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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur serologischen in
vitro-Diagnostik der infektiösen
Endokarditis mit negativer Hämokultur
bei einem Patienten, der eine Endokarditis, und spezieller eine Infektion
durch ein oder zwei Keime, aufweist, die die häufigsten in den Endokarditen
mit negativer Hämokultur
sind, nämlich
Coxiella burnetii und Bartonella sp.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Diagnosekit, der für die Durchführung des
serologischen in vitro-Diagnoseverfahrens verwendbar ist.
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Die
Bakterien der Gattung Bartonella sp und Coxiella burnetii sind bei
einer großen
Anzahl von Krankheiten involviert. Die verschiedenen Krankheitsformen,
die mit dem Bakterium Bartonella verbunden sind, sind die folgenden
Krankheiten:
Katzenkratzfieber, bazilläre Angiomatose, wolhynisches
Fieber, hepatitische Peliose und Endokarditis.
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Die
Krankheiten aufgrund der Infektionen, die hervorgerufen werden durch
ein Bakterium der Art Coxiella definieren sich als Q-Fieber und
können sich
ausdrücken
durch:
- – akute
Infektionen: Fieber, Hepatitis, Pneumonie, Myokarditis, Perikarditis
oder Meningitis,
- – chronische
Infektionen: Endokarditis, Perikarditis, Gefäßinfektion, Osteitis, Lungentumor
oder wiederholte Schwangerschaftsabbrüche.
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Endokarditisinfektionen
resultieren aus der bakteriellen Infektion einer Herzklappe. Die
Patienten, die unter Endokarditis leiden, haben daher eine Herzklappenschädigung,
identifizierbar durch Befragung (dem Patienten bekannte Krankheit),
durch medizinische Untersuchung (Gegenwart eines Herzflatterns)
oder Radiologie (Echokardiographie). Die Diagnose der Endokarditisinfektionen
mit gewöhnlichen Keimen
basiert auf Hämokultur.
Es gibt Endokarditisinfektionen mit negativer Hämokultur, deren Grund (aber
nicht notwendigerweise) eine Infektion mit Bartonella- oder Coxiella-Bakterien
sein kann.
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Andererseits
sind bestimmte Träger
eines akuten Q-Fiebers oder einer Infektion nicht mit Endokarditis
angegriffen.
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Wenn
man derzeit Endokarditis mit negativer Hämokultur diagnostizieren will,
insbesondere Endokarditis, der mit einer Infektion durch Coxiella
burnetii oder durch ein Bakterium der Art Bartonella verbunden ist,
ist es aktuell notwendig, auf spezifische Serologien für jeden
der beiden Bakterientypen zurückzugreifen
[(Raoult D. et al., Ann. Intern. Med., 1996, 125:646-652 und Drancourt
M., et al., New Engl J Med. 1995, 332:419-423)] und auf das Bakterium Bartonella
quintana, hinterlegt bei ATCC unter der Nummer 49193.
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Die
Diagnostik der Krankheiten, die mit einer Infektion durch das Bakterium
Coxiella burnetii verbunden sind, geschieht derzeit durch eine parallele Dosierung
der Antikörper
gegen die Antigene aus Phase I und der Antikörper aus Phase II, welche zwei spezifische
unterschiedliche Formen für
das Bakterium Coxiella burnetii sind. Die Endokarditisinfektionen sind
gewöhnlich
von einer großen
Erhöhung
der gegen die Phase I gerichteten Antikörper zur gleichen Zeit wie
jene gegen die Phase II gerichteten begleitet. Das zu testende Serum
wird der Erkennung für
die beiden Phase I- und Phase II-Formen von dem Bakterium Coxiella
burnetii getrennt in den unterschiedlichen Diagnosekits unterzogen.
Außerdem
geschieht diese Erkennung, indem die Gesamtheit der Immunoglobuline
(IgG, IgM und IgA) detektiert wird und indem getrennt die Immunoglobuline
G, M und A getestet werden. Die Serologie kann für akute Infektionen vorgeschrieben
sein, nämlich
Fieber, Hepatitis, Pneumonie, Myokarditis, Perikarditis, Meningitis, oder
chronische Infektionen, nämlich
Endokarditis, Perikarditis, Gefäßinfektionen,
Osteitis, Lungentumor, wiederholte Schwangerschaftsabbrüche. Wenn die
Ergebnisse positiv sind, führt
man eine quanitative Bewertung der Antikörper ausgehend von Tests durch,
die zunehmende Verdünnungen
jedes Immunoglobulintyps implizieren, bei Verdünnungen, die von 1/50 bis zu
1/3200 gehen, um den genauen Titer zu bestimmen.
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Ebenso
werden derzeit Diagnoseverfahren von bakteriellen Krankheiten mit
Bakterien der Art Bartonella durchgeführt mit Antigenen, die entweder das
Bakterium Bartonella henselae oder Bartonella quintana sind, welche
getestet werden bei aufeinanderfolgenden Verdünnungen unter Detektieren der Gegenwart
des Gesamtimmunoglobulins oder in bestimmten Fällen IgGM. In diesem Fall schreibt
man dieselbe serologische Untersuchung für verschiedene Infektionsformen
mit Bartonella vor, nämlich
Katzenkratzkrankheit, bazilläre
Engiomatose, Bakteriämie,
wolhynische Krankheit, hepatitische Pelliose und Endokarditis.
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Man
weiß,
daß etwa
80% der Endokarditisinfektionen mit negativer Hämokultur in Frankreich durch
diese Bakterien hervorgerufen werden (Coxiella burnetii im Anteil
von etwa 50% und die Bakterien Bartonella mit einem Anteil von etwa
30%).
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Die
Behandlungen der Endokarditis sind deutlich verschieden je nach
Infektionsgrund.
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Es
gibt bis heute keinen Diagnosekit für die spezifische serologische
Diagnose der Endokarditis, insbesondere um die spezifische Endokarditis
von Bakterieninfektionen mit Coxiella burnetii oder Bartonella zu
detektieren.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein in vitro-Diagnoseverfahren
mit einfacher schneller Anwendung bereitzustellen, welches lediglich
einen einzigen Test impliziert, um die Gegenwart gegebenenfalls
einer Endokardits mit Bartonella sp oder Coxiella burnetii bei den
Kranken zu bestimmen, die mit einer Beeinträchtigung der Herzklappen angegriffen
sind.
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Um
dies zu machen, liefert die vorliegende Erfindung ein serologisches
in vitro-Diagnoseverfahren
der infektiösen
Endokarditis mit negativer Hämokultur,
die hervorgerufen werden durch die Bakterien Coxiella burnetii und
Bartonella sp bei einem Kranken, der von einer Beeinträchtigung
der Herzklappen angegriffen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Dosierung der Antikörper
vom Typ IgG durchführt,
die gegen das Bakterium gerichtet sind. Coxiella burnetii mit Phase
I und Antikörper
vom Typ IgG, die gerichtet sind gegen das Bakterium Bartonella sp, auf
einem gleichen Serum von einem der Kranken, und man bestimmt, ob
der Titer der IgG-Antikörper größer oder
gleich 1/800 ist, das heißt,
man prüft,
ob man die Gegenwart der IgG-Antikörper in einem Serum eines Patienten,
verdünnt
zu 1/800, detektieren kann.
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Die
vorliegende Erfindung liefert einen schnellen und einfachen Test,
indem eine einzige Verdünnung
eines Serums getestet wird, die es nicht nur erlaubt, zu erkennen,
daß der
Patient Antikörper hat,
sondern auch, daß er
Antikörper
mit einem hohen vorgegebenen Gehalt aufweist, was es ermöglicht,
eine genannte Endokarditis zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung
erlaubt es spezieller, auf einem einzigen Serum, insbesondere durch
eine indirekte Immunofluoriszenztechnik unter Verwendung einer einzigen
Verdünnung
eine Infektion zu bestimmen durch einen der beiden häufigsten
Keimen in den Endokarditis mit negativer Hämokultur, nämlich Coxiella burnetii und
Bartonella sp, bei einem Patienten, der eine Beeinträchtigung
der Herzklappen aufweist, klinisch oder durch Echokardiographie
entdeckt. Die vorliegende Erfindung hat es daher erlaubt, eine einzigartige
Konzentration der Anti-IgG-Antikörper des
Bakteriums Coxiella burnetii von Phase I und eines Bakteriums Bartonella
sp zu bestimmen, aus der in einer Probe, insbesondere eines Patienten,
der Endokarditis zeigt, das Ergebnis gefolgert werden kann, daß gegebenenfalls
eine Endokarditis mit einem der beiden Keime vorliegt.
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In
einer besonderen und vorteilhaften Ausführungsform führt man
eine Dosierung durch, in welcher man die beiden genannten Antigene-Bakterien auf
einem festen Träger
abscheidet und man eine einzige Verdünnung zu testenden Serums einsetzt,
in welches man ein Anti-IgG-Immunoglobulin im Überschuß zugegeben hat, vorzugsweise
markiert, das man mit dem festen Träger reagieren läßt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet man einzig das Bakterium Coxiella burnetii der Phase
I, da man beobachtet hat, daß ein
hoher Antikörpergehalt
gegen Phase I, insbesondere oberhalb 1/800 nur in den chronischen
Infektionsformen mit Coxiella burnetii, einschließlich der
Endokarditisinfektionen auftrat. Auch sind diese Antikörpergehalte oberhalb
1/800 spezifisch für
eine chronische Infektion, die zu einem Bakterium der Gattung Bartonella
sp gehört,
einschließlich
der Endokarditisinfektionen.
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Für Subjekte,
die unter einer Edokarditisbeeinträchtigung leiden, ist daher
die Gegenwart von Antikörpern
gegen eines dieser Antigene mit einem Titer oberhalb 1/800 notwendigerweise
mit einer Infektion durch eines dieser beiden Bakterien verbunden,
da nur der chronische Angriff, der mit diesen beiden Keimen verbunden
ist und Beeinträchtigungen auf
kardiatischem Niveau hervorruft, eine Beeinträchtigung vom Typ Edokarditis
ist.
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Im übrigen ist
gemäß der vorliegenden
Erfindung beobachtet worden, daß die
Detektion von Antikörpern
gegen das Bakterium Coxiella burnetii oder das Bakterium Bartonella
vom Typ IgM der Gegenwart eines rheumatoiden Faktors zuzuschreiben
ist. Die rheumtoiden Faktoren sind Immunoglobuline vom Typ IgM-anti-IgG
im Großteil
der Fälle
und riskieren es, falsche Positivangaben zu ergeben, wenn es geringe
Gehalte von IgG bei den Patienten gibt, die unter einer Endokarditis
von anderen Keimen leiden, während
die Patienten, die Endokarditis aufweisen, häufig rheumatoide Faktoren haben.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung detektiert man deshalb spezifisch Antikörper, die
gegen die IgG gerichtet sind (und nicht die IgM oder die Gesamtimmunoglobuline) in
einer Weise, daß die
fälschlichen
Positivangaben aufgrund der geringen Gehalte von IgG eliminiert werden,
die mit rheumatoiden Faktoren verbunden sind (welche IgM-anti-IgG
sind).
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Der
Test gemäß der vorliegenden
Erfindung stellt eine Vereinfachung und einen beträchtlichen Zeitgewinn
im Verhältnis
zu den Techniken zur Erkennung und Diagnose dar, die derzeit eingesetzt werden.
Man testet daher davon keine Verdünnung zur Erkennung und man
macht nur einen Serumtest. Man hat eine Verdünnung von 1/800 bestimmt, die das
beste Verhältnis
Sensibilität-Spezifität, angewandt
auf die beiden Bakterien, aufweist, was es ermöglicht, auf einem einzigen
Detektionstest fragliche Bakterien zu gruppieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung
realisiert man einen originalen Diagnoseansatz gegebenenfalls pro
Syndrom und nicht pro bakterieller Krankheit wie zuvor unter Begrenzen
der gestellten serologischen Frage zu dem diagnostischen Problem
der Endokarditis und unter Ersetzen der Gesamtheit der serologischen
Techniken, die später
eingesetzt werden durch eine einzige Technik, die gleichzeitig das
Erkennen und die Diagnose auf einem einzigen Titer durchführt.
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In
einer vorteilhaften Ausführungsform
wird eine Dosierung durchgeführt,
bei der:
- 1. die beiden genannten Bakterien
auf einen festen Träger
aufgebracht werden, und
- 2. die Bakterien mit einem Serum des Kranken, das auf 1/800-stel
verdünnt
ist und dem ein Antihumanimmunglobulin IgG, das vorzugsweise markiert
ist, hinzugefügt
wurde, zur Reaktion gebracht werden, und
- 3. überprüft wird,
ob sich die Antihumanimmunglobuline IgG, die vorzugsweise markiert
sind, auf dem festen Träger
fixieren.
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Anders
ausgedrückt,
wenn nach Waschen des festen Trägers
man die Anti-IgG-Immunoglobuline
detektiert, die markiert auf jenem fixiert sind, konnte die Fixierung
auf den festen Träger
nur mittels IgG-(Ac)-Antikörpern
geschehen, die gegen das Bakterium (Ag) angezogen waren unter Ausbildung
eines Ag-Ac-Ig-Anti-IgG-Komplexes.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Bakterium Bartonella henselae oder Bartonella quintana.
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In
einer besonderen Ausführungsform
scheidet man auf den festen Träger
die folgenden Bakterien ab:
- – ein Bakterium
Coxiella burnetii von Phase I,
- – ein
Bakterium Bartonella quintana.
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Die
Bakterien Coxiella burnetii von Phase I und Bartonella sind der Öffentlichkeit
durch verschiedene Quellen zugänglich.
Sie sind in der Literatur beschrieben worden [Tissot Dupont H.,
et al. Clin. Diag. Lab. Immunol., 1994, 1:189-196] und mehrere sind
in der Hinterlegungssammlung von ATCC hinterlegt worden, insbesondere
das Bakterium Coxiella burnetii von Phase I, hinterlegt bei ATCC
unter der Nummer VR615.
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Als
festen Träger
kann man jede Vorrichtung verwenden, die der Handhabung von Zell-
und Bakteriensuspensionen angepaßt ist und insbesondere Röhrchen,
Objektträger
aus Glas, Cups (tubes Bijoux) oder starre Mikrotiterplatten aus
Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Nitrozellulose, die Mikrolöcher umfassen,
wobei die Glasobjektträger bevorzugt
sind.
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Als
Markierungstyp von Anti-Human-Immunoglobulin verwendet man daher
vorzugsweise eine enzymatische, radioaktive oder fluoreszente Markierung,
wobei dieser letztere Markierungstyp bevorzugt ist.
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Der
Ausdruck "Fluoreszenzmarkierung" bedeutet, daß der Antikörper durch
Kopplung oder Komplexierung mit einem Fluoreszenzreagenz fluoreszierend
gemacht ist, das geeignet ist, wie Iso(thio)cyanat von Fluorescin.
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Der
Ausdruck "Radioaktivmarkierung" bedeutet, daß der Antikörper ein
radioaktives Isotop trägt,
das es ermöglicht,
ihn durch Auszählen
der Radioaktivität,
die mit ihm verbunden ist, zu dosieren, wobei das Isotop entweder
auf einem Element der Antikörperstruktur
getragen sein kann, zum Beispiel konstitutive Tyrosinreste oder
auf einem geeigneten Rest, der an ihm fixiert worden ist.
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Der
Ausdruck "enzymatisches
Markieren" bedeutet,
daß der
spezifische Antikörper
gekoppelt wird und komplexiert ist mit einem Enzym, das dem Einsatz
von geeigneten Reagenzien zugeordnet ist, was eine quantitative
Messung dieses spezifischen Antikörpers erlaubt.
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Das
Substrat und die Reagenzien werden derart gewählt, daß das Endprodukt der Reaktion oder
der Sequenz von Reaktionen, die durch das Enzym hervorgerufen wird
und diese Substanzen einsetzt, ist:
- – entweder
eine farbige oder fluoreszierende Substanz, die in ein flüssiges Medium
diffundiert, das die getestete Probe umgibt und das der Gegenstand
ist, entweder der endgültigen
jeweils spektrometrischen oder fluorimetrischen Messung oder einer
Bewertung durch das Auge, gegebenenfalls im Verhältnis zu einem geeichten Färbungsbereich,
- – oder
eine gefärbte,
unlösliche
Substanz, die sich auf der getesteten Probe abscheidet und die Gegenstand
sein kann, entweder einer photometrischen Messung durch Reflektion
oder einer Bewertung mit dem Auge, gegebenenfalls im Verhältnis zu
einem geeichten Färbungsbereich.
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Wenn
man ein fluoreszent gemachtes Immunoglobulin verwendet, wird die
verbundene Fluoreszenz bei der getesteten Probe direkt auf einer
geeigneten Vorrichtung gelesen.
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Wenn
man eine Radioaktivitätssonde
verwendet, wie zum Beispiel 125Iod, wird
die mit der getesteten Probe verbundene Radioaktivität in einem Gammazähler ergänzt gemäß jeder
geeigneten Modalität
und zum Beispiel nach Solubilisierung der Zellen durch eine Alkalilösung (zum
Beispiel eine Sodalösung)
und Gewinnung der Lösung,
die die Radioaktivität
enthält,
mit Hilfe eines Absorptionsmittelpuffers.
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Wenn
man ein Enzym auf den spezifischen Antikörper verwendet, wird das Auftreten
eines gefärbten
oder fluoreszenten Produktes erhalten unter Zugeben einer Lösung, die
das Substrat des Enzyms enthält
und eines oder mehrerer Hilfsreagenzien, die es erlauben, schließlich als
Reaktionsprodukt entweder ein gefärbtes Produkt zu erhalten,
das in dem Medium löslich
ist, oder ein gefärbtes
unlösliches Produkt,
oder ein fluoreszentes lösliches
Produkt, wie dies bereits oben erklärt worden ist. Man mißt anschließend das
Lichtsignal, das von den so behandelten Proben kommt mit Hilfe einer
für jeden
Fall geeigneten Vorrichtung: Transmissionsphotometer oder Reflektionsfluorimeter
oder Fluorimeter jeweils. Alternativ kann man mit dem Auge die erhaltene
Färbung
bewerten, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme eines geeigneten Bereichs
von gefärbten
Eichlösungen.
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Indem
als Enzym alkaline Phosphatase verwendet wird, wird die Kopplung
dieses Enzyms mit dem spezifischen Antikörper gemäß dem Verfahren durchgeführt, das
vorgeschlagen wird durch Boehringer Mannheim-Biochemica. Die bevorzugten
Substrate dieses Enzyms sind das Paranitrophenylphosphat für eine fluorimetrische
Auslesung oder das 5-Brom-4-Chlor-Umbelliferylphosphat für eine fluorimetrische
Auslösung
oder das 5-Brom-4-Chlor-6-Indolylphosphat, um ein gefärbtes unlösliches
Reaktionsprodukt zu erhalten. Man kann auch als Enzym die β-Galactosidase
verwenden, deren bevorzugte Substrate Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid oder
4-Methyl-Umbelliferyl-β-D-Galactopyranosid sind.
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Bevorzugt
kann man die spezifischen Antikörper
mit Peroxydase koppeln. In diesem Fall wird das Kopplungsverfahren
von jenem abgeleitet, das beschrieben wird durch M.B. Wilson und
P.K. Nakane in "Immunofluorescence
and related staining techniques",
W. Knapp, K. Kolubar, G. Wicks ed. Elsevier/North Holland. Amsterdam
1978, Seiten 215-224.
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Die
verwendeten Reagenzien, um die Peroxydase zu zeigen, die konjugiert
ist mit den spezifischen Antikörpern,
enthalten oxygeniertes Wasser, Substrat des Enzyms und ein geeignetes
Chromogen, zum Beispiel Orthophenyldiamin oder 2,2'-Azino-bis-(3-Ethyl-6-Thiazolinsulfon)-Säure oder
ABTS, um ein Endreaktionsprodukt zu erhalten, das gefärbt ist
und löslich
in dem Medium oder auch 3,3'-Diaminobenzidin
oder 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol
oder 4-Chlor-α-Naphtol,
um ein unlösliches
Reaktionsendprodukt zu erhalten oder Parahydroxylphenylpropionsäure, um
ein fluoreszierendes, in dem Medium lösliches Produkt zu erhalten.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung ist die Verwendung von Immunoglobulin, gekoppelt an
Acetylcholinesterase.
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Acetylcholinesterase
wird gekoppelt mit dem Antikörper
unter Verwendung vorzugsweise eines Verfahrens, das abgeleitet ist
von jenem, das beschrieben ist in dem französischen Patent Nummer 2 550
799 oder ein Verfahren, das schematisch die Herstellung von Fragmenten
der Antikörper
durch eine bekannte Technik umfaßt, der Modifikation des Enzyms
durch Reaktion mit einem Heterobifunktionellen geeigneten Reagenz
und schließlich
das Koppeln der so erhaltenen Produkte. Andere bekannte Verfahren
zur Konstruktion von immunoenzymatischen Konjugaten können in
diesem Fall verwendet werden.
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Die
Enthüllung
der spezifischen enzymatischen Aktivität, die mit dem bekannten Antigen
verbunden ist, durch das Konjugat an Acethylcholinesterase wird
vorzugsweise durchgeführt
durch die wohlbekannte Technik, die Acethylcholin als Substrat des Enzyms,
und Ellman-Reagenz oder 5-5'-Dithio-2-Nitrobezolsäure als
Chromogen einsetzt, gemäß jeder geeigneten
Variante im untersuchten Fall, zum Beispiel beschrieben durch Pradelles
et al., in Anal. Chem. 1985, 57:1170-1173.
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Die
genannten Chromogene werden als solche oder in Form von in Wasser
löslichen
Salzen verwendet.
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Andere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung erscheinen beim
Lesen der detaillierten Beschreibung, welche folgen wird, klarer,
welche das detaillierte Experiment mit dem Ziel, die Erfindung auszuführen, beschreibt
und welche lediglich veranschaulichend angegeben sind.
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1 – Die Antigene
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Bartonella
quintana (Stamm Oklahoma (ATCC Nr. 49193) und Stamm Marseille (Faculté de Médecine,
27 Boulevard Jean Moulin 13385 Marseille cedex 5 – Hinterlegungssammlung
der Einheit der Rickettsien) Bartonella henselae (Stamm Houston (N°ATCC 49882)
und Stamm Marseille (Faculté de Médecine,
27 Boulevard Jean Moulin 13385 Marseille cedex 5 – Hinterlegungssammlung
der Einheit der Rickettsien) sind getestet worden als Antigene für Bartonella.
Das Antigen von Bartonella quintana ist wie folgt erhalten worden:
das Bakterium wird in Gelose mit frischem Blut zu 10% kultiviert.
Es handelt sich um einen Oklahoma genannten Stamm. Dieser Stamm
dient dazu, Kulturzellen anzuimpfen, die Humanendothelialzellen
sind aus einer ECV genannten Zellinie. Nach 24 Stunden Animpfen
werden diese Zellen geerntet. Die Antigene profitieren von einer Halbreinigung,
die darin besteht, die Zelldebris durch Zentrifugation abzunehmen
und werden dann mit Natriumazid fixiert, bevor sie verwendet werden.
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Die
Bakterien sind auf einer Endothelialzellinie kultiviert (ECV 304),
geerntet, eingestellt bei 1 mg/ml und direkt als Antigen verwendet
worden. Diese Antigenherstellung ist Gegenstand von Veröffentlichungen
[D. Raoult., H,Tissot-Dupont.,
M. Enea Mutillod., Clin. Infect. Dis., 1994, 19:335), [Raoult D., Fournier
PE., Drancourt M. et al, Ann. Intern. Med. 1996, 125:646-652).
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Die
Antigene von Coxiella burnetii wurden erzeugt mittels des Stammes
Nine Mile (ATCC Nr. VR615). Um Antigen von Phase I zu erhalten wird
der Stamm eingespritzt in eine BalbC-Maus aus auf intraperitonealem
Wege. Am siebten Tag wurde die Milz dieser Maus entnommen, zermahlen
und mit diesen Verozellen in Kultur angeimpft. Wenn das Bakterium sich
in den Verozellen einmal vervielfacht hat, werden die Bakterien
geerntet wie schon veröffentlicht und
dienen dazu, andere Zellen anzuimpfen. Das Antigen von Phase I wird
in den sechs ersten Durchgängen
in Kultur auf Verozellen erhalten. Die Phasen II werden darüber hinaus
am 15. Tag des Durchganges auf den Verozellen erhalten. Die Phase
II ist eine Mutante, erhalten in Kultur der Phase I. Das Antigen
von Coxiella burnetii, das geerntet ist, ist Gegenstand von zwei
aufeinanderfolgenden Zentrifugationen, um ein halbgereinigtes Antigen
zu erhalten, eingestellt auf 1 mg/ml. Diese Technik ist beschrieben
worden [Fournier PE., Marrie TJ., Raoult D. J. Clin. Microbiol., 1998,
36:1823-1834]. Diese Antigene sind mit einem Federhalter auf einem
teflonisierten Objektträger
mit 10 Löchern,
Dynatech® abgeschieden
worden.
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2 – Getestete Seren
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Der
Erfinder hat, um die Technik optimieren zu können, eine bestimmte Anzahl
von Seren von Patienten ausgewählt,
die eine identifizierte Pathologie aufgewiesen haben. Es handelt
sich um Patienten, die Träger
von Endokarditis des Q-Fiebers sind oder mit Bartonella und Patienten,
die Träger
von Endokarditis oder anderen Keimen sind, um Negativkontrollen
zu haben, aber auch Patienten, die Träger von einem akuten Q-Fieber sind (ohne
Endokarditis), Patienten, die Träger
einer Katzenkratzkrankheit sind (Infektion, die hervorgerufen wird
durch Bartonella aber ohne Endokarditis) und auch Kranken, die von anderen
identifizierten Krankheiten angegriffen sind (Infektionen mit Cytomegalovirus,
Infektion mit Epstein Barr-Virus).
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244
Seren sind getestet worden. Die ausgewählten Seren bestehen aus 40
Seren von Patienten, die mit Bluttransfusion entnommen werden und
von denen jeder keine Krankheit aufweist, 15 Seren von Patienten,
die Katzenkratzfieber aufweisen, aufweisend eine Diagnose, die durch
andere Mittel (PCR auf den Ganglien) durchgeführt ist, 15 Patienten, die ein
akutes Q-Fieber aufgewiesen haben (diagnostiziert durch Nachweis
einer Serokonversion bzw. Blutumwandlung), 30 Patienten, die diagnostiziert
sind als eine Endokarditis des Q-Fiebers habend (diagnostiziert
durch Nachweis des Bakteriums auf den Herzklappen des Patienten)
und den Seren von 20 Patienten, die eine Endokarditis mit Bartonella
aufweisen (Diagnostik, die durch Nachweis durch Kultur oder durch
PCR auf den Herzklappen des Patienten nachgewiesen ist). Im sind übrigen 99
Seren von Patienten, die eine Endokarditis aufweisen, dessen Etiologie
nicht Coxiella burnetii oder Bartonella ist, getestet worden sowie
eine Patientengruppe, die eine Infektion zeigt, die dokumentiert ist
bei einer anderen Krankheit (weder eine Endokarditis noch eine Infektion
mit Bartonella oder Coxiella). Darüber hinaus sind 25 Patienten,
die eine andere Krankheit aufweisen, getestet worden. Es handelt
sich um 5 Patienten, die eine infektiöse Mononucleose zeigten, 5
Patienten, die eine Infektion mit Cytomegalovirus zeigten, 5 Patienten,
die eine Serokonversion mit Herpesvirus zeigten, 5 Patienten, die
eine Hepatitis B zeigten, und 5 Patienten, die eine Serokonversion
für das
Virus HIV, dem Erreger des Aids, zeigten. Unter den Patienten, die
eine Endokarditis zeigen, zeigten 11 einen rheumatoiden Faktor,
der detektiert wird durch den Latextest (Rapitex, RF. Dade Behring).
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3 – Serologische Technik
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Die
durchgeführte
serologische Technik besteht darin, 6 Antigene auf einem Objektträger abzuscheiden
(Bartonella quintana Marseille, Bartonella quintana Oklahoma, Bartonella
henselae Houston (ATCC Nr. 49882) und Marseille und Coxiella burnetii Phase
I und Phase II (Faculté de
Médecine,
27 Boulevard Jean Moulin 13385 Marseille cedex 5 – Hinterlegungssammlung
der Einheit der Rickettsien).
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Die
Objektträger
sind Glasobjektträger,
die 20 Flecken zeigen. Diese Träger
werden entfettet, das Antigen wird auf der Oberfläche mit
Feder oder Mikropipette abgeschieden, tangential zum oberen Teil
des Kreises für
Coxiella burnetii, dann mit einer anderen Pipette am unteren Teil
desselben Fleckes auf jedem Fleck für Bartonella quintana. Wenn
das Antigen einmal abgeschieden ist, wird es fixiert durch eine
Immersion des Objektträgers
10 Minuten in Aceton. Ist der Objektträger einmal getrocknet, wird
die Serumlösung
abgeschieden.
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Serumverdünnungen
sind getestet worden zu 1/400, 1/800, 1/1600 und 1/3200 in PBS.
Die so in PBS verdünnten
Sera sind abgeschieden worden [D. Raoult., H, Tissot-Dupont, M. Enea Mutillod.,
Clin. Infect. Dis., 1994, 19:335], für 30 Minuten inkubiert gelassen
worden, dreimal gewaschen worden. Die humanen Anti-Immunoglobulinantikörper sind
dann zu der vorgesehenen Verdünnung
durch den Hersteller zugegeben worden, nämlich 1/400. Jener verwendete
(Bio Mérieux)
war entweder ein Gesamt-Anti-Immunoglobulinantikörper (gegen ein Gemisch von IgG,
IgM, IgA) oder ein spezifischer Antikörper gegen die IgG. Die Objektträger sind inkubiert
worden für eine
halbe Stunde, und dann dreimal 10 Minuten in PBS gewaschen und getrocknet
worden. Ein Deckglas wird auf dem Objektträger mit einem Tropfen Glyzerin
zwischen dem Objektträger
und dem Deckglas abgelegt und in der Immunofluoreszenz beobachtet.
Jeder Objektträger
umfaßt
eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle und die Flecken
werden im Fluoreszenzmikroskop und mit einer 400-fachen Vergrößerung ausgelesen.
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4 – Ergebnisse
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Die
Gegenwart einer deutlichen Reaktion gegen das eine oder das andere
der Antigene zeigt, daß der
Endokarditis, der beobachtet wird bei dem Patienten, dem er entnommen
worden ist, eine Endokarditis mit einem Keim ist, der die positive
Reaktion zeigt. Die Gegenwart der beiden Antigene wird gerechtfertigt
durch die Tatsache, daß Kreuzreaktionen unter
den beiden vorliegen, aber es handelt sich im allgemeinen um Infektionen
mit Coxiella burnetii mit geringen Antikörperntitern mit Bartonella.
Die Tatsache, zwei Positivreaktionen zu haben, kann dazu führen, einen
vollständigeren
Test auszulösen
mit Coxiella burnetii. Es handelt sich um zwei Keime, die den größeren der
Teil der Endokarditisinfektionen mit negativen Hämokulturen aufweisen. In einer
neueren Reihe der Einheit der Rickettsien [Houpikian P. Diagnostic
des Endokarditiss à hémocultures
négatives. Thése de
Médecine,
Marseille, 2001) waren 50% von 300 Endokarditisinfektionen mit negativen
Hämokulturen
hervorgerufen durch Coxiella burnetii und 30% durch Bartonella.
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Die
Ergebnisse haben gezeigt, daß die
Gesamt-Immunoglobulindetektion ein Spezifitätsproblem ergab. Daher zeigen
zwei Patienten eine Endokarditis mit gewöhnlichen Keimen und rheumatoide Faktoren
präsentierten
Antikörper
bei 1/800 gegen Bartonella. Zweitens hat die Arbeit gezeigt, daß es nicht
nützlich
war, gleichzeitig Coxiella burnetii Phase I und Phase II zu testen,
da alle Endokarditisinfektionen Antikörper gegen Phase I bei einem
Titer größer oder
gleich 1/800 hatten, während
allein Q-Fieber ohne Endokarditis Antikörper über oder gleich 1/800 gegen
Phase II hatte. Im Gegenzug, wenn die Endokarditisinfektionen auch
Antikörper
gegen Phase II mit einem Titer größer oder gleich 1/800 hatten,
hatten 10 der Q-Fieber Antikörper über oder
gleich 1/800 für
Phase II. Es hatte daher entschieden werden können, nicht mehr die Phase
II zu testen und nur Phase I für
die Diagnose der Endokarditisinfektionen zu nehmen.
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Für die Infektionen
mit Bartonella, wie auch immer die Ursache der Endokardits mit Bartonella
sei (Bartonella henselae, Bartonella quintana) erlaubte es das Antigen
von Bartonella quintana Marseille oder Oklahoma bei der Serumkonzentration
von 1/800, alle Endokarditis-Ursachen zu identifizieren. Es gab
15 Endokarditisinfektionen mit Bartonella quintana und 5 Endokarditisinfektionen
mit Bartonella henselae und alles wurde durch Antigene von Bartonella
quintana detektiert.
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Eine
Verdünnung
von 1/1600 detektierte nur 11 auf 20 Endokarditisinfektionen mit
Bartonella. Im Gegenzug erlaubte es eine Verdünnung von 1/800, alle Endokarditisinfektionen
mit Bartonella zu detektieren. Alle Endokarditisinfektionen mit
Coxiella burnetii wurden auch detektiert bei 1/800 und 1/1600. Bei
einer Verdünnung
von 1/800 war keine der Negativkontrollen positiv für Bartonella
oder Coxiella burnetii, unter den Patienten, die entweder unter
Katzenkratzkrankheiten oder Endokarditisinfektionen mit anderen
Keimen oder anderen Krankheiten litten. Insgesamt waren gab es unter
den 224 getesteten Seren 50 mit Endokarditisinfektionen mit Coxiella burnetii
oder Bartonella henselae oder B. quintana. Eine Serologieimmunofluoreszenz,
welche allein die Antigene Bartonella quintana und Coxiella burnetii Phase
I zeigten, haben es erlaubt, 50 positive Ergebnisse für die 50
Endokarditisinfektionen und 1 Positivergebnis für das akute Q-Fieber zu haben.
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Wenn
man den Wert der Serologie unter den Endokarditisinfektionen bei
149 getesteten Fällen
bewertet, ist eine Endokarditis mit einem anderen Keim als Bartonella
oder Coxiella burnetii nur mit einer Technik detektiert worden,
die IgG gegen Coxiella burnetii Phase I und Bartonella quintana
verwendet.