DE69026106T2

DE69026106T2 - Verfahren, das gemischte immunoglobuline verwendet, zum nachweis von rheumatischen faktoren

Info

Publication number: DE69026106T2
Application number: DE69026106T
Authority: DE
Inventors: Richard Weisbart
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1989-10-23
Filing date: 1990-10-03
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2010-10-04
Also published as: DK0497886T3; EP0497886A4; CA2070411A1; EP0497886B1; WO1991005873A1; ES2085917T3; ATE135821T1; JP2905595B2; EP0497886A1; JPH05501919A; DE69026106D1

Description

Einleitung

Technisches Anwendungsgebiet

Das Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis des Rheuma-Faktors.

Hintergrund

Rheuma-Faktoren sind Antiglobulin-Antikörper, die sich an heterogene Determinanten an dem kristallisierbaren Fragment (Fc) von IgG-Immunglobulinen binden und in dem Serum und in der Synovial-Flüssigkeit der meisten Patienten mit rheumatoider Arthritis gefunden werden. Die Rolle der Rheuma- Faktoren bei der Pathogenese von rheumatoider Arthritis war bisher zweifelhaft, weil sie auch in Patienten mit verschiedenen anderen chronischen Erkrankungen vorhanden sind, was vermuten läßt, daß ihre Anwesenheit nichtspezifisch ist. Die Bindungsspezifität von Rheuma-Faktoren ist jedoch manigfaltig und sie umfaßt allotypische Antigene (Gm) auf Human-IgG, Neoantigene, die innerhalb von IgG entstehen durch die Bildung von Immunkomplexen und kreuzreaktive Antigene, die anderen Säugetier-IgG-Immunoglobulinen gemeinsam sind.
Rheuma-Faktoren, die sich an Alloantigene binden, können auftreten als Folge von Bluttransfusionen und der Schwangerschaft, sie stellen jedoch keine echten Auto-Antikörper dar, wenn sie sich nicht selbst an Determinanten binden. Rheuma-Faktoren, die Neoantigene binden, sind ebenfalls keine echten Auto-Antikörper, da sie auf neue Determinanten gerichtet sind, die innerhalb von Immunkomplexen entstehen. Im Gegensatz dazu wurde eine autologe reaktive Rheuma-Faktor-Spezifität Ga im Rheumaserum nachgewiesen.
Die Anwesenheit von autoreaktiven Rheuma-Faktoren in zirkulierenden Immunkomplexen aus Patienten mit rheumatoider Arthritis stützt eine potentielle pathogene Rolle für diese Auto-Antikörper. Die zum Nachweis von Rheuma- Faktoren derzeit angewendete Methode identifiziert jedoch nicht ausschließlich die Anwesenheit von autoreaktiven Antikörpern. Darüber hinaus sind die Methoden zur Bestimmung von verwandten Rheuma-Faktor-Auto-Antikörpern zu komplex, um eine Beurteilung ihrer Spezifität für rheumatoide Arthritis zu erlauben. Es besteht daher ein großes Interesse daran, Methoden zu entwickeln, die eine signifikante Spezifität für rheumatoide Arthritis aufweisen.

Relevante Literatur

Ein monoklonaler Antikörper hRF-1, der aus dem Synovialgewebe eines Patienten mit rheumatoid-artiger Arthritis isoliert wurde, der sich an multiple Säugetier-IgG-Immunglobuline bindet, wurde von Weisbart et al. in "J. Immunol.", 139 : 2925-2928 (1987), beschrieben. Über das Vorhandensein einer autologen reaktiven Rheuma-Faktor-Spezifität Ga in einem Rheumaserum wurde von Allen und Kunkel in "Arth Rheumatism, 9 : 758-768 (1966), berichtet. Generelle Beschreibungen von Rheuma-Faktoren sind zu finden in Waller, "Acta Pathol. Microbiol. Scand." 17 : 172-188 (1940); Rose et al., "Proc. Soc. Exp. Biol. Med" 68, 1-6 (1948), und Natvig et al., "Clin Exp Immunol" 12 : 177-183 (1972). Cohen et al. berichten in "J. Immunology", 139 : 1466 (1987), daß IgG RF in RA-Patienten IgG&sub4;-Antikörpern überwiegen. Carsen "Rheumatoid factor in: Textbook of Rheumatology" (Kelly et al., eds.), W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa, 1981, S. 685, und Pope und McDuffy, "J. Lab. Clin. Med." 97 : 842-853 (1981), diskutieren die Bindung von RF in RA-Serum an heterologe Säugetier-IgG. In der zuletzt genannten Literaturstelle ist auch angegeben, daß Pferde-IgG einen empfindlicheren Assay für den Nachweis von RF in Seren von Patienten mit rheumatoider Arthritis ergibt. Butler und Vaughan beschreiben die Reaktion des Rheuma-Faktors mit tierischen γ-Globulinen in "Immunology", 8 : 144-159 (1965).
In EPA-0323785 ist ein Immunoassay zum Nachweis des Vorhandenseins von Rheuma-Faktoren beschrieben, bei dem ein einzelnes Ovin (Schaf)- Immunglobulin an einen Träger gebunden wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Rheuma-Faktor wird in einem Sachwich-Assay bestimmt, bei dem als Liganden für den Rheuma-Faktor Human-IgG und Schaf-IgG verwendet werden. Insbesondere wird ein ELISA-Assay zum Nachweis des Rheuma- Faktors angewendet, insbesondere in Verbindung mit Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis, die eine aktive Erkrankung haben.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Ein verbesserter empfindlicher Assay wird bereitgestellt für den Nachweis des Rheuma-Faktors in Human-Patienten, insbesondere solchen, die eine aktive Form der Erkrankung haben. Das Verfahren liefert den Nachweis des Vorhandenseins einer Komponente im Humanserum, die ein Verbindungsglied zwischen Human-IgG und Rinder-IgG, insbesondere Schaf-IgG ergibt. Durch Bereitstellung eines der IgG-Liganden, der an einen festen Träger gebunden werden soll, und des anderen, der frei in Lösung vorliegt, insbesondere des Schaf-IgG, das an den Träger gebunden ist, wird ein empfindlicher Assay erzielt. Insbesondere kommt es bei dem Assay zu einem geringen Auftreten der Angabe von falschen Positivergebnissen, während gleichzeitig eine hohe Korrelation zwischen der aktiven Form von rheumatoider Arthritis und einem positiven Ergebnis erzielt wird.
Das Ovin-IgG (Schaf-IgG) kann aus irgendeiner geeigneten Quelle erhalten werden und ist im Handel erhältlich. Konventionelle Methoden zur Isolierung von IgG aus Säugetier-Blut sind in der Literatur sehr häufig beschrieben. Ovin-IgG kann beispielsweise von Organon Technika, West Chester, PA, erhalten werden. Das Human-IgG kann auf irgendeine geeignete Weise erhalten werden, entweder aus handelsüblichen Quellen oder unter Anwendung konventioneller Verfahren für die IgG-Isolierung.
Die Seren, die als Probe verwendet werden, werden nur im Verhältnis von mindestens 1 : 20, häufiger im Verhältnis von mindestens etwa 1 : 80 verdünnt und sie können mindestens im Verhältnis von etwa 1 : 100 verdünnt werden. Zweckmäßig wird ein Ausschalten (cutoff) eines positiven Ergebnisses erzielt bei einer Verdünnung von mindestens etwa 1 : 100 oder mindestens etwa 1 : 150.
Die nicht-gebundene Liganden-IgG wird markiert, entweder direkt oder indirekt mit einer Markierung, die ein nachweisbares Signal liefert. Es ist eine große Vielzahl von Markierungen bekannt, beispielsweise Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Teilchen und dgl. Diese Markierungen können covalent an den IgG-Liganden oder an ein anderes Molekül, das sich an den IgG-Liganden bindet, gebunden werden. So kann beispielsweise das nicht-gebundene IgG mit einem kleinen Molekül wie Biotin, konjugiert sein und die nachweisbare Markierung kann an Streptavidin oder Avidin (nachstehend als "Avidin" bezeichnet) gebunden sein. Durch Durchführung eines 2-Stufen-Assays, bei dem die Probe mit den beiden verschiedenen IgG-Liganden kombiniert wird, kann das markierte Avidin dann zugegeben werden zur Bestimmung der Anwesenheit des spezifisch an den Träger gebundenen Human- oder Ovin-IgG-Liganden.
Der Assay kann in jeder geeigneten Form als Sandwich-Assay durchgeführt werden. Das heißt, der gebundene IgG-Ligand kann kovalent oder nichtkovalent an eine Oberfläche gebunden sein, bei der es sich um die Wand eines Behälters, beispielsweise eine Mikrotiterplatten-Vertiefung, um Perlen, beispielsweise Glasperlen mit kontrollierten Poren-, Pyrex-Perlen und dgl., Kapillarrohrwände oder dgl. handeln kann. Verfahren zum Binden von Proteinen an eine Oberfläche sind allgemein bekannt und brauchen hier nicht beschrieben zu werden. Die Oberfläche kann eine aktive Oberfläche sein, an der kovalente Reaktionen zwischen einer funktionellen Gruppe auf der Oberfläche und dem Protein auftreten, oder eine Oberfläche, an die sich das Protein nichtspezifisch, insbesondere nach dem Erhitzen, bindet und während des Verlaufs des Assays zurückgehalten wird. Es stehen verschiedene aktivierte Substrate zur Verfügung, die funktionelle Gruppen aufweisen, die an das Protein gebunden werden. Zu funktionellen Gruppen gehören aktive Carboxylgruppen, Iminogruppen, Aldehyde und dgl.
Zu spezifischen interessierenden Markierungen gehören Enzyme, z. B. Hydrolasen und Oxidoreduktasen, beispielsweise alkalische Phosphatase, β- Galactosidase, Glyceryl-3-phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehyderogenase, Meerrettich-Peroxidase, Glucose- Oxidase, Uricase, Xanthin-Oxidase und dgl. Zu fluoreszierenden Stoffen, die verwendet werden können, gehören Fycobili-Proteine, Fluorescein, Dansyl, Rhodamin, Bumbelliferon und dgl.
Bei der Durchführung des Assays wird die Probe mit dem an das Substrat gebundenen IgG-Liganden in Kontakt gebracht. Die Blutprobe kann einer vorherigen Behandlung unterzogen worden sein, beispielsweise einer Entfernung von roten Blutkörperchen, um ein Serum oder Plasma zu ergeben, eine Citratbildung mit Citronensäure, insbesondere einer Verdünnung mit einem Puffer oder dgl. In der Regel werden die Seren verdünnt, um einen geeigneten Cutoff zu ergeben, um das praktische Fehlen von falschen positiven Ergebnissen zu gewährleisten.
Es können verschiedene Puffer verwendet werden, die so ausgewählt werden, daß sie mit dem Assay kompatibel sind. Zu Puffermitteln gehören Tris, MOPS, HEPES, Phosphate, Borat, Carbonat und dgl. Der jeweilige Puffer ist hauptsächlich eine Sache der willkürlichen Wahl, obgleich ein Puffer bevorzugt sein kann gegenüber einem anderen in einem speziellen Assay-Protokoll, das mit einer speziellen Markierung in Verbindung steht. Allgemein liegt die Puffer-Konzentration in dem Bereich von etwa 10 bis 400 mM und der pH-Wert liegt allgemein in dem Bereich von etwa 5 bis 11, insbesondere von etwa 6 bis 10. Zu weiteren Komponenten können gehören inerte Proteine, wie Rinderserumalbumin oder Ovalbumin, um die nicht-spezifische Bindung zu reduzieren, wobei die zugegebenen Proteine in der Regel in einer Menge von nicht mehr als etwa 2% vorliegen.
Die spezielle Reihenfolge der Zugabe der Probe und des nichtgebundenen IgG-Liganden ist nicht kritisch, obgleich die Probe und der markierte IgG-Ligand vorzugsweise gleichzeitig zu dem gebundenen IgG- Liganden zugegeben werden. Die Assay-Mischung kann dann mindestens 30 min lang, vorzugsweise mindestens 1 h lang, insbesondere mindestens etwa 6 h lang, inkubiert werden und dann wird sie auf geeignete Weise analysiert, je nachdem, ob der markierte IgG-Ligand eine nachweisbare Markierung aufweist oder die Bindung einer nachweisbaren Markierung erfordert. Es kann ein beträchtlicher Überschuß an dem markierten Liganden verwendet werden, um eine optimale Bindung bis zur Sättigung an die verfügbaren Stellen der RF in den Seren zu gewährleisten.
Nach der Inkubation wird die überstehende Flüssigkeit entfernt, die Oberfläche wird mit einer gepufferten Lösung, beispielsweise dem zum Verdünnen der Probe verwendeten Puffer, gründlich gewaschen und die Anwesenheit der spezifisch gebundenen Markierung wird, falls vorhanden, nachgewiesen. Wenn die Markierung an den IgG-Liganden gebunden ist, können Markierungen, die direkt bestimmt werden können, beispielsweise Radioisotope oder fluoreszierende Verbindungen, bestimmt werden. Wenn eine nachweisbare markierte Einheit erforderlich ist, beispielsweise markiertes Avidin, wird die markierte Einheit zugegeben, um eine vollständige Bindung an eines der komplementären spezifischen Bindungselemente, die auf der Oberfläche vorhanden sind, zu gewährleisten. Falls erforderlich, kann die Markierung direkt oder mit einem zugegebenen Enzymsubstrat bestimmt werden und die Anwesenheit eines nachweisbaren Moleküls kann gemessen werden. Meistens umfassen die Enzym-Substrate Leucofarbstoffe, aus denen gefärbte Farbstoffe oder fluoreszierende Verbindungen entstehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht automatisiert werden, die Zugaben, Inkubationen und dgl. können kontrolliert werden, es können Waschungen vorgesehen sein, und die Ergebnisse können abgelesen werden.
Die erfindungsgemäßen Reagentien können zweckmäßig in Form eines Kits vorliegen, in dem der an die Oberfläche gebundene IgG-Ligand, der markierte Ligand entweder selbst oder in Verbindung mit einem markierten spezifischen Bindungsmolekül in für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Assay geeigneten Mengen vorliegen. Zweckmäßig kann für eine Enzymmarkierung auch ein Substrat mit anderen Reagentien, z. B. einem Puffer, einem inerten Protein, beispielsweise Ovalbumin und dgl., versetzt sein.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Versuche

A. Rheuma-Faktor-Assays

Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit gereinigtem Schafs-IgG bedeckt. IgG (10 µg/ml) in 0,06 M Carbonatpuffer, pH 9,6, wurden über Nacht bei 4ºC in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Die Seren wurden bei einer Verdünnung von 1 : 160 untersucht und der IgG-Rheuma-Faktor wurde bestimmt unter Verwendung von Human-IgG, das unter Verwendung von NHS- LC-BIOTIN biotinyliert worden war (Pierce, Rockford, IL). In der Inkubationslösung waren 0,625 µg biotinyliertes Human-IgG enthalten. Nach der Inkubation wurde überschüssige Meerrettich-Peroxidase, die mit Streptavidin konjugiert war, zugegeben (0,1 µg/ml in 100 µl), die Platten wurden mit PBST gewaschen und die Umwandlung von 2,2'-Azino-di-1,3-ethylbenzthiazolinsulfonat in einen Chromophoren mit einem optischen Dichtemaximum (Extinktionsmaximum) bei 414 nm wurden überwacht. Die Messung der Bindung an eine Platte, die nur mit Ovalbumin beschichtet war, wurde in jedem Assay als negative Kontrolle verwendet. Ein bekanntes positives Serum von einem Patienten mit rheumatoider Arthritis (Polyarthritis) wurde in jedem Assay als positive Kontrolle verwendet und die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozentsatz der positiven Kontrolle.
Seren von 704 Patienten wurden auf Rheuma-Faktoren untersucht mit einer autologen Bindung und/oder einer gleichzeitigen Bindung an Human-IgG und Schaf-IgG. Das Humanserum wurde, verdünnt im Verhältnis 1 : 100 mit Ovalbumin in PBS oder einer Phosphat-gepufferten Salzlösung, zugegeben.

Patienten und Verfahren

Patienten

Das Serum wurde von 704 Patienten erhalten, von denen 108 eine klassische rheumatoide Arthritis (Polyarthritis) hatten, definiert nach den revidierten Kriterien der American Rheumatism Association (Arnett et al., "Arth. Rheumatism", 31 : 315-324 (1988)). Es wurden 231 Patienten untersucht, die andere Bindegewebserkrankungen als rheumatoide Arthritis (Polyarthritis) hatten, davon 190 mit systemischer Lupus erythematosis, 31 mit einer fortschreitenden systemischen Sklerosis, 3 mit einer Polymyositis, 4 mit einer temporalen Arteritis und 3 mit einer Polyarteritis nodosa. Außerdem wurden Seren von 317 Krankenhauspatienten mit nicht-rheumatischen Erkrankungen zusätzlich zu Seren von 48 gesunden Personen untersucht. Die Seren wurden bis zur Durchführung des Assays bei -20ºC aufbewahrt.
Es wurde eine Probeuntersuchung durchgeführt, um die Beziehung zwischen den Rheuma-Faktoren und der Aktivität der rheumatoiden Arthritiserkrankung zu bewerten. Die Aktivität der rheumatoide Arthritiserkrankung wurde von Ärzten bei 40 Patienten zum Zeitpunkt der Serumentnahme beurteilt. Ein Index der Aktivität der Erkrankung wurde bestimmt auf der Basis der Anzahl der geschwollenen oder brüchigen Gelenke, der subjektiven Bewertung der Schmerzen durch die Patienten und einer quantitativen Bestimmung der Dauer der Morgen-Steifheit. Jedem Parameter wurde ein Wert von 0 (inaktiv) bis 5 (höchst aktiv) gegeben und der Aktivitätsindex wurde als Summe der drei Werte aufgezeichnet. Bei 23 dieser Patienten wurde als zusätzliches objektives Maß für die Aktivität der Erkrankung die Westergren-Erythrozyten- Sedimentationsgeschwindigkeit bestimmt.
Rheuma-Faktoren bestimmt durch Agglutination von Latex-Teilchen Alle Seren wurden auf Rheuma-Faktoren untersucht durch Agglutination von Latex-Perlen, die mit Hitze-aggregiertem Human-IgG beschichtet waren (RF-Test, Difco, Detroit, MI). Die Seren wurden in Zweifach-Reihen-Verdünnungstests, beginnend mit der Verdünnung 1 : 20, untersucht und die positiven Tests wurden als solche ausgewählt, bei denen ein Titer von 1 : 160 oder höher auftrat. Durch Auswahl eines Titers von 1 : 160 wurden niedrigere Titer- Antworten, die bei Patienten mit nicht-rheumatoider Arthritis häufiger auftraten, eliminiert. Darüber hinaus wurden bei Titern von 1 : 160 oder höher die positiven Rheuma-Faktor-Tests bei Patienten mit nicht-rheumatoider Arthritis mit denjenigen verglichen, die bei Patienten mit rheumatoider Arthritis gefunden wurden.

Rheuma-Faktoren bestimmt durch ELISA

Seren, die Latex-Teilchen agglutinierten, wurden ebenfalls mittels ELI- SA untersucht unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die über Nacht bei 4ºC mit 10 µg/ml gereinigtem nativem Human-IgG, Human-IgG, das durch 30-minütiges Erhitzen auf 63ºC aggregiert worden war, und mit gereinigten Säugetier-IgG-Immunoglobulinen, umfassend Schaf-, Pferde-, Kaninchen-, Maus-, Meerschweinchen- und Ziegen-IgG, beschichtet worden waren. Die Platten wurden dreimal mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung, die 0,05% Tween®-2 (PBST) enthielt, gewaschen und Humanserum (0,1 ml, verdünnt im Verhältnis 1 : 100 mit 1% Ovalbumin wurden in den Vertiefungen über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden mit PBST gewaschen und es wurden Affinitäts-gereinigte, mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegen- Antikörper, die für Human-IgM Fc spezifisch sind, 1 h lang bei Raumtemperatur zugegeben. Vorläufige Tests zeigten, daß das konjugierte Antiserum den Rheuma-Faktor-Assay nicht konkurrierend hemmte. Nachdem die Vertiefungen mit PBST gewaschen worden waren, wurde die alkalische Phosphatase bestimmt durch ihr Absorptionsvermögen durch Umwandlung von p-Nitrophenylphosphat in p-Nitrophenol bei 405 nm.

Statistische Analyse

Die Genauigkeit des Doppelbindungstests für den Rheuma-Faktor wurde bewertet durch Intrachargen- und Interchargen-Vergleiche und ausgedrückt als Variationskoeffizient V, wobei V = die Standardabweichung (σ)/Mittelwert (µ).

Ergebnisse

Rheuma-Faktoren, bestimmt durch Agglutination von Latex-Teilchen

Die Seren wurden untersucht in 2-fach-Reihen-Verdünnungen, beginnend mit der Verdünnung 1 : 20. Um Seren mit vergleichbaren Werten für den Rheuma-Faktor bei Patienten mit und ohne rheumatoide Arthritis miteinander zu vergleichen, wurde eine Serumverdünnung von 1 : 160 ausgewählt für die Verwendung als positiver Test. Bei einer Verdünnung von 1 : 160 agglutinierte das Serum von 41 von 108 Patienten (38,0%) mit rheumatoider Arthritis mit IgG-beschichteten Latex-Teilchen. Im Gegensatz dazu hatten 14 von 231 Patienten (6,1%) mit anderen Bindegewebserkrankungen, in erster Linie systemischer Lupus erythematosus, und 19 von 317 Patienten (6,0%) mit nichtrheumatischen Erkrankungen positive Rheuma-Faktor-Tests (insgesamt positive Tests = 33 von 548 oder 6,0%). Der mittlere Titer der positiven Antworten sowohl bei Patienten mit rheumatoider als auch mit nicht-rheumatoider Arthritis betrug 1 : 320. Der Latex-Agglutinationstest war deshalb zu 38,0% empfindlich und zu 94,0% spezifisch für rheumatoide Arthritis, wenn Seren mit Verdünnungen von 1 : 160 oder höher untersucht wurden.

Rheuma-Faktoren, bestimmt durch ELISA, die Human-IgG und Schaf-IgG Überkreuz binden

Rheuma-Faktoren, die Human-IgG und Schaf-IgG Überkreuz binden wurden in Seren von 704 Patienten untersucht. Die positiven Tests wurden definiert als solche mit einer Bindung von mehr als 28% einer positiven Standard-Kontrolle, da 28% 2 S.D. oberhalb der mittleren Antwort für die Kontrollgruppe von 548 Patienten ohne rheumatoide Arthritis entsprachen. Die Ergebnisse des Überkreuz-Bindungs-Assays zeigten, daß er in bezug auf die Empfindlichkeit (39 von 108, 36,1%) mit dem Latex-Agglutinations-Test (41 von 108, 38,0%) vergleichbar war. Im Gegensatz zu dem Latex-Agglutinations-Test wurde die Überkreuz-Bindung von Human-AgG und Schaf-IgG als spezifischer angesehen, da positive Tests in nur zwei von 317 Patienten (0,6%) mit nicht- rheumatischen Erkrankungen, bei nur 3 von 231 Patienten (1,3%) mit anderen rheumatischen Erkrankungen als einer rheumatoiden Arthritis und bei 0 von 48 gesunden Individuen auftraten. Die Gesamtanzahl der positiven Tests bei Probanden ohne rheumatoide Arthritis betrug 5 von 596 oder 0,8%). Dieser ELISA-Assay für Rheuma-Faktoren, die Humn-IgG und Schaf-IgG Überkreuz binden, war deshalb zu 99,2% spezifisch für rheumatoide Arthritis im Vergleich zu einer Spezifität von nur 94,0% des Latex-Agglutinationstests (λ² = 24,2, p < 0,001). Auf der Basis einer vorherrschenden Rate von 1,0% für rheumatoide Arthritis beträgt der positive vorhergesagte Wert für den Latex- Agglutinations-Test für Serum, das im Verhältnis 1 : 160 verdünnt ist, 6,0%, verglichen mit 31,3% für Rheuma-Faktoren, die eine Überkreuz-Bindung zwischen Humn-IgG und Schaf-IgG bewirken. Der Überkreuz-Bindungs-Assay war bei keinem der Patienten mit nicht-rheumatoider Arthritis mit Latex- Agglutinations-Titern von weniger als 1 : 160 positiv. Rheuma-Faktoren bei Patienten ohne rheumatische Erkrankungen Das Serum von 19 von 317 Patienten mit einer nicht-rheumatischen Erkrankung, die bei der Latex-Agglutination positive Rheuma-Faktoren und Titer aufwiesen, die mit denjenigen von Patienten mit rheumatoider Arthritis vergleichbar waren, wurden unter Anwendung des ELISA-Assays untersucht zur Bestimmung der IgM-Rheuma-Faktoren. Viele dieser Patienten (7 von 19) hatten eine Lebererkrankung. Die Bindungsspezifitäten dieser Rheuma- Faktoren wurden charakterisiert durch Vergleich ihrer Bindung an Hitzeaggregiertes Human-IgG, natives Humn-IgG, Schaf-IgG und gleichzeitige Bindung an Schaf- und Human-IgG. Bei der Untersuchung mit dem ELISA-Assay enthielt das Serum von 18 von 19 Patienten IgM-Antikörper, die an Hitzeaggregiertes Human-IgG gebunden waren, Ergebnisse, die vergleichbar waren mit dem Latex-Agglutionations-Test bei Verwendung von aggregiertem IgG. Im Gegensatz dazu erhielt man weniger positive Tests bei Verwendung von nativer Human-IgG (9 von 19, λ² = 8,2, p < 0,01), Schaf-IgG (12 von 19, λ² =4,8, p=0,028) und Human/Schaf-IgG (2 von 19, λ² = 23,8, p < 0,001). Darüber hinaus ergaben die durch Überkreuz-Bindung(cross-linking) von Schaf- und Human-IgG bestimmten Rheuma-Faktoren weniger positive Tests als Human-IgG und Schaf-IgG allein (λ² = 4,6, p < 0,032 bzw. λ² = 8,3, p < 0,01). Der Überkreuz- Bindungs-Assay war bei einem Patienten mit bakterieller Endocarditis und bei einem Patienten mit einer Lebererkrankung positiv. Es bestand keine Korrelation zwischen dem Rheuma-Faktor gemäß ELISA-Assay bei Verwendung von aggregiertem IgG und dem Überkreuz-Bindungs-Assay (r=0,39), was zeigt, daß die Differenz in bezug auf die Ergebnisse zwischen diesen Tests nicht einfach auf eine Änderung der Assay-Empfindlichkeit zurückzuführen war.

Rheuma-Faktoren bei Patienten mit anderen Bindegewebserkrankungen als rheumatoider Arthritis

Die Seren von 14 von 231 Patienten mit anderen Bindegewebserkrankungen als rheumatoider Arthritis mit positiven Rheuma-Faktoren durch Latex- Agglutination und mit Titern, die vergleichbar waren mit denjenigen von Patienten mit rheumatoider Arthritis, wurden unter Anwendung des ELISA-Assays auf Rheuma-Faktoren getestet. Die meisten der positiven Rheuma-Faktor-Tests traten bei Patienten mit systemischer Lupus erythematosis (12 von 14) auf. Im Gegensatz zu Patienten ohne Bindegewebserkrankungen bildeten diese Patienten mit rheumatischer Erkrankung IgM-Antikörper, die gleich gut gebunden wurden an Hitze-aggregiertes Humn-IgG, natives Human-IgG und Schaf-IgG. Die ELISA-Antworten auf aggregiertes IgG (18 von 19 positiv) waren vergleichbar mit dem Latex-Agglutinations-Test, in dem aggregiertes IgG verwendet wurde. Die Rheuma-Faktoren bei diesen Lupus-Patienten konnten jedoch von denjenigen der Patienten mit rheumatoider Arthritis durch ihre Unfähigkeit zur gleichzeitigen Bindung und Überkreuzbindung von Schaf-IgG und Human- IgG oder ihre Unfähigkeit, sich an autologes IgG zu binden, das an Schaf-IgG gebunden war, unterschieden werden. So war beispielsweise der Überkreuzbindungs-Assay positiv bei weniger Lupus-Patienten (3 von 14) als in den Tests, in denen aggregiertes IgG (13 von 14, λ² = 11,8, p < 0,001), natives Human-IgG (12 von 14, λ² = 9,2, p < 0,01) oder O Schaf-IgG (11 von 14, λ² = 7,0, p < 0,01) verwendet wurde. Diese Tests zeigen, daß viele Patienten ohne rheumatoide Arthritis Antikörper gegenüber Schafs-IgG bilden, daß sich diese Antikörper jedoch nicht an Determinanten binden, die eine Überkreuzreaktion eingehen mit Determinanten, die sie mit Human-IgG gemeinsam haben.

Korrelation der Rheuma-Faktoren mit der Aktivität der rheumatoiden Arthritis-Erkrankung

Die Aktivität der rheumatoiden Arthritis -Erkrankung wurde bei 40 Patienten bestimmt und verglichen mit den Serum-Rheumafaktor-Gehalten. Es wurden Patienten ausgewählt, die ein breites Spektrum der Aktivität der Erkrankung repräsentierten. Die männliche Prädominanz gab zum Teil die Population der Veterans Administration wieder. Es wurden die Serum-Rheuma- Faktor-Titer bestimmt in Reihenverdünnungen unter Anwendung des Latex- Agglutinations-Tests und diese Rheuma-Faktor-Titer ergaben keine gute Korrelation mit der Aktivität der rheumatischen Erkrankung (r=0,31). Im Gegensatz dazu ergaben die Gehalte an Rheuma-Faktoren, die durch den ELISA-Assay in dem Überkreuz-Bindungs-Assay ermittelt wurden, eine gute Korrelation (r=0,68) mit der Aktivität der rheumatischen Erkrankung, was anzeigt, daß die Rheuma-Faktoren eine Überkreuzbindung von Human-IgG und Schaf-IgG bewirken, die in erster Linie bei Patienten mit rheumatoider Arthritis auftrat, die eine aktive Erkrankung aufwiesen. So waren beispielsweise 0 von 11 Patienten mit einer minimalen Aktivität der Erkrankung (Aktivitätsindex < 4) positiv im Vergleich zu 14 von 16 Patienten (87,5%) mit einer mittleren bis schwereren Erkrankung (Aktivitätsindex 6). Die positiven Tests wurden definiert als solche mit mehr als 28% positiver Kontrolle entsprechend mehr als 2 S.D. oberhalb des Mittelwertes bei 548 Patienten ohne rheumatoide Arthritis. Die durch Überkreuzbindung von Human-IgG und Schaf-IgG bestimmten Rheuma- Faktoren ergaben auch eine gute Korrelation (r = 70) mit der Westergren- Erythrozyten-Sedimentationsrate bei 23 dieser Patienten mit rheumatoider Arthritis, bei denen die Sedimentationsgeschwindigkeit bestimmt wurde. Diese Ergebnisse stützen ferner die Assoziation von Rheuma-Faktoren, die durch Überkreuzbindung von Human-IgG und Schaf-IgG gemessen wurden, mit der aktiven rheumatoiden Arthritis.

Genauigkeit des Assays zur Bestimmung von Rheuma-Faktoren die eine Überkreuzbindung zwischen Human-IgG und Schaf-IgG ergeben

Es wurden wiederholte Tests zur Bestimmung des Rheuma-Faktors durchgeführt unter Anwendung des Überkreuzbindungs-Assays, um die Genauigkeit dieses ELISA-Verfahrens zu ermitteln. Die Intrachargen-Variation wurde gemessen durch Testseren mit einer niedrigen, mittleren und hohen Antwort von jeweils 6 Versuchswiederholungen. Die Tests wurden als Vierfach-Bestimmung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt und zwei Sätze von Doppelt-Bestimmungen wurden jeweils auf getrennten Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Der Mittelwert ± S.D. (gemessen als optische Dichte) von sechs Wiederholungen für das Serum mit hoher, mittlerer und niedriger Antwort betrug 1,56 ± 0,13 ± 1,38 ± 0,09 bzw 0,77 ± 0,10; der Variationskoeffizient für die 3 Gruppen von Serumproben betrug 0,08, 0,06 bzw. 0,13. Die Interchargen-Variation wurde gemessen durch Testen einer positiven Probe bei fünf getrennten Gelegenheiten. Der Mittelwert ± S.D. für die fünf Bestimmungen betrug 1,38 ± 0,14. Der Variations-Koeffizient für diese Interchargen-Vergleiche betrug 0,10.
Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß der erfindungsgemäße Assay deutlich verbesserte Ergebnisse liefert, die gleiche oder eine bessere Empfindlichkeit aufweist als der Agglutinations-Assay und gleichzeitig beträchtlich weniger falsche Positivergebnisse ergibt. Außerdem scheinen die positiven Ergebnisse genauer in Relation zu stehen zu der aktiven Erkrankung, einer mittleren bis schweren Erkrankung, mit einem Aktivitätsindex von mehr als 6, verglichen mit einer minimalen Aktivität der Erkrankung, mit einem Aktivitätsindex von weniger als 4. Außerdem erlaubt der erfindungsgemäße Assay die Identifizierung von Determinanten, die dem Schaf und dem Menschen gemeinsam sind, um auf diese Weise Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die mit der Bindung des Rheuma-Faktors an Immunglobuline in Zusammenhang stehen. Mit den erfindungsgemäßen Assays besteht eine viel größere Sicherheit, daß ein positives Ergebnis eine aktive rheumatoide Arthritis und keine anderen degenerativen Erkrankungen anzeigt. Die Behandlungen können somit auf die Behandlung der rheumatoiden Arthritis ausgerichtet werden mit einer hohen Sicherheit, daß diese Erkrankung vorliegt.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des Rheumafaktors in einem menschlichen Wirt, bei dem Verdacht auf rheumatoide Arthritis besteht, das umfaßt:

das Kombinieren einer physiologischen Probe aus dem Wirt mit Ovin-IgG- Immunglobulin und Human-IgG-lnnnunglobulin, wobei eines der genannten Immunglobuline an einen Träger gebunden ist und das andere in Lösung dispergiert ist; und

den Nachweis des Auftretens der Bindung des genannten dispergierten Immunglobulins, das an den genannten Träger gebunden ist, als Anzeichen für das Vorhandensein des Rheumafaktors in der physiologischen Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ovin-Immunglobulin Schaf- Immunglobulin ist und an den Träger gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Nachweis durch ein Enzym- Markierungsmittel erfolgt, wobei das Enzyin-Markierungsmittel an das Human- Immunglobulin oder ein Protein gebunden ist, das sich spezifisch an das Human- Immunglobulin bindet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Human-Immunglobulin dispergiert ist und das Human-Immunglobulin an Biotin konjugiert ist und der Nachweis durch Enzym-konjugiertes Avidin oder Streptavidin erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Enzym Meerrettich-Peroxidase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe Blut ist, das mindestens im Verhältnis von etwa 1 : 100 verdünnt ist.

7. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Rheumafaktors in einem menschlichen Wirt, bei dem Verdacht auf rheumatoide Arthritis besteht, das umfaßt:

das Kombinieren einer verdünnten Blutprobe aus dem Wirt mit Schaf-IgG- Immunglobulin und Human-IgG-Immunglobulin, wobei das Schaf- Immunglobulin an einen Träger gebunden ist und das Human-Immunglobulin an ein Markierungsmittel konjugiert ist, das ein nachweisbares Signal abgibt; und

den Nachweis des Vorliegens der Bindung des Human-Immunglobulins, das an den Träger gebunden ist, mittels des Markierungsmittels als Anzeichen für das Vorliegen des Rheumafaktors in der Blutprobe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Probe mindestens im Verhältnis von etwa 1 : 100 verdünnt ist und der Nachweis mittels eines Enzyms erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Markierungsmittel Biotin ist und das Enzym an Avidin oder Streptavidin konjugiert ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Enzym Meerrettich-Peroxidase ist.