DE69606024T2

DE69606024T2 - Feststellung von antikörperproduktion

Info

Publication number: DE69606024T2
Application number: DE69606024T
Authority: DE
Inventors: Lars Reinhardt Haaheim
Original assignee: Individual
Current assignee: Plasmacute As Bergen No
Priority date: 1995-02-21
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 2000-09-14
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: CA2213083A1; CZ289582B6; HU225687B1; FI117911B; DK0811165T3; WO1996026443A1; CN1098460C; CN1176000A; JPH11500226A; US6080552A; CA2213083C; EP0811165B1; NZ301770A; PL322209A1; ES2140821T3; NO317151B1; NO973823D0; AU4726896A; ATE188551T1; EP0811165A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis der Antikörperproduktion und insbesondere den Nachweis aktiver Antikörpersynthese in Blutproben als Antwort auf Infektion oder Impfung etc. durch einen modifizierten enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA).
Der ELISA wird seit geraumer Zeit zum Nachweis oder zur Messung von Antikörpern (oder Antigen) verwendet (siehe z. B. US-A 5 188 942). Alternative Techniken wie Durchflußcytometrie können zur Untersuchung von Antikörpern oder Antigenen verwendet werden (siehe Hetland et al., J. Immunol. Methods 1991, 140, S. 167 bis 171). Üblicherweise wird der ELISA als serologischer Assay verwendet, er wird aber auch zur Untersuchung der immunochemischen Eigenschaften von Antigenen oder Antikörpern verwendet und fand wiederholt Anwendung, beispielsweise zur Bewertung und Charakterisierung von Immunantworten, zur Ermittlung der Antikörperproduktion durch Zellkulturen, in der Hybridomtechnologie etc.
Aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Einfachheit und Leichtigkeit sowie Geschwindigkeit ihrer Durchführung wurde diese Technik weithin als diagnostisches Werkzeug akzeptiert und wird nun routinemäßig in klinischen Laboratorien zum Nachweis von Antikörpern auf infektiöse Mittel im Serum oder Plasma, die einer Infektion oder Impfung folgen, verwendet. Somit basieren beispielsweise viele HIV- Infektionstests auf dem Nachweis der Antikörper auf das Virus im Serum oder Plasma des Patienten, wobei man einen herkömmlichen ELISA-Assay verwendet. Alternative diagnostische Tests zur Identifizierung klinischer Beschwerden machen von dem Assay eines nicht- Antikörper-Markers Gebrauch, wie dem löslichen IL-2-Rezeptor (siehe EP-A 526 952), oder einem Glycoproteinmarker (siehe US-A S 019 497). Dadurch, dass ein solch einfacher serologischer ELISA-Test nur die Gegenwart des Zielantikörpers in der Probe misst, kann jedoch nicht zwischen beginnender Antikörpersynthese als Antwort auf das Antigen und Antikörpern unterschieden werden, die schon seit einer früheren Infektion oder durch passive Übertragung etc. vorhanden sind. Während es in einigen Fällen ausreichen kann, nur die Information betreffend der Gegenwart des Antikörpers zu erhalten, ist es in anderen Fällen wünschenswert, bestimmen zu können, ob die nachgewiesenen Zielantikörper von den Lymphozyten zum Zeitpunkt des Tests akut systhetisiert werden oder nicht, z. B. im Verlauf einer Impfung oder bei der Diagnose von Infektionen in Kindern, um sie von passiv übertragenen maternalen Antikörpern zu unterscheiden. Dies ist durch ein klassisches ELISA-Vefahren nicht möglich.
Daher wurden andere Methoden entwickelt, die es ermöglichen, die beginnende Antikörpersynthese nachzuweisen. Besonders sollte in diesem Zusammenhang der enzyme-linked immunospot (ELISPOT) erwähnt werden (auch als spot-ELISA oder ELISA-plaque Assay bekannt), worüber beispielsweise Czerkinsky et al. in ELISA and other Solid Phase Immungssays, Ed. D. M. Kenneny and S.. J. Challacombe, 1988, Kapitel 10, 217-239 eine Übersicht gibt. Diese auf dem ELISA- Verfahren basierende Technik ermöglicht die Zählung von Lymphozyten, die Antikörper gegen ein oder mehrere Zielantigene sekretieren. Grundsätzlich ist der ELISPOT eine Variante des ELISA- Verfahrens, wobei antikörpersekretierende Zellen (ASC) nachgewiesen werden können, indem man Lymphozyten in speziell modifizierten ELISA-wells kultiviert, die mit dem Zielantigen beschichtet sind, und indem man die Standard-ELISA-Reagenzien durch Enzymsubstratkomplexe ersetzt, die einen an der sekretierenden Zelle anhaftenden farbigen Niederschlag (Spots) ergeben. Die Spots können dann gezählt werden, wodurch man ein Maß für die Zahl der antikörperproduzierenden Zellen erhält. Im Kulturmedium können Proteinsyntheseinhibitoren enthalten sein, um zu sicherzustellen, dass die nachgewiesenen Spots durch de-novo-Antikörpersynthese während der in- vitro-Inkubationszeit entstehen.
Während sich die ELISPOT-Technik beim Studium der Dynamik von humoralen Immunantworten als sehr nützlich erwies und sie zum Nachweis spontaner ASC verwendet wurde, die vorübergehend im peripheren Kreislauf von immunisierten Versuchspersonen auftauchen, führen bestimmte Merkmale des Verfahrens zu Einschränkungen bei seiner Verwendung in einem klinisch diagnostischen Rahmen. Erstens ist das Verfahren für die Analyse großer Probenzahlen, wie sie in einem klinisch diagnostischen Labor vorkommt, nicht besonders geeignet, da bei jeder Probe einzelne Spots gezählt werden müssen, was zeitaufwendig und mühsam sein kann. Zweitens wird in jeder Probe nur die Zahl von Zellen gezählt, die Antikörper sekretieren und dies erfordert im Allgemeinen angemessen große Probenvolumina, z. B. mehrere ml. ELISPOT-Platten sind außderdem teuer und der Assay ist noch nicht der Automatisierung zugänglich.
Amadori et al. (1988, Clin. Immunol. Immunopathol., Vol. 26, S. 342) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Antikörpersynthese, aber dieses Verfahren verwendete gereinigte Lymphozyten und lange Kulturspannen. Die in-vitro-Stimulation mit einem geeigneten Antigen wurde zur Aktivierung von Zellen in Blutproben verwendet, wonach aktivierte Lymphozyten (d. h. Gesamtzell-Assays) durch Eigenschaften, die auf ihre Aktivierung hinweisen, identifiziert werden (siehe US-A-5 360 719). Atkinson et al. (1985, J. Immunol. Methods, 76, S. 365-373) beschreibt einen Assay zur Bestimmung der Antikörperproduktion von Immunzell-Suspensionen. Jedoch verwendet dieses Verfahren aufgereinigte Proben und weist ein Empfindlichkeitsniveauauf, das die Verwendung relativ großer Proben erfordert.
Es ist daher offensichtlich, dass trotz der Fortschritte der Antikörper-Nachweistechniken ein Bedarf an einem Assay besteht, der einfach, schnell und kosteneffektiv auszuführen ist, der zuverlässig eine genaue Quantifizierung von spontan sekretierten Antikörpern gestattet, der de-novo-Antikörpersynthese unterscheiden kann und der insbesondere für diagnostische Zwecke in Blutproben durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung behandelt dieses Problem.
Zum einen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer aktiven Antikörperproduktion als Antwort auf ein Zielantigen in einer Blutprobe bereit, wobei man:
In Gegenwart und bei Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren, Aliquots dieser Probe, oder gegebenenfalls aus dieser Probe direkt isolierte Lymphozyten mit einer festen Phase unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Antikörperproduktion und Sekretion durch die Lymphozyten erlauben;
in Lösung die Antikörperbindung an dieses Antigen (diese Antigene) auf der festen Phase nachweist;
und die Antikörperbindung in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren vergleicht, wobei man eine Bestimmung der Menge aktiver Antikörpersekretion als Antwort auf dieses Antigen (diese Antigene) erhält.
Hier bezeichnet die "aktive Antikörperproduktion" die Produktion spontan sekretierter Antikörper durch Lymphozyten in der Probe, welche als Folge einer akiven beginnenden Immunantwort im Verlauf des Assays aktiv Antikörper prodzieren. In jedem Fall sind die Antikörper gegen Antigene gerichtet, die in vivo und nicht in vitro, entweder vor oder während dem erfindungsgemäßen Assay- Verfahren präsentiert werden.
Hier bedeutet der Satz "aktive Antikörpersekretion als Antwort auf das Antigen", dass die aktiv sekretierten Antikörper an das im Assay verwendete Antigen binden, obwohl das verwendete Antigen möglicherweise nicht das Immunogen war, das zuerst die Immunantwort stimulierte. Folglich müssen das Antigen und das Immunogen nicht identisch sein, obwohl sowohl das im Assay verwendete Antigen als auch das Immunogen, das die Produktion von Antikörpern in vivo stimulierte oder stimuliert, an die nachzuweisenden Antikörper aufgrund der identischen oder sehr ähnlichen Epitope binden können. Folglich kann das Antigen in ähnlicher Weise synthetisch hergestellt werden, z. B. durch chemische Synthese oder rekombinante Expression mit über das native Antigen hinzugefügten oder deletierten Abschnitten, obwohl das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antigen, ein Stoff sein kann, der alle oder manche Abschnitte des betreffenden Immunogens enthält, das z. B. von infizierten Patienten oder gereinigten Teilen desselben oder ähnlichen Stoffs stammt. Somit können Fusionsproteine oder Moleküle, die nur das entsprechende Epitop (die Epitope) exprimieren, verwendet werden.
Im Allgemeinen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Inkubation von Lymphozyten aus der Blutprobe in Kontakt mit einer geeigneten festen Oberfläche, um die nachzuweisenden Antikörper unter Bedingungen zu immobilisieren, die die Antikörperproduktion und Sekretion durch die Lymphozyten gestattet, und danach die Entfernung der Zellen und der Nachweis der Antikörperbindung an das Antigen in der festen Phase. Durch den Vergleich der Niveaus der nachgewiesenen Antikörperbindung, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Proteinsyntheseinhibitors, kann die de-novo-Antikörpersynthese erkannt und quantifiziert werden. Überraschenderweise erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung von geringen Blutprobenvolumina (z. B. ul-Volumina, weniger als 1 ml) zum direkten Nachweis spontaner Antikörperproduktion durch nicht-stimulierte Lymphozyten, oder zur Herstellung von Lymphozyten zur Verwendung in diesem Verfahren, ohne einen vorausgehenden Schritt der Präkultivierung von Lymphozyten vor der Inkubation mit der festen Phase. Mit anderen Worten werden die Lymphozyten der Probe im erfindungsgemäßen Assay- Verfahren direkt verwendet, ohne eine Vorbehandlung oder Stimulation, z. B. durch in-vitro-Stimulation durch das Antigen. Die von den Lymphozyten zum Zeitpunkt der Probennahme sekretierten Antikörper können auf diese Weise nachgewiesen werden. Dadurch kann trotz der Verwendung solch kleiner Probenvolumina, die spontan beginnende Antikörpersynthese als Antwort auf das Testantigen vorteilhafterweise von der unspezifischen Aktivierung von Lymphozyten unterschieden werden. Außerdem werden Lymphozyten unter Bedingungen untersucht, bei denen sie spontan Antikörper sekretieren, ohne dass die Zellen zur Aktivierung einer Memoryfunktion stimuliert werden. Dies steht im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Verfahren, die zur Steigerung der Empfindlichkeit des Tests einen Vorteil aus der in-vitro-Stimulierung durch das Antigen ziehen. Demgegenüber liegt der Vorteil der vorliegenden Erfindung in der spontanen Antikörpersekretion, was den Nachweis von Antikörpern in Blut als Indiz auf eine beginnende Infektion durch das Testantigen gestattet; Plasmalymphozyten werden Antikörper gegen das Testantigen in den ersten wenigen Wochen nach der Infektion oder Impfung etc. sekretieren. Der Nachweis solcher Antikörper durch das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Diagnose und Bestimmung der Infektion oder die Überwachung, etc. der Antikörperantwort auf eine Impfung. Dies ist besonders nützlich bei Kindern oder Neugeborenen, wo es wichtig ist, neu synthetisierte Antikörper von passiv übertragenen maternalen Antikörpern zu unterscheiden. Dieselbe Blutprobe kann in Bezug auf Antikörper gegen einige verschiedene infektiöse Mittel, entweder in getrennten Assays oder im gleichen Assay unter Verwendung mehrfach relevanter Antigene analysiert werden. Auf diese Weise wird die Verwendung relevanter kontaktierender Antigene ermöglicht, die mit dem klinischen Syndrom, das der Patient zeigt, übereinstimmen. Bei der Diagnose von Infektionen ist es auch wichtig, zwischen beginnender Antikörpersynthese und Antikörpern, die bereits aufgrund einer früheren Infektion vorhanden sind, unterscheiden zu können. Das Abrufen des immunologischen Gedächtnisses durch invitro-Stimulierung durch das Antigen ist ungeeignet für einen Assay, der auf die Identifizierung einer beginnenden akuten Infektion abzielt. Daher weisen frühere Verfahren, die auf der Stimulierung durch das Antigen beruhen, nicht diesen Vorteil auf. Außderdem würde der die Einbeziehung des Schritts der Antigenstimulierung den vorteilhaften Zeitfaktor des erfindungsgemäßen Assays beeinträchtigen, der im Vergleich zu bisherigen Verfahren schnell auszuführen ist.
Antigene, gegen die die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisenden Antikörper gerichtet sind, umfassen sowohl bakterielle als auch virale Antigene. Zu den klinisch wichtigen Antigenen zählen z. B. Antigene von Herpes Simplex Virus, Cytomegalovirus, human immunodeficiency virus (HIV) und jeder Hepatitisvirus; sie sind aber nicht auf diese beschränkt. Ein Nachweis solcher Antigene kann dazu verwendet werden, um rasch nachzuweisen, ob Patienten infiziert sind, z. B. für Zwecke des Screenings von Blut oder zum Nachweis und/oder zur Überwachung von Infektionen. Das Verfahren ist dank seiner Einfachheit besonders nützlich und kann z. B. unter Feldbedingungen verwendet werden, wenn komplizierte Ausrüstung nicht verfügbar ist.
Wie hier verwendet umfassen die Ausdrücke "Nachweisen" und "Bestimmen der Menge von" sowohl die quantitative als auch die qualitative Bewertung des Niveaus der Antikörperproduktion in dem Sinne, dass man einen Absolutwert der Menge der in der Probe produzierten Antikörper erhält und auch einen Index, ein Verhältnis, einen Prozentsatz oder einen ähnlichen Hinweis auf das Niveau der Antikör perproduktion, sowie semiquantitative oder qualitative Bewertungen. Ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass man im Vergleich zu klassischen diagnostischen Tests, die im Allgemeinen auf mehrere ml Serumvolumen angewiesen sind, nur kleine Probenvolumina benötigt, z. B. 50-500 ul, vorzugsweise 100-300 ul und üblicherweise 100-200 ul Blut oder ein Blutprodukt mit einem der Gesamtblutquelle verleichbaren Volumen. Das ist besonders im Fall von Blutproben aus Neugeborenen nützlich, da das erfindungsgemäße Verfahren nur ul-Volumina erfordert.
Die Blutprobe, im Allgemeinen eine periphere Blutprobe, kann direkt verwendet werden, obwohl es bevorzugt sein kann, erst die Lymphozyten aus der Probe zu isolieren. Dies kann unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Folglich können z. B. in geeigneter Weise verschiedene Gesamtblutpräparationen verwendet werden, wie sie routinemäßig in klinischen Labors hergestellt werden, z. B. heparinisiertes Blut, EDTA-Blut etc. Obwohl es nicht zwingend erforderlich ist, können Erythrozycten, die in der Probe vorhanden sind, lysiert werden, z. B. unter Verwendung von gewöhnlichen Verfahren der kurzzeitigen Exposition gegenüber destilliertem Wasser oder Ammoniumchlorid, oder unter Verwendung anderer bekannter Hämolysetechniken. Es ist erstrebenswert, dass alle angereicherten oder gereinigten Präparationen die Lymphozyten enthalten müssen, die im Gesamtblut, aus dem die Präparation stammt, vorhanden sind, um die spontane Antikörperproduktion nachweisen zu können. Falls erwünscht, können die Lymphozyten abgetrennt werden, z. B. unter Verwendung von Standardmedien zur Lymphozytentrennung wie Lymphoprep (Nyegaard Co. Oslo, Norwegen) oder unter Verwendung von immunomagnetischer Trennung (IMS) oder einem ähnlichen, auf einer festen Phase basierenden Trennungssystem oder anderen üblichen Techniken. Im Fall der IMS oder ähnlichen Trennungstechniken kann eine feste Phase, z. B. magnetische Perlen, die mit einem für bestimmte Sets von Leukozyten-spezifischen Antikörper beschichtet sind, zur selektiven Trennung der nützlichen Lymphozyten verwendet werden. Wenn abgetrennte Lymphozyten verwendet werden, können die Zellen vor der Verwendung mit Hilfe von bestehenden Waschverfahren gewaschen werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass ausgiebiges Waschen der Zellen nicht erforderlich ist. Tatsächlich kann die Überlebensrate der Zellen erhöht und die Methode beschleunigt werden, indem man nicht ausgiebig wäscht.
Die wie oben erwähnt behandelte Blutprobe oder die abgetrennten Lymphozyten werden dann, falls erforderlich, in geeigneter Weise mit der festen Phase in Kontakt gebracht, die den passenden Bindungspartner zur Immobilisierung des nachzuweisenden Antikörpers (oder der Antikörper) trägt. Geeigneterweise ist der Bindungspartner das Testantigen (oder -antigene), das von dem nachzuweisenden Antikörper (oder den Antikörpern) erkannt wird. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zum Nachweis aktiver Antikörperproduktion in Blutproben, wobei man: Aliquots dieser Probe oder ggf. Lymphozyten, die direkt aus dieser Probe isoliert sind, mit einer festen Phase, die ein oder mehrere Antigene trägt, die den nachzuweisenden Antikörper oder die Antikörper erkennt, in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren in Kontakt bringt;
in Lösung die Bindung des Antikörpers an dieses Antigen(e) nachweist;
und diese Antikörperbindung in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitor vergleicht, um dadurch eine Bestimmung der Menge aktiver Antikörpersekretion als Antwort auf dieses Antigen(e) zu erhalten.
Man kann auch alternative Bindungspartner verwenden, z. B. Protein A, Protein G oder Antikörper, die den nachzuweisenden Antikörper erkennen oder binden. In letzterem Fall ist eine hochspezifische Bindung nicht erforderlich, da die Spezifität durch die anschließende Bindung des Antigens, das spezifisch an die nachzuweisenden Antikörper bindet, in diese Ausführungsform des Assay- Verfahrens eingeführt wird. Folglich wird in allen Ausführungesformen ein spezifischer Antigen-Antikörper-Komplex gebildet. Die Gegenwart solcher, auf der festen Unterlage immobilisierter Komplexe wird im Nachweisschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelt.
Die feste Phase kann irgendein bekannter Träger oder Matrix sein, die gegenwärrig weitverbreitet verwendet werden oder zur Immobilisierung, Trennung etc. empfohlen werden. Diese können die Form von Partikeln, Blättern, Gelen, Filtern, Membranen oder Mikrotiterstreifen, Röhrchen oder Platten etc. aufweisen und geeigneterweise aus einem polymeren Material bestehen. Jedoch können zur einfachen Bedienung und zur Vereinfachung Standardmikrotiterplatten und Wells verwendet werden, vorzugsweise Standard-ELISA-Platten. Die feste Phase kann auch verändert werden, um einen Nachweis von Antikörpern, die für eine Reihe von verschiedenen Antigenen spezifisch sind, zu gestatten. Somit können z. B. Scheiben oder Streifen eines passenden Festphasenmaterials, z. B. Nitrocellulose oder ähnliche, mit verschiedenen Antigenen beschichtet werden und gleichzeitig in ein Mikrotiter-well oder andere passende Gefäße, die kein kontaktierendes Antigen enthalten, gegeben werden. Nachweismethoden der Antikörperbindung können dann dazu verwendet werden, um zwischen verschiedenen Antigenen zu unterscheiden. Um herauszufinden, welche der vermuteten Mittel die Krankheit verursacht, kann man Sets von Scheiben verwenden, wobei jede mit den gemäß bestimmter klinischer Bedingungen oder Syndrome relevanten Antigenen beschichtet ist. Die Scheiben können dann einzeln in getrennten Wells entwickelt werden. Dies ist ein besonders materialsparendes Verfahren, da Tests für die gleichzeitige Untersuchung einer Vielzahl von verschiedenen Antigenen (entweder vom selben infektiösen Mittel oder von verschiedenen Mitteln, die jeweils für das klinische Syndrom oder die Bedingungen relevant sind) unter Verwendung desselben kleinen Blutvolumens ausgeführt werden. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung vieler Blutproben in getrennten Wells, wobei jedes mit verschiedenen Bindungspartnern beschichtet ist, z. B. Antigene oder Antikörper, und die demgemäße Entwicklung des Tests.
Techniken zur Bindung des Bindungspartners, z. B. des Antigens, an die feste Phase, sind ebenfalls bestens bekannt und häufig in der Literatur beschrieben. Viele Standardverfahren der Antigenbeschichtung sind z. B. in ELISA and other solid phase Immuno- Assays, Theoreticcal and Practical Aspects; 1988, ed. D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons, beschrieben. Falls erwünscht, können die Platten gewaschen und blockiert werden, wobei man wiederum Standardtechniken verwendet. So können beispielsweise Standardmikrotiterplatten, z. B. ELISA-Platten, mit dem Bindungspartner einfach dadurch beschichtet werden, dass man die Platten über Nacht bei 4ºC in einem geeigneten Puffer, z. B. Phosphat- gepufferte Salzlösung (PBS), der den Bindungspartner z. B. in Konzentrationen von 0,01 bis 150 ug/ml Protein enthält, inkubiert, gefolgt von der Blockierung unter Verwendung passender Blockierungsmedien (im Allgemeinen ein Zellkulturmedium) und Inkubation z. B. 1 bis 5 Stunden bei 37ºC. Nach Entfernen der Blockierungslösung sind die Platten gebrauchsfertig.
Geeigneterweise jedoch können die zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Materialien in Kit-Form erhalten werden, wobei die feste Unterlage, mit dem Bindungspartner fertig beschichtet und passend blockiert, geliefert wird.
Wie oben erwähnt, umfasst der Schritt des in-Kontakt-Bringens im Allgemeinen die Inkubation der Probe oder der abgetrennten Lymphozyten in Gegenwart der festen Phase, unter Bedingungen, die eine Antikörpersynthese und -Sekretion erlauben. Geeigneterweise können Standard-ELISPOT-Inkubationsbedingungen verwendet werden, wie beispielsweise in Czerkinsky et al., 1988 (supra) beschrieben. Im Allgemeinen werden die Probe oder die Zellen bei 37ºC mit 5% CO&sub2; in der Luft inkubiert, falls das Medium, in dem die Zellen inkubiert sind, auf CO&sub2; als Teil des Puffersystems angewiesen ist. Man kann auch CO&sub2;-unabhängiges Medium verwenden, in dem alternative Puffersystme wirken, wie Medien, die den bekannten Bestandteil HEPES verwenden. In diesen Fällen werden die Zellen einfach bei 37ºC inkubiert, wodurch der Assay und seine Anforderungen an komplizierter Ausrüstung weiter vereinfacht wird. Die Inkubationszeiten können variieren, aber im Allgemeinen sind mindestens 1 bis 2 Stunden erforderlich. Man fand heraus, dass Inkubationszeiten von 2 bis 6 Stunden, z. B. 2 bis 4 Stunden, gute Ergebnisse liefern, obwohl längere Inkubationszeiten, z. B. bis zu 12 oder 24 Stünden, oder über Nacht in manchen Situationen wünschenswert sind. Passende Me dien für die Inkubation sind bestens bekannt und umfassen alle Standardzellkulturmedien, z. B. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) oder RPMI oder bekannte Zellkulturmedien, die HEPES als CO&sub2;- unabhängiges Puffersystem verwenden und die, falls erforderlich, passende Seren, z. B. fötales Kälberserum (FCS) oder andere Bestandteile, z. B. Glutamin, enthalten. Optionale zusätzliche Bestandteile im Medium umfassen Antibiotika, z. B. Gentamycin, Penicillin, Streptomycin etc., andere Aminosäuren, Wachstumsfaktoren etc..
Es kann wünschenswert sein, die Proben/Zellsuspension vor dem Schritt des in-Kontakt-Bringens zu verdünnen und geeigneterweise können Zell/Probenverdünnungsreihen verwendet werden. Die Verdünnung wird im Allgemeinen unter Verwendung des Kulturmediums als Verdünnungsmittel durchgeführt.
Zur Erkennung der beginnenden Antikörpersynthese wird die Inkubation in Gegenwart und bei Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren durchgeführt. Somit wird vor der Inkubation der Inhibitor zu einem Teil der Proben/Zell-Aliquots gegeben, um Protein- und daher Antikörpersynthese zu blockieren und andere Teile werden ohne Inhibitor inkubiert. Man kann jeden der gemeinhin bekannten Proteinsyntheseinhibitoren, z. B. Cycloheximid verwenden. Man kann Konzentrationen von 10 bis 5000 ug/ml, z. B. 50-500 ug/ml Cycloheximid verwenden.
Vorzugsweise wird man auch einen ATPase-Inhibitor wie Natriumazid oder andere ähnliche Inhibitoren mit dem Proteinsyntheseinhibitor zugeben, um schnell und vollständig den Zellmetabolismus anzuhalten.
Nach der Inkubation werden die Proben/Zellen von der festen Phase entfernt. Das kann im Allgemeinen einfach durch Waschen unter Verwendung eines passenden Mediums z. B. eines Puffers wie PBS bewältigt werden. Man fand jedoch heraus, dass ausgiebiges Waschen nicht erforderlich ist.
Die feste Phase wird dann dem Nachweisschritt der Bindung des Antikörpers unterzogen. Der Nachweisschritt in Bezug auf das Auswerten des Signals, findet in Lösung statt. Man kann jedes der be kannten Verfahren zum Nachweis der Antikörperbindung verwenden, soweit ein Signal erzeugt wird, das in Lösung auswertbar ist; z. B. beruhend auf Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Colorimetrie oder einer Enzymreaktion zur Erzeugung des auswertbaren Signals. Geeigneterweise jedoch wird ein Immungssay als Nachweismethode verwendet, und bevorzugt ein enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA).
Immuno-Assay-Techniken und besonders ELISA-Techniken sind bestens bekannt und in der Literatur beschrieben (siehe z. B. ELISA and other solid phase ImmunoAssays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed.D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons).
Nach der Entfernung der Probe/Zellen, kann z. B. im ELISA- Nachweisverfahren ein Enzym-Antikörper-Konjugat zugefügt werden, das an den Antikörper bindet, der an das Antigen auf der festen Phase gebunden ist. Falls der nachzuweisende Antikörper unspezifisch über einen Bindungspartner an die feste Phase gebunden ist, z. B. durch einen Antikörper gegen Antikörper verschiedene Spezies, kann in ähnlicher Weise ein Enzym-Antigen-Konjugat, das spezifisch an den nachzuweisenden immobilisierten Antikörper binden wird, zugegeben werden. Dann wird zur Entwicklung des nachweisbaren Signals ein Enzymsubstrat zugefügt. In der vorliegenden Erfindung wird üblicherweise ein lösliches Substrat verwendet, wodurch man ein in Lösung nachweisbares Signal erhält. Dies ist vorteilhaft, da es die Behandlung und Verarbeitung großer Probenzahlen vereinfacht und erleichtert und die Abschätzung der Antikörperproduktion erlaubt, obwohl, wie oben erwähnt, die absolute Quantifizierung nicht notwendig ist, und man ein qualitatives oder semi-quantitatives Ergebnis erhält, falls dies erwünscht ist. Geeigneterweise kann das Substrat so ausgewählt werden, dass es ein spektrophotometrisch nachweisbares Signal liefert, das einfach durch Ablesen der Absorption ausgewertet werden kann, z. B. unter Verwendung eines Standard-ELISA- Plattengeräts. Tatsächlich können Standard-ELISA-Reagenzien verwendet werden, was den Vorteil hat, dass der erfindungsgemäße Assay mit vorhandenen Methoden und Techniken, die routinemäßig in klinischen Laboratorien eingesetzt werden, kompatibel ist. Jedoch können andere Nachweis/Signal-erzeugende Systeme, die durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz etc. nachweisbare Signale ergeben, verwendet werden.
Immunenzymatische Verstärkungsverfahren können auch zur Verbesserung des Signals und zur Steigerung der Empfindlichkeit verwendet werden, z. B. unter Verwendung von Avidin-Biotin-Verfahren, wie das Extravidin-System, das von Sigma erhältlich ist. Biotinylierte zweite Antikörper werden in Kombination mit einem Peroxidase-Avidin-Komplex als ELISA-Reagenzien verwendet. Da ein Molekül Avidin mehrere Moleküle Biotin binden kann, erhöht die Verwendung von Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexen die Oberflächenkonzentration von Peroxidasemolekülen, was der Methode sogar eine höhere Empfindlichkeit verleiht.
Die Materialien und Mittel, die für den Zellinkubationsschritt (in-Kontakt-Bringen) und den Nachweisschritt der Antikörperbindung notwendig sind, können auch geeigneterweise in Kit-Form zusammen mit der mit dem Bindungspartner beschichteten festen Phase geliefert werden. Die Information, die man aus dem erfindungsgemäßen Assay erhält, kann durch die Verwendung anderer Assay-Verfahren ergänzt werden. Zusätzliche und nützliche Daten über vorher vorhandene Serum/Plasma-Antikörper kann man durch klassische ELISA-Tests erhalten. Zusätzlich kann die nach Abtrennung von Lymphozyten aus der Blutprobe zurückbleibende Plasmaflüssigkeit, sofern man so vorgeht, verwendet werden, um vorher vorhandene Antikörper nachzuweisen, wobei man dieselben mit Bindungspartner beschichtete feste Phase, die im erfindungsgemäßen Assay verwendet wird, verwendet.
Um sicherzustellen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zuverlässig arbeitet, kann man geeignete Kontrollen durchführen. Zunächst gewährleistet der Vergleich zwischen Proteinsynthese- blockierten Wells und nicht blockierten Wells, dass die Erfindung eine akute Antikörperproduktion durch die Testzellen aufzeichnet und nicht nur vorher vorhandene Antikörper aus dem peripheren Blut aufzeichnet. Durch Verwendung gereinigter Lymphozytenpräparationen als Proben wird gewährleistet, dass Spuren von in der Lymphozytenprobe eingeschlossenen Antikörpern des peripheren Bluts nicht den Test beeinträchtigen. Außerdem verwendet man ein negatives Kontrollantigen, um zu ermitteln, dass der aufgezeichnete Unterschied zwischen Signalen von blockierten und nicht blockierten Wells nicht durch sporadisch und unspezifisch (nebenbei) aktivierten Lymphozyten hervorgerufen wird. Dieses Antigen würde von einem infektiösen Mittel stammen, das am unwahrscheinlichsten für die akute Krankheit des Patienten verantwortlich ist, z. B. Tetanustoxin. Die Zahl solcher nebenbei aktivierter Lymphozyten wird in jedem Fall und unter allen Umständen niedriger sein, als für ein positives Testergebnis unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich ist. Die Ausgestaltung dieser Erfindung berücksichtigt diesen Punkt.
Wie oben erwähnt, eignet sich der erfindungsgemäße Assay aufgrund seiner einfachen Bedienbarkeit und -Geschwindigkeit für diagnostische oder andere klinische oder veteränere Verwendungen, z. B. die Fischwirtschaft. Zusätzlich zu den geringen Probenvolumina ist ein weiterer Vorteil, dass nur eine Probe benötigt wird, im Unterschied zu den Serumpaaren, die in einem zwei- bis dreiwöchigen Intervall genommen werden, wie es in den meisten herkömmlichen serologischen Tests notwendig ist. Aufwendige Geräte sind nicht notwendig und der Assay lässt sich leicht automatisieren. Zusätzlich ist es leicht möglich, gegen verschiedene Immunglobulinisotypen zu testen, sofern dies erforderlich ist.
Das oben erwähnte erfindungsgemäße Assay-Verfahren liefert durch Analyse der spontanen Expression von spezifischen Antikörpern gegen ein definiertes Antigen ein Verfahren zur Bewertung der Gegenwart oder des Ausmaßes der beginnenden Infektion. Solch ein Verfahren ist zweifelsohne zur Bewertung von Krankheitsbildern anwendbar, die bekannt sind und zu denen Antigene des relevanten Immunogen erhältlich sind, und liefert folglich eine spezifische Anzeige der Infektion. In manchen klinischen Situationen jedoch kann man die spezifische Krankheit oder Infektion nicht identifizieren und/oder das passende Antigen für die Verwendung im Assay nicht erhalten. In solchen Fällen kann der Assay verändert werden, um die Gegenwart oder das Ausmaß von nicht spezifischen Indikatoren der Infektion zu bewerten. Somit können z. B. Lymphozyten-enthaltende Proben, z. B. Gesamtblut oder daraus gereinigte oder angereicherte Lymphozytenpräparationen, in Bezug auf ihre Produktion von Infektionsmarkern, z. B. Cytokine oder Interferone, wie Interferon-γ untersucht werden.
Folglich betrifft ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von unspezifischen Infektionsindikatoren in einer Blutprobe, wobei man:
Aliquots dieser Probe oder gegebenenfalls von Lymphozyten, die direkt aus dieser Probe isoliert sind, mit einer festen Phase unter Bedingungen, die die Produktion und Sekretion von Infektionsindikatoren durch die Lymphozyten erlauben, in Gegenwart und Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren, in Kontakt bringt;
In Lösung die Bindung von Infektionsindikatoren an einen Bindungspartner an der soliden Phase nachweist; und
die Bindung dieses Infektionsindikators in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren miteinander vegleicht, und damit die Menge an Infektionsindikatoren in dieser Probe bestimmt.
Zur Durchführung dieser Methode kann die feste Phase mit passenden Fängermolekülen ausgestattet sein, z. B. mit Antikörpern zum Nachweis der Infektionsindikatoren. Für den Nachweis der Gegenwart dieser Infektionsindikatoren, die auf der festen Phase immobilisiert sind, können Methoden wie die hier zuvor beschriebene verwendet werden, z. B. unter Verwendung von markierten Antikörpern oder Liganden. Durch dieses Verfahren können spezifische Marker durch geeignete Wahl des immobilisierten Abschnitts oder des Nachweismoleküls identifiziert werden. Folglich kann z. B. das gesamte Protein der Probe auf der festen Unterlage immobilisiert werden und der Nachweis kann unter Verwendung eines markierten spezifischen Antikörpers oder Liganden durchgeführt werden. Alternativ kann ein spezifischer Bindungspartner verwendet werden, um dazugehörende Infektionsindikatoren zu immobilisieren, die dann passend markiert werden können, entweder positiv oder negativ, z. B. in ersterem Fall durch Bindung an eine Domäne, die an dem Infektionsindikator aber nicht exklusiv an diesem Molekül vorhanden ist, oder im zweiten Fall durch Markierung ungebundener Bindungspartner an der festen Phase.
Die Erfindung wird nun mit Hinweis auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele detaillierter beschrieben, wobei das Assay- Verfahren der Erfindung als "Plasmacute"-Assay bezeichnet wird.

Beispiel 1

Allgemeines Verfahren

Zellen: Heparinisiertes Blut, das zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung von Freiwilligen abgenommen wurde, denen inaktivierte Influenzaimpfstoffe gegeben wurden. Blut gemischt mit einem gleichen Volumen PBS. Lymphozyten, abgetrennt durch Lymphoprep (Nyegaard & Co, Oslo). Zellen, zweimal gewaschen in PBS, resuspendiert
(Verdünnungen) in Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium ergänzt mit 20% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin (Pen+Strep) = MEDIUM.
STOP Lösung: 1 mg/ml Cycloheximid angesetzt in PBS, das 10% Natriumazid enthält.
ELISA und Influenza-Antigene: Aufgereinigte Oberflächenantigene aus den drei Virusstämmen des Influenzaimpfstoffs, der in klinischen Versuchen verwendet wird, hier kurz bezeichnet als H3N2, H1N1 und B.
ELISA-Platten: Greiner EIA Platten 655001 F-Form, oder Costar EIA Platten 3590. Beschichtung mit 100 ul/well mit einer Lösung aus 10 ug/ml Protein in PBS über Nacht bei 4ºC. Blockierung mit MEDIUM eine Stunde bei Raumtemperatur. Einmaliges Waschen mit PBS.
TEST: 100 ul-Verdünnungen von Zellsuspensionen in MEDIUM, zu Dreifach-Wells in zwei parallelen Sets für jedes der drei Influenzaantigene gegeben. Ein Set der Dreifach-Wells wird im ersten Schritt durch Zugabe von 50 ul STOP-Lösung blockiert. Inkubation zu ver schiedenen Zeitpunktion bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; in Luft. Die ELISA-Platte wird einmal mit PBS gewaschen, dann zweimal mit PBS mit 0,05% Tween 20. 50 ul/well eines passend verdünnten Kaninchen-Anti-Mensch-Ig-Peroxidase-Konjugats (Sigma) wird zugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Platte wird anschließend unter Verwendung von o-Phenylendiamin-(OPD)-Substrat entwickelt und die Absorption bei 492 nm abgelesen. Blut, das elf Tage nach der Impfung abgenommen wurde Zellinkubationszeit: 4 Stunden, 0 Stunden = blockierte Wells
Alle Eintragungen sind Mittelwerte von Dreifach-Wells als Absorption · 1000. Bereich ± 10%.
Schlußfolgerung: 6.6 10&sup4; = 66.000 Zellen ergeben eine bei 4 stündiger Inkubation signifikante Signalsteigerung. Die H3N2-Absorption erhöht sich um 98%, H1N1 um 153% und B um 50%.
Das ist ein repräsentatives Experiment. Zusätzliche Tests zeigten, dass eine über-Nacht-Inkubation der Zellen einen sogar noch deutlicheren Unterschied zwischen blockierten und unblockierten Wells mit Absorptionen von über 1000 ergibt. Das System ist auch bei kürzeren Inkubationszeiten wirksam, z. B. 2 bis 3 Stunden. Ein Zehntel Zellen, z. B. 6.6 10³ Zellen/well können auch, jedoch nicht immer, einen deutlicheren Unterschied ergeben.

Beispiel 2

Allgemeines Verfahren

Zellen: Heparinisiertes Blut, abgenommen 7 Tage nach der Impfung von Freiwilligen, denen inaktivierter Influenzaimpfstoff gegeben wurde. Blut gemischt mit dem gleichen Volumen PBS. Lymphozyten abgetrennt durch Lymphoprep (Nyegaard & Co, Oslo). Zellen zweimal ge waschen in PBS, resuspendiert in Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium ergänzt mit 20% FCS, 2 mM L-Glutamin, Pen+Strep (wie zuvor) MEDIUM.
STOP Lösung: 1 mg/ml Cycloheximid angesetzt in PBS, das 10% Natriumazid enthält.
TEST-Antigene: Aufgereinigte Oberflächenantigene aus den drei Virusstämmen des Influenzaimpfstoffs, der in klinischen Versuchen verwendet wir, hier kurz bezeichnet als H3N2, H1N1 und B.
Kontrollantigen: Tetanustoxin (nicht Aluminium-absorbiert; Lederle).
ELISA-Platten: Greiner EIA Platten 655001 F-Form, oder Costar EIA Platten 3590. Beschichtung mit 100 ul/well einer Lösung aus 10 ug/ml Protein in PBS über Nacht bei 4ºC, Tetanus: 10 Lf/ml. Blockierung mit MEDIUM eine Stunde bei Raumtemperatur. Einmaliges Waschen mit PBS.
TEST: 100 ul-Verdünnungen aus Zellsuspensionen in MEDIUM wurden zu Dreifach-Wells in zwei parallelen Sets für jedes der drei Influenzaantigene und das Tetanuskontrollantigen gegeben. Ein Set von Wells wird im ersten Schritt durch Zugabe von 50 ul STOP-Lösung blockiert. Drei Stunden bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; in Luft inkubiert. Nach der Inkubation wird die ELISA-Platte einmal mit PBS gewaschen, dann zweimal mit PBS mit 0,05% Tween 20. 50 ul/well eines passend verdünnten Kaninchen-Anti-Mensch-Ig- Peroxidase-Konjugats (Sigma) wird hinzugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Platte wird anschließend unter Verwendung von o-Phenylendiamin-(OPD; Sigma)-Substrat entwickelt und die Absorption bei 492 nm abgelesen. [Der Test kann zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch einen zusätzlichen Schritt vor der Substratzugabe verändert werden, indem man einen einstündigen Extravidin/Peroxidase-Schritt (Sigma) verwendet. Dies erfordert die Ver wendung von biotinyliertem Konjugat, anstelle des Peroxidase Konjugats (Sigma)].

Repräsentative Experimentergebnisse (kein Extravidin):

7 Tage nach der Impfung (2 Personen; #1 und #2)
Zellinkubationszeit: 3 Stunden, 0 Stunden = blockierte Wells
Alle Eintragungen sind Mittelwerte aus Dreifach-Wells als Absorption · 1000. Bereich ± 16%.
Die Personen sind Teenager (16 Jahre). Es ist bestens bekannt, dass Jugendliche besonders gut auf A/H1N1 Influenzaimpfstoff antworten. Das ist oben deutlich zu sehen, beide Personen #1 und #2 antworten gut. Jedoch antworten gewöhnlich Impfpatienten unterschiedlich auf verschiedene Impfstoffbestandteile, so dass Unterschiede in der Steigerung der Absorption erwartet werden müssen. Dies zeigt sich hier in der schwachen Antwort von Person #1 auf das B-Virus, während #2 nur auf das H1N1-Virus signifikant antwortet. Wie erwartet, antwortet keiner von Ihnen auf das Tetanustoxin. Wenn überhaupt, könnte das immunologische frühere Gedächtnis (durch Impfung in der Kindheit) von Zellen, die in in vitro mit Toxin über einen Zeitraum von mehreren Tagen stimuliert wurden, zu einer Tetanusantikörperproduktion geführt haben. Bei einem tatsächlichen Infektionsereignis, untersucht in einem diagnostischen Labor unter Verwendung der Erfindung, wird nur ein Testmittel/Antigen ein positives Signal liefern.

Beispiel 3

Allgemeines Verfahren:

Zellen: Heparinisiertes Blut 6 Tage nach der Impfung von einem Erwachsenen (männlich, 24 Jahre alt) und einem Kind (männlich, 3 Jahre alt) abgenommen, die inaktivierten Impfstoff aus Influenzauntereinheiten erhielten. Lymphozyten wurden, wie unter Beispiel 1 und 2 beschrieben, abgetrennt. Die Zellen wurden 3 Stunden bei 37ºC mit der festen Phase in Kontakt gebracht, die das Antigen H3N2, H1N1 und B, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, trug und der Test wurde wie beschrieben entwickelt (in diesem Experiment wurde keine STOP- Lösung oder Kontrollantigen verwendet).
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der zwei Personen, wobei der angezeigte Wert für jedes Antigen ein Mittelwert von Dreifach-Wells als Absorption · 1000 ist. Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, dass das kleine Kind, das nur eine frühere Influenzaepisode hatte, eine A/H3N2-Infektion, eine sehr starke Immunantwort auf den A/H3N2-Bestandteil im trivalenten Impfstoff ausbildete. Wie bei diesem Kind erwartet, gab es keine Antwort auf die Bestandteile A/H1N1 und B. Solch kleine Kinder benötigen gewöhnlich 2 Impfstoffdosierungen im Abstand von einigen Wochen, um eine zufriedenstellende Immunantwort zu liefern. Etwa 70.000 Lymphozyten, einem Volumen von 70 ul Vollblut entsprechend, reichten aus, um ein eindeutig positives Ergebnis zu erhalten. Beim Erwachsenen mit bereits mehreren Influenzaepisoden war die Antwort auf alle drei Bestandteile des Impfstoffs nicht so heftig, aber dennoch signifikant, obgleich in unterschiedlichem Ausmass. Beim B-Bestandteil waren etwa 100.000 Lymphozyten notwendig um eine positive Antwort zu erhalten, während die zwei A-Bestandteile mindestens 100.000 Zellen, vorzugsweise 200.000 Zellen erforderten.

Beispiel 4: Nachweis von Herpes simplex Typ 2 mit Hilfe klassischer oder Plasmacute-Assay-Verfahren

Allgemeines Verfahren

Gewebekultur und serologische Analysen

Material von Genitalien von fünf Personen, die Symptome zeigten, die auf eine Genitalherpes-Virus-Infektion schließen lassen, wurde Routinegewebekulturverfahren ausgesetzt, um zu versuchen, den replizierenden Virus in der Probe nachzuweisen (durchgeführt vom Viruslabor, Haukeland University Hospital, Bergen). Dasselbe Labor führte zum Nachweis von IgG und IgM serologische Routineanalysen an Serumproben unter Verwendung käuflich erhältlicher ELISA-Kits (Behringer Enzygnost von Behringer, Deutschland) durch, die HSV- Antigene enthielten.

Abtrennung von Lymphozyten

Lymphozyten wurden mithilfe der Lymphoprep-(Nycomed)- Dichtegradienten-Zentrifugation aus heparinisiertem Blut isoliert, das gleichzeitig mit den Krankenhausproben von fünf Personen abgenommen wurde, die Symptome zeigten, die auf einer Genitalherpessimplex-Infektion schließen lassen. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und in DMEM Kulturmedium, das 20% FCS, 1 mM L- Glutamin, 50 IU/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin (DMEM/FCS) enthielt, resuspendiert. Lebende Zellen wurden durch Trypanblauausschluß (0,2%) gezählt.

Plasmacute-Assay unter Verwendung der Behringer Enzygnost Anti-HSV- IgM- und IgG-ELISAs

Behringer Enzygnost anti-HSV-IgM und -IgG wurden als Streifen geliefert, die acht Wells enthielten, beschichtet mit einem Antigen, das von beständigen Simian-Nierenzellen, infiziert mit HSV, stammte, und acht Wells, -beschichtet mit Kontrollantigen aus nicht- infizierten Zellen. Die Streifen wurden mit 200 ul/well DMEM/FCS eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; blockiert. 100 ul/well der geeigneten Lymphozytenverdünnung wurden hinzugefügt und drei Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Alle nachfolgenden Verfahren entsprachen genau den vom Hersteller des Kits angegebenen Anweisungen. Die Platten wurden unter Verwendung der Konjugate, Reagenzien und Puffer, die vom selben Hersteller geliefert wurden, entwickelt. Das Substrat, Tetramethylbenzidinhydrochlorid (TMB) erforderte ein Ablesen der ODs bei 450 nm, unter Verwendung des vorhandenen Titertek-Multiskan-MCC/340-Plattenlesegeräts (Flow Laboratories).

Plasmacute-Assay unter Verwendung des Biloelisa HSV-2-IgG

Der Bioelisa-IgG HSV-2-ELISA (BIOKIT, Spanien) wird als Streifen geliefert, der acht Wells enthält, die mit inaktiviertem HSV-2- Antigen beschichtet sind. Die Streifen wurden mit 200 ul/well DMEM/FCS eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; blockiert. 100 ul/well der passenden Lymphozytenverdünnung wurden zugefügt und drei Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Alle nachfolgenden Verfahren entsprachen genau den vom Hersteller des Kits angegebenen Anweisungen. Die Platten wurden unter Verwendung der Konjugate, Reagenzien und Puffer, die vom selben Hersteller geliefert wurden, entwickelt. Das Substrat Tetramethylbenzidinhydrochlorid (TMB), erforderte ein Ablesen der ODs bei 450 nm, unter Verwendung des vorhandenen Titertek-Multiskan-MCC/340-Plattenlese- geräts (Flow Laboratories).

Plasmacute-Assay unter Verwendung des Bioelisa-HSV-IgM- (Immunocapture) Assays

Der Bioelisa-HSV-IgM-(Immunocapture)-Assay (BIOKIT, Spanien) wird als Streifen geliefert, der acht Wells enthält, die mit Kaninchen- anti-Mensch-IgM-Antikörpern beschichtet sind. Die Streifen wurden mit 200 ul/well DMEM/FCS eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; blockiert. 100 ul/well der passenden Lymphozytenverdünnung wurden hinzugefügt und 3 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Alle Verfahren wurden gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Speziell wurde der gebundene Antikörper mit 100 ul/well HSV-Antigen nachgewiesen, das mit Meerrettich-Peroxidase (aufgereinigtes und inaktiviertes HSV, das in vitro in menschlichen Fibroblasten hergestellt wurde) war, und zur Minimierung unspezifischer Reaktionen nicht-markierte Kontrollantigene, bestehend aus nichtinfizierten zellulären Bestandteilen (geliefert mit dem Kit), 10 ul HSV-Antigen und 10 ul Kontrollantigen pro Streifen. Die Platten wurden im einem Titertek Multiskan MCC/340 Plattenlese bei 450 nm (Flow Laboratories) gelesen.
Die Ergebnisse des Experiments werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
nt = nicht getestet
Tabelle 2 fasst die Daten der Patienten 1 bis 5 zusammen. Das diagnostische Labor am Haukeland Universitätskrankenhaus versuchte, das Virus aus klinischen Proben zu isolieren, und führte unter Verwendung des Behringer Enzygnost ELISA-Kits auch Routine-ELISA-Tests zu Serum- IgG und -IgM durch. Der isolierte Virustyp ist angegeben, -ve bedeutet negative Isolierung. Serum-ELISA-Ausschlußwerte werden vom Hersteller des Kits festgelegt; + = OD > 0,2, grenzwertig = OD 0,1-0,2, vom Hersteller des Assays als nicht-eindeutiges Ergebnis definiert; und -- = OD < 0,1.
Für den Plasmacute-Assay haben wir die OD < 0,2 als positiv verwendet und die Zahlen der Lymphozyten, die notwendig sind, eine solche Antowort herbeizuführen, tabellarisch dargestellt.
Nur der Bioelisa-IgG-Test beansprucht die Identifizierung von HSV2-Antikörpern, während die anderen die Infektionen mit HSV (1 und/oder 2) anzeigen.

Ergebnisse

Patient 1 zeigte klinische Symptome einer primären HSV-2-Infektion. Die Krankenhaustests versagten bei der Isolierung des Virus aus der klinischen Probe, und es wurde kein IgM durch Standard-ELISA-Assays gefunden. Es wurde grenzwertig Serum-IgG-Antikörper durch Standard- Krankenhaus-ELISA-Tests gefunden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurden im Plasmacute-Assay keine Zellen gefunden, die IgM- Antikörper produzierten. Sowohl der Behringer-IgG als auch der Bioelisa-IgG-Plasmacute-Assay wiesen Zellen nach, die IgG-Antikörper gegen HSV produzierten. 205.000 Lymphozyten waren notwendig, um die Ausschlußabsorption im Behringer-Plasmacute-Assay zu erreichen und im Bioelisa-IgG waren 103.000 Lymphozyten erforderlich, um die Ausschlußabsorption zu erreichen.
Patient 2 durchlief eine Primärinfektion, die durch eine Virusisolierung als HSV-Typ 1 bestätigt wurde. Das Krankenhauslabor wies kein IgM nach, aber IgG-Antikörper wurden nachgewiesen. Im Plasmacute-Assay wurden keine Zellen nachgewiesen, die IgM produzieren, jedoch sowohl der Behringer als auch der Bioelisa-Plasmacute-Assay wiesen IgG- produzierende Zellen nach, 223.000 bzw. 111.000 Zellen waren erforderlich.
Patient 3 hatte eine wiederkehrende HSV-2-Infektion, was durch Isolierung des HSV-2-Virus aus klinischen Proben bestätigt wurde. IgG war in einer Serumprobe, die 2 Tage nach Beginn klinischer Symptome genommen wurde, enthalten, jedoch wurde kein Serum-IgM zu dieser Zeit nachgewiesen. Im Plasmacute-Assay wurde 2 Tage nach Beginn klinischer Symptome kein IgM nachgewiesen, jedoch sowohl der Behringer als auch der Bioelisa-Plasmacute-Assay wiesen IgG-produzierende Zellen nach (48.000 bis 96.000 Zellen erforderlich). IgM-Serum-Antikörper wurden vom Krankenhaus in einer Serumprobe, die 20 Tage nach Beginn der klinischen Symptome genommen wurde, nachgewiesen. 182.000 Zellen waren erforderlich, um eine Ausschlußabsorption im Plasmacute-Behringer-IgM- Assay herzustellen, jedoch wurden durch den Bioelisa-IgM-Plasmacute- Assay keine Zellen nachgewiesen.
Patient 4 hatte eine Primärinfektion mit HSV. In der klinischen Probe, die an das Krankenhauslabor geschickt wurde, wurde kein Virus nachgewiesen. Es wurden grenzwertig Serum-IgM-Antikörper nachgewiesen, und man fand positive Serum-IgG-Antikörper-Level. Sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper wurden im Plasmacute Assay unter Verwendung sowohl des Behringer als auch des Bioelisa-Kits in Blutproben, die 5 und 19 Tage(kein Behringer IgM nachgewiesen) nach Beginn klinischer Symptome genommen wurde, nachgewiesen. Im Plasmacute-Assay waren weniger als 8.000 Zellen für den Bioelisa-IgM-Assay erforderlich und 60.500 waren für den Behringer-IgM-Assay erforderlich, von denen beide weniger als 100 ul heparinisiertes Blut benötigten.
Bei Patient 5 vermutete man eine Primärinfektion mit HSV. Jedoch wurde vom Labor kein Virus isoliert, und die nicht-Serum-Antikörper wurden nachgewiesen. Im Plasmacute-Assay wurden keine Zellen nachgewiesen, die entweder IgG- oder IgM-Antikörper gegen HSV produzierten.

Diskussion

Es wurde gezeigt, dass der Plasmacute-Assay sowohl bei primären als auch bei wiederauftretenden Infektionen mit Herpes Viren wirksam ist. In allen Beispielen erbrachte der Plasmacute-Assay mindestens dieselbe gute Leistung wie die hier verwendeten traditionellen ELISA-Verfahren. Insbesondere bei Patient 1 zeigte der Plasmacute-Assay, dass etwa 100.000 bzw. 200.000 Zellen ein eindeutig positives Ergebnis ergaben, obwohl kein Virus aus der klinischen Probe isoliert wurde und diese durch Krankenhaus-Routine-Assay nur als grenzwertig positiv (d. h. nicht schlüssig) bewertet wurde. Es ist möglich, dass dieser Patient eine zweifache Infektion (HSV1 und HSV2) hatte, von denen nur HSV1 durch Virusisolierung gefunden wurde. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass das positive HSV2-Ergebnis (Bioelisa-IgG) durch eine serologische Kreuzreaktion hervorgerufen wurde. Bei den zwei über einen längeren Zeitraum genommenen Proben von Patient 4, aus denen kein Virus isoliert wurde, zeigte der Plasmacute-Assay von der frühen Phase zur späteren Phase der Infektion eine Verschiebung der Zahl der Lymphozyten, die Herpes-spezifische IgM und IgG produzieren, in Übereinstimmung mit der bekannten Dynamik, die einer Primärinfektion folgt, die eindeutig eine aktive Immunantwort bestätigt. Der Bioelisa- IgM -Plasmacute-Test war besonders empfindlich, da weniger als 8.000 Lymphozyten erforderlich waren, um ein positives Signal in der ersten der zwei Proben zu liefern.
Wir haben in diesem Experiment gezeigt, dass das Plasmacute- Verfahren bei klinischen Fällen viraler Infektionen des Menschen wirksam ist.
Experiment 5: Mehrfach-Scheiben - Beschichtung von Nitrocellulosescheiben mit Fängerantikörpern, die spezifisch für IgG-, IgA- und IgM-Antikörper sind.
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um nachzuweisen, ob ein Mehrfachscheibensystem im Plasmacute-Assay für nachgewiesene Antikörper verschiedener Spezifitäten verwendet werden kann.

Allgemeines Verfahren

Heparinisierte Vollblutproben wurden von zwei gesunden erwachsenen Patienten genommen. Da sich diese Patienten nicht in einer akuten Phase einer Infektion befanden, beabsichtigten wir die spontane IgG-, IgM- und IgA-Antikörpersekretion ungeachtet ihrer (unbekannten) antigenen Spezifität zu analysieren.
Person 1 wurde verwendet, um zu ermitteln, ob ein System, dass mit 3 verschiedenen Antigenen beschichtete Scheiben verwendet, in einem einzelnen Well im Plasmacute-Assay verwendet werden kann. Ein Well (Nr. 1).
Person 2 wurde verwendet, um zu ermitteln, ob in Anwesenheit einer Zahl von Scheiben, die mit demselben Antigen beschichtet sind, eine Schwächung des Signals auftitt. Drei getrennte Wells im Plasmacute- Assay (Wells Nr. 2, 3 und 4).

Abtrennung von Lymphozyten

Lymphozyten wurden mithilfe der Lymphoprep-(Nycomed)-Dichtegradienten- Zentrifugation aus heparinisiertem Blut isoliert. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und in DMEM-Kulturmedium, das 20% FCS, 1 mM L-Glutamin, 50 IU/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin (DMEM/FCS) enthielt, suspendiert. Lebende Zellen wurden durch Trypanblau- Ausschluß (0,2%) gezählt.

Plasmacute-Assay unter Verwendung von Scheiben als feste Phase

Gemischte Ester von Cellulosescheiben mit einer Porengröße von 8 um (Millipore SCWP 013 00) wurden mit 10 ug/ml klassenspezifischen Ziegen-Anti-Mensch-Antikörpern (Sigma, Anti-IgG I-3382; Anti-IgA I-0884; Anti-IgM I-0759) gelöst in PBS-Azid (0,001%), über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Die Scheiben wurden mit DMEM/FCS eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; blockiert. Die Lymphozyten wurden in ein klares 12 mm- Transwell mit einer Porengröße von 0,4 um (Costar 3460) gegeben und die Scheiben daruntergestellt, und 3 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Einzelne Scheiben wurden in getrennte Wells einer 24-Well- Platte (Costar) überführt und dreimal mit PBS und dreimal mit PBS- Tween (0,05%) gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mit 200 ul/well klassenspezifischen Ziege-Anti-Mensch-Peroxidase-konjugierten Antikörpern (Sigma IgG A-6029, IgA A-4165, IgM A-4290) nachgewiesen, in DMEM/FCS gelöst und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Scheiben wurden, wie zuvor beschrieben, zur Beseitigung ungebundenen Antikörpers, gewaschen und unter Verwendung von 200 ul/Well o-Phenylen-diamin-dihydrochlorid (OPD) (Sigma P-7288) in 0,05 M Phosphatcitratpuffer (pH 5,0) entwickelt. 30 Minuten nach Zugabe des Substrats wurde die Entwicklung unter Verwendung von 100 ul/Well 1 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. 100 ul/Well wurden in eine 96-Well-ELISA-Platte (Greiner EIA Platten 655001 F-Form) überführt und die ODs wurden bei 492 nm in einem Titertek-Multiskan-MCC/340-Plattenlesegerät (Flow Laboratories) ausgewertet.
Die Ergebnisse des Experiments werden in Tabelle 3 gezeigt, in der die Anzeige für jeden Fängerantikörper den Mittelwert von Dreifach- Wells als Absorption · 1000 entspricht. Tabelle 3
Well 1 enthielt zwei Millionen Lymphozyten, die Wells 2 bis 4 enthielten 1 Mio. Lymphozyten. Die "Zell"-Referenz ist dazu da, umzu zeigen, welche Scheibennummern der Zelllage am nächsten lokalisiert war.

Ergebnisse:

Der Test mit Person 1 zeigte, dass man in dem Well, das die Lymphozyten enthält, sogar neun Scheiben einfach verwenden kann. Die Antwort für die drei IgG-Scheiben, die drei IgA-Scheiben und die drei IgA- Scheiben waren für alle praktischen Zwecke und für jedes Set identisch und zeigten folglich, dass die aktuelle Position einer Scheibe relativ zu den Antikörper-sekretierenden Lymphozyten nicht entscheidend war. Der Test mit Lymphozyten von Person 2 zeigte, dass man mindestens acht identisch beschichtete Wells in ein Well, das Lymphozyten enthielt, stellen konnte und identische Ergebnisse erhält. Folglich erlaubt die Erfindung mehrere Assays bei derselben Lymphozytenpräparation in einem Well.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer aktiven Antikörperproduktion als Antwort auf ein Zielantigen in einer Blutprobe, wobei man:

(a) Aliquots der Probe oder gegebenenfalls aus der Probe direkt isolierter Lymphozyten unter Bedingungen, welche die Produktion und Sektretion von Antikörpern durch die Lymphozyten zulassen, in Gegenwart und in Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren mit einer festen Phase in Kontakt bringt;

(b) in Lösung die Antikörperbindung an das Antigen (die Antigene) auf der festen Phase nachweist; und

(c) die Antikörperbindung in Gegenwart und in Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren miteinander vergleicht und damit die Menge an aktiver Antikörpersekretion als Antwort auf das Antigen (die Antigene) bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die feste Phase ein oder mehrere Antigene trägt, die von dem oder den nachzuweisenden Antikörpern erkannt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die feste Phase ein oder mehrere Antigene trägt, die den oder die nachzuweisenden Antikörper erkennen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Blutprobe zur Verwendung in diesem Verfahren oder zur Präparation von Lymphozyten zur Verwendung in diesem Verfahren ein Volumen von weniger als 1 ml hat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren an Blutproben von Neugeborenen oder Kindern durchgeführt wird, um zwischen neu synthetisierten Antikörpern und passiv übertragenen, mütterlichen Antikörpern zu unterscheiden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Blutprobe erhalten wird, indem man dem Patienten direkt abgenommenes Blut reinigt oder anreichert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in dem Verfahren Lymphozyten verwendet werden, die direkt aus der Probe isoliert wurden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei man vor dem Schritt des In-Kontakt-Bringens aus Anspruch 1 den festen Träger blockiert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei als Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid bei einer Konzentration von 50-500 ug/ml verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein ATPase-Inhibitor zusammen mit dem Proteinsyntheseinhibitor verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Nachweisschritt aus Anspruch 1 mit einem Immunoassay vorgenommen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Immunoassay ein ELISA ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei ein oder mehrere Antigene, die durch den oder die nachzuweisenden, auf der festen Phase immobilisierten Antikörper erkannt werden, mit der festen Phase in Kontakt gebracht werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 12, wobei ein oder mehrere Antikörper, die den oder die auf der festen Phase immobilisierten Antikörper erkennen, mit der festen Phase in Kontakt gebracht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei ein lösliches Substrat für den Nachweisschritt aus Anspruch 1 verwendet wird und ein spektrophotometrisch nachweisbares Signal liefert.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei ein Negativkontroll-Antigen verwendet wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei eine aktive Antikörperproduktion gegen Herpes-Viren nachgewiesen wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 17, wobei multiple Festphasen verwendet werden, die jeweils ein unterschiedliches Zielantigen aufweisen.

19. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines nichtspezifischen Infektionsindikators in einer Blutprobe, wobei man:

Aliquots der Probe oder gegebenenfalls aus der Probe direkt isolierter Lymphozyten unter Bedingungen, welche die Produktion und Sekretion von Infektionsindikatoren durch die Lymphozyten zulassen, in Gegenwart und in Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren mit einer festen Phase in Kontakt bringt;

in Lösung die Infektionsindikatorbindung an einen Bindungspartner auf der festen Phase nachweist; und

die Bindung des Infektionsindikators in Gegenwart und in Abwesenheit von Proteinsyntheseinhibitoren miteinander vergleicht und damit die Menge an Infektionsindikatoren in der Probe bestimmt.