fáze nese jednu nebo více protilátek, které rozpoznávají protilátku nebo protilátky, které mají být detekovány.

4. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že vzorek krve použitý ve způsobu, nebo použitý pro přípravu lymfocytů pro použití ve způsobu, má objem menší než 1 ml.

5. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků laž 4, vyznačující se tím, že se provádí na vzorcích krve od novorozenců nebo dětí pro odlišení mezi nově vytvořenými protilátkami a pasivně přenesenými mateřskými protilátkami.

6. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vzorek krve se získá čištěním nebo obohacením krve získané od pacienta.

7. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se pro postup užijí lymfocyty, které jsou přímo izolovány z uvedeného vzorku.

8. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 7, vyznačuj icí se tím, že před kontaktováním se vzorkem se pevná fáze inkubuje v blokovacím prostředí.

-17CZ 289582 B6

9. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se jako inhibitor proteinové syntézy užije cykloheximid v koncentraci 50 až 500 pg/ml.

10. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se spolu s inhibitorem proteinové syntézy použije inhibitor ATPasy.

11. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že detekce vazby se provádí imunotestem.

12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že imunotestem je ELISA.

13. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 3ažl 2, vyznačující se tím, že se s pevnou fází uvede do kontaktu jeden nebo více antigenů rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, imobilizovanými na uvedené pevné fázi.

14. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 2a4 až 12, vyznačující se tím, že se s pevnou fází uvede do kontaktu jedna nebo více protilátek rozpoznávajících protilátku nebo protilátky, imobilizované na uvedené pevné fázi.

15. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků lažl 4, vyznačující se tím, že pro detekci vazby se použije rozpustný substrát, poskytující spektrofotometricky detekovatelný signál.

16. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků lažl5,vyznačující se tím, že se použije negativní kontrolní antigen.

17. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že se detekuje aktivní produkce protilátek k Herpes viru.

18. Způsob podle kteréhokoliv z předešlých nároků 2a4až 17, vyznačující se tím, že se použije více pevných fází, z nichž každá nese jiný cílový antigen.

19. Způsob pro detekování přítomnosti nespecifických ukazatelů infekce ve vzorku krve, vyznačující se tím, že se:

kontaktuje v přítomnosti a za absence inhibitoru proteinové syntézy aliquot uvedeného vzorku, nebo popřípadě vzorek lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází za podmínek, které umožňují produkci a sekreci ukazatelů infekce lymfocyty, detekuje se vazba ukazatele infekce na vazebný partner na pevné fázi, a srovnává se vazba uvedeného ukazatele infekce v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, čímž se stanoví množství ukazatele infekce v uvedeném vzorku.