DE69836396T2

DE69836396T2 - ELISA-Serodiagnose von Schweinepleuropneumonie des Serotyps 2

Info

Publication number: DE69836396T2
Application number: DE69836396T
Authority: DE
Inventors: Marcelo Quebec Gottschalk; Daniel Montreal Quebec Dubreuil; Real St-Hyacinthe Quebec Lallier
Original assignee: Universite de Montreal
Current assignee: Universite de Montreal
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2018-04-09
Also published as: US6350584B1; EP0875760B1; ATE345501T1; DE69836396D1; EP0875760A2; ES2277376T3; EP0875760A3

Description

Hintergrund der Erfindung
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Kits für die genaue, schnelle und empfindliche Bestimmung von A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörpern im Serum von Schweinen für die Serodiagnose von Schweinepleuropneumonie.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Actinobacillus pleuropneumoniae ist als eines der am stärksten pathogenen Agentien der Atemwege von Schweinen bekannt. Schweinepleuropneumonie ist in großen Schweinebetrieben immer noch ein wichtiges Problem, das in dieser Industrie schwere ökonomische Verluste verursacht. Da die Anwesenheit von A. pleuropneumoniae bei chronisch infizierten Herden oft unbemerkt bleibt, ist die Identifizierung von Trägertieren ein Hauptanliegen. Nach einer Stresssituation können in einer gegebenen Herde mehrere klinisch tödliche Fälle vorkommen. Die Infektion bei Schweinen kann tödlich sein, aber Tiere, die die Infektion überleben, werden häufig zu Trägern. Der Nachweis von chronisch infizierten Trägern ist entscheidend, da diese Tiere als Reservoire der Infektion wirken. Da die Infektion häufig unbemerkt bleibt, wird die Serologie zu einem nützlichen Werkzeug für den Nachweis einer chronischen Infektion. Mehrere Studien weisen darauf hin, dass es möglich ist, die Infektion in bestimmten Herden auf der Basis von serologischen Ergebnissen zu bekämpfen oder zu besiegen.
Es wurden verschiedene serologische Assays für A. pleuropneumoniae beschrieben. Unter anderem wurden der Komplement-Fixierungstest (CPT), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Goyette G. et al., 1986, Int. Pig. Vet. Soc. Proc., 9: 258) und der 2-Mercaptoethanol-Röhrchen-Agglutinierungstest (Mittal, K. et al., 1984, Am. J. Vet. Res., 45: 715–719) verwendet. Von den verschiedenen Assays ist ELISA häufig der nützlichste, da er schneller und leichter durchzuführen ist. Andererseits legten die erhaltenen Ergebnisse bisher die Verwendung eines besser gereinigten Antigenpräparats nahe, um die Spezifität des Tests zu verbessern.
Zur Zeit wird in einigen Labors ein Kochsalzlösungsextrakt von gekochten formalinisierten ganzen Zellen von A. pleuropneumoniae (auch Rohextrakt genannt) als Antigen für die ELISA-Serodiagnose verwendet (Goyette G. et al., 1986, Int. Pig. Vet. Soc. Proc., 9: 258). Die Standardisierung des Assays ist kompliziert, da Variationen zwischen Extrakten beobachtet werden.
Bei Verwendung verschiedener Antigenpräparate wurden auch Kreuzreaktionen unter Serotypen und mit anderen Bakterienspezies beschrieben (Bosse, J. et al., 1990, Can. J. Vet. Res., 54: 427–431). Obwohl gezeigt wurde, dass das kapsuläre Polysaccharid (CPS) von A. pleuropneumoniae für die Serotyp-Spezifität verantwortlich ist (Inzana, T. und Mathison, T., 1987, Infect. Immun., 55: 1580–1587), schließt die Schwierigkeit der Gewinnung von reinem CPS in großer Menge seine Verwendung für serodiagnostische Zwecke aus. Die CPS waren sehr instabil und ließen sich nur unter Schwierigkeiten an den Wänden der im ELISA-Assay verwendeten Polystyrolplatte fixieren (Perry, B. et al., 1990, Sero. Immunol. Infect. Dis., 4: 299–308).
Serologie, die verwendet wird, um Tiere zu identifizieren, die eine Immunantwort auf spezifische Pathogene entwickelt haben, ist ein wichtiges Werkzeug beim Umgang mit und Prävention von Krankheit bei einer A.-pleuropneumoniae-Infektion bei Schweinen. Die Bedeutung der serologischen Tests wird weiterhin durch das Fehlen eines Impfstoffs betont, der die Infektion zuverlässig verhindert.
Die Verwendung von Antibiotika ist hauptsächlich geeignet, um die Mortalität zu reduzieren, aber sie hat keinen wirklichen Nutzen für Schweine mit chronischer Pleuropneumonie. Behandelte Tiere tragen den Organismus häufig weiter und können eine Quelle für die Infektion anderer Tiere sein. Außerdem wurde in den letzten Jahren in Quebec eine wachsende Zahl von Stämmen beobachtet, die gegen verschiedene antimikrobielle Mittel resistent sind (Nadeau, M. und Higgins, R., 1991, Bulletin épidémiologique, 2: 4–5).
Die Nachfrage nach Schweinen aus A.-pleuropneumoniae-seronegativen Herden nimmt zu, insbesondere bei Herstellern, deren Herden akute Ausbrüche der Krankheit erfahren haben und die beschlossen haben, A. pleuropneumoniae "auszurotten", indem sie als Ersatz nur seronegative Tiere (die aus seronegativen Herden stammen) kaufen. Ein erfolgreiches Ausrottungsprogramm hängt hauptsächlich von der Genauigkeit und Zuverlässigkeit der serologischen Tests ab, die verwendet werden, um mit A. pleuropneumoniae infizierte Schweine zu identifizieren. Dennoch sollte die Interpretation der Serologie vorsichtig erfolgen. Ein Test, der nicht empfindlich ist, wird nicht alle infizierten Herden oder Tiere nachweisen (falsch negative Ergebnisse), und einer, der nicht spezifisch ist, wird fälschlicherweise einige nichtinfizierte Tiere verurteilen (falsch positive Ergebnisse).
Die antigene Spezifität von A. pleuropneumoniae scheint wenigstens teilweise mit den kapsulären Polysacchariden (Altman et al., 1988, Biochem. Cell. Biol. 66: 998–1004; Benyon et al., 1991, Carbohydrate Res., 209: 211–223; Bosse et al., 1990a, Can. J. Res. 54: 320–325, und 1990b, Can. J. Vet. Res. 54: 427–431) oder nach anderen Autoren mit den glatten Lipopolysacchariden (Altman et al., 1989, Carbohydrate Res. 191: 295–303; Benyon et al., 1991, Carbohydrate Res. 209: 225–238) verknüpft zu sein. Diese kapsulären Polysaccharide erweisen sich jedoch als sehr instabil und sind schwierig an den Polystyroloberflächen der für den ELISA verwendeten Platten zu befestigen (Perry et al., 1990, Immunother. Infect. Dis. 4: 299–308; Gray B.M., 1979, J. Immun. Methods, 28: 187–192).
FEMS Immunology and Medical Microbiology, Vol. 11, 1995, Seite 35–44, Rodriguez-Barbosa et al., offenbart die Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen das 0-Antigen des Lipopolysaccharids von Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 2 und ihre Verwendung bei der Klassifizierung von Feldisolaten.
FEMS Microbiology Letters, Vol. 82, 1991, Seite 143–148, Toyotsugu Nakai et al., offenbart die Epitopenstruktur im Lipopolysaccharid, die vom Serotyp-2-spezifischen monoklonalen Antikörper von Actinobacillus pleuropneumoniae erkannt wird. Beide offenbaren ELISAs, bei denen bakterieller Rohextrakt verwendet wird.
Veterinary Microbiology, Vol. 52, Nr. 3, 4, 1996, Seite 285–292, Stenbaeck et al., offenbart den Nachweis einer Variante des Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Lipopolysaccharids (LPS). Es wird ein gereinigtes Antigen verwendet, aber es gibt keine Offenbarung bezüglich positiver und negativer Kontrollseren.
WO 97-A1-05487 offenbart Screening-Kits für Antikörper gegen Actinobacillus pleuropneumoniae in Schweineseren unter Verwendung von gereinigtem Antigen und geeigneten Kontrollen, aber es werden nur Serotyp-5-Antigene verwendet.
Es gibt einige Kreuzreaktionen zwischen den Serotypen, zum Beispiel: Serotyp 3, 6 und 8, Serotyp 1, 9 und 11 sowie Serotyp 7 und 4. Es ist bisher nicht möglich, zwischen diesen Serotypen serologisch zu differenzieren. Die meisten dieser Kreuzreaktionen sind auf die Gegenwart von gemeinsamen Epitopen auf dem LPS-Niveau zurückzuführen. Außerdem konnten bei der serologischen Analyse von chronisch infizierten Tieren, die fortwährend mit dem Mikroorganismus provoziert werden, noch andere Kreuzreaktionen, die man bei der Serotypbestimmung nicht findet, beobachtet werden. Diese Kreuzreaktionen werden gewöhnlich mit Proteinen der äußeren Membran (Zellwandproteinen, eisenreprimierbaren Proteinen usw.) und rauhen Lipopolysacchariden assoziiert. Es ist jedoch wichtig, sich zu erinnern, dass eine einzige Herde und sogar ein einziges Tier mit mehreren Serotypen gleichzeitig infiziert sein könnte. In diesem Fall handelt es sich bei den nachgewiesenen Antikörpern gegen verschiedene Serotypen wahrscheinlich nicht um Kreuzreaktionen, sondern um homologe und spezifische Reaktionen. Dies ist eines der wichtigsten Probleme, die durch die Verwendung von spezifischen und empfindlichen serologischen Tests gemäß der vorliegenden Erfindung zu lösen sind.
Gesunde Trägerschweine können für die Übertragung der Krankheit verantwortlich sein. Das Fehlen von klinischen Symptomen und/oder Läsionen im Schlachthof impliziert nicht notwendigerweise die Abwesenheit der Infektion.
Nach der Infektion können Antikörper gewöhnlich in 10–15 Tagen nachgewiesen werden. Einige Tiere bleiben einige Monate lang serologisch positiv, aber die meisten sind lange Zeit positiv; wiederum wird dies von dem verwendeten Test abhängen.
Der Anteil an seropositiven Säuen sowie ihre Titer nahmen mit dem Alter häufig ab.
Die Isolierung von A. pleuropneumoniae aus scheinbar gesunden Trägerschweinen ist schwierig; sie sollte wahrscheinlich in widersprüchlichen Fällen als Ergänzung zur Serologie verwendet werden.
Die Entwicklung von besseren serologischen Tests ist eine Notwendigkeit, da die Infektion immer noch einen ökonomischen Einfluss auf die Schweineindustrie hat und die derzeitigen Impfstoffe nicht wirkungsvoll sind.
Bisher gibt es keinen stabilen Kit für die effektive Serodiagnose von Schweinepleuropneumonie im Feld.
Es wäre hochgradig wünschenswert, einen Kit zu haben, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen A. pleuropneumoniae Serotyp 2 in einer Serumprobe leicht bestimmen zu können.
Es wäre hochgradig wünschenswert, einen solchen ELISA-Diagnosekit für A. pleuropneumoniae zu haben, der für die A.-pleuropneumoniae-Serodiagnose verwendet werden könnte, während er im Feld bleibt.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Kit für die genaue, schnelle und empfindliche Bestimmung von Antikörpern gegen A. pleuropneumoniae Serotyp 2 in einer Probe bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen ELISA-Diagnosekit für A. pleuropneumoniae zur Verwendung für die A.-pleuropneumoniae-Serodiagnose, während er im Feld bleibt, bereitzustellen. Die Neuheit und Originalität des ELISA-Diagnosekits der vorliegenden Erfindung liegt in der besonderen Kombination aus einem neuen Reinigungsverfahren für das zu verwendende Antigen und einem neuen Sensibilisierungs- und Stabilisierungsverfahren für die Platten des Kits.
Die Kits der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich vom ELISA-Verfahren des Standes der Technik für die Bestimmung von A.-pleuropneumoniae-Antikörpern. Bei dem Verfahren des Standes der Technik wird das Antigen in einem PBS-Puffer auf den Platten fixiert, und die Platten werden sofort verwendet, nachdem die Antigenfixierung beendet ist. Das Verfahren des Standes der Technik kann ein computerisiertes Leseprotokoll für die Bestimmung der Antikörper in den Proben beinhalten, wie es von Trottier, Y.L. et al. (1992, J. Clin. Microbiol., 30: 46–53) beschrieben wird. Die Kits der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich hauptsächlich dadurch, dass das Antigen in der Phenolschicht anstatt in der Wasserschicht zurückgehalten wird. Außerdem ist das Verfahren der Antigenfixierung anders. Tatsächlich wird das gereinigte Antigen in einem PBS-EDTA-Puffer resuspendiert, der dann in jeden Napf der Platte gegeben wird. Nach 18 h Inkubation wird ein HRP-Puffer in jeden Napf gegeben. Die Antikörper in den Proben werden visuell bestimmt, indem man ein Chromogen, vorzugsweise TMBlue^TM, hinzufügt. Die Kits der vorliegenden Erfindung zeigen im Vergleich zum ELISA-Verfahren des Standes der Technik eine relative Empfindlichkeit und eine relative Spezifität von 100%.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein ELISA-Diagnosekit zur Bestimmung von A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörpern im Serum von Schweinen bereitgestellt, der in getrennter Verpackung Folgendes umfasst:

a) einen festen Träger, an den ein gereinigtes Lipopolysaccharid-Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen für eine spezifische Bindung an Anti-A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörper, die im Serum von Schweinen vorhanden sind, gebunden ist, wobei das Antigen in einer Lösung aufbewahrt wird, die Meerrettich-Peroxidase-stabilisierende Lösung umfasst und die das gebundene Antigen wenigstens 25 Wochen lang bei 4 °C stabil hält; und gegebenenfalls
b) Serum von Schweinen, das experimentell mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 geimpft ist und als positive Kontrolle dienen soll;
c) Schweineserum aus einer von einem spezifischen Pathogen freien Herde, das als negative Kontrolle dienen soll;
d) ein nachweisbar markiertes Konjugat, das an Schweineantikörper bindet, die an die Platte von a) gebunden sind.

Das Antigen von Schritt a) kann an den festen Träger gebunden werden, indem man es in einer Lösung aufbewahrt, die eine HRP-stabilisierende Lösung umfasst und die das gebundene Antigen wenigstens 25 Wochen lang bei 4 °C stabil hält.
Die ELISA-Diagnosekits der vorliegenden Erfindung können weiterhin Folgendes umfassen

e) ein Substrat, das die Visualisierung des nachweisbar markierten Konjugats ermöglicht.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Kits bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Reinigen von Lipopolysaccharid-A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen durch Phenolextraktion und Zentrifugation des antigenen bakteriellen Rohextrakts;
b) Fixieren des Antigens von Schritt a) auf einem festen Träger und Stabilisieren des fixierten Antigens;
c) Immunisieren von Tieren mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 und Gewinnen von Serum, das als positives Kontrollserum dienen soll; und
d) Gewinnen von Seren von A.-pleuropneumoniae-freien Herden, die als negative Kontrollseren dienen sollen.

Das Fixieren des Antigens von Schritt b) kann erfolgen, indem man es in einer Lösung aufbewahrt, die eine HRP-stabilisierende Lösung umfasst und die das gebundene Antigen wenigstens 25 Wochen lang bei 4 °C stabil hält.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 zeigt den Übersichtsplan der Platte des bevorzugten Kits der vorliegenden Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Kits der vorliegenden Erfindung sind insofern neu, als sie ein einfaches und schnelles Testen im Feld, wo die Tiere sind, ermöglichen. Diese Kits sind ausreichend stabil, so dass sie eine Lagerbeständigkeit von wenigstens 3½ Monaten haben. Das Antigen wurde nach einem neuen Verfahren gereinigt, das eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht.
Die Kits der vorliegenden Erfindung beruhen im Wesentlichen auf der besonderen Kombination aus einem neuen Reinigungsverfahren für Lipopolysaccharid-Antigen aus einem Referenzstamm von A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen und einer neuen Beschichtung und Stabilisierung des Antigens auf der Oberfläche der Platte. Der Kit gemäß der vorliegenden Erfindung ist sehr spezifisch, empfindlich und stabil. Der Test gemäß dem Kit der vorliegenden Erfindung besteht in der Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Anti-A.-pleuropneumoniae-Antikörpern im Serum von Schweinen für die Serodiagnose von A. pleuropneumoniae Serotyp 2.
Der Test besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten:

a) Eine Platte mit 96 Näpfen, die mit dem spezifischen Antigen von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 sensibilisiert ist, wird mit einer PBS-Tween^TM-20-Pufferlösung gewaschen.
b) Eine Serumprobe von jedem Schwein aus der getesteten Herde wird auf zwei sensibilisierte Näpfe von Schritt a) verteilt. Während dieser ersten Inkubation binden die Anti-A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörper, falls in den Seren vorhanden, an das an der Platte befestigte oder festphasengebundene Antigen.
c) Die Platte wird gewaschen, um ungebundenes Material aus den Näpfen zu entfernen. Ein Peroxidase-Anti-IgG-Konjugat, das vorzugsweise von den Jackson Immuno Research Laboratories (Katalog-Nr. 114-035-003) erhal ten wird, wird in jeden Napf gegeben. Dieses Konjugat bindet an alle IgG, die an das in Schritt b) an der Platte befestigte Antigen gebunden hätten. Wenn das Schweineserum keine Anti-A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörper enthielt, bleibt das Konjugat frei oder in Suspension und wird während dieses Waschschritts beseitigt.
d) Die Anwesenheit von immobilisierter Peroxidase innerhalb des gebundenen Konjugats wird durch die Zugabe eines chromogenen Substrats TMBlue^TM (vertrieben von Transgenic Science Inc., Milford, MA 01757, USA, Katalog-Nr. TM-102) nachgewiesen. Wenn das Konjugat vorhanden ist, gibt es eine Oxidationsreaktion, und eine blaue Farbe erscheint.

Der bevorzugte Kit der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Artikel:

1. Fünf 96-Napf-Platten (Nunc^TM, vertrieben von Gibco, Burlington, Ontario, Kanada, L7P 1A1), die mit dem gereinigten Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung sensibilisiert und stabilisiert sind.
2. Positive Kontrolle: fünf Vials, die jeweils 0,1 ml lyophilisiertes Serum von Schweinen enthalten, die experimentell mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 geimpft wurden.
3. Negative Kontrolle: fünf Vials, die jeweils 0,1 ml lyophilisiertes Schweineserum aus einer von einem spezifischen Pathogen freien Herde enthalten.
4. Schwach positive Kontrolle: fünf Vials, die jeweils 0,1 ml lyophilisiertes Serum von Schweinen enthalten, die experimentell mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 geimpft wurden.
5. Konjugat: fünf Vials mit an Peroxidase gekoppelten Schweine-Anti-IgG-Immunglobulinen. Jedes Vial enthält 1,2 ml Konjugat, stabilisiert mit HRP (Calbiochem Corporation, Kanada, Nr. 516534).
6. TMBlue^TM: fünf Vials, die jeweils 12 ml TMBlue^TM enthalten.

1 zeigt den Übersichtsplan der Platte des bevorzugten Kits der vorliegenden Erfindung, wo 40 verschiedene Seren analysiert werden. Die Näpfe werden wie folgt identifiziert:

BL: = Blindproben, PBS-Tween^TM-20-Pufferlösung (4 Näpfe)
CP: = positive Kontrolle, der obige Artikel Nr. 2 (4 Näpfe)
CN: = negative Kontrolle, der obige Artikel Nr. 3 (4 Näpfe)
CPFA: = schwach positive Kontrolle, der obige Artikel Nr. 4 (4 Näpfe)
S1 bis S40: = zu analysierendes Serum, 2 Näpfe für jedes Serum.

Herstellung der PBS-Tween^TM-20-Pufferlösung
Man gebe Folgendes zu 3 l destillierten Wassers:
52,59 g Natriumchlorid;
1,47 g einbasiges Natriumphosphat;
7,02 g zweibasiges Natriumphosphat;
1,5 ml Tween^TM-20.
Gut mischen, bis eine vollständige Auflösung erreicht ist. Man überprüfe den pH-Wert, der etwa 7,30 ± 0,05 betragen sollte, wenn nicht, stelle man den pH-Wert mit Hilfe von zweibasigem Natriumphosphat ein. Diese Lösung hat eine Lagerstabilität von 1 Woche, wenn man sie bei 4 °C aufbewahrt. Die Pufferlösung sollte stets auf Raumtemperatur gebracht werden, bevor sie im Test verwendet wird.
Bakterienstamm
Der Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2, der als Stamm ATCC 27089 bezeichnet wird, wurde für die Antigenproduktion verwendet (Altman et al., 1987, Biochem. Cell Biol., 65: 414–422). Der Stamm wurde lyophilisiert gehalten.
Bakterienkultur
Der Inhalt eines Vials wurde in einem ml PPLO-Flüssigmedium (Difco Laboratories, Detroit, MI) resuspendiert und bis zur Erschöpfung auf eine PPLO-Agarplatte geimpft. Die Platte wurde 24 Stunden lang aerob bei 37 °C inkubiert. Einige Kolonien wurden in 5 ml PPLO-Flüssigmedium resuspendiert. PPLO-Platten wurden bei Konfluenz mit einem sterilen Wattestäbchen geimpft, und diese Platten wurden dann 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die gewachsenen Bakterien geerntet, indem man 3,0 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) (Oxoid Ltd., Basingstoke, England), die 0,5 Vol.-% Formaldehyd enthielt (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), zu jeder Gelplatte gab.
Antigenreinigung
Die erhaltene Bakteriensuspension wurde in eine sterile Flasche gegeben und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Die optische Dichte wurde mit einer Lösung von PBS/0,5% Formaldehyd eingestellt. Die Suspensionen wurden in sterilen Vials mit Schraubverschluss getrennt und 60 min lang gekocht. Dann wurden die Suspensionen 30–40 min lang mit 12 000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und durch ein Filter mit 0,22 μm Porengröße (Millipore Corp., Bedford, MA) filtriert.
Das Antigen wurde nach dem folgenden Verfahren gereinigt.

• Herstellen der Phenollösung durch Mischen von 90 g Phenolkristallen mit 100 ml destilliertem Wasser;
• Mischen eines gleichen Volumens der Phenollösung mit einem gleichen Volumen des rohen Extrakts in Corex^TM-Röhrchen, Mischen durch Umdrehen und 30 min Stehenlassen bei Raumtemperatur.
• 30 min Zentrifugieren mit 12 000 × g bei 4 °C.
• Nach der ersten Zentrifugation wurden zwei Phasen erhalten mit einer Grenzfläche aus unlöslichem Material. Die Phenolphase wurde mit einer Pasteur^TM-Pipette gewonnen, und das Volumen wurde in einem Messzylinder gemessen.
• Mischen eines gleichen Volumens der Phenolphase (erste Extraktion) mit einem gleichen Volumen der Wasserphase in Corex^TM-Röhrchen, Mischen durch Umdrehen und 30 min Stehenlassen bei Raumtemperatur.
• 30 min Zentrifugieren mit 12 000 × g bei 4 °C.
• Die Phenolphase wurde gewonnen, und das Volumen wurde in einem Messzylinder gemessen.
• Mischen eines gleichen Volumens der Phenolphase (zweite Extraktion) mit einem gleichen Volumen der Wasserphase in Corex^TM-Röhrchen, Mischen durch Umdrehen und 30 min Stehenlassen bei Raumtemperatur.
• Während dieser Zeit Vorbereiten der Dialysemembran durch Tränken in destilliertem Wasser während einer ausreichenden Zeit.
• 30 min Zentrifugieren mit 12 000 × g bei 4 °C.
• Die wässrige Phase wurde gewonnen, und das Volumen wurde in einem Messzylinder gemessen.
• Die Phenolphase (dritte Extraktion) wurde gegen 3 × 12 l destilliertes Wasser dialysiert, um Spuren von Phenol zu entfernen, nicht länger als 24 Stunden dialysieren.

Antiseren – negative Kontrolle
Seren von mehreren Schweinen wurden beim Schlachten von einer von einem spezifischen Pathogen freien Herde erhalten; die Seren wurden miteinander gemischt, und Thimerosal (vertrieben von Sigma, St. Louis, MO 14508, USA, Katalog-Nr. T-5125) wurde hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration von 0,01% erhielt. Keine Anamnese von A. pleuropneumoniae wurde seit wenigstens vier Jahren jemals für diese Herde beschrieben. Die Seren wurden vom Pleuropneumonie-Labor der veterinärmedizinischen Fakultät der University of Montreal mit Hilfe der ELISA-Technik gegen alle A.-pleuropneumoniae-Serotypen getestet.
Antiseren – positive Kontrolle
Der Stamm A. pleuropneumoniae Serotyp 2 (Stamm ATCC 27089) wurde für die Bakterienproduktion verwendet. Der Inhalt eines Vials wurde in einem ml PPLO-Flüssigmedium (Difco Laboratories, Detroit, MI) resuspendiert und bis zur Erschöpfung auf zwei PPLO-Agarplatten geimpft. Die Platten wurden 18 Stunden lang bei 37 °C aerob inkubiert.
Die Bakterienproduktion für die Immunisierung von Schweinen wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt.

• Sammeln einiger Kolonien, die mit einem sterilen Wattestäbchen isoliert wurden, und Resuspendieren derselben in einer PPLO-Bouillon.
• 5 PPLO-Agarplatten wurden bei Konfluenz mit dem Bouillon und sterilen Wattestäbchen geimpft. Eine Mueller-Hinton-Agarplatte wurde mit dem übrigen Bouillon geimpft und diente als negative Kontrolle. Eine PPLO-Agarplatte wurde bis zur Erschöpfung geimpft.
• Diese Platten wurden dann 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Eine Platte wird für die Serotypbestimmung verwendet.
• Nach der Inkubation, Ernten der gewachsenen Bakterien durch Zugabe von 3,0 ml PBS/0,5% Formaldehyd zu jeder Platte und Mischen mit einem Hockey Stick, der aus einer sterilen Pasteur^TM-Pipette besteht, und Gewinnen der Suspension mit einer Pipette.
• Die erhaltene bakterielle Suspension wurde in eine sterile Flasche gegeben, gut gemischt und 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
• Die optische Dichte wurde bei 540 nm abgelesen und mit einer Lösung von PBS/0,5% Formaldehyd auf 1,0 eingestellt.
• Die Lösung wurde bis zur Verwendung oder höchstens eine Woche lang bei 4 °C aufbewahrt.

Für die Immunisierung wurden vier fünf Wochen alte Ferkel von einer von einem spezifischen Pathogen freien Herde erhalten. Keine Anamnese von A. pleuropneumoniae wurde seit wenigstens vier Jahren jemals für diese Herde beschrieben, und beim Schlachten wurden keine Lungenläsionen beobachtet. Bei ihrer Ankunft wird der allgemeine Gesundheitszustand der Ferkel überprüft. Die Ferkel werden nach Bedarf mit einführendem Mastfutter für Schweine (15/30 CP-OP) gefüttert. nach wenigen Tagen der Anpassung wird von jedem Tier eine Blutprobe entnommen. Die Seren wurden vom Pleuropneumonie-Labor der veterinärmedizinischen Fakultät der University of Montreal mit Hilfe der ELISA-Technik gegen alle A.-pleuropneumoniae-Serotypen getestet. Die Seren waren für alle Serotypen negativ.
Die Schweine wurden alle drei Wochen intravenös mit 5 ml der bakteriellen Suspension immunisiert, bis der ELISA-Titer einen Wert von größer oder gleich 1,0 ergab. Die Schweine wurden ausbluten gelassen, und die Seren von jedem Tier wurden miteinander gemischt.
ELISA
Zur Bewertung der Effizienz und Zuverlässigkeit der Kits der vorliegenden Erfindung wurden zwei ELISA-Verfahren verwendet. Im ersten Verfahren werden die Platten unmittelbar nach der Sensibilisierung verwendet, die Inkubationszeit beträgt eine Stunde, und ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) wird als Chromogen verwendet. Im zweiten Verfahren werden die Platten nach der Sensibilisierung mit HRP behandelt (konjugatstabilisierende Lösung, vertrieben von der Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, CA 92039, USA, Katalog-Nr. 516534), die Inkubationszeit beträgt 15 min, und TMBlue^TM wird als Chromogen verwendet.
Der ELISA besteht aus:
1 – Sensibilisierung der Platten

• Verdünnen in 1,5 ml Antigen in 73,5 ml PBS-EDTA-Puffer, pH 7,3.
• Zugeben von 100 μl Antigen in jeden Napf.
• Verschließen der Platte mit einer Acetatfolie.
• Über Nacht bei 4 °C inkubieren.

Für die Bewertung des Kits, für die Stabilitätsassays sowie für die visuellen Assays werden die Platten mit HRP behandelt. Der Inhalt der Näpfe wird ausgeleert, und 100 μl HRP werden in jeden Napf gegeben. Die Platten werden bis zur Verwendung auf 4 °C gehalten.
2 – Waschen der sensibilisierten Platten

• Zurückgewinnen der Platte und Ausleeren ihres Inhalts.
• Füllen jedes Napfs mit PBS-Tween^TM-20-Puffer.
• Ausleeren des Platteninhalts.
• Diese Schritte viermal wiederholen.
• 2–3-mal Abschütteln auf einem saugfähigen Papier zur Entfernung von überschüssiger Waschlösung.

3 – Serenherstellung

• Die Seren werden in PBS-Tween^TM-20-Puffer 1/200 verdünnt und in einer Menge von 100 μl auf jeden Napf verteilt.
• Die Platte sachte schütteln, um die Verteilung der Proben am Boden der Näpfe zu gewährleisten. Abdecken der Platte mit einer Acetatfolie.
• Stehenlassen der Platte während einer Stunde bei Raumtemperatur für ELISA unter Verwendung von ABTS oder 15 min lang zwischen 18 °C und 22 °C für ELISA unter Verwendung von TMBlue^TM.

4 – Waschen der Platte zur Entfernung von ungebundenen Antikörpern

5 – Verteilung von Konjugat

• Das Konjugat besteht aus einer mit Meerrettich-Peroxidase markierten Immunglobulin-G-Fraktion von Kaninchen-Antiserum gegen Schweine-IgG (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Katalog-Nr. 114-035-003). Das Konjugat wird in einer endgültigen Verdünnung von 1/6000 verwendet. Das Konjugat wird in einer Menge von 100 μl auf jeden Napf der Platte verteilt.
• Die Platte sachte schütteln, um die Verteilung der Proben am Boden der Näpfe zu gewährleisten. Abdecken der Platte mit einer Acetatfolie.
• Stehenlassen der Platte während einer Stunde bei Raumtemperatur für ELISA unter Verwendung von ABTS oder 15 min lang für ELISA unter Verwendung von TMBlue^TM.

6 – Waschen der Platte zur Entfernung von ungebundenem Koniugat

• Zurückgewinnen der Platte und Ausleeren ihres Inhalts.
• Füllen jedes Napfs mit PBS-Tween^TM-20-Puffer.
• Ausleeren des Platteninhalts.
• Diese Schritte zweimal wiederholen.
• 2–3-mal Abschütteln auf einem saugfähigen Papier zur Entfernung von überschüssiger Waschlösung.

ELISA unter Verwendung von ABTS
Dieser wurde nur verwendet, um den Kit der vorliegenden Erfindung zu bewerten oder einen Spektrophotometerwert zu erhalten.
7a – Vorbereitung und Verteilung von Chromogen

• Die Reaktion wurde unter Verwendung von 3% H₂O₂ und 40 mM ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma Chemical) in 50 mM Citratlösung (pH 5,0) sichtbar gemacht. Man gebe 100 μl dieser Citrat-ABTS-Lösung in jeden Napf der Platte.
• Die Platte sachte schütteln, um die Verteilung der Proben am Boden der Näpfe zu gewährleisten.
• Stehenlassen der Platte während 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 18 °C und 22 °C).

8a – Ablesen und Interpretation der Ergebnisse
Die optische Dichte wurde bei 414 nm unter Verwendung eines automatischen Plattenlesegeräts (MR5000^TM, Dynatech Laboratories Inc.) abgelesen.
Die Ergebnisse wurden nach dem folgenden Verfahren berechnet.

1 – Die Werte der acht Näpfe BL (Blindprobe) wurden überprüft: • Ein Wert von unter 0,08 zeigt einen gültigen Test an, Ablesen fortsetzen. • Ein Wert von über 0,08 zeigt einen ungültigen Test an, Test mit einem neuen Kit wiederholen oder mit dem Hersteller des Kits in Verbindung setzen.
2 – Die Mittelwerte der negativen und positiven Kontrollen werden wie folgt berechnet (siehe 1 wegen der Identifizierung der Näpfe): positive Kontrolle = ((A1 + E1 + A7 + E7)/4) – BL-Mittelwert negative Kontrolle = ((B1 + F1 + B7 + F7)/4) – BL-Mittelwert

ELISA unter Verwendung von TMBlue^TM gemäß der vorliegenden Erfindung
7b – Vorbereitung und Verteilung von Chromogen

• 100 μl TMBlue^TM in jeden Napf der Platte geben.
• Die Platte sachte schütteln, um die Verteilung der Proben am Boden der Näpfe zu gewährleisten.
• Stehenlassen der Platte während 5 bis 15 min bei Raumtemperatur (zwischen 18 °C und 22 °C).

8b – Ablesen und Interpretation der Ergebnisse
Die visuelle Ablesung wurde ohne Ableseinstrumente wie folgt durchgeführt:
Die Ergebnisse wurden nach dem folgenden Verfahren berechnet.

1 – Die Farbe der acht Näpfe BL (Blindprobe) und der negativen Kontrollen wird überprüft; sie sollte Farblos sein.
2 – Die Farbe der positiven Kontrollen wird überprüft; sie sollte Dunkelblau sein.
3 – Die Farbe der CPFA (schwach positiven Kontrolle) wird überprüft; sie sollte Hellblau sein.
4 – Die Antwort jeder Probe sollte wie folgt quantifiziert werden: 0 = farbloser Napf oder leicht bläulich 1+ = Napf von hellblauer Farbe 2+ = Napf von blauer Farbe 3+ = Napf von dunkelblauer Farbe 4+ = Napf von dunkelblauer Farbe

Das Ablesen mit einem Spektrophotometer wurde so durchgeführt und berechnet, wie es oben in Abschnitt 8a beschrieben ist. Die positive Kontrolle sollte in einer optischen Dichte von ≥ 1,0 vorhanden sein, um die Platte zu akzeptieren.
Ergebnisse
Reproduzierbarkeit der Antigenbefestigung
Das Ziel dieser Testreihe besteht darin, die Reproduzierbarkeit der Antigenbindung am Boden der Näpfe der Platte zu überprüfen. Die Variation in der Antigenbindung zwischen den Näpfen derselben Platte wurde bestimmt. Jeder der 96 Näpfe von jeweils drei Platten wurde mit 1/50 Verdünnung von A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen sensibilisiert, die Platten wurden unmittelbar nach ihrer Sensibilisierung gemäß dem ELISA-TMBlue^TM-Verfahren verwendet. Die Kontrollseren wurden in den drei Platten verteilt. Das positive Kontrollserum wurde in 17 Näpfen von jeweils drei Platten und das negative Kontrollserum in 16 Näpfen verwendet. Jedes der sechs Kontrollserumfelder wurde in acht Näpfe jeder Platte verteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Reproduzierbarkeit der Antigenbindung zwischen Näpfen derselben Platte oder von verschiedenen Platten
Spezifität und Empfindlichkeit des Kits
Die Spezifität des Antigens wurde unter Verwendung von Seren von Schweinen überprüft, die experimentell mit Stämmen von A. pleuropneumoniae verschiedener Serotypen oder mit anderen Bakterientypen infiziert wurden. Das ELISA-Verfahren wurde mit ABTS als Chromogen verwendet.
Das Antigen ergab positive Reaktionen mit Seren von Schweinen, die experimentell mit Stämmen von A. pleuropneumoniae des Serotyps 2 infiziert wurden, und negative Reaktionen mit Seren von Schweinen, die experimentell mit Stämmen von A. pleuropneumoniae der Serotypen 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11 und 12 infiziert wurden (Tabelle 2). Die Seren von Schweinen, die mit H. parasuis, P. multocida, E. coli oder A. suis infiziert wurden, ergaben negative Reaktionen. Tabelle 2 ELISA-Ergebnisse des Antigens, das aus A. pleuropneumoniae Serotyp 2 gereinigt wurde, gegenüber verschiedenen Seren von experimentell geimpften Schweinen
Zweitens wurden die Platten nach der Sensibilisierung mit dem Antigen mit HRP behandelt, und die ELISA-TMBlue^TM-Technik wurde verwendet (Tabelle 3). Tabelle 3 ELISA-TMBlue^TM-Reaktionen des Antigens, das aus A. pleuropneumoniae Serotyp 2 gereinigt wurde, gegenüber Referenzseren
Das CP-, das EP1- und das EP2-Serum ergaben positive Reaktionen. Das CP-Serum stammte aus einem Pool von Seren, die nach der Impfung von zwei fünf Wochen alten Ferkeln mit dem Referenzstamm von A. pleuropneumoniae erhalten wurden. Das EP1- und das EP2-Serum wurden von Tieren einer Herde erhalten, die eine akute Infektion zeigten, wobei häufig eine Mortalität durch A. pleuropneumoniae Serotyp 2 beobachtet wird. Das CN-, das EN1- und das EN2-Serum ergaben negative Reaktionen. Das CN-Serum stammte aus einem Pool von Schweineseren, die von einer SPF (von einem spezifischen Pathogen freien) Herde genommen wurden, für die seit wenigstens vier Jahren keine Anamnese von Pleuropneumonie im Schlachthof beschrieben wurde. Das EN1- und das EN2-Serum stammten von Schweinen aus zwei Herden ohne Anamnese von Pleuropneumonie und ohne Läsionen im Schlachthof. Das ED1- und das ED2-Serum zeigten im ELISA schwach positive Reaktionen. Diese Seren wurden von zwei Schweinen aus einer Herde erhalten, die chronisch mit A. pleuropneumoniae Serotyp 2 infiziert war. Diese zwei Seren werden als schwach positiv angesehen; sie wurden tatsächlich durch den Pleuropneumoniedienst der veterinärme dizinischen Fakultät (VMF) der University of Montreal anhand des ELISA-Referenztests als schwach positive Seren klassifiziert.
Untersuchung der Stabilität des Kits
Während der vorläufigen Versuche wurden verschiedene Techniken der Antigenbindung, verschiedene Puffer sowie verschiedene Verfahren der Konservierung der Platten bewertet. Das gewählte Verfahren in Bezug auf die Antigenbindung besteht in einer Verdünnung von 1,5 ml Antigen in 73,5 ml PBS-EDTA-Puffer, pH 7,3. Dann wurden 100 μl dieser Lösung in jeden Napf der 96-Napf-Platten (Nunc^TM) verteilt, und die Platten werden 18 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Der Inhalt der Platten wird ausgeleert, und 100 μl HRP werden in jeden Napf gegeben. Die Platten werden bei 4 °C aufbewahrt. Die Stabilität der Platten wird monatlich bewertet. Außer den drei Kontrollen, die in dem Kit mit enthalten sind, werden acht zusätzliche Seren für die Stabilitätsuntersuchung verwendet. Diese Seren werden bei –20 °C aufbewahrt, und für jeden Assay wird ein neues Aliquot verwendet. Der Kit wird so bewertet, wie es in der Anwendungsvorschrift beschrieben ist. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, ist der Kit wenigstens 6 Monate lang stabil. Tabelle 4 Stabilitätsbewertung des visuellen Testkits für A. pleuropneumoniae Serotyp 2

* Zahl der Seren

Reproduzierbarkeit des Kits in Abhängigkeit von Anwender
Eine Charge von drei vollständigen Kits wurde hergestellt. Sechs (6) verschiedene Seren wurden aus dem Serologielabor der VMF erhalten; ein Kit sowie ein Aliquot jedes unverdünnten Serums wurden drei verschiedenen Anwendern gegeben. Von den drei verschiedenen Anwendern wurden identische Ergebnisse erhalten (Tabelle 5). Tabelle 5 Bewertung des visuellen Testkits für A. pleuropneumoniae Serotyp 2 durch drei verschiedene Anwender

* Zahl der Seren

Um die Empfindlichkeit und Spezifität des Kits der vorliegenden Erfindung zu überprüfen, wurden schließlich mehrere vollständige Kits hergestellt. Insgesamt 259 Seren wurden vom Pleuropneumonie-Serologielabor der veterinärmedizinischen Fakultät der University of Montreal erhalten. Diese Seren wurden durch dieses Labor klassifiziert und waren von Herden mit einem wohlbekannten Gesundheitsstatus erhalten worden. Die 117 Seren, die vom Pleuropneumonie-Serologielabor als negativ klassifiziert wurden, wurden mit dem Kit der vorliegenden Erfindung als negativ bestätigt. Innerhalb der 142 Seren, die vom Pleuropneumonie-Serologielabor als positiv klassifiziert wurden, ergaben 2 Seren mit dem Kit der vorliegenden Erfindung eine 1+-Reaktion, und die übrigen 140 Seren ergaben damit eine 2-4*-Reaktion (Tabelle 6). Tabelle 6 Empfindlichkeit und Spezifität des visuellen Testkits für A. pleuropneumoniae Serotyp 2
Diskussion
Die Bestimmung der Empfindlichkeit und Spezifität eines Tests wird durchgeführt, indem man entweder Tierpopulationen verwendet, die einen Status haben, der eindeutig als "infiziert" oder als "gesund" identifiziert ist, oder indem man die Ergebnisse des Tests mit einem Referenztest, einem "goldenen Test", vergleicht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden beide Verfahren verwendet.
Ein Serum von wohldefiniertem Status, 85 Seren von Schweinen, die experimentell mit Stämmen von A. pleuropneumoniae verschiedener Serotypen oder mit verschiedenen Bakterien infiziert wurden, wurden verwendet. Danach wurden acht zusätzliche Seren von Schweinen von wohldefiniertem Status verwendet; ein Serum stammte von einem Schwein, das experimentell mit A. pleuropneumoniae Serotyp 2 (Stamm ATCC 27089) infiziert worden war, ein Serum kam aus einem Pool von Seren von Schweinen, die frei von einem spezifischen Pathogen waren (SPF), und sechs Schweineseren kamen von Schweinen, die zu verschiedenen Herden mit einem wohldefinierten Status gehören.
Der ELISA-Kit der vorliegenden Erfindung ergab eine positive Reaktion nur mit Seren von Schweinen, die experimentell oder natürlich mit A. pleuropneumoniae Serotyp 2 infiziert waren. Die Seren von Schweinen, die experimentell mit Stämmen von A. pleuropneumoniae Serotyp 1, 2, 3, 5, 9, 10, 11 und 12 und 11, H. parasuis, P. multocida, E. coli oder A. suis infiziert waren, sowie die beiden Pools von Seren von SPF-Schweinen ergaben negative Reaktionen. Das ED1- und das ED2-Serum stammten von Schweinen, die keine klinischen Symptome von Pleuropneumonie zeigten, aber Anzeichen einer Infektion mit A. pleuropneumoniae Serotyp 2 wurden in der Herde beobachtet. Diese Seren wurden daher als schwach positiv angesehen.
Der ELISA-Kit der vorliegenden Erfindung ist bei 4 °C wenigstens 6 Monate lang stabil. Die Stabilitätsuntersuchungen sind immer noch im Gange.
Die Spezifität und Empfindlichkeit des Kits der vorliegenden Erfindung wurde auch unter Verwendung von 259 Schweineseren bewertet. Diese Seren wurden vom Pleuropneumonie-Labor der veterinärmedizinischen Fakultät der University of Montreal zur Verfügung gestellt. Dieses Labor wurde als Referenzlabor in Bezug auf die Serologie von Actinobacillus pleuropneumoniae angesehen, und die in diesem Labor erhaltenen Ergebnisse galten als "goldener Test". Dieses Labor analysiert schon seit mehr als 10 Jahren zwischen 30 000 und 40 000 Schweineseren pro Jahr. Die von dem Pleuropneumonie-Labor verwendete Methode besteht in einer ELISA-Technik, die normiert wurde, um die Anwesenheit von Antikörpern zu bestimmen. Ein ergänzender Fixierungstest wird aufgrund seiner fehlenden Empfindlichkeit und Spezifität in diesem Labor nicht mehr verwendet. Das Serologie-Labor hat seinen normierten ELISA-Test entwickelt, indem es verschiedene Antigentypen miteinander verglich (Gottschalk, M. et al., 1994, Vet. Microbiol., 42: 91–104). Im Hinblick auf die großen Zahlen von Seren, die von diesem Labor empfangen werden, wurden die dabei erhaltenen Ergebnisse als Referenz angesehen. Der Status der Seren, wie er durch dieses Labor erhalten wurde, ob positiv oder negativ, war also gut bescheinigt. Zwischen den Ergebnissen, die man mit dem Kit der vorliegenden Erfindung erhält, und der Klassifikationsform des Serologielabors wurde eine Korrelation von 100% beobachtet. Alle Seren, die vom Referenz-Serologielabor als negativ klassifiziert wurden, wurden also durch den Kit der vorliegenden Erfindung als negativ bestimmt. Wenn man die schwach positiven oder positiven 1+ als positive ansieht, ergaben alle vom Referenzlabor als positiv klassifizierten Seren bei Verwendung des Kits der vorliegenden Erfindung eine positive Reaktion.
Der Kit der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem ELISA-Verfahren, das vom Referenz-Serologielabor verwendet wird. Bei dem von letzterem verwendeten Verfahren wird das Antigen in einem PBS-Puffer auf den Platten fixiert, und die Platten werden sofort nach der Antigenfixierung verwendet. Außerdem verwendet das Serologielabor ein computerisiertes Leseprotokoll für die Bestimmung der Antikörper in den Proben (Trottier, Y.L. et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30: 46–53).
Im Falle des Kits der vorliegenden Erfindung wird das Antigen unter Verwendung eines in der Phenolfraktion (nicht in der Wasserfraktion) zurückgehaltenen Antigens gereinigt, und die Antigenfixierung ist anders. Tatsächlich wird das gereinigte Antigen in einem PBS-EDTA-Puffer resuspendiert, der dann zu den Näpfen der Platten gegeben wird. Nach einer 18-stündigen Inkubation wird HRP-Puffer in jeden Napf gegeben. Die Antikörper in den Proben werden dann visuell bestimm, indem man ein Chromogen, vorzugsweise TMBlue^TM, hinzufügt.
Im Vergleich zu dem normierten ELISA-Verfahren, das vom Serologielabor verwendet wird, zeigt der Kit der vorliegenden Erfindung eine Empfindlichkeit und Spezifität von 100%. Außerdem ist der Kit der vorliegenden Erfindung schneller zu verwenden als das ELISA-ABTS-Verfahren des Standes der Technik. Tatsächlich werden bei Verwendung des Kits der vorliegenden Erfindung Ergebnisse in weniger als einer Stunde erhalten, während für das ELISA-ABTS-Verfahren wenigstens drei Stunden erforderlich sind, neben dem über Nacht dauernden Schritt, der für die Fixierung des Antigens erforderlich ist. Weiterhin gilt ABTS als potentiell karzinogen und ist außerdem nur mäßig stabil.
Der Kit der vorliegenden Erfindung lässt sich leicht verwenden und liefert schnelle Ergebnisse. Der Kit kann von einem Veterinär mit einem Minimum an Erfahrung verwendet werden, er kann im Feld verwendet werden, wo die Tiere gehalten werden, und erfordert keine Fähigkeiten eines Labors, da nur einfache Schritte durchgeführt werden müssen. Außerdem wurde bewiesen, dass dieser Kit unabhängig vom Anwender hochgradig zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Die mit dem Kit der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse sind identisch mit denjenigen, die vom Pleuropneumonie-Labor der VMF erhalten werden. Der Kit der vorliegenden Erfindung ist also im Vergleich zu den zur zeit verfügbaren Labortests hochgradig vorteilhaft in Bezug auf Schnelligkeit, Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität, Stabilität und Kosten.
Während die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, wird man sich darüber im Klaren sein, dass sie zu weiteren Modifikationen befähigt ist, und ihre Anwendung soll alle Variationen, Verwendungen oder Adaptionen der Erfindung abdecken, die im Allgemeinen die Prinzipien der Erfindung befolgen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die in der Technik, auf die sich die Erfindung bezieht, bekannte oder übliche Praxis sind und auf die oben dargelegten wesentlichen Merkmale angewendet werden können und in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

ELISA-Diagnosekit zur Bestimmung von A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörpern im Serum von Schweinen, umfassend in getrennter Verpackung: a) einen festen Träger, an den ein gereinigtes Lipopolysaccharid-Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen für eine spezifische Bindung an A.-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antikörper, die im Serum von Schweinen vorhanden sind, gebunden ist, wobei das Antigen in einer Lösung aufbewahrt wird, die Meerrettich-Peroxidase-stabilisierende Lösung umfasst und die das gebundene Antigen wenigstens 25 Wochen lang bei 4 °C stabil hält; und gegebenenfalls b) Serum von Schweinen, das experimentell mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 geimpft ist und als positive Kontrolle dienen soll; c) Schweineserum aus einer von einem spezifischen Pathogen freien Herde, das als negative Kontrolle dienen soll; d) ein nachweisbar markiertes Konjugat, das an Schweineantikörper bindet, die an die Platte von a) gebunden sind.
Kit gemäß Anspruch 1, der weiterhin Folgendes umfasst: e) ein Substrat, das die Visualisierung des nachweisbar markierten Konjugats ermöglicht.
Kit gemäß Anspruch 2, wobei das nachweisbar markierte Konjugat einen Enzymmarker umfasst.
Kit gemäß Anspruch 3, wobei das Substrat eine Zusammensetzung ist, um in Gegenwart des Enzymmarkers ein kolorimetrisches, fluorimetrisches oder chemilumineszentes Signal zu erhalten.
Kit gemäß Anspruch 3, wobei das nachweisbar markierte Konjugat an Peroxidase gekoppelte Schweine-Anti-IgG-Immunglobuline umfasst.
Kit gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei der kolorimetrischen Zusammensetzung um TMBlue^TM handelt.
Kit gemäß Anspruch 6, wobei das positive und/oder das negative Kontrollserum lyophilisiertes Serum ist.
Kit gemäß Anspruch 7, wobei das Serum in einer Menge von etwa 0,4 ml lyophilisiertem Serum vorliegt.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der feste Träger eine 96-Napf-Platte ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Platte ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das nachweisbar markierte Konjugat ein Konjugat-Vial mit an Peroxidase gekoppelten Schweine-Anti-IgG-Immunglobulinen ist.
Kit gemäß Anspruch 1, der weiterhin ein Vial mit einer schwach positiven Kontrolle in Form von Serum von Schweinen, die experimentell mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 geimpft sind, umfasst.
Kit gemäß Anspruch 1, der weiterhin eine kolorimetrische Zusammensetzung umfasst, die aus TMBlue^TM oder ABTS besteht.
Verfahren zur Herstellung des Kits von Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst: a) Reinigen von Lipopolysaccharid-Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-2-Antigen durch Phenolextraktion und Zentrifugation des antigenen bakteriellen Rohextrakts; b) Fixieren des Antigens von Schritt a) auf einem festen Träger und Stabilisieren des fixierten Antigens in einer Lösung, die Meerrettich-Peroxidase-stabilisierende Lösung umfasst und die das gebundene Antigen wenigstens 25 Wochen lang bei 4 °C stabil hält; c) Immunisieren von nichthumanen Tieren mit einem Stamm von A. pleuropneumoniae Serotyp 2 und Gewinnen von Serum, das als positives Kontrollserum dienen soll; und d) Gewinnen von Seren von A.-pleuropneumoniae-freien Herden, die als negative Kontrolle dienen sollen.